CN111718993A - 一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开人血清miR‑146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，包括有：人miR‑146a逆转录物引物和探针、内参REF1的逆转录物引物和探针。本发明的microRNA逆转录使用的是发夹茎环法，比现在主流的加尾法特异性强，成本低，同时为双重荧光定量PCR提供了可能。本发明的双重荧光定量PCR在同一个反应管中同时加入miR‑146a和内参的两套引物和两种不同荧光的探针，同时进行荧光定量PCR互不干扰，一管反应可以获得两个结果，比目前的单色荧光定量PCR提高了100％的效率，简化了50％的实验步骤，节省了50％的标本量和扩增试剂，提高了结果的可靠性。本发明提供的miR‑146a定量参考品，能够绘制标准曲线并且定量标本中miR‑146a的拷贝数浓度，比目前的相对定量方法更直接客观。

Description

一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物、医学检测领域，具体涉及一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

miR-146a位于人类5号染色体LOC285628基因的第二外显子上。2006年Taganov等首先报道了miR-146a可通过核因子-kB(NF-kB)信号通路抑制机体免疫反应，随后不断有研究报道其与机体的自身免疫、炎性反应、病毒感染等有着错综复杂的关系，近年来有研究发现其表达异常与病毒复制、肝细胞再生、炎性反应甚至肝细胞癌的发生发展有密切的联系(Li JF，Dai XP，Zhang W，et al.Upregulation of MicroRNA-146a by Hepatitis BVirus X Protein Contributes to Hepatitis Development by DownregulatingComplement Factor H.MBio,2015,6,pii:e02459-14)。因此，miR-146a可以作为一种新的生物学指标应用于临床检测，具有重要的临床意义。

从血清中运用荧光PCR检测miR-146a，目前有染料法和探针法，染料法特异性不如探针法，目前这两种方法都是通过内参Ct值进行相对定量的方法，无法准确定量出具体的分子拷贝数，检测下限和灵敏性都不可知。而且目前已有的方法都是单通道单色检测，microRNA和内参各需要单独一管进行PCR，检测效率低下。

发明内容

本发明的目的是提供一种人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，解决现有技术中miR-146a检测单色荧光PCR效率低，特异性差，灵敏度低，内参不恒定，不能绝对定量血清miR-146a分子拷贝浓度技术问题。

本发明这种人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括有以下引物和探针：

用于逆转录人miR-146a采用的发夹茎环法逆转录引物：

CTGGTTAAGGAGCCTCCCAGGCTCCAGGCTCCTTAACCAGAACCCATG(序列1所示)，

用于检测人miR-146a的荧光探针：CTCCTTAACCAGAACCCATGGAATT(序列2所示)，

人miR-146a探针5’端连有荧光基团FAM，3’端连有猝灭基团BHQ1：

用于扩增miR-146a的PCR上游引物：AGCGTTGAGAACTGAATTC(序列3所示)，

用于扩增人miR-146a的PCR下游引物：AGGAGCCTCCCAGGCT(序列4所示)；

内参检测的REF1引物和探针，包括：

用于逆转录内参REF1采用的发夹茎环法逆转录引物：

CTGGTTAAGGAGCCTCCCAGGCTCCAGGCTCCTTAACCAGAACATGAC(序列5所示)，

用于检测内参REF1的荧光探针：CTCCTTAACCAGAACATGACTATGA(序列6所示)，

内参REF1探针5’端连有荧光基团Hex，3’端连有猝灭基团BHQ1：

用于扩增内参REF1的PCR上游引物：AGCGTACCCTGAGTCATA(序列7所示)；

用于扩增内参REF1的PCR下游引物：AGGAGCCTCCCAGGCT(序列8所示)。

所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有：

人miR-146a定量参考品：

GCGTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTCTGGTTAAGGAGCCTGGAGCCTGGGAGGCTCCT(序列9所示)；

标准化内参REF1：

ACCCUGAGUCAUAGUCAUGUU(序列10所示)。

所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有microRNA提取试剂：Trizol试剂、小分子RNA吸附柱、洗液1(75％乙醇)、洗液2(85％乙醇)。

所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有3×逆转录混合液:120mmol/L Tris-HCl(PH 8.3)，120mmol/L KCl,9mmol/L MgCl₂，21mmol/L DTT，15U/μL逆转录酶，1.5U/μL RNA酶抑制剂，1.5mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。

所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有2×DNA聚合酶(Taq酶)混合液：0.05U/μL DNA聚合酶，100mmol/L Tris-HCl(PH 8.5)，100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl₂，0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。

根据所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒检测血清中miR-146a的方法，包括以下步骤：

步骤1.用10倍于样本体积的Trizol试剂处理血清或血浆样本，并加入内参至25pmol/L，反复吹打混匀至充分溶解，室温静置10分钟；(这个内参是)

步骤2.加入2倍于样本体积的氯仿，振荡15秒后静置3分钟。12000g以上高速离心15分钟，转移上层水相即萃取出的血清或血浆总RNA至1.5ml无RNA酶离心管,并加入等体积异丙醇混匀，室温静置10分钟。

步骤3.将异丙醇处理的RNA加入小分子RNA吸附柱离心过滤，将小分子RNA吸附在柱子上，将大分子RNA滤过并丢弃。用500μL洗液1离心洗涤一次，再用500μL洗液2离心洗涤两次，去除杂质，最后用15μL无RNA酶水离心洗脱小分子RNA吸附柱，获得microRNA。

步骤4.对提取的microRNA进行逆转录：取9.5μL提取的microRNA、5μL的3×逆转录混合液和0.5μL的1μmol/L逆转录引物混合液(miR-146a和内参REF1的逆转录引物共2条用无酶水配制为各1μmol/L的混合液)，充分混匀，置于42℃进行逆转录30分钟，再于70℃孵育5分钟灭活逆转录酶，逆转录获得的cDNA置冰盒中备用。

步骤5.双重荧光定量PCR：取15μl逆转录好的cDNA，加入25μl的2×DNA聚合酶混合液、5μl的2μmol/L探针引物混合液(miR-146a和内参REF1的扩增引物共4条及探针共2条用去离子水配制为各2μmol/L的混合液)、5μl去离子水，于PCR管内混匀，进行荧光定量PCR反应，反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒(检测荧光)，运行45-50个循环结束。

步骤6.分析结果数据，通过标准品拷贝数和Ct值绘制标准曲线，计算获得待测样本中人miR-146a浓度，通过内参Ct值和扩增曲线来监控miRNA提取和RT-PCR是否正常，如果内参结果异常，则表示本次结果不可靠，需查找原因进行复查。

本发明的有益效果：

1)本发明的microRNA逆转录使用的是发夹茎环法，逆转录引物摒弃了传统的茎环序列，设计为一种稳定的发夹结构，特异性结合小分子microRNA，排除长链RNA干扰，比现在主流的加尾法特异性强，成本低，同时为双重荧光定量PCR提供了可能。本发明的双重荧光定量PCR在同一个反应管中同时加入miR-146a和内参的两套引物和两种不同荧光的探针，同时进行荧光定量PCR互不干扰，一管反应可以获得两个结果，比目前的单色荧光定量PCR提高了100％的效率，简化了50％的实验步骤，节省了50％的标本量和扩增试剂。本发明提供的miR-146a定量参考品，能够绘制标准曲线并且定量标本中miR-146a的拷贝数浓度，比目前的相对定量方法更直接客观。

2)本发明试剂盒因为采用用于检测人miR-146a和内参的探针都具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对微量血清、血浆等未知样本中的人miR-146a的浓度进行快速、精准测定，特异性好，双重荧光PCR能够在同一管中同时检测出人miR-146a和内参，比现有的单色荧光PCR方法效率提高了100％。进一步地，因为本发明试剂盒通过外加标准化内参，解决了血清中常用microRNA内参U6等因个体化差异不恒定的问题，既可以有效监控假阴性的存在，还可以通过内参Ct值校正不同血清样本microRNA提取过程和PCR过程中产生的实验操作误差，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。总之，本试剂盒在很大程度上简化了实验的步骤，降低了成本，提高了特异性和灵敏度，在5E+07copies/ml至5.00E+03copies/ml浓度范围内有极好的线性关系(R²＝0.99998)。

附图说明

图1为实施例中提供的试剂盒人miR-146a定量参考品A(5.00E+07copies/ml)、B(5.00E+06copies/ml)、C(5.00E+05copies/ml)、D(5.00E+04copies/ml)和E(5.00E+03copies/ml)的扩增曲线图；

图2为实施例中提供的试剂盒人miR-146a荧光定量PCR检测定量分析的标准曲线图；

图3为实施例中提供的试剂盒检测了20例乙型肝炎患者血清样本中miR-146a浓度，每个标本在同一管中同时扩增人miR-146a和内参的双重荧光定量PCR扩增曲线结果图；

图4为实施例中20例乙型肝炎患者干扰素治疗基线期、12周、24周、48周、72周，血清中人miR-146a均值动态曲线图。

具体实施方式

本发明的实施例中人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括有以下引物和探针：

用于逆转录人miR-146a采用的发夹茎环法逆转录引物：CTGGTTAAGGAGCCTCCCAGGCTCCAGGCTCCTTAACCAGAACCCATG(序列1所示)，

用于检测人miR-146a的荧光探针：CTCCTTAACCAGAACCCATGGAATT(序列2所示)，

miR-146a探针5’端连有荧光基团FAM，3’端连有猝灭基团BHQ1：

用于扩增人miR-146a的PCR上游引物：AGCGTTGAGAACTGAATTC(序列3所示)，

用于扩增人miR-146a的PCR下游引物：AGGAGCCTCCCAGGCT(序列4所示)；

内参检测的REF1引物和探针，包括：

用于逆转录内参REF1采用的发夹茎环法逆转录引物：CTGGTTAAGGAGCCTCCCAGGCTCCAGGCTCCTTAACCAGAACATGAC(序列5所示)，

用于检测内参REF1的荧光探针：CTCCTTAACCAGAACATGACTATGA(序列6所示)，

内参REF1探针5’端连有荧光基团Hex，3’端连有猝灭基团BHQ1：

用于扩增内参REF1的PCR上游引物：AGCGTACCCTGAGTCATA(序列7)；

用于扩增内参REF1的PCR下游引物：AGGAGCCTCCCAGGCT(序列8)。

所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有：

人miR-146a定量参考品：GCGTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTCTGGTTAAGGAGCCTGGAGCCTGGGAGGCTCCT(序列9所示)；

人miR-146a定量参考品为一段长为59碱基的人工合成DNA序列，根据摩尔分子数计算分子拷贝数稀释而成。该人miR-146a定量参考品包括A、B、C、D、E五个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为5.00E+07copies/ml(A)、5.00E+06copies/ml(B)、5.00E+05copies/ml(C)、5.00E+04copies/ml(D)、5.00E+03copies/ml(E)。

标准化内参REF1：ACCCUGAGUCAUAGUCAUGUU(序列10所示)。

标准化内参REF1为一段长为21碱基的人工合成RNA序列。

本发明的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法：按照microRNA提取、microRNA逆转录、荧光定量PCR的流程进行，具体详细步骤见实施例：

实施例1.microRNA提取

(1)取50μL血清/血浆加入1.5mL离心管，每管加入0.5mL的Trizol试剂，并加入1nmol/L的内参2.5μL，混匀，室温放置10分钟。

(2)每管加入100μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

(3)4℃，12000×g离心15分钟，吸取300μL上清至新的1.5ml离心管中，并加入300μL异丙醇，混匀，室温静置10分钟。

(4)把小分子RNA吸附柱装在真空抽吸装置上，转移所有RNA异丙醇混合液至小分子RNA吸附柱中，打开真空泵抽吸1分钟。

(5)加入500μL洗涤液1至柱中，真空抽吸1分钟。加入500μL洗涤液2至柱中，真空抽吸1分钟，再加入500μL洗涤液2至柱中，真空抽吸1分钟。最后把小分子RNA吸附柱装在2mL收集管中，12000×g离心3分钟，充分甩干。

(6)将柱子转移至无RNA酶的1.5ml离心管中，加入15μl无RNA酶水至柱中，静置2分钟，12000×g离心2分钟，丢弃柱子，microRNA置冰盒中备用。

实施例2.microRNA逆转录

(1)取3×逆转录混合液5μl、1μmol/L的逆转录引物混合液(0.5μl加入0.2ml无RNA酶的PCR薄壁管中。

(2)取提取好的microRNA 9.5μl加入上述混合液中，吹打混匀。

(3)放入PCR仪进行逆转录，条件为：42℃30分钟，70℃5分钟。获得的cDNA置冰盒中备用。

实施例3.双重荧光定量PCR

(1)取2×PCR混合液25μL、2μmol/L探针引物混合液5μL、去离子水5μL加入0.2mL的8联PCR管中。

(2)每管加入15μL逆转录好的cDNA，混匀。

(3)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度

(4)荧光检测通道的选择：通过软件选择FAM通道检测miR-146a，选择HEX检测内参。

(5)荧光定量PCR反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒(检测荧光)，运行45-50个循环结束。

(6)结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果。在相应的通道，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时，所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本人miR-146a的5个浓度梯度定量参考品扩增曲线(见图1)，获得Ct值绘制标准曲线(见图2)，每个标本通过双重荧光PCR扩增可以在同一个反应管内同时获得人miR-146a和内参2条扩增曲线(见图3)，软件可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且定值结果≥500copies/ml，报告具体拷贝数浓度；如果定值结果≤500copies/ml，报告结果为低于检测下限；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示或无定值结果显示，可以判为阴性。凡内参无扩增曲线或异常的数据为无效，应复查获得有效数据才能报告结果。

实施例4.应用

人血清miR-146双重荧光定量PCR检测试剂盒在干扰素抗乙肝病毒治疗疗效评估中的应用：检测20例乙型肝炎患者干扰素治疗过程中血清标本的miR-146a浓度。

收集20例慢性乙型肝炎患者干扰素治疗基线期、12周、24周、48周、72周的血清标本，各取50μL，按照上述实施例1、2、3所描述的方法检测人miR-146a。

检测结果按72周HBeAg是否发生血清学转换分两组统计：SR(转换)和NON-SR(未转换)。干扰素治疗过程中人血清miR-146a浓度对比见图4。由图4可见，干扰素治疗过程中，乙肝患者血清miR-146a浓度均均有下降，而SR组与Non-SR组比较下降幅度更大，72周无反弹。因而，本试剂盒检测的人血清miR-146a浓度能够应用于干扰素抗乙肝病毒治疗的疗效监测。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ctggttaagg agcctcccag gctccaggct ccttaaccag aacccatg 48

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

ctccttaacc agaacccatg gaatt 25

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

agcgttgaga actgaattc 19

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

aggagcctcc caggct 16

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

ctggttaagg agcctcccag gctccaggct ccttaaccag aacatgac 48

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ctccttaacc agaacatgac tatga 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

agcgtaccct gagtcata 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

aggagcctcc caggct 16

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

gcgttgagaa ctgaattcca tgggttctgg ttaaggagcc tggagcctgg gaggctcct 59

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

acccugaguc auagucaugu u 21

Claims (6)

1.一种人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括有以下引物和探针：

用于逆转录miR-146a采用的发夹茎环法逆转录引物：

CTGGTTAAGGAGCCTCCCAGGCTCCAGGCTCCTTAACCAGAACCCATG，序列1所示，

用于检测人miR-146a的荧光探针：CTCCTTAACCAGAACCCATGGAATT，序列2所示，

miR-146a探针5’端连有荧光基团FAM，3’端连有猝灭基团BHQ1：

用于扩增miR-146a的PCR上游引物：AGCGTTGAGAACTGAATTC，序列3所示，

用于扩增miR-146a的PCR下游引物：AGGAGCCTCCCAGGCT，序列4所示；

内参检测的REF1引物和探针，包括：

用于逆转录内参REF1采用的发夹茎环法逆转录引物：

CTGGTTAAGGAGCCTCCCAGGCTCCAGGCTCCTTAACCAGAACATGAC，序列5所示，

用于检测内参REF1的荧光探针：CTCCTTAACCAGAACATGACTATGA，序列6所示，

内参REF1探针5’端连有荧光基团Hex，3’端连有猝灭基团BHQ1：

用于扩增内参REF1的PCR上游引物：AGCGTACCCTGAGTCATA，序列7所示；

用于扩增内参REF1的PCR下游引物：AGGAGCCTCCCAGGCT，序列8所示。

2.根据权利要求1所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有：

miR-146a定量参考品：

GCGTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTCTGGTTAAGGAGCCTGGAGCCTGGGAGGCTCCT，序列9所示；

标准化内参REF1：

ACCCUGAGUCAUAGUCAUGUU，序列10所示。

3.根据权利要求2所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有包括microRNA提取试剂：Trizol试剂、小分子RNA吸附柱、洗液1为75％乙醇、洗液2为85％乙醇。

4.根据权利要求3所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有3×逆转录混合液:120mmol/L Tris-HCl pH为8.3，120mmol/L KCl,9mmol/L MgCl₂，21mmol/L DTT，15U/μL逆转录酶，1.5U/μL RNA酶抑制剂，1.5mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸。

5.根据权利要求4所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括有2×DNA聚合酶混合液：0.05U/μL DNA聚合酶，100mmol/L Tris-HCl pH为8.5，100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl₂，0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸。

6.根据1～5中任意一项所述的人血清miR-146a的双重荧光定量PCR检测试剂盒检测血清中miR-146a的方法，包括以下步骤：

步骤1.用10倍于样本体积的Trizol试剂处理血清或血浆样本，并加入内参至25pmol/L，反复吹打混匀至充分溶解，室温静置10分钟；

步骤2.加入2倍于样本体积的氯仿，振荡15秒后静置3分钟。12000g以上高速离心15分钟，转移上层水相即萃取出的血清或血浆总RNA至1.5ml无RNA酶离心管,并加入等体积异丙醇混匀，室温静置10分钟；

步骤3.将异丙醇处理的RNA加入小分子RNA吸附柱离心过滤，将小分子RNA吸附在柱子上，将大分子RNA滤过并丢弃。用500μL洗液1离心洗涤一次，再用500μL洗液2离心洗涤两次，去除杂质，最后用15μL无RNA酶水离心洗脱小分子RNA吸附柱，获得microRNA；

步骤4.对提取的microRNA进行逆转录：取9.5μL提取的microRNA、5μL的3×逆转录混合液和0.5μL的1μmol/L逆转录引物混合液，充分混匀，置于42℃进行逆转录30分钟，再于70℃孵育5分钟灭活逆转录酶，逆转录获得的cDNA置冰盒中备用；其中：逆转录引物混合液为miR-146a和内参REF1的逆转录引物共2条用无酶水配制为各1μmol/L的混合液；

步骤5.双重荧光定量PCR：取15μl逆转录好的cDNA，加入25μl的2×DNA聚合酶混合液、5μl的2μmol/L探针引物混合液、5μl去离子水，于PCR管内混匀，进行荧光定量PCR反应，反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒(检测荧光)，运行45-50个循环结束；其中：探针引物混合液为miR-146a和内参REF1的扩增引物共4条及探针共2条用去离子水配制为各2μmol/L的混合液；

步骤6.分析结果数据，通过标准品拷贝数和Ct值绘制标准曲线，计算获得待测样本中人miR-146a浓度，通过内参Ct值和扩增曲线来监控miRNA提取和RT-PCR是否正常，如果内参结果异常，则表示本次结果不可靠，需查找原因进行复查。

Images