CN102612650A - 电泳分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能通过电泳正确分析蛋白酶的方法。该含有蛋白酶的试样的电泳分析方法的特征在于，将含有被分析对象蛋白酶的试样置于该蛋白酶迅速失活的pH条件后，使该试样进行电泳。

Description

电泳分析方法
技术领域
本发明涉及能够正确测定蛋白酶的纯度的电泳分析方法。
背景技术
在处理动物细胞的领域中，广泛实施培养细胞的酶处理。尤其是通过使用酶，能够在温和条件下分解构成基底膜的细胞外基质等，所以在培养细胞的传代培养等中不可欠缺。在此使用的酶熟知的有胰蛋白酶、胶原蛋白酶等蛋白酶、透明质酸酶等多糖分解酶。
Bacillolysin是微生物尤其是芽孢杆菌属及近缘属细菌生产的中性金属蛋白酶。从微生物Bacillus polymyxa（从1994年属名改为Paenibacillus属）的培养液中发现了作为Bacillolysin的一种的蛋白酶。可确认该蛋白酶显示与胰蛋白酶、胶原蛋白酶不同的分解作用，例如，可以将其它酶不能很好分散的细胞块，在不损伤细胞自身的情况下分散成单细胞。另外，利用在血清中不受抑制的性质，用来在浮游体系中培养粘合性的细胞等，可利用于各种领域（专利文献1、2）。该蛋白酶由合同酒精株式会社以Dispase（注册商标）的名称在销售，已在世界范围广泛被使用。
如今，在将从皮肤组织分离的上皮细胞培养并以片状取出的情况、从胰腺取出胰岛素产生细胞的情况等的再生医疗相关领域，最常用该蛋白酶（Dispase）。并且，不仅是如上的实验室、工业用途，而且作为医疗用，尤其在眼科领域作为增生性视网膜病变外科手术中切除玻璃体时的辅助用途、糖尿病性白内障的预防疗法等，一直在研究将Bacillolysin作为医药品进行利用的研究（非专利文献1）。
虽然从较早开始酶作为医药品被利用，但当初仅仅是将蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等作为促消化剂进行利用。它们大多是口服给药，迄今为止纯度基本不成为问题。但是，如对代谢异常疾病的补偿疗法、参与血液凝固系统的酶群的利用等那样，已开始进行酶的非口服给药治疗法，对作为医药品的酶开始要求过敏诱导物质的去除、内毒素的去除等非口服给药所需的纯度和杂质的去除。同时，为了防范无法预期的副作用于未然，对作为原药的酶蛋白质也开始要求高纯度。
以往，作为分析蛋白质的纯度的方法，有时使用凝胶过滤法，但凝胶过滤法中，对于具有数万分子量的蛋白质欠缺将数千分子量差区分的分辨能力。另一方面，电泳法分辨能力高，作为分析蛋白质的纯度的方法被广泛利用。尤其提前将试样与SDS一起加热进行SDS化，在SDS存在下进行泳动的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS－PAGE法）与同样在表面活性剂下进行泳动的毛细管电泳法都是能分析精制蛋白质的纯度的优异的方法（非专利文献2）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:特公昭56－51747号公报
专利文献2:特公昭57－14836号公报
非专利文献
非专利文献1:Tezel TH等，Retina，1998；18（1）
非专利文献2:Laemmli等，Nature，227，680－685（1970）
发明内容
但是，将上述的蛋白酶（Dispase）那样的中性金属蛋白酶作为对象进行伴有SDS处理的电泳分析，结果发现会检测到多个条带。另外，发现该多个条带的产生完全不能通过高温条件下或添加市售蛋白酶抑制剂来防止。因此，不能测定含有该蛋白酶的试样的纯度，完全不知道进一步精制的蛋白酶达到何种程度的纯度。
本发明的课题在于提供能够通过电泳正确分析各种蛋白酶的方法。
因此，本发明人为了防止蛋白酶在SDS处理中分解，进行了各种研究。首先，为了防止蛋白酶的自身分解，添加了胍、尿素等蛋白质改性剂，但仍然观察到了分解。另外，由于所述的蛋白酶为金属蛋白酶，所以也研究了添加金属螯合剂，但观察到活性没有即刻停止，而是缓慢地失活，而残留有活性的酶参与自身分解，结果无法反映本来的纯度。因此进一步进行了研究的结果发现，尽管认为设成强酸性、强碱性则因进行化学性水解所以不能正确地分析，但完全令人意外的是如果调节到该蛋白酶迅速失活的pH之后进行电泳，则能抑制自身分解，并且还能抑制因酸、碱而导致的化学性水解，可观察到蛋白酶的主条带，可进行正确的纯度测定。另外，对于所述蛋白酶(Dispase)，初次确认了其纯度，初次得到了纯度92%以上的高纯度的酶。
即，本发明提供一种含有蛋白酶的试样的电泳分析方法，其特征在于，将含有被分析对象蛋白酶的试样置于该蛋白酶迅速失活的pH条件后，使该试样进行电泳。
另外，本发明提供一种蛋白酶，是采用上述分析方法确认到具有92%以上的纯度的满足如下条件的蛋白酶：（1）由属于类芽孢杆菌属的细菌产生；（2）在中性范围分解酪蛋白、血红蛋白；（3）最适pH是7.0～8.0，在pH5.5～9.0稳定；（4）在20～75℃进行作用，最适温度为55℃；（5）以电泳法测定的分子量推定为32000～34000Da。
在本发明的pH条件下处理后进行电泳，由此明确了容易发生自身分解的蛋白酶的本来的纯度。尤其是所述特定的蛋白酶，通过本发明初次可以算出纯度。精制到纯度为92%以上、尤其95%以上的该蛋白酶在医药用途中有用，可得到副作用少的医药品。
附图说明
图1表示Dispase I的以往方法的SDS－PAGE的结果。
图2表示Dispase I的HPLC凝胶过滤色谱。
图3表示精制酶的HPLC凝胶过滤色谱。
图4表示Dispase I和精制酶的SDS－PAGE的结果。
图5表示EDTA、金属、改性剂对SDS－PAGE的影响。
图6表示对EDTA和SDS－PAGE的影响。
图7表示酸处理对SDS－PAGE的影响。
图8表示酸的种类对SDS－PAGE的影响。
图9表示酸处理后改变pH时的SDS－PAGE的结果。
图10表示利用碱处理样品后的SDS－PAGE的结果。
图11表示TCA处理与硫酸处理的比较。
图12表示各精制阶段的蛋白酶的SDS－PAGE的结果。
图13表示毛细管电泳的结果。
图14表示本发明的前处理后的以SDS－PAGE进行的纯度确认（左：Dispase I、右：精制酶）的结果。
图15表示各种蛋白酶的分析（前处理法的比较）结果。
图16表示D－蛋白酶的最适pH。
图17表示D－蛋白酶的pH稳定性。
图18表示D－蛋白酶的最适温度。
图19表示D－蛋白酶的SDS－PAGE的结果。
具体实施方式
本发明的电泳分析法的特征在于，将含有被分析对象蛋白酶的试样置于该蛋白酶迅速失活的pH条件后对该试样进行电泳分析。
作为被分析对象蛋白酶，只要是蛋白酶则没有特别限定，酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶均可使用。
作为被分析对象蛋白酶的具体例，可举出肝胰蛋白酶（最适pH7.8）、胰蛋白酶（最适pH8.0）、枯草杆菌蛋白酶（最适pH7～10.5）、蛋白酶K（最适pH7.5～12）等丝氨酸蛋白酶；木瓜蛋白酶（最适pH6～7.5）等半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶（最适pH2～3）等天冬酰胺蛋白酶；嗜热菌蛋白酶（最适pH7）、BNP（最适pH7.0～8.0）等金属蛋白酶等。其中，优选最适pH在中性附近的中性蛋白酶，更优选中性金属蛋白酶，特别优选上述专利文献1记载的蛋白酶（以下，记为D蛋白酶）。
作为含有本发明的被分析对象蛋白酶的试样，可使用从微生物等的细胞培养液利用常法制造蛋白酶的过程中的纯度不明的含蛋白酶试样、含有精制的纯度不明的蛋白酶试样、含有被分析蛋白酶和其它蛋白质的试样、纯度不明的市售蛋白酶等。作为从培养液精制的方法，可举出吸附、溶剂分馏、硫酸铵分馏、色谱、结晶化等。作为市售的蛋白酶，可举出上述的各种蛋白酶、Dispase I、Dispase II（注册商标）等。
在本发明中，将含有被分析对象蛋白酶的试样置于该蛋白酶迅速失活的pH条件。所谓蛋白酶迅速失活的pH是指在1分钟以内失去蛋白酶活性的pH，特别优选在10秒以内失去蛋白酶活性的pH。这种pH条件通常优选从该蛋白酶的最适pH偏离3以上的pH条件，进一步优选从最适pH偏离4以上的pH条件。
对于更优选的蛋白酶迅速失活的pH条件，当该蛋白酶为中性蛋白酶时，优选pH0.1～3或pH11～14，进一步优选pH0.1～2.0或12～14。当该蛋白酶为酸性蛋白酶时，优选pH10～14，进一步优选pH11～14。当该蛋白酶为碱性蛋白酶时，优选pH0.1～4，进一步优选pH0.1～3。
当蛋白酶为D蛋白酶时，优选调节为pH0.7～2.0。如果小于pH0.7，则发生蛋白酶的化学性水解，另一方面，如果大于pH2.0则不能抑制自身分解。更优选pH是0.9～1.9，特别优选1.5～1.9。
对于pH的调节而言，在含蛋白酶试样中添加酸或碱即可。作为这样的酸，可举出硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、三氯乙酸等。另外作为碱，可举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等。
作为置于这种pH条件的时间和温度，只要是对象蛋白酶失活且不发生化学性水解的条件即可，例如优选在25℃、1～30分钟，进一步优选在25℃、1～10分钟。
含有被分析对象蛋白酶的试样，由于所述pH处理而其活性失去，所以可以在该pH处理后直接进行电泳，也可以使pH成为中性附近活碱性后进行电泳。即，对提供到电泳装置时的pH没有涂布限制。
然后，将含有被分析对象蛋白酶的试样按照常法进行电泳即可。作为电泳方法，可举出SDS－PAGE、毛细管电泳、非改性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳。例如对于SDS－PAGE的情况，将该蛋白酶含有试样等量地混合到含有SDS、巯基乙醇、溴酚蓝色素的样品处理液中后提供到PAGE即可。应予说明，使用所述含有D蛋白酶的试样时，不需要在SDS化阶段煮沸。相反，如果煮沸pH0.7～2.0的试样则蛋白酶可能会分解。因此，SDS化优选在10～30℃进行。
另外，对于毛细管电泳的情况，将所述进行了pH处理的蛋白酶含有试样添加到各装置所表明的样品处理液（Experion PRO260分析试剂盒Biorad公司制等）中，提供到毛细管电泳装置（Experion全自动电泳装置BioRad公司制等）即可。
作为泳动后的分析方法，例如能检测凝胶上的色素即可，例如可以利用密度计等将纯度数值化。另外，即使使用毛细管电泳，也能算出纯度。
根据本发明方法，可以利用电泳法正确地测定各种蛋白酶、尤其是D蛋白酶的纯度。因此，如果使用本发明方法，则可确认以往不能得到的具有92%以上的纯度的D蛋白酶。用本发明方法确认到纯度为92%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上的D蛋白酶，特别是作为医药品可使用。
在此，关于D蛋白酶，在专利文献1中记载了其具有以下性质：（1）由属于多粘芽孢杆菌的细菌产生，（2）在中性范围分解酪蛋白、血红蛋白，（3）最适pH为8.5，在pH4.0～9.0稳定，（4）在20～75℃进行作用，最适温度是60℃，（5）在Ca2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+下活性增强，（6）利用超高速离心法测定的分子量为35900Da。
但是，这次本发明人再次研究D蛋白酶的性质的结果，发现其具有以下的性质：（1）由属于类芽孢杆菌属的细菌产生，（2）在中性范围分解酪蛋白、血红蛋白，（3）最适pH是7.0～8.0，（4）在pH5.5～9.0稳定，（4）在20～75℃进行作用，最适温度是55℃，（5）利用电泳法测定的分子量推定为32000～34000Da。应予说明，现在，多粘芽孢杆菌的种名已变为Paenibacillus·polymyxa。
另外，D蛋白酶具体地具有以下性质。
（1）作用
呈作为中性蛋白酶的一般性质，在pH中性范围分解酪蛋白、血红蛋白等蛋白质，生成肽以至游离氨基酸。
已确认对于氧化胰岛素的B链，切断如下的12处肽键：Pha（1）－Val（2）、His（5）－Leu（6）、His（10）－Leu（11）、Glu（13）－Ala（14）、Ala（14）－Ler（15）、Ler（15）－Tyr（16）、Tyr（16）－Leu（17）、Leu（17）－Val（18）、Gly（23）－Phe（24）、Phe（24）－Phe（25）、Phe（25）－Tyr（26）和Lys（29）－Ala（30）。
（2）基质特异性
对于酪蛋白，显示温和的蛋白分解作用。
（3）最适pH和稳定pH范围
1、最适pH：对酪蛋白的蛋白分解作用的最适pH是7.0～8.0。
2、稳定的pH范围：在5.5～9.0范围极其稳定。
（4）作用适宜温度范围
在20℃～75℃的范围进行作用，最适温度是55℃。
（5）由于pH、温度等而失活的条件
pH3.0以下和pH10.0以上时，活性完全消失。另外，通过65℃、10分钟的加热处理，完全失活。
（6）抑制、活化和稳定化
可利用乙二胺四乙酸（EDTA）、柠檬酸、邻菲罗啉、2，2－联吡啶、氟化钠等的金属螯合剂、以及N－溴代琥珀酰亚胺（NBS）、碘等氧化剂抑制。
可通过钙离子稳定化，活性需要锌离子。
（7）分子量
利用电泳法获得的分子量推定为32000～34000Da。
实施例
以下，列举实施例详细地说明本发明。
参考例1（伴有以往前处理方法的SDS－PAGE分析）
以蛋白质成为1mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解在50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液(pH7.5）中。在其100μL中添加以往的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL。准备2个试样，一个煮沸3分钟。
将如上处理的试样以各10μL，提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
结果，如图1所示，在使用以往前处理方法的SDS－PAGE中，Dispase I检测出多个条带。Dispase I的主成分的D蛋白酶的分子量呈32kDa～34kDa，但检测到分子量比该分子量条带小的多个条带。另外，未煮沸试样的样品有可能因未发生SDS化，未检测到属于D蛋白酶的条带。
参考例2（精制酶的利用以往前处理方法的分析）
以蛋白质成为0.4mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH8.0）中。将该200mL吸附于预先用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH8.0）平衡化的阴离子交换树脂TSK GEL DEAE 650M柱（3×20cm），用含有0.1M食盐的50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH8.0）梯度洗脱。色谱操作在4℃附近进行。收集D蛋白酶的洗脱馏分，用UF膜（旭化成株式会公司制AIP）浓缩，使用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液进行脱盐，使结晶析出。将该结晶作为精制酶。
以蛋白质成为1mg／mL的方式将精制酶溶解在50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（含有0.2M食盐，pH7.5），提供到凝胶过滤HPLC（G2000SＷXL TOSOH制），结果在保留时间18～20分钟处检测到D蛋白酶的峰。通过将该峰与另行制作的分子量标记比较，推定分子量为30kDa～40kDa。
向溶解成上述凝胶过滤HPLC用的试样中加入以往的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL，煮沸3分钟。
将这样处理的试样以各10μL提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图2～图4所示，即使对于用DEAE柱精制的D蛋白酶，也检测到了分子量比该分子量条带小的多个条带。这表明在SDS－PAGE法的过程中D蛋白酶发生了分解。并且可推测原因尤其在于电泳的前处理。
参考例3（EDTA、金属、蛋白质改性剂的影响）
D蛋白酶是含钙、锌的金属蛋白酶的一种，所以通过使用EDTA等金属螯合剂和锌以外的重金属使其失活，从而希望抑制前处理中的分解。另外，通过用胍、尿素、三氯乙酸（TCA，pH4.8）等使蛋白质即刻改性，从而同样地希望抑制因自身导致的分解。
以蛋白质成为2mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解在50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在该50μL中添加各浓度的EDTA、金属、或蛋白质改性剂50μL，加入以往的试样的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL，煮沸3分钟。同样地也制造了未煮沸的试样。
将这样处理的试样以各10μL，提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图5所示，煮沸时，在EDTA、金属、蛋白改性剂等情况中，未能通过抑制分解而反映本来的纯度。检测到与以往方法的SDS－PAGE相同程度、或在其以上的杂质条带。
其中，未煮沸的EDTA 10mM样品的D蛋白酶的条带浓，推测可能杂质条带相对少。
参考例4（EDTA的效果）
对EDTA的效果进一步进行了研究。以蛋白质成为2mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在其50μL中添加各浓度的EDTA50μL，加入以往的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL（不进行煮沸）。将这样处理的试样以各10μL，提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图6所示，虽然因使用5mM以上的EDTA而杂质条带的数目减少，但另行测定EDTA添加时的残留蛋白酶活性的结果，可知如表1所示，仍维持蛋白酶活性。由此可知，EDTA不能有效地即刻使蛋白酶活性丧失而反映本来的纯度。
（蛋白酶活性的测定方法）
蛋白酶活性测定使用常用的酪蛋白分解法进行。即，用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）适度稀释添加EDTA后的试样，将其置于1mL试验管，在30℃保温3分钟。向其中加入预先在30℃保温的0.6%牛奶酪蛋白溶液5mL，在30℃反应10分钟。加入沉淀试剂（用水将三氯乙酸18g、乙酸钠18g、乙酸19.8g调成1L的溶液）5mL，停止反应，在30℃稍稍形成沉淀后，用滤纸过滤，测定滤液在275nm的吸光度。对照使用预先用沉淀试剂进行了失活的试样。
以将缓冲液（EDTA未处理）的情况作为100的相对值表示结果。
表1
样品处理时的活性
Figure BDA00001646531700111
实施例1（利用酸的前处理）
D蛋白酶是中性蛋白酶，所以期待通过使试样处理时的pH设为酸性而使酶反应即刻失活、抑制分解。
以蛋白质成为2mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在其50μL添加各浓度的硫酸50μL，加入以往的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL。另外，同样地制造了煮沸的样品。将这样处理的试样以各10μL，提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图7所示，在添加0.05M硫酸的样品（pH1.9）中，煮沸后的样品除D蛋白酶条带（32kDa～34kDa）以外还观察到了分解物的条带。另一方面，在添加0.05M～1.0M硫酸的样品（pH0.7～1.9）中，未煮沸的样品显示D蛋白酶（32kDa～34kDa）的条带，另外在比D蛋白酶低的分子（小于32kDa）处观察到认为是夹杂蛋白质的多个条带。在添加0.01M硫酸的样品（pH3.7）中未煮沸的样品发生自身分解，所以D蛋白酶的条带薄，并且，可明显确认到分解物的条带。
即，发现通过将试样液以前处理使其成为酸性，根据其酸性程度而在分解上具有差别。
另外，发现通过置于该酸性条件后添加SDS，从而可以不经过在中性区域施加SDS时所必需的煮沸作业就能进行SDS化。
实施例2（酸的种类的影响）
确认了使用的酸的种类的影响。以蛋白质成为2mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解在50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在该50μL中添加各种酸50μL，加入以往的试样前处理液(含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL。
将这样处理的试样以各10μL提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图8所示，除乙酸外不论酸的种类，都在pH0.7～2.0显示D蛋白酶（32kDa～34kDa）的条带，另外，在比D蛋白酶低的分子区域（小于32kDa）观察到了被认为是夹杂蛋白质的多个条带。
实施例3（酸处理后将pH调节到中性和碱性进行电泳）
以蛋白质成为2mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。混和该试样0.5mL与等量的0.05M硫酸，实施酸处理（此时pH1.7）。进而，对该试样，一边测定pH一边缓慢加入0.1M氢氧化钠，将pH调回中性和碱性。
在各pH的试样50μL中加入等量的样品处理液（含有25%甘油、5%SDS、BPB适量），充分混和后，将各10μL提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。结果，如图9所示，在酸处理后即使改变pH，也未观察到电泳结果不同。
实施例4（碱处理（pH12附近））
以蛋白质成为1mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解到蒸馏水。混和该试样50μL与等量的氢氧化钠溶液，实施碱处理。改变使用的氢氧化钠溶液的浓度，测定各pH。
在用各浓度的氢氧化钠溶液处理的试样中加入100μL的样品处理液（含有25%甘油、5%SDS、BPB适量），充分混和后，将各10μL提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。结果，如图10所示，即使进行碱处理，也可得到与酸处理法同样的电泳图。其中，在未调成pH12以上的强碱性的状态的情况下，观察到了多个被认为是自身分解物的杂质条带。
实施例5（TCA处理和硫酸处理的比较）
以成为5mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）溶解到蒸馏水。另外，将精制的D蛋白酶制备成5万PU／mL（约5mg／mL）。将该试样0.05mL与等量的0.1M三氯乙酸（TCA）、0.05M硫酸分别混和进行酸处理。该处理全部以在冰上冷却的状态下进行。
在处理的各试样中加入0.1mL的样品处理液（含有25%甘油、5%SDS、BPB适量），充分混和后，将各10μL提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图11所示，无论是TCA处理法还是硫酸法，条带图案几乎相同。
另外，显示出精制酶的纯度是98%左右，Dispase I的纯度是90%左右。
实施例6（精制酶的用本发明法进行的分析）
确认了对市售Dispase II（粗精制品）、市售Dispase I（精制品）和精制酶（高度精制品）的溶液添加酸后，加入以往的试样处理液这样的本发明法的效果。
以蛋白质成为2mg／mL的方式将Dispase I、II和精制酶溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在试样50μL中加入0.05M硫酸50μL并混合，接着，加入以往的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL。为了比较，代替0.05M硫酸而加入水50μL并混合，接着加入以往的试样前处理液100μL，煮沸3分钟而制得。
将这样处理的试样以各10μL，提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图12所示，通过利用本发明法进行前处理，可明确地观察到Dispase I、Dispase II所含的D蛋白酶和杂质。进一步可观察到精制酶中杂质在减少。另一方面，可确认在以往方法中不论是在试样的何种精制程度均未获得完全反映本来的纯度的结果，不适合D蛋白酶这样的蛋白酶的纯度分析。
实施例7（精制酶的利用本发明法进行的分析：毛细管电泳）
以蛋白质成为2mg／mL的方式将市售Dispase I（合同酒精株式会公司制）和精制酶溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。
在试样50μL中加入0.05M硫酸50μL并混合，在其4μL中添加Biorad样品处理液（Experion Pro260分析试剂盒Biorad公司制）2μL、水84μL。
为了比较，在试样50μL中添加水50μL并搅拌后，在该4μL中添加Biorad样品处理液2μL、水84μL并煮沸。另外，同样地也制作了未煮沸的样品。
将这样处理的试样提供到毛细管电泳（Experion全自动电泳装置BioRad公司制）。
其结果，如图13所示，如果利用本发明法进行前处理，则在45～50kDa显示D蛋白酶的条带，另外，在比本酶低的分子区域观察到多个被认为是夹杂蛋白质的条带。另一方面，不进行本发明的前处理时，在50kDa以下将确认到多个分解物条带。
根据本毛细管电泳法，可显示精制酶的纯度是98%以上、Dispase I的纯度是80%。
实施例8（精制酶的纯度分析）
为了定量精制的D蛋白酶的纯度，利用梯度稀释法进行了算出。为了使杂质条带可视化，将精制酶10mg／mL梯度性地稀释而得的产物在本发明的前处理后提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。作为比较，Dispase I也同样处理。电泳后，确认杂质条带相对于D蛋白酶含有多少。
其结果，从图14可知，精制酶中，泳道（2）所确认的28kDa～32kDa的条带的浓度与1／50稀释的泳道（8）的本酶的条带的浓度基本一致，由此可知这次得到的精制酶中的28kDa～32kDa的条带是2%左右。
同样地分析Dispase I，则小于32kDa的条带总计混合有8～12%左右。
实施例9（一般的蛋白酶的利用本发明的前处理后的分析）
为了确认本发明法是否能在其它蛋白酶应用，用本发明法分析了D蛋白酶以外的7种蛋白酶。
以蛋白质成为2mg／mL的方式将7种蛋白酶溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在试样50μL中加入0.05M硫酸50μL并混合，接着，加入以往的试样前处理液（含有25%甘油、2.5%SDS、0.125M Tris－盐酸缓冲液pH6.8、2－巯基乙醇2.5%和溴酚蓝适量）100μL。
为了比较也制作了代替0.05M硫酸而加入水50μL并混合，接着，加入以往方法的试样处理液100μL，煮沸3分钟的样品。
将这样处理的试样以各10μL，提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
其结果，如图15所示，除了作为酸性蛋白酶的胃蛋白酶，通过本发明的使用了酸的前处理，不论蛋白酶的种类（活性中心不同），SDS－PAGE上的蛋白酶的条带均浓，其泳道所含的其它条带的数目和量均减少。这表明通过本发明法的前处理法，抑制了蛋白酶的在以往的前处理中发生的自身分解以及分解共存的蛋白质的情况。
实施例10（D蛋白酶的性质的确认）
测定了D蛋白酶的最适pH、pH稳定性、最适温度。另外，从SDS－PAGE的结果推定了分子量。
i）最适pH（专利文献1：pH8.5）
用调整为各pH的缓冲液以成为50PU／mL的方式将市售Dispase I稀释，作为基质制备了用调制为各pH的缓冲液制备的0.6%牛奶酪蛋白，测定各pH中的蛋白酶分解活性。另行混合基质和酶，确认了反应时的pH。
应予说明，pH5.5、6.5是使用50mM Mes－2mM乙酸钙缓冲液，pH7.5、8.5是使用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液，pH9.5、10.5、11.0是使用50mM Chaps－2mM乙酸钙缓冲液。
其结果，D－蛋白酶的最适pH是7.0～8.0（图16）。
ii）pH稳定性（专利文献1：pH4～9）
用调节到各pH的缓冲液以成为6500PU／mL的方式将市售Dispase I稀释，在4、37、45、50、55、60℃的各温度保持1小时。用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）以成为50PU／mL的方式各自进行稀释，测定蛋白酶活性（pH7.5）。
应予说明，pH5.5、6.5是使用50mM MES－2mM乙酸钙缓冲液，pH7.5、8.5是使用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液，pH9.5、10.5、11.0是使用50mM CAPS、2mM乙酸钙缓冲液。
其结果，D－蛋白酶在pH5.5～9.0下稳定（图17）。
iii）最适温度（专利文献1：60℃）
用50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）以成为50PU／mL的方式将市售Dispase I稀释，在30、40、50、55、60℃的各温度测定蛋白酶活性（pH7.5）。
其结果，D－蛋白酶的最适温度是55℃（图18）。
iv）分子量的测定（专利文献1：利用超高速离心法，是35900Da）
以成为2mg／mL的方式将市售Dispase I溶解到50mM Tris－2mM乙酸钙缓冲液（pH7.5）。在该试样50μL中加入0.05M硫酸50μL并混合。向其中加入等量的样品处理液（含有25%甘油、5%SDS、BPB适量），充分混和后，将各10μL提供到SDS－PAGE（15%凝胶）。
电泳后，从D蛋白酶的条带和标记蛋白分子的条带的移动度（RF值），推定D蛋白酶的分子量的结果，是32～34kDa（图19）。

Claims (9)

1.一种含有蛋白酶的试样的电泳分析方法，其特征在于，将含有被分析对象蛋白酶的试样置于该蛋白酶迅速失活的pH条件后，使该试样进行电泳。
2.如权利要求1所述的分析方法，其中，所述蛋白酶迅速失活的pH条件为从该蛋白酶的最适pH偏离3以上的pH条件。
3.如权利要求1或2所述的分析方法，其中，当所述蛋白酶为中性蛋白酶时，该蛋白酶迅速失活的pH条件为pH0.1～3或pH11～14，当所述蛋白酶为酸性蛋白酶时，该蛋白酶迅速失活的pH条件为pH10～14，当所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，该蛋白酶迅速失活的pH条件为0.1～4。
4.如权利要求1～3中任一项所述的分析方法，其中，所述蛋白酶为中性金属蛋白酶，该蛋白酶迅速失活的pH条件为pH0.7～2.0或12～14。
5.如权利要求1～4中任一项所述的分析方法，是分析蛋白酶纯度的方法。
6.如权利要求1～5中任一项所述的分析方法，其中，电泳为十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳即SDS－PAGE或毛细管电泳。
7.如权利要求1～6中任一项所述的分析方法，其中，所述蛋白酶为满足如下条件的蛋白酶：（1）由属于类芽孢杆菌属的细菌产生；（2）在中性范围分解酪蛋白、血红蛋白；（3）最适pH为7.0～8.0，在pH5.5～9.0稳定；（4）在20～75℃进行作用，最适温度为55℃；（5）由电泳法获得的分子量推定为32000～34000Da；
并且，该蛋白酶迅速失活的pH条件为pH0.7～2.0或12～14。
8.一种蛋白酶，是利用权利要求1～7中任一项所述的分析方法确认到具有92%以上的纯度的满足如下条件的蛋白酶：（1）由属于类芽孢杆菌属的细菌产生；（2）在中性范围分解酪蛋白、血红蛋白；（3）最适pH为7.0～8.0，在pH5.5～9.0稳定；（4）在20～75℃进行作用，最适温度为55℃；（5）由电泳法获得的分子量推定为32000～34000Da。
9.如权利要求8所述的蛋白酶，其中，纯度为95%以上。
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