CN110346443B - 检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法 - Google Patents

检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测牛乳中A2β‑酪蛋白含量的方法。该方法包括：将牛乳进行冷却离心处理，以便得到待测储备液；利用样品稀释液对所述待测储备液进行稀释处理，以便得到稀释后的储备液，其中，所述样品稀释液含有5‑15mmol/L磷酸二氢钠浓度、100‑150mmol/L三羟甲基氨基甲烷、6‑10mol/L尿素、30‑50mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.05‑0.15％二硫苏糖醇，且所述样品稀释液的pH值为7.5‑8.6；以及利用毛细管电泳法对所述稀释后的储备液进行检测，以便确定所述牛乳中A2β‑酪蛋白含量。该方法能对A2β‑酪蛋白进行定量检测，并且，特异性好、准确度高、检测时间短、操作简单、重复性好。

Description

检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法
技术领域
本发明涉及食品领域，具体地，涉及检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法。
背景技术
牛奶中的乳蛋白质主要包括酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白约占牛乳蛋白的80％，主要包括α-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白三种类型。其中β酪蛋白占蛋白质总量的25％-30％，是氨基酸的重要来源。β-酪蛋白的多态性比较复杂，目前已检测到的遗传变异体有A1，A2，A3，A4，B，C，D等共13种。他们的区别是组成这种蛋白质的209个氨基酸的其中一个或几个氨基酸的不同。A1和A2型β-酪蛋白是奶牛群体中最常见的两种。其区别在于β-酪蛋白基因发生了一个碱基变化，从而导致相应位置氨基酸发生了变化，A1β-酪蛋白的氨基酸链第67位是组氨酸(Histidine)，A2β-酪蛋白的氨基酸链第67位是脯氨酸(Proline)。
A1和A2型β-酪蛋白是牛乳β-酪蛋白中最常见的两种，有研究表明，A1型β-酪蛋白的水解产物BCM-7对肠道炎症、呼吸系统炎症、消化系统等方面有着不良影响。而A2型β-酪蛋白由于不产生BCM-7，蛋白安全性更高，在结构和消化特点方面与母乳中的β-酪蛋白也更为接近。目前，西方的奶牛经筛选鉴定，只有约30％是纯正的A2奶牛，足见其珍贵性。国内外学者对A1型和A2型β-酪蛋白的关注也越来越多，相关研究日渐深入。因此，准确检测出牛乳中A2β-酪蛋白的含量，具有十分重要的意义。
目前，国内尚未有A2β-酪蛋白含量检测方法的国家标准和行业标准。相关国际标准有DIN－10470－1999《牛奶和牛奶制品的全部蛋白质中乳蛋白含量和酪蛋白含量测定》以及DIN－10472－1996《牛奶和乳制品总蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量测定－电泳法》。虽然一些专利公开了β-酪蛋白的检测方法，例如申请号为200810146950.X的《一种乳中β-酪蛋白含量的检测方法》以及申请号为201610784180.6的《检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法》，但这些国际标准及专利只是对牛乳中总蛋白及总酪蛋白的含量进行测定或者对牛乳中A2β-酪蛋白进行定性检测，无法实现对牛乳中A2β-酪蛋白进行定量检测。
由此，对A2β-酪蛋白进行定量检测的方法有待研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，该方法能对A2β-酪蛋白进行特异性检测，并且检测时间短、操作简单、重复性好、准确度高。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将牛乳进行冷却离心处理，以便得到待测储备液；利用样品稀释液对所述待测储备液进行稀释处理，以便得到稀释后的储备液，其中，所述样品稀释液含有5-15mmol/L磷酸二氢钠浓度、100-150mmol/L三羟甲基氨基甲烷、6-10mol/L尿素、30-50mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.05-0.15％二硫苏糖醇，且所述样品稀释液的pH值为7.5-8.6；以及利用毛细管电泳法对所述稀释后的储备液进行检测，以便确定所述牛乳中A2β-酪蛋白含量。
由于牛乳中含有大量的脂肪，脂肪结合在蛋白质的表面影响蛋白质的分散，现有技术中通常先加热，再对牛乳进行离心，去除牛乳中的脂肪。但发明人在研究中意外发现，在使用实验室台式或立式离心机脱脂时，将牛乳先冷却再离心，不仅牛乳中脂肪的去除率更好，而且低温还可以有效促进A2β-酪蛋白的分离。一方面，适当的低温条件不仅可以抑制嗜热脂肪酶的活力，防止牛乳脂肪被分解成游离脂肪酸，还可以促使牛乳脂肪球发生冷凝聚集，离心除脂率更高。另一方面，牛乳在离心之前进行降温处理，可以避免乳清蛋白在酪蛋白胶束表面形成二硫键，减弱乳蛋白中疏水基团之间的相互作用，从而防止乳清蛋白与酪蛋白之间发生聚合。有利于酪蛋白的分散，进而促进A2β-酪蛋白的分离及含量检测。在此基础上，发明人针对A2β-酪蛋白蛋白的空间构象和理化性质，进一步对样品稀释液的配方进行了优化，加入稀释液后，又对样品进行一定程度的加热处理，由于样品缓冲液的作用，乳清蛋白与酪蛋白不再发生聚合，而β-酪蛋白和αs-酪蛋白、κ-酪蛋白之间的离解程度却能有效增强，从而在最大程度上促使A2β-酪蛋白与其它蛋白质的分离，使A2β-酪蛋白不仅实现定性检测，而且可以定量测量。并且，该方法特异性好、准确度高、检测时间短、操作简单、重复性好。
另外，根据本发明上述实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述低温离心处理包括：将所述牛乳在0-10摄氏度条件下静置0.5-2小时，以便得到冷却的牛乳；以及将所述冷却的牛乳在4000-8000r/min条件下离心10-30min，以便得到所述待测储备液。由此，牛乳的脂肪去除率高。
根据本发明的实施例，所述样品稀释液含有8-10mmol/L磷酸二氢钠浓度、110-130mmol/L三羟甲基氨基甲烷、7-9mol/L尿素、40-50mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.08-0.12％二硫苏糖醇，且所述样品稀释液的pH值为7.8-8.2。由此，A2β-酪蛋白的分散效果好。
根据本发明的实施例，所述样品稀释液与所述待测储备液按体积比1-6：1进行所述稀释处理。由此，A2β-酪蛋白的检测浓度适宜，检测准确度高。
根据本发明的实施例，所述稀释后的储备液的pH值为6.5-8.5，温度为30-50摄氏度。由此，β-酪蛋白和αs-酪蛋白、κ-酪蛋白之间的离解程度高，A2β-酪蛋白分离效果好。
根据本发明的实施例，所述毛细管电泳法是采用溶胶-凝胶毛细管进行的。由此，防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，提高检测的准确性和重复性。
根据本发明的实施例，制备所述溶胶-凝胶毛细管的方法包括：将预处理的毛细管分别利用水、酸溶液和碱溶液进行清洗处理，以便得到清洗后的毛细管；将所述清洗后的毛细管在溶胶溶液中浸洗10-50分钟后，再静置10-30分钟，以便得到浸洗后的毛细管；将所述浸洗后的毛细管利用丙酮进行第一冲洗处理，以便得到第一冲洗后的毛细管；将所述第一冲洗后的毛细管进行干燥处理，以便得到干燥后的毛细管；以及将所述干燥后的毛细管进行第二冲洗处理，以便得到所述溶胶-凝胶毛细管。由此，防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，提高检测的准确性和重复性。
根据本发明的实施例，所述干燥处理是以0.5-2℃/min的速度升温至80-150℃后，烘干0.5-2h。由此，膜层内外应力均匀，溶胶-凝胶涂层光滑、平整、无裂痕和凹陷。
根据本发明的实施例，所述溶胶溶液包括：450-950μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷；以及50-250μL PH值为2.5-4.5的乙酸溶液。由此，有效避免蛋白质在毛细管内壁的吸附，检测的准确性和重复性更好。
根据本发明的实施例，所述毛细管电泳法采用的电泳缓冲液包括：0.1-0.2mol/L磷酸；10-30mmol/L磷酸二氢钠；6-10mol/L尿素；0.05-0.15％羟乙基甲基纤维素，且pH值为2.0-5.0。由此，A1和A2β-酪蛋白的电泳分离度好，响应值高。
根据本发明的优选实施例，所述毛细管电泳法采用的电泳缓冲液包括：0.15mol/L磷酸；20mmol/L磷酸二氢钠；6-10mol/L尿素；0.05-0.15％羟乙基甲基纤维素，且pH值为2.0-5.0。由此，A1和A2β-酪蛋白的电泳分离度更佳，响应值显著提高。
根据本发明的优选实施例，该方法进一步包括：利用所述样品稀释液对A2β-酪蛋白标准品进行梯度稀释，以便得到不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液；利用毛细管电泳法对所述不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液进行检测，以便得到A2β-酪蛋白的浓度-峰面积关系曲线；以及基于所述A2β-酪蛋白的浓度-峰面积关系曲线，以便确定所述牛乳中A2β-酪蛋白含量。由此，利用标准曲线准确测量A2β-酪蛋白的含量。
根据本发明的优选实施例，所述毛细管电泳法的检测条件包括：检测波长为150-350纳米，优选地，为214nm；检测温度为15-35℃；采用压力进样，进样压力为0.2-1psi，优选地，为0.5psi，进样时间为5-20s；工作电压为20-30kv；检测频率为4-16Hz。由此，检测的灵敏度和准确度高。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的制备该溶胶-凝胶毛细管的方法的流程示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的图谱检测结果示意图；
图4显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图5显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图6显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图7显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图8显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图9显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图10显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图；
图11显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图。
图12显示了根据本发明又一个实施例的图谱检测结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法。由于牛乳中含有大量的脂肪，脂肪结合在蛋白质的表面影响蛋白质的分散，现有技术中通常先加热，再对牛乳进行离心，去除牛乳中的脂肪。但发明人在研究中意外发现，在使用实验室台式或立式离心机脱脂时，将牛乳先冷却再离心，不仅牛乳中脂肪的去除率更好，而且低温还可以有效促进A2β-酪蛋白的分离。一方面，适当的低温条件不仅可以抑制嗜热脂肪酶的活力，防止牛乳脂肪被分解成游离脂肪酸，还可以促使牛乳脂肪球发生冷凝聚集，离心除脂率更高。另一方面，牛乳在离心之前进行降温处理，可以避免乳清蛋白在酪蛋白胶束表面形成二硫键，减弱乳蛋白中疏水基团之间的相互作用，从而防止乳清蛋白与酪蛋白之间发生聚合。有利于酪蛋白的分散，进而促进A2β-酪蛋白的分离及含量检测。在此基础上，发明人针对A2β-酪蛋白蛋白的空间构象和理化性质，进一步对样品稀释液的配方进行了优化，加入稀释液后，又对样品进行一定程度的加热处理，由于样品缓冲液的作用，乳清蛋白与酪蛋白不再发生聚合，而β-酪蛋白和αs-酪蛋白、κ-酪蛋白之间的离解程度却能有效增强，从而在最大程度上促使A2β-酪蛋白与其它蛋白质的分离，使A2β-酪蛋白不仅实现定性检测，而且可以定量测量。并且，该方法特异性好、准确度高、检测时间短、操作简单、重复性好。
参考图1，根据本发明的实施例，对检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法进行解释说明，该方法包括：
S100冷却离心
根据本发明的实施例，将牛乳进行冷却离心处理，得到待测储备液。由于牛乳中含有大量的脂肪，脂肪结合在蛋白质的表面影响蛋白质的分散，现有技术中通常先加热，再对牛乳进行离心，本领域技术人员通常认为加热有利于去除牛乳中的脂肪，提高脂肪的去除率。但发明人在研究中意外发现，将牛乳先冷却再离心，不仅牛乳中脂肪的去除率更好，而且低温还能有效避免乳清蛋白在酪蛋白胶束表面形成二硫键，减弱乳蛋白中疏水基团之间的相互作用，从而防止乳清蛋白与酪蛋白之间发生聚合，有利于酪蛋白的分散，进而促进A2β-酪蛋白的分离及含量检测。
根据本发明的实施例，该低温离心处理包括：将牛乳在0-10摄氏度条件下静置0.5-2小时，得到冷却的牛乳；将冷却的牛乳在4000-8000r/min条件下离心10-30min，得到待测储备液。发明人发现，先在0-10摄氏度条件下将牛乳进行冷却，使脂肪球凝结聚集，脂肪球凝结聚集后更易于与蛋白分离，再对冷却的牛乳进行离心，在4000-8000r/min条件下离心10-30min，凝聚的脂肪球与蛋白分离效果好，牛乳的脂肪去除率高，使牛乳中A2β-酪蛋白能够更好的与其它蛋白质分离开，有利于A2β-酪蛋白进行定量测量。
其中，用于进行该离心处理的离心机的类型不受特别的限制，本领域技术人员可以根据生产条件和处理量等进行自行选择，优选地，可以是台式或立式离心机，管式离心机，牛乳的脂肪去除率更高。
S200稀释处理
根据本发明的实施例，利用样品稀释液对待测储备液进行稀释处理，得到稀释后的储备液，其中，该样品稀释液含有5-15mmol/L磷酸二氢钠浓度、100-150mmol/L三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、6-10mol/L尿素、30-50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)和0.05-0.15％二硫苏糖醇，且该样品稀释液的pH值为7.5-8.6。发明人针对A2β-酪蛋白蛋白的空间构象和理化性质，进一步对样品稀释液的配方进行了优化，其中，TRIS是一种很好的蛋白质溶剂，能使蛋白质更好的分散溶解；而EDTA-2Na络合金属离子，能有效控制蛋白质聚合，通过TRIS和EDTA-2Na间的协同作用，能使乳中蛋白质彻底分离。并且，TRIS的浓度为100-150mmol/L，EDTA-2Na的浓度为30-50mmol/L，使样品稀释液的pH值适宜，稳定性好，蛋白分散效果更好。尿素能有效地破坏非共价键结合的蛋白质，同时破坏蛋白质分子内部的疏水键，合理的尿素浓度能提高蛋白质的可溶性；二硫苏糖醇则用于蛋白质中二硫键的还原，阻止蛋白质中半胱氨酸之间形成分子内或分子间二硫键。当样品稀释液的二硫苏糖醇浓度为0.05-0.15％，尿素浓度为6-10mol/L时，通过尿素和二硫苏糖醇之间的协同作用，使牛乳中A2β-酪蛋白能够更好的与其它蛋白质分离开。当样品稀释液的pH值为7.5-8.6时，蛋白质分子内部的疏水键和二硫键键力相对较弱，此时，样品稀释液各组分能更好的发挥协同作用，表现为A2β-酪蛋白的蛋白峰值更高，且图谱清晰，分离效果更好，使A2β-酪蛋白不仅实现定性检测，而且可以定量测量。
进一步地，根据本发明的优选实施例，样品稀释液含有8-10mmol/L磷酸二氢钠浓度、110-130mmol/L三羟甲基氨基甲烷、7-9mol/L尿素、40-50mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.08-0.12％二硫苏糖醇，且所述样品稀释液的pH值为7.8-8.2。通过对样品稀释液的配方进行进一步优化，A2β-酪蛋白的分散效果更好。
根据本发明的一些实施例，利用氢氧化钠调节样品稀释液的pH值。由此，蛋白分离的效果好，灵敏度高。
根据本发明的优选实施例，利用0.45μm水系滤膜对样品稀释液进行过滤后，超声。由此，去除样品稀释液中的杂质，防止杂质影响检测结果，再通过超声使样品稀释液的成份均一、稳定。
根据本发明的实施例，样品稀释液与待测储备液按体积比1-6：1进行所述稀释处理。具体地，该稀释处理可以按如下步骤进行操作：取1ml待测液，按1：1-6的比例加入样品缓冲液，漩涡震荡3min，并使用0.1mol/L NaOH调节PH值至6.5-8.5，迅速加热至30-50℃，恒温保持10-50min，随后使用0.45μm水系滤膜过滤，制得待测样品稀释溶液。由此，稀释后的储备液中A2β-酪蛋白的浓度适宜，通过标准曲线可以准确确认样品稀释液中的A2β-酪蛋白的浓度，并且，当稀释后的储备液的PH值为6.5-8.5，温度为30-50℃时，β-酪蛋白和αs-酪蛋白、κ-酪蛋白之间的离解程度有效增强，从而在最大程度上促进A2β-酪蛋白与其它蛋白质的分离，使A2β-酪蛋白不仅实现定性检测，而且可以定量测量。蛋白的吸光值更高，分离效果更好。
S300检测处理
根据本发明的实施例，利用毛细管电泳法对稀释后的储备液进行检测，确定牛乳中A2β-酪蛋白含量。毛细管电泳法不仅检测准确度高，而且，方法简单，成本低。
根据本发明的实施例，毛细管电泳法既可以采用未涂层毛细管，也可以采用溶胶-凝胶毛细管。其中，未涂层毛细管分离时间短，检测成本低。但未涂层的毛细管内壁的硅羟基在被氢氧化钠活化后容易吸附蛋白质，无法形成双电层而导致样品无法彻底分离，同时出现不同程度的电渗流而导致毛细管电泳的基线不平。为了提高毛细管电泳的准确性，发明人采用溶胶-凝胶毛细管进行毛细管电泳。由此，溶胶-凝胶涂层可以防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，提高检测的准确性和重复性。
需要说明的是，在进行毛细管电泳前，可以对未涂层毛细管进行预处理，该预处理包括截取内径为25-75μm，总长度为402-700mm，有效长度为300-600mm的未涂层石英毛细管柱装入卡盒，然后，0.1-1mol/L乙酸浸洗5-15min、0.1-1mol/L HNO3浸洗3-10min，去离子水冲洗3-10min，乙腈冲洗5-20min，取出毛细管置于50℃真空恒温干燥箱中过夜。由此，毛细管的内径和长度适宜，如果毛细管长度过长，使检测时间过长，检测效率较低。并且，利用乙酸、HNO3、去离子水和乙腈进行冲洗，去除毛细管内壁的杂质，防止这些杂质影响后续的检测，使检测的灵敏度和精确度更高。
参考图2，根据本发明的实施例，对制备该溶胶-凝胶毛细管的方法进行解释说明，该方法包括：
S310清洗处理
根据本发明的实施例，将预处理的毛细管分别利用水、酸溶液和碱溶液进行清洗处理，得到清洗后的毛细管。其中，水、酸溶液和碱溶液的清洗顺序和清洗次数不受特别的限制，可以根据情况自由选择，例如，可以先水清洗，再酸溶液和碱溶液清洗，然后在水清洗，也可以先水清洗，分别酸溶液、水、碱溶液清洗后，再水清理。例如，用1mol/L NaOH冲洗30min、去离子水冲洗10min、1mol/L HCl冲洗10min，再用去离子水冲洗5min。由此，充分去除毛细管内壁的附着物，减少A2β-酪蛋白的检测干扰，使检测的准确度和重复性更好。
S320溶胶浸洗
根据本发明的实施例，将清洗后的毛细管在溶胶溶液中浸洗10-50分钟后，再静置10-30分钟，得到浸洗后的毛细管。由此，使溶胶均匀附着在毛细管内壁上，防止蛋白质吸附在毛细管壁上，影响测量结果。
根据本发明的实施例，该溶胶溶液包括：450-950μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷和50-250μL PH值为2.5-4.5的乙酸溶液。发明人经过大量实验发现，检测不同蛋白质所用的溶胶溶液的配方有所不同，该配方并不具有普遍适用性，发明人针对A2β-酪蛋白的空间构象和理化性质，经过大量实验筛选得到溶胶溶液的最优组成成分，γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷是一种性能优良的硅烷偶联剂，在适宜浓度乙酸的催化水解作用下，能在未涂层毛细管内壁形成一层致密的、覆盖性能和粘附性能良好的钝化膜，该配方的溶胶可以使未涂层毛细管内壁的硅羟基充分钝化，有效避免蛋白质在毛细管内壁的吸附，避免毛细管堵塞，检测峰的峰值和出峰时间更稳定，检测的准确性和重复性更好。
S330第一冲洗
根据本发明的实施例，将浸洗后的毛细管利用丙酮进行第一冲洗处理，得到第一冲洗后的毛细管。一般情况下，丙酮试剂冲洗10-50min即可。由此，利用丙酮去除未吸附的溶胶，防止溶胶影响后续的检测。
S340干燥处理
根据本发明的实施例，将第一冲洗后的毛细管进行干燥处理，以便得到干燥后的毛细管。由此，通过干燥处理，使冲洗后残留在毛细管上的丙酮挥发，避免丙酮影响后续检测的准确性。
根据本发明的一些实施例，该干燥处理可以是缓慢升温干燥。根据本发明的优选实施例，该干燥处理以0.5-2℃/min的速度升温至80-150℃后，烘干0.5-2h。由此，溶胶-凝胶涂层光滑、平整，无裂缝和空穴塌陷，蛋白出峰面积大，出峰速度适宜。如果温度升高的速度过快，可能导致涂层内外应力不均而产生开裂，或涂层表面空穴塌陷，造成管内壁不光滑，蛋白吸附，表现为蛋白出峰面积降低，出峰速率减慢。
S350第二冲洗
根据本发明的实施例，将干燥后的毛细管进行第二冲洗处理，得到溶胶-凝胶毛细管。由此，进一步去除溶胶-凝胶毛细管的化学物质，提高检测的准确性和重复性。
根据本发明的实施例，该毛细管电泳法采用的电泳缓冲液包括：0.1-0.2mol/L磷酸、10-30mmol/L磷酸二氢钠、6-10mol/L尿素和0.05-0.15％羟乙基甲基纤维素，且pH值为2.0-5.0。由此，缓冲液的稳定性好，缓冲能力强，使电泳两极的pH保持基本不变，并且，该pH值条件下，羟乙基甲基纤维素磷酸盐水溶液表面活性高，是一种良好的蛋白分散剂，配合尿素对蛋白非共价键的破坏作用，使A2β-酪蛋白与其它蛋白，尤其是相近的A1β-酪蛋白等的电泳分离度好，响应值高。根据本发明的优选实施例，毛细管电泳法采用的电泳缓冲液包括：0.15mol/L磷酸；20mmol/L磷酸二氢钠；6-10mol/L尿素；0.05-0.15％羟乙基甲基纤维素，且pH值为2.0-5.0。由此，A2β-酪蛋白的电泳分离度更佳，响应值显著提高。
根据本发明的优选实施例，利用0.45μm水系滤膜对电泳缓冲液进行过滤后，超声。由此，去除电泳缓冲液中的杂质，防止杂质影响检测结果，再通过超声使电泳缓冲液的成份均一稳定。
根据本发明的优选实施例，该方法进一步包括：利用样品稀释液对A2β-酪蛋白标准品进行梯度稀释，得到不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液；利用毛细管电泳法对不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液进行检测，得到A2β-酪蛋白的浓度-峰面积关系曲线；基于A2β-酪蛋白的浓度-峰面积关系曲线，确定所述牛乳中A2β-酪蛋白含量。由此，利用标准曲线准确测量A2β-酪蛋白的含量。由此，通过标准曲线，根据稀释后的储备液的检测结果计算牛乳中，A2β-酪蛋白的含量。
具体地，根据本发明的实施例，A2β-酪蛋白标准品的浓度梯度可以为2g/100g、1g/100g、0.5g/100g、0.25g/100g、0.125g/100g和0.0625g/100g。由此，与稀释后的储备液中的A2β-酪蛋白的含量范围相近，使A2β-酪蛋白的计算更准确。
根据本发明的优选实施例，该毛细管电泳法的检测条件可以包括：检测波长为150-350纳米，优选地，为214nm；检测温度为15-35℃；采用压力进样，进样压力为0.2-1psi，优选地，为0.5psi，进样时间为5-20s；工作电压为20-30kv；检测频率为4-16Hz。由此，检测的灵敏度和准确度高。发明人经过大量实验优化得到最优检测条件，利用该方法能够有效地特异地检出A2β-酪蛋白。电压过小，检测时间过长，检测效率较低，电压时间过长，将产生一定的焦耳热，对检测结果造成影响。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中A2β-酪蛋白的含量，且操作简便、快速。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1
利用本发明实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，对生牛乳中A2β-酪蛋白含量进行检测，具体方法如下：
1、样品缓冲溶液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别如下：磷酸二氢钠浓度为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)为120mmol/L、尿素(UREA)为8mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)为45mmol/L、二硫苏糖醇(DTT)为0.1％，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
2、电泳缓冲溶液的配制：
用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，使得各成分浓度达到如下：磷酸0.15mol/L、磷酸二氢钠20mmol/L，尿素(UREA)8mol/L，羟乙基甲基纤维素(MHEC)0.05％，用0.5mol/L磷酸溶液调节pH至2.2，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
3、牛乳样品前处理过程：
(1)取20ml牛乳样品置于4℃条件下恒温保持1h，然后取出于5600r/min条件下离心15min，以除去乳中脂肪，制得待测牛乳储备液；
(2)取1ml待测牛乳储备液，按1：4的比例加入样品缓冲液，漩涡震荡3min，并使用0.1mol/L NaOH调节PH值至8.0，迅速加热至35℃，恒温保持30min，随后使用0.45μm水系滤膜过滤，制得待测样品稀释溶液。
4、形成毛细管的溶胶-凝胶涂层
(1)未涂层毛细管预处理过程：截取内径为50μm，总长度为602mm，有效长度为500mm的未涂层石英毛细管柱装入卡盒，1mol/L乙酸浸洗10min、0.1mol/LHNO3浸洗5min，去离子水冲洗5min，乙腈冲洗10min，取出毛细管置于50℃真空恒温干燥箱中过夜，得到预处理后的毛细管。
(2)未涂层毛细管溶胶-凝胶涂层过程
①毛细管内壁清洗：将预处理后的毛细管用1mol/LNaOH冲洗30min、去离子水冲洗10min、1mol/LHCl冲洗10min，再用去离子水冲洗5min，得到清洗后的毛细管。
②溶胶溶液的制备：将850μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)与150μL预先调节PH值到3.0的乙酸溶液混合，漩涡振荡20min，置于4℃冰箱中备用。
③溶胶-凝胶涂层：将清洗好的毛细管用制备好的溶胶溶液浸洗20min，室温下静置20min，再用丙酮试剂冲洗30min，取出毛细管以1℃/min的速度升温至120℃烘干1h，最后经样品缓冲液冲洗10min即可使用。
5、检测设备及参数设定：
采用高效毛细管电泳仪(BECKMAN，P/ACE MDQ plus)进行检测，检测参数如下：检测波长为214nm，检测温度为25℃，毛细管柱直径为50μm，长度为600mm，压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为10s，工作电压为25kv；检测频率为8Hz。
6、标准曲线的绘制及样品的测定
(1)A2β-酪蛋白标准溶液的配制：将A2β-酪蛋白标准品与样品缓冲溶液混合，准确配制2g/100g的A2β-酪蛋白标准品储备液；依次梯度稀释至2g/100g、1g/100g、0.5g/100g、0.25g/100g、0.125g/100g、0.0625g/100g。
(2)标准曲线的绘制：将不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液依次上样，标定A2β-酪蛋白的出峰时间，并按浓度从大到小积分计算出不同浓度下的峰面积依次为1072182、539006、284672、130666、64451、39725，建立A2β-酪蛋白浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线为y＝5.35E+5x+3920，其线性相关系数为0.9997，线性范围为0.0625～2g/100g，最低检出限为0.0078g/100g，定量限为0.03125g/100g，样品加标回收率达95％～105％，详见图3。
(3)样品中A2β-酪蛋白含量的测定：将制得的待测样品稀释液重复多次进样，按标定好的出峰时间找到A2β-酪蛋白，积分计算出A2β-酪蛋白出峰面积平均值为603120，带入标准曲线计算得生牛乳中A2β-酪蛋白含量为1.12g/100g，详见图4。
实施例2：检测生牛乳中A2β-酪蛋白的含量
利用本发明实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，对生牛乳中A2β-酪蛋白含量进行检测，具体方法如下：
1样品缓冲溶液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别如下：磷酸二氢钠浓度为5mmol/L、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)100mmol/L、尿素(UREA)6mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)30mmol/L、二硫苏糖醇(DTT)0.15％，用0.1mol/LNaOH调节pH值至7.5，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
2电泳缓冲溶液的配制：
用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，使得各成分浓度达到如下：磷酸0.15mol/L、磷酸二氢钠20mmol/L，尿素(UREA)6mol/L，羟乙基甲基纤维素(MHEC)0.15％，用0.5mol/L磷酸溶液调节pH至3.0，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
3牛乳样品前处理过程：
(1)取20ml牛乳样品置于1℃条件下恒温保持1h，然后取出于4000r/min条件下离心30min，以除去乳中脂肪，制得待测牛乳储备液；
(2)取1ml待测牛乳储备液，按1：2的比例加入样品缓冲液，漩涡震荡3min，并使用0.1mol/L NaOH调节PH值至6.5，迅速加热至50℃，恒温保持10min，随后使用0.45μm水系滤膜过滤，制得待测样品稀释溶液。
4、形成毛细管的溶胶-凝胶涂层
(1)未涂层毛细管预处理过程：截取内径为25μm，总长度为700mm，有效长度为600mm的未涂层石英毛细管柱装入卡盒，0.1mol/L乙酸浸洗15min、0.5mol/LHNO3浸洗10min，去离子水冲洗3min，乙腈冲洗20min，取出毛细管置于50℃真空恒温干燥箱中过夜，得到预处理后的毛细管。
(2)未涂层毛细管溶胶-凝胶涂层过程
①毛细管内壁清洗：将预处理后的毛细管用1mol/L NaOH冲洗30min、去离子水冲洗10min、1mol/L HCl冲洗10min，再用去离子水冲洗5min，得到清洗后的毛细管。
②溶胶溶液的制备：将450μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)与50μL预先调节PH值到2.5的乙酸溶液混合，漩涡振荡10min，置于4℃冰箱中备用。
③溶胶-凝胶涂层：将清洗好的毛细管用制备好的溶胶溶液浸洗10min，室温下静置30min，再用丙酮试剂冲洗10min，取出毛细管以0.5℃/min的速度升温至80℃烘干2h，最后经样品缓冲液冲洗10min即可使用。
5、检测设备及参数设定：
采用高效毛细管电泳仪(BECKMAN，P/ACE MDQ plus)进行检测，检测参数如下：检测波长为214nm，检测温度为35℃，毛细管柱直径为50μm，长度为600mm，压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为5s，工作电压为20kv；检测频率为4Hz。
6、样品中A2β-酪蛋白含量的测定：
将制得的待测样品稀释液重复多次进样，按标定好的出峰时间找到A2β-酪蛋白，积分计算出A2β-酪蛋白出峰面积平均值为517520，带入实施例1绘制的标准曲线计算得生牛乳中A2β-酪蛋白含量为0.96g/100g。
实施例3
利用本发明实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，对生牛乳中A2β-酪蛋白含量进行检测，具体方法如下：
1、样品缓冲溶液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别如下：磷酸二氢钠浓度为15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)150mmol/L、尿素(UREA)10mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)50mmol/L、二硫苏糖醇(DTT)0.05％，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.6，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
2电泳缓冲溶液的配制：
用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，使得各成分浓度达到如下：磷酸0.15mol/L、磷酸二氢钠20mmol/L，尿素(UREA)10mol/L，羟乙基甲基纤维素(MHEC)0.1％，用0.5mol/L磷酸溶液调节pH至5.0，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
3、牛乳样品前处理过程：
(1)取20ml牛乳样品置于10℃条件下恒温保持1h，之后取出于8000r/min条件下离心10min，以除去乳中脂肪，制得待测牛乳储备液；
(2)取1ml待测牛乳储备液，按1：6的比例加入样品缓冲液，漩涡震荡3min，并使用0.1mol/L NaOH调节PH值至8.5，迅速加热至30℃下恒温保持50min，随后使用0.45μm水系滤膜过滤，制得待测样品稀释溶液。
4、形成毛细管的溶胶-凝胶涂层
(1)未涂层毛细管预处理过程：截取内径为75μm，总长度为402mm，有效长度为300mm的未涂层石英毛细管柱装入卡盒，0.5mol/L乙酸浸洗5min、1mol/LHNO3浸洗3min，去离子水冲洗10min，乙腈冲洗5min，取出毛细管置于50℃真空恒温干燥箱中过夜，得到预处理后的毛细管。
(2)未涂层毛细管溶胶-凝胶涂层过程
①毛细管内壁清洗：将预处理后的毛细管用1mol/L NaOH冲洗30min、去离子水冲洗10min、1mol/L HCl冲洗10min，再用去离子水冲洗5min，得到清洗后的毛细管。
②溶胶溶液的制备：将950μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)与250μL预先调节PH值到4.5的乙酸溶液混合，漩涡振荡30min，置于4℃冰箱中备用。
③溶胶-凝胶涂层：将清洗好的毛细管用制备好的溶胶溶液浸洗50min，室温下静置10min，再用丙酮试剂冲洗50min，取出毛细管以2℃/min的速度升温至150℃烘干0.5h，最后经样品缓冲液冲洗10min即可使用。
5检测设备及参数设定：
采用高效毛细管电泳仪(BECKMAN，P/ACE MDQ plus)进行检测，检测参数如下：检测波长为214nm，检测温度为15℃，毛细管柱直径为50μm，长度为600mm，压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为20s，工作电压为30kv；检测频率为16Hz。
6样品的测定
样品中A2β-酪蛋白含量的测定：样品中A2β-酪蛋白含量的测定：将制得的待测样品稀释液重复多次进样，按标定好的出峰时间找到A2β-酪蛋白，积分计算出A2β-酪蛋白出峰面积平均值为554970，带入实施例1绘制的标准曲线计算得生牛乳中A2β-酪蛋白含量为1.03g/100g。
实施例4
利用本发明实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，对巴氏奶中A2β-酪蛋白含量进行检测，具体方法如下：
1、样品缓冲溶液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别如下：磷酸二氢钠浓度为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)150mmol/L、尿素(UREA)6mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)50mmol/L、二硫苏糖醇(DTT)0.1％，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
2电泳缓冲溶液的配制：
按照实施例1的方法配制电泳缓冲溶液。
3牛乳样品前处理过程：
(1)取20ml牛乳样品置于4℃条件下恒温保持1h，之后取出于6500r/min条件下离心20min，以除去乳中脂肪，制得待测牛乳储备液；
(2)取1ml待测牛乳储备液，按1：4的比例加入样品缓冲液，漩涡震荡3min，并使用0.1mol/L NaOH调节PH值至8.0，迅速加热至35℃，恒温保持50min，随后使用0.45μm水系滤膜过滤，制得待测样品稀释溶液。
4、形成毛细管的溶胶-凝胶涂层：
(1)未涂层毛细管预处理过程：截取内径为50μm，总长度为700mm，有效长度为600mm的未涂层石英毛细管柱装入卡盒，1mol/L乙酸浸洗10min、0.1mol/LHNO3浸洗5min，去离子水冲洗5min，乙腈冲洗10min，取出毛细管置于50℃真空恒温干燥箱中过夜，得到预处理后的毛细管。
(2)未涂层毛细管溶胶-凝胶涂层过程
按照实施例1的涂层处理步骤进行处理。
5、检测设备及参数设定：
采用高效毛细管电泳仪(BECKMAN，P/ACE MDQ plus)进行检测；检测参数如下：检测波长为214nm，检测温度为25℃，毛细管柱直径为50μm，长度为600mm，压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为10s，工作电压为30kv；检测频率为8Hz。
6、样品的测定
样品中A2β-酪蛋白含量的测定：样品中A2β-酪蛋白含量的测定：将制得的待测样品稀释液重复多次进样，按标定好的出峰时间找到A2β-酪蛋白，积分计算出A2β-酪蛋白出峰面积平均值为571020，带入实施例1绘制的标准曲线计算得生牛乳中A2β-酪蛋白含量为1.06g/100g，详见图5。
实施例5
利用本发明实施例的检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，对UHT奶中A2β-酪蛋白含量进行检测，具体方法如下：
1、样品缓冲溶液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别如下：磷酸二氢钠浓度为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)150mmol/L、尿素(UREA)10mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)50mmol/L、二硫苏糖醇(DTT)0.15％，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，用0.45μm水系滤膜对配制好的溶液进行过滤，超声，备用。
2电泳缓冲溶液的配制：
按照实施例1的方法配制电泳缓冲溶液。
3牛乳样品前处理过程：
(1)取20ml牛乳样品置于4℃条件下恒温保持1h，之后取出于8000r/min条件下离心30min，以除去乳中脂肪，制得待测牛乳储备液；
(2)取1ml待测牛乳储备液，按1：4的比例加入样品缓冲液，漩涡震荡3min，并使用0.1mol/L NaOH调节PH值至8.5，迅速加热至35℃，恒温保持50min，随后使用0.45μm水系滤膜过滤，制得待测样品稀释溶液。
4、形成毛细管的溶胶-凝胶涂层
(1)未涂层毛细管预处理过程：截取内径为50μm，总长度为700mm，有效长度为600mm的未涂层石英毛细管柱装入卡盒，1mol/L乙酸浸洗15min、0.1mol/LHNO3浸洗10min，去离子水冲洗10min，乙腈冲洗20min，取出毛细管置于50℃真空恒温干燥箱中过夜，得到预处理后的毛细管。
(2)未涂层毛细管溶胶-凝胶涂层过程
按照实施例1的涂层处理步骤进行处理。
5、检测设备及参数设定：
采用高效毛细管电泳仪(BECKMAN，P/ACE MDQ plus)进行检测；检测参数如下：检测波长为214nm，检测温度为25℃，毛细管柱直径为50μm，长度为600mm，压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为20s，工作电压为30kv；检测频率为8Hz。
6、样品的测定
样品中A2β-酪蛋白含量的测定：样品中A2β-酪蛋白含量的测定：将制得的待测样品稀释液重复多次进样，按标定好的出峰时间找到A2β-酪蛋白，积分计算出A2β-酪蛋白出峰面积平均值为506820，带入实施例1绘制的标准曲线计算得生牛乳中A2β-酪蛋白含量为0.94g/100g，详见图6。
对比例1
该对比例中，按照实施例1的方法测定生牛乳中A2β-酪蛋白的含量，区别在于，在步骤(3)中，牛乳样品先加热至50℃，再取出于5600r/min条件下离心15min，以除去乳中脂肪，制得待测牛乳储备液。
毛细管电泳检测结果如图7所示，先加热至50℃再离心的样品，蛋白质图谱出峰时间延后，检测时间延长，出现一定数量的杂峰，且蛋白质峰宽增大，有一定的拖尾现象。结果表明，将牛乳先冷却再离心，可以防止牛乳脂肪被分解成游离脂肪酸，促使牛乳脂肪球发生冷凝聚集，牛乳脂肪的去除率更好。而且低温还可以避免乳清蛋白在酪蛋白胶束表面形成二硫键，减弱乳蛋白中疏水基团之间的相互作用，从而防止乳清蛋白与酪蛋白之间发生聚合，进而促进A2β-酪蛋白的分离。
对比例2
该对比例中，按照实施例1的方法测定生牛乳中A2β-酪蛋白的含量，区别在于，在步骤(1)中，不向样品缓冲液中加入三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。
毛细管电泳检测结果如图8所示，不添加TRIS和EDTA-2Na的样品，蛋白质图谱无法实现有效分离。结果表明，TRIS是一种很好的蛋白质溶剂，能使蛋白质更好的分散溶解，EDTA-2Na络合金属离子，能有效控制蛋白质聚合，通过TRIS和EDTA-2Na间的协同作用，能使乳中蛋白质彻底分离。
对比例3
按照实施例1的方法测定生牛乳中A2β-酪蛋白的含量，区别在于，样品缓冲液和电泳缓冲液中，尿素(UREA)的添加量调整为4mol/L。
毛细管电泳检测结果如图9所示，尿素添加量为8mol/L的吸光值比4mol/L更高，表现为蛋白峰值更高，且图谱清晰，分离效果更好。尿素能破坏蛋白质分子内部的疏水键，合理的尿素浓度能提高蛋白质的可溶性。
对比例4
按照实施例1的方法测定生牛乳中A2β-酪蛋白的含量，区别在于，在步骤(3)中，样品稀释液经NaOH调节PH值至8.0后，恒温保持温度调整为25℃。
毛细管电泳检测结果如图10所示，35℃比25℃恒温保持的样品蛋白质吸光值更高，且分离效果更好。
对比例5
按照实施例1的方法测定生牛乳中A2β-酪蛋白的含量，区别在于，直接采用未涂层毛细管进行样品检测。
毛细管电泳检测结果如图11所示，经溶胶-凝胶涂层的毛细管蛋白分离效果明显好于未涂层的裸管，基线也更为稳定，这是因为未涂层毛细管内壁的硅羟基未经钝化，容易吸附蛋白质导致样品无法彻底分离，同时出现不同程度的电渗流而导致基线不平，毛细管也更容易发生堵塞。
对比例6
按照实施例1的方法测定生牛乳中A2β-酪蛋白的含量，区别在于，在步骤(4)中，毛细管内壁涂层烘干的升温速度调整为3℃/min，其它条件不变。
毛细管电泳检测结果如图12所示。对比例因涂层烘干升温速度过快，可能导致涂层内外应力不均而产生开裂，或涂层表面空穴塌陷，造成管内壁不光滑，蛋白吸附，表现为蛋白出峰面积降低，出峰速率减慢。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (14)

1.一种检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法，其特征在于，包括：
将牛乳进行冷却离心处理，以便得到待测储备液；
利用样品稀释液对所述待测储备液进行稀释处理，以便得到稀释后的储备液，其中，所述样品稀释液含有5-15mmol/L磷酸二氢钠、100-150mmol/L三羟甲基氨基甲烷、6-10mol/L尿素、30-50mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.05-0.15%二硫苏糖醇，且所述样品稀释液的pH值为7.5-8.6；以及
利用毛细管电泳法对所述稀释后的储备液进行检测，以便确定所述牛乳中A2β-酪蛋白含量，
其中，所述冷却离心处理包括：
将所述牛乳在0-10摄氏度条件下静置0.5-2小时，以便得到冷却的牛乳；以及
将所述冷却的牛乳在4000-8000r/min条件下离心10-30min，以便得到所述待测储备液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品稀释液含有8-10mmol/L磷酸二氢钠浓度、110-130mmol/L三羟甲基氨基甲烷、7-9mol/L尿素、40-50mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.08-0.12%二硫苏糖醇，且所述样品稀释液的pH值为7.8-8.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品稀释液与所述待测储备液按体积比1-6：1进行所述稀释处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释后的储备液的pH值为6.5-8.5，温度为30-50摄氏度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳法是采用溶胶-凝胶毛细管进行的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，制备所述溶胶-凝胶毛细管的方法包括：
将预处理的毛细管分别利用水、酸溶液和碱溶液进行清洗处理，以便得到清洗后的毛细管；
将所述清洗后的毛细管在溶胶溶液中浸洗10-50分钟后，再静置10-30分钟，以便得到浸洗后的毛细管；
将所述浸洗后的毛细管利用丙酮进行第一冲洗处理，以便得到第一冲洗后的毛细管；
将所述第一冲洗后的毛细管进行干燥处理，以便得到干燥后的毛细管；以及
将所述干燥后的毛细管进行第二冲洗处理，以便得到所述溶胶-凝胶毛细管。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述干燥处理是以0.5-2℃/min的速度升温至80-150℃后，烘干0.5-2小时。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶胶溶液包括：
450-950μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷；以及
50-250μL pH值为2.5-4.5的乙酸溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳法采用的电泳缓冲液包括：
0.1-0.2mol/L磷酸；
10-30mmol/L磷酸二氢钠；
6-10mol/L尿素；
0.05-0.15%羟乙基甲基纤维素，
且pH值为2.0-5.0。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述电泳缓冲液包括：
0.15mol/L磷酸；
20mmol/L磷酸二氢钠；
6-10mol/L尿素；
0.05-0.15%羟乙基甲基纤维素，
且pH值为2.0-5.0。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
利用所述样品稀释液对A2β-酪蛋白标准品进行梯度稀释，以便得到不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液；
利用毛细管电泳法对所述不同浓度的A2β-酪蛋白标准品溶液进行检测，以便得到A2β-酪蛋白的浓度-峰面积关系曲线；以及
基于所述A2β-酪蛋白的浓度-峰面积关系曲线，以便确定所述牛乳中A2β-酪蛋白含量。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳法的检测条件包括：
检测波长为150-350纳米；
检测温度为15-35℃；
采用压力进样，进样压力为0.2-1psi；
工作电压为20-30kv；
检测频率为4-16Hz。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述检测波长为214nm。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳法采用压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为5-20s。
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