CN105136896B - 测定牛乳中κ‑酪蛋白含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了用于对毛细管进行涂层处理的试剂以及测定牛乳中κ‑酪蛋白含量的方法。根据本发明的实施例，所述毛细管用于通过毛细管电泳法测定牛乳中κ‑酪蛋白含量，所述试剂是含有下列的水溶液：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；120mmol/L的十六烷基溴化铵；80mmol/L的聚乙二醇；和60mmol/L的戊二胺，其中，所述试剂的pH值为8.5。由此，本发明利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ‑酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法。更具体地，本发明涉及用于对毛细管进行涂层处理的试剂及测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法。
背景技术
κ-酪蛋白是酪蛋白组分中含量最少的一种蛋白质，约占总酪蛋白的12％，占牛乳中总蛋白质的10％。κ-酪蛋白的相对分子质量约为19000D，含有169个氨基酸残基，1个磷酸基团。
然而，目前测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种用于对毛细管进行涂层处理的试剂以及一种检测κ-酪蛋白含量的方法。该测定κ-酪蛋白含量的方法以及利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ-酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
国际标准DIN-10470-2011提出了一种《牛奶和牛奶制品的全部蛋白质中乳蛋白含量和酪蛋白含量测定》的测定方法。但该方法只是对乳中总的酪蛋白含量进行了定量检测，而未对具体的κ-酪蛋白含量进行分析。κ-酪蛋白由于含量低，检测难度大。
本发明的发明人经过大量实验发现，预先将未涂层毛细管进行涂层处理，然后采用毛细管电泳法检测经过预处理的牛乳，基于检测结果确定牛乳中κ-酪蛋白的含量。由此，该测定κ-酪蛋白含量的方法以及利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ-酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于对毛细管进行涂层处理的试剂。根据本发明的实施例，所述毛细管用于通过毛细管电泳法测定牛乳中κ-酪蛋白含量，所述试剂是含有下列的水溶液：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；120mmol/L的十六烷基溴化铵；80mmol/L的聚乙二醇；和60mmol/L的戊二胺，其中，所述试剂的pH值为8.5。发明人发现，利用该试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中κ-酪蛋白含量的准确性。由此，根据本发明实施例的利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ-酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)采用毛细管电泳法对所述牛乳进行检测，其中，所述毛细管电泳法采用预先利用前面描述的试剂进行涂层处理的毛细管；(2)基于步骤(1)中所得到的毛细管电泳结果，确定所述牛乳中的κ-酪蛋白含量。如前所述，利用该试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中κ-酪蛋白含量的准确性。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
根据本发明的实施例，上述测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法还可以具有下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述涂层处理包括：(1)涂层处理试剂的配制：用去离子水准确配制100ml涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.5；(2)缓冲溶液的配制：用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，其中各成分及其浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/LNaOH调节pH至8.5；(3)涂层的形成：用浓度为0.1～0.5mol/L的NaOH冲洗毛细管内壁3～5分钟，并用去离子水冲洗3～5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗3-10分钟，静置5-10分钟，再用缓冲溶液冲洗3-5分钟，将上述涂层的形成步骤循环2-5次。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，所述毛细管预先经过活化处理，所述活化处理包括：(1)将毛细管用色谱级甲醇冲洗5～20分钟，并用去离子水冲洗5～20分钟；(2)将经过步骤(1)处理得到的毛细管用1～4mol/L NaOH冲洗5～20分钟，静置5～30分钟；以及(3)将经过步骤(2)处理得到的毛细管用去离子水冲洗5～20分钟。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，所述牛乳包括选自生牛乳、超高温灭菌牛乳以及巴氏灭菌牛乳的至少一种。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，所述采用毛细管电泳法进行检测前，预先将所述牛乳进行预处理，所述预处理包括：(1)将所述牛乳用乙酸调节pH值，离心并弃上清，并用水洗涤沉淀3～5次，离心，收集沉淀；(2)将步骤(1)所得到的沉淀用硼酸调节pH值；以及(3)取步骤(2)所得到的混合物10mL，添加尿素以及二硫苏糖醇，振荡混匀，并静置处理，以便得到待测液。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，在步骤(1)中，用浓度为30～80mmol/L的所述乙酸调节pH值至4.6；在步骤(2)中，用浓度为20～70mmol/L的所述硼酸调节pH值至6.6；所述尿素浓度为6mol/L，添加量为3.6克，所述二硫苏糖醇的添加量为0.05克，所述静置时间为10分钟。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，针对所述生牛乳，所述预处理进一步包括：将所述生牛乳用乙酸调节pH值之前，预先将所述生牛乳离心，并进行冷冻处理，任选地，所述离心是在3000～10000r/min的转速下进行10～30分钟；所述冷冻处理是在-40摄氏度的温度下进行10～30分钟。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，将所述待测液进行所述毛细管电泳法检测前，预先将所述待测液中κ-酪蛋白的浓度调节至0.25～4mg/ml。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，所述毛细管电泳法测定是按照下列条件进行的：毛细管的内径为25-75μm、总长度为200-900mm、有效长度为100-800mm；检测波长为200-450nm；检测温度为15-40℃；进样方式为压力进样或真空进样；压力为0-1psi；进样时间为1s-20s；工作电压为7-30kv；以及检测频率为5-18Hz，优选地，所述检测温度25℃；所述毛细管的内径为25-75μm、所述总长度为600mm；所述进样方式为压力进样；所述压力为0.5psi；所述进样时间为10s-20s；以及所述工作电压为20-30kv。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
此外，根据本发明的实施例，本发明提供的用于对毛细管进行涂层处理的试剂及测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法具有以下优点的至少之一：
1、根据本发明的实施例，将用于对毛细管进行涂层处理的试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中κ-酪蛋白含量的准确性。
2、根据本发明的实施例，样品离心时间短，脂肪去除率高，且样品经冷冻处理后，可以使部分酪蛋白胶束实现分离。
3、根据本发明的实施例，κ-酪蛋白含量出峰时间约为10.5分钟左右，分离速度较快，能够实现快速分离的目的。
4、根据本发明的实施例，本发明能够测定含量为0.25mg/ml-4mg/ml的κ-酪蛋白，能够有效地检测出较低含量的κ-酪蛋白。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的涂层处理的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的牛乳预处理的流程示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的生牛乳预处理的流程示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的0.25mg/mlκ-酪蛋白标准品的图谱；
图5显示了根据本发明一个实施例的0.5mg/mlκ-酪蛋白标准品的图谱；
图6显示了根据本发明一个实施例的1mg/mlκ-酪蛋白标准品的图谱；
图7显示了根据本发明一个实施例的2mg/mlκ-酪蛋白标准品的图谱；
图8显示了根据本发明一个实施例的4mg/mlκ-酪蛋白标准品的图谱；
图9显示了根据本发明一个实施例的κ-酪蛋白含量的标准曲线；以及
图10～13分别显示了根据本发明一个实施例的图谱。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
国际标准DIN-10470-2011提出了一种《牛奶和牛奶制品的全部蛋白质中乳蛋白含量和酪蛋白含量测定》的测定方法。但该方法只是对乳中总的酪蛋白含量进行了定量检测，而未对具体的κ-酪蛋白含量进行分析。κ-酪蛋白由于含量低，检测难度大。
本发明的发明人经过大量实验发现，预先将未涂层毛细管进行涂层处理，然后采用毛细管电泳法检测经过预处理的牛乳，基于检测结果确定牛乳中κ-酪蛋白的含量。由此，该测定κ-酪蛋白含量的方法以及利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ-酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
由此，本发明提出了测定κ-酪蛋白含量的方法以及用于对毛细管进行涂层处理的试剂。下面将进行详细描述。
用于对毛细管进行涂层处理的试剂
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于对毛细管进行涂层处理的试剂。根据本发明的实施例，毛细管用于通过毛细管电泳法测定牛乳中κ-酪蛋白含量，试剂是含有下列的水溶液：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；120mmol/L的十六烷基溴化铵；80mmol/L的聚乙二醇；和60mmol/L的戊二胺，其中，试剂的pH值为8.5。
由于未涂层的毛细管内壁的硅羟基在被氢氧化钠活化后容易吸附蛋白质，无法形成双电层而导致样品无法彻底分离，同时出现不同程度的电渗流而导致毛细管电泳的基线不平。但是，未涂层毛细管价格低廉，重复使用率高，对环境要求底，可以降低检测成本。
发明人发现，利用该试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中κ-酪蛋白含量的准确性。发明人经过大量实验发现，检测不同蛋白质所用的用于对毛细管进行涂层处理的试剂的种类有所不同，该试剂并不具有普遍适用性，由此，发明人经过大量实验筛选得到该试剂的最优组成成分，试剂组分浓度过高或者过低都会对κ-酪蛋白含量的测定造成影响。由此，根据本发明实施例的利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ-酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
本发明所使用的术语“毛细管”为本领域技术人员所公知，对于毛细管的种类和型号，本发明不做严格限定，可以通过商业购买途径得到。根据本发明的实施例，毛细管选自美国BECKMAN COULTER公司，型号为Capillary Tubing-50μm I.D，375μm O.D。
测定κ-酪蛋白含量的方法
在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)采用毛细管电泳法对牛乳进行检测，其中，毛细管电泳法采用预先利用前面描述的试剂进行涂层处理的毛细管；(2)基于步骤(1)中所得到的毛细管电泳结果，确定牛乳中的κ-酪蛋白含量。由此，由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
参见图1，根据本发明的实施例，涂层处理包括下列步骤，由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
S100a：涂层处理试剂的配制
在该步骤中，用去离子水准确配制100ml涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.5。发明人经过大量实验筛选及优化得到最优涂层处理试剂。其中三羟甲基氨基甲烷起缓冲作用，如果浓度过大，则缓冲液中离子变大，将会导致电渗流变大，影响分离；浓度太小，则难以缓冲作用，影响分离；戊二胺与十六烷基溴化铵的作用是通过静电作用来改变毛细管内壁硅羟基的电荷量，从而控制电渗流大小和方向，抑制蛋白质的吸附；聚乙二醇的作用是与毛细管内壁硅羟基发生反应，防止蛋白吸附。浓度的过大会导致溶液离子强度过大，浓度太小则影响毛细管内壁涂层的稳定性及重现性。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
S200a：缓冲溶液的配制
在该步骤中，用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，其中各成分及其浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/LNaOH调节pH至8.5。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
S300a：涂层的形成
在该步骤中，用浓度为0.1～0.5mol/L的NaOH冲洗毛细管内壁3～5分钟，并用去离子水冲洗3～5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗3-10分钟，静置5-10分钟，再用缓冲溶液冲洗3-5分钟，将上述涂层的形成步骤循环2-5次。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，毛细管预先经过活化处理，活化处理包括：(1)将毛细管用色谱级甲醇冲洗5～20分钟，并用去离子水冲洗5～20分钟；(2)将经过步骤(1)处理得到的毛细管用1～4mol/L NaOH冲洗5～20分钟，静置5～30分钟；以及(3)将经过步骤(2)处理得到的毛细管用去离子水冲洗5～20分钟。利用甲醇进行冲洗，目的去除毛细管内壁的脂类物质，以防止这些脂类物质影响后续操作以及最终的检测结果。利用NaOH进行冲洗，目的是为了活化毛细管内壁硅羟基，使其带电。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，牛乳包括选自生牛乳、超高温灭菌牛乳以及巴氏灭菌牛乳的至少一种。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
参见图2，根据本发明的实施例，采用毛细管电泳法进行检测前，预先将牛乳进行预处理，该预处理包括如下步骤，通过预处理可以纯化得到κ-酪蛋白，以便对其进行含量检测。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
S100b：乙酸调节pH值
在该步骤中，将牛乳用乙酸调节pH值，离心并弃上清，并用水洗涤沉淀3～5次，离心，收集沉淀。根据本发明的另一个实施例，在步骤S100b中，用浓度为30～80mmol/L的乙酸调节pH值至4.6。发明人经过大量实验优化得到最优乙酸浓度。浓度过大，调pH过程中会导致蛋白质的局部酸度过大，而引起蛋白质的变性，使得κ-酪蛋白与其他酪蛋白难以彻底分离，同时溶液离子强度也会增大，增加电渗流；浓度过小，导致加入乙酸的量过多。根据本发明的一个具体示例，离心是在3000～10000r/min的转速下进行10～30分钟。κ-酪蛋白的等电点为4.6，在此条件下κ-酪蛋白能够形成沉淀，通过离心并收集沉淀而得到κ-酪蛋白。此外，离心的另一个目的是去除乳脂肪，因为乳脂肪可以很好的吸附于毛细管内壁表面而导致毛细管内部无法形成双电层，最终无法实现蛋白的有效分离，同时乳脂肪还容易导致毛细管阻塞而影响分离。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
S200b：硼酸调节pH值
在该步骤中，将步骤S100b所得到的沉淀用硼酸调节pH值。根据本发明的另一个实施例，用浓度为20～70mmol/L的硼酸调节pH值至6.6。发明人发现，正常生牛乳的pH为6.6，所以将沉淀调至pH值为6.6时，κ-酪蛋白呈溶解状态。发明人经过大量实验优化得到最优硼酸浓度，目的是有效地溶解酪蛋白。硼酸浓度过大，一是增加溶液离子强度，二是使得酪蛋白胶束难以有效分离；浓度过小，会增加样品的总体积(质量)，导致κ-酪蛋白含量较低，低于检测限，产生误差。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
S300b：混合
在该步骤中，取步骤S200b所得到的混合物10mL，添加尿素以及二硫苏糖醇，振荡混匀，并静置处理，以便得到待测液。根据本发明的一个实施例，尿素浓度为6mol/L，添加量为3.6克，二硫苏糖醇的添加量为0.05克，静置时间为10分钟。发明人经过大量实验筛选到尿素和二硫苏糖醇及两者的添加量。尿素和二硫苏糖醇能够将酪蛋白胶束彻底分离和防止各酪蛋白分子重新聚合在一起，以进一步得到κ-酪蛋白。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
另外，参见图3，根据本发明的实施例，针对生牛乳，预处理进一步包括：将生牛乳用乙酸调节pH值之前，预先将生牛乳离心，并进行冷冻处理S100i，根据本发明的一个具体示例，离心是在3000～10000r/min的转速下进行10～30分钟；冷冻处理是在-40摄氏度的温度下进行10～30分钟。发明人发现，样品离心时间短，脂肪去除率高，且样品经冷冻处理后，可以使部分酪蛋白胶束实现分离。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
发明人发现，由于超高温灭菌牛乳以及巴氏灭菌牛乳在生产加工过程中预先进行均质处理，使乳中大的脂肪球破碎成小的脂肪球，细小的脂肪球通过预先离心及冷冻处理而被除去的效果不明显，因此，为提高检测效率，针对超高温灭菌牛乳以及巴氏灭菌牛乳，无需预先进行离心和冷冻处理，直接用乙酸调节pH后进行离心处理，能很好的分离乳脂肪。
根据本发明的实施例，将待测液进行毛细管电泳法检测前，预先将待测液中κ-酪蛋白的浓度调节至0.25～4mg/ml。该方法能够有效地检测出较低含量的κ-酪蛋白。根据本发明的一个具体示例，待测液无需与缓冲溶液缓和即可上样，进行毛细管电泳检测。由于待测液与缓冲溶液的pH值相近，性质相近，毛细管电泳过程不会产生电势差，进而影响检测结果。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
根据本发明的实施例，毛细管电泳法测定是按照下列条件进行的：毛细管的内径为25-75μm、总长度为200-900mm、有效长度为100-800mm；检测波长为200-450nm；检测温度为15-40℃；进样方式为压力进样或真空进样；压力为0-1psi；进样时间为1s-20s；工作电压为7-30kv；以及检测频率为5-18Hz，根据本发明的一个优选示例，检测温度25℃；毛细管的内径为25-75μm、总长度为600mm；进样方式为压力进样；压力为0.5psi；进样时间为10s-20s；以及工作电压为20-30kv。发明人经过大量实验优化得到最优检测条件。毛细管有效长度过长，使检测时间过长，过短则蛋白出峰时间一致，导致无法实现分离，电压过小，检测时间过长，电压时间过长，将产生一定的焦耳热，对检测结果造成影响。根据本发明的一个具体示例，发明人发现，κ-酪蛋白出峰时间约为10.5分钟左右，分离速度较快，能够实现快速分离的目的。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
需要说明的是，本发明对所用毛细管电泳检测的仪器不作严格限定，凡是能够进行毛细管电泳检测并得到检测结果的仪器即可。根据本发明的实施例，本发明所用毛细管电泳检测的仪器选自美国贝克曼库尔特P/ACE MDQ毛细管电泳仪，配备紫外检测器。
综上，根据本发明的实施例，本发明提供的用于对毛细管进行涂层处理的试剂及测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法具有以下优点的至少之一：
1、根据本发明的实施例，将用于对毛细管进行涂层处理的试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中κ-酪蛋白含量的准确性。
2、根据本发明的实施例，样品离心时间短，脂肪去除率高，且样品经冷冻处理后，可以使部分酪蛋白胶束实现分离。
3、根据本发明的实施例，κ-酪蛋白含量出峰时间约为10.5分钟左右，分离速度较快，能够实现快速分离的目的。
4、根据本发明的实施例，本发明能够测定含量为0.25mg/ml-4mg/ml的κ-酪蛋白，能够有效地检测出较低含量的κ-酪蛋白。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，通过下列步骤测定生牛乳中κ-酪蛋白含量：
(1)生牛乳预处理
取30ml待测生牛乳，置于50ml离心管中，于6000r/min条件下，离心20分钟，除去乳脂肪；然后置于-40℃冰箱中冷冻20分钟后；取出恢复至室温状态，用40mmol/L乙酸水溶液调节pH至4.6，于6000r/min条件下离心20分钟，弃上清液，用水洗涤3次，于6000r/min条件下离心20分钟，弃上清液，然后用40mmol/L硼酸溶液调节pH至6.6，制得待测储备液。取10ml待测储备液，添加3.6g尿素和0.05g二硫苏糖醇(DTT)，振荡混匀制得待测液。
(2)未涂层毛细管的活化
截取内径为50μm，总长度为800mm，有效长度为700mm的未涂层石英毛细管柱，用甲醇(色谱级)冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/LNaOH冲洗10min，静置10min，去离子水冲洗10min。
(3)涂层处理
1)涂层处理试剂的配制：用去离子水准确配制100ml涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.5；
2)缓冲溶液的配制：用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，其中各成分及其浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/LNaOH调节pH至8.5；
3)涂层的形成：用浓度为0.1mol/L的NaOH冲洗活化后的毛细管内壁5分钟，并用去离子水冲洗5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗5分钟，静置5分钟，再用缓冲溶液冲洗5分钟，如此循环3次。
(4)毛细管电泳检测
进行毛细管电泳检测，并基于检测结果确定生牛乳中κ-酪蛋白含量。其中，毛细管电泳检测条件为：检测波长为200nm，检测温度为25℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为15s，工作电压为30kv；检测频率为5Hz。
实施例2
在该实施例中，通过下列步骤测定生牛乳中κ-酪蛋白含量：
(1)生牛乳预处理
取30ml待测生牛乳，置于50ml离心管中，于3000r/min条件下，离心30分钟，除去乳脂肪；然后置于-40℃冰箱中冷冻20分钟后；取出恢复至室温状态，用40mmol/L乙酸水溶液调节pH至4.6，于3000r/min条件下离心30分钟，弃上清液，用水洗涤3次，于3000r/min条件下离心30分钟，弃上清液，然后用40mmol/L硼酸溶液调节pH至6.6，制得待测储备液。取10ml待测储备液，添加3.6g尿素和0.05g二硫苏糖醇(DTT)，振荡混匀制得待测液。
(2)未涂层毛细管的活化
截取内径为50μm，总长度为800mm，有效长度为700mm的未涂层石英毛细管柱，用甲醇(色谱级)冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/LNaOH冲洗10min，静置10min，去离子水冲洗10min。
(3)涂层处理
1)涂层处理试剂的配制：用去离子水准确配制100ml涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.5；
2)缓冲溶液的配制：用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，其中各成分及其浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/LNaOH调节pH至8.5；
3)涂层的形成：用浓度为0.1mol/L的NaOH冲洗活化后的毛细管内壁5分钟，并用去离子水冲洗5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗5分钟，静置5分钟，再用缓冲溶液冲洗5分钟，如此循环3次。
(4)毛细管电泳检测
进行毛细管电泳检测，并基于检测结果确定生牛乳中κ-酪蛋白含量。其中，毛细管电泳检测条件为：检测波长为200nm，检测温度为25℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为15s，工作电压为30kv；检测频率为5Hz。
实施例3
在该实施例中，通过下列步骤测定生牛乳中κ-酪蛋白含量：
(1)生牛乳预处理
取30ml待测生牛乳，置于50ml离心管中，于10000r/min条件下，离心10分钟，除去乳脂肪；然后置于-40℃冰箱中冷冻10分钟后；取出恢复至室温状态，用40mmol/L乙酸水溶液调节pH至4.6，于3000r/min条件下离心30分钟，弃上清液，用水洗涤3次，于10000r/min条件下离心10分钟，弃上清液，然后用40mmol/L硼酸溶液调节pH至6.6，制得待测储备液。取10ml待测储备液，添加3.6g尿素和0.05g二硫苏糖醇(DTT)，振荡混匀制得待测液。
(2)未涂层毛细管的活化
截取内径为50μm，总长度为700mm，有效长度为600mm的未涂层石英毛细管柱，用甲醇(色谱级)冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/LNaOH冲洗10min，静置10min，去离子水冲洗10min。
(3)涂层处理
1)涂层处理试剂的配制：用去离子水准确配制100ml涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.5；
2)缓冲溶液的配制：用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，其中各成分及其浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH至8.5；
3)涂层的形成：用浓度为0.1mol/L的NaOH冲洗活化后的毛细管内壁5分钟，并用去离子水冲洗5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗5分钟，静置5分钟，再用缓冲溶液冲洗5分钟，如此循环3次。
(4)毛细管电泳检测
进行毛细管电泳检测，并基于检测结果确定生牛乳中κ-酪蛋白含量。其中，毛细管电泳检测条件为：检测波长为200nm，检测温度为30℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为15s，工作电压为25kv；检测频率为5Hz。
实施例4
在该实施例中，通过下列步骤测定超高温灭菌牛乳中κ-酪蛋白含量：
(1)超高温灭菌牛乳预处理
取30ml待测超高温灭菌牛乳，置于50ml离心管中，用40mmol/L乙酸水溶液调节pH至4.6，于8000r/min条件下离心30分钟，弃上清液，用水洗涤3次，于8000r/min条件下离心30分钟，弃上清液，然后用40mmol/L硼酸溶液调节pH至6.6，制得待测储备液。取10ml待测储备液，添加3.6g尿素和0.05g二硫苏糖醇(DTT)，振荡混匀制得待测液。
(2)未涂层毛细管的活化
截取内径为75μm，总长度为600mm，有效长度为500mm的未涂层石英毛细管柱，用甲醇(色谱级)冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/LNaOH冲洗10min，静置10min，去离子水冲洗10min。
(3)涂层处理
按照实施例1的涂层处理步骤进行处理。
(4)毛细管电泳检测
进行毛细管电泳检测，并基于检测结果确定超高温灭菌牛乳中κ-酪蛋白含量。其中，毛细管电泳检测条件为：检测波长为200nm，检测温度为25℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为10s，工作电压为15kv；检测频率为5Hz。
实施例5
在该实施例中，通过下列步骤测定巴氏杀菌牛乳中κ-酪蛋白含量：
(1)巴氏杀菌牛乳预处理
取30ml待测超高温灭菌牛乳，置于50ml离心管中，用40mmol/L乙酸水溶液调节pH至4.6，于6000r/min条件下离心25分钟，弃上清液，用水洗涤3次，于6000r/min条件下离心25分钟，弃上清液，然后用40mmol/L硼酸溶液调节pH至6.6，制得待测储备液。取10ml待测储备液，添加3.6g尿素，0.05g二硫苏糖醇(DTT)、振荡、混匀制得待测液。
(2)未涂层毛细管的活化
截取内径为25μm，总长度为700mm，有效长度为600mm的未涂层石英毛细管柱，用甲醇(色谱级)冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/LNaOH冲洗10min，静置10min，去离子水冲洗10min。
(3)涂层处理
按照实施例1的涂层处理步骤进行处理。
(4)毛细管电泳检测
进行毛细管电泳检测，并基于检测结果确定巴氏杀菌牛乳中κ-酪蛋白含量。其中，毛细管电泳检测条件为：检测波长为200nm，检测温度为20℃，进样方式为压力进样，压力为1psi，进样时间为5s，工作电压为20kv；检测频率为10Hz。
实施例6
按照实施例1测定生牛乳中κ-酪蛋白含量的方法对生牛乳中κ-酪蛋白含量进行测定，区别在于，
(4)毛细管电泳检测
进行毛细管电泳检测，并基于检测结果确定生牛乳中κ-酪蛋白含量。其中，毛细管电泳检测条件为：检测波长为200nm，检测温度为25℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为15s，工作电压为30kv；检测频率为5Hz。
对比例1
按照实施例1的方法测定生牛乳中κ-酪蛋白含量，区别在于，直接采用未涂层毛细管进行毛细管电泳检测。
对比例2
按照实施例1的方法测定生牛乳中κ-酪蛋白含量，区别在于，在步骤(4)中，工作电压为5kV。
对比例3
按照实施例1的方法测定生牛乳中κ-酪蛋白含量，区别在于，不添加尿素和二硫苏糖醇，直接用待测储备液进行检测。
对比例4
按照实施例1的方法测定生牛乳中κ-酪蛋白含量，区别在于，在步骤(1)中，生牛乳不进行离心，直接置于-40℃冰箱中冷冻20分钟。
实施例7
按照如下步骤建立κ-酪蛋白含量的标准曲线：
(1)分别将κ-酪蛋白标准品稀释成浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml以及4mg/ml的样品。
(2)按照实施例1的方法对未涂层毛细管柱进行活化以及涂层处理，并采用毛细管电泳分别检测0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml以及4mg/ml的样品。
图4-8分别显示了浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml以及4mg/ml的样品检测图谱，通过峰面积与样品中κ-酪蛋白含量的线性关系得到了如图9所示的κ-酪蛋白含量的标准曲线。标准曲线的线性回归方程相关系数＞0.99，其线性范围在0.25mg/ml～4mg/ml，最低检出限为0.01μg，最低检出限含量为0.25mg/ml，标准品回收率达90％。可以有效检测出样品中κ-酪蛋白的含量。
实施例8
根据实施例7中得到的峰面积-κ-酪蛋白浓度计算出实施例1～6以及对比例1～4的样品中κ-酪蛋白含量，如表1所示。实施例1～6的方法能够准确测定出κ-酪蛋白含量。
表1 κ-酪蛋白含量
另外，图10显示了实施例1和对比例1的方法测定κ-酪蛋白含量的图谱。可以看出，经涂层处理的毛细管的分离效果明显好于未涂层的毛细管，而且基线也较为平缓，这是因为毛细管内壁的硅羟基在被氢氧化钠活化后容易吸附蛋白质而导致样品无法彻底分离，同时出现不同程度的电渗流而导致基线不平。
图11显示了实施例1和对比例2的方法测定κ-酪蛋白含量的图谱。可以看出，在高电压下κ-酪蛋白分子迁移速度加快以致分离速度提升。
图12显示了实施例1和对比例3的方法测定κ-酪蛋白含量的图谱。尿素和二硫苏糖醇(DTT)在样品处理和缓冲溶液中主要起到将酪蛋白胶束彻底分离和防止各酪蛋白分子重新聚合在一起的作用，由图可以看出，添加了尿素和二硫苏糖醇的图谱，各酪蛋白之间实现了有效的分离。
图13显示了实施例1和对比例4的方法测定κ-酪蛋白含量的图谱。离心的目的主要是去除乳脂肪，因为乳脂肪可以很好的吸附于毛细管内壁表面而导致毛细管内部无法形成双电层，最终无法实现蛋白的有效分离，同时乳脂肪还容易导致毛细管阻塞而影响分离。图中可以看出，不进行离心处理，得到的图谱中没有明显的κ-酪蛋白的峰，不能实现有效地分离。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“另一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (11)
1.一种用于对毛细管进行涂层处理的试剂，所述毛细管用于通过毛细管电泳法测定牛乳中κ-酪蛋白含量，所述试剂是含有下列的水溶液：
200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；
120mmol/L的十六烷基溴化铵；
80mmol/L的聚乙二醇；和
60mmol/L的戊二胺，其中，
所述试剂的pH值为8.5。
2.一种测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法，其特征在于，包括：
(1)采用毛细管电泳法对所述牛乳进行检测，其中，所述毛细管电泳法采用预先利用权利要求1所述的试剂进行涂层处理的毛细管；
(2)基于步骤(1)中所得到的毛细管电泳结果，确定所述牛乳中的κ-酪蛋白含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述涂层处理包括：
(1)涂层处理试剂的配制：用去离子水准确配制100ml涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.5；
(2)缓冲溶液的配制：用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，其中各成分及其浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/LNaOH调节pH至8.5；
(3)涂层的形成：用浓度为0.1～0.5mol/L的NaOH冲洗毛细管内壁3～5分钟，并用去离子水冲洗3～5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗3-10分钟，静置5-10分钟，再用缓冲溶液冲洗3-5分钟，将上述涂层的形成步骤循环2-5次。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述毛细管预先经过活化处理，所述活化处理包括：
(1)将毛细管用色谱级甲醇冲洗5～20分钟，并用去离子水冲洗5～20分钟；
(2)将经过步骤(1)处理得到的毛细管用1～4mol/L NaOH冲洗5～20分钟，静置5～30分钟；以及
(3)将经过步骤(2)处理得到的毛细管用去离子水冲洗5～20分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，所述牛乳包括选自生牛乳、超高温灭菌牛乳以及巴氏灭菌牛乳的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，所述采用毛细管电泳法进行检测前，预先将所述牛乳进行预处理，所述预处理包括：
(1)将所述牛乳用乙酸调节pH值，离心并弃上清，并用水洗涤沉淀3～5次，离心，收集沉淀；
(2)将步骤(1)所得到的沉淀用硼酸调节pH值；以及
(3)取步骤(2)所得到的混合物10mL，添加尿素以及二硫苏糖醇，振荡混匀，并静置处理，以便得到待测液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
在步骤(1)中，用浓度为30～80mmol/L的所述乙酸调节pH值至4.6；
在步骤(2)中，用浓度为20～70mmol/L的所述硼酸调节pH值至6.6；
所述尿素浓度为6mol/L，添加量为3.6克，所述二硫苏糖醇的添加量为0.05克，
所述静置时间为10分钟。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，针对所述生牛乳，所述预处理进一步包括：
将所述生牛乳用乙酸调节pH值之前，预先将所述生牛乳离心，并进行冷冻处理，
所述离心是在3000～10000r/min的转速下进行10～30分钟；
所述冷冻处理是在-40摄氏度的温度下进行10～30分钟。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述待测液进行所述毛细管电泳法检测前，预先将所述待测液中κ-酪蛋白的浓度调节至0.25～4mg/ml。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳法测定是按照下列条件进行的：
毛细管的内径为25-75μm、总长度为200-900mm、有效长度为100-800mm；
检测波长为200-450nm；
检测温度为15-40℃；
进样方式为压力进样或真空进样；
压力为0-1psi；
进样时间为1s-20s；
工作电压为7-30kv；以及
检测频率为5-18Hz。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，
所述检测温度25℃；
所述毛细管的内径为25-75μm、总长度为600mm；
所述进样方式为压力进样；
所述压力为0.5psi；
所述进样时间为10s-20s；以及
所述工作电压为20-30kv。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |