CN111718991A - 血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用 - Google Patents

血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用，属于生物技术领域。所述血浆miRNA分子标志物包含hsa‑miR‑526b‑5p（SEQIDNO:1）、hsa‑miR‑551b（SEQIDNO:2）、hsa‑miR‑487a（SEQIDNO:3）或hsa‑miR‑518e（SEQIDNO:4）中的任一种。本发明还公开了所述血浆miRNA分子标志物在制备诊断代谢综合征的试剂盒中的应用，包括以所述miRNA分子标志物作为诊断标志物，通过荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中miRNA分子标志物的表达水平，判断代谢综合征是否发生。本发明提供的血浆miRNA分子标志物检测方便，人为干预程度低，可控化程度高，诊断程序简单，经济实用，有利于临床诊断工作的开展。

Description

血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用
技术领域
属于生物技术领域，涉及血浆miRNA分子标志物的应用，具体地说，涉及血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用。
背景技术
代谢综合征是一种常见而复杂的代谢性疾病，是指人体蛋白质、脂肪、碳水化合物等发生代谢紊乱的病理状态，患者通常患有胰岛素抵抗或糖尿病、肥胖和高血压等的集合症候。代谢综合征是导致心脑血管疾病的病理基础，可造成多种疾病的发生率上升，如高血压、冠心病、脑卒中及癌症等。因此，代谢综合征早期诊断急需准确有效的标志物，提高代谢综合征的诊断率及早期干预率，有利于患者的预后和生活质量。
公告号CN109239346B的专利文件公开了一组代谢标志物在代谢综合征早期诊断方面的应用，具体披露了三种诊断代谢综合征的标志物：1）酪氨酸、磷脂酰乙醇胺PE(18:2(9Z,12Z)/P-18:0)和谷氨酰胺-亮氨酸联合；2）苯丙氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸和磷脂酰乙醇胺PE(18:2(9Z,12Z)/P-18:0)联合；3）异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸、对羟基肉桂酸和磷脂酰乙醇胺PE(18:2(9Z,12Z)/P-18:0)七个目标代谢物联合。然而，所述标志物包含多个代谢物，在诊断过程中需测定各代谢标志物的相对含量，准确测定困难，诊断程序复杂，而且人为干扰因素较大，可控化程度低，灵敏度有待提高。鉴于此，为提高代谢综合征早期诊断率，迫切需要研究开发准确率更高、灵敏度和特异性更强的标志物及试剂盒。
发明人在临床研究中发现，代谢综合征患者血浆中的hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-551b、hsa-miR-487a和hsa-miR-518e的表达水平明显低于健康受试者血浆中相关基因的表达水平。该研究结果提示，以所述hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-551b、hsa-miR-487a和hsa-miR-518e作为标志物，用于检测代谢综合征具有可行性。经检索，目前尚未有将这四种血浆miRNA分子作为代谢综合征标志物的报道。
发明内容
本发明的目的在于：提供四种血浆miRNA分子在代谢综合征检测中的新应用，特别是作为标志物在制备代谢综合征检测试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了可用于诊断代谢综合征的血浆miRNA分子标志物，其包含hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-551b、hsa-miR-487a、hsa-miR-518e中的任一种，其中，
所述hsa-miR-526b-5p的序列如SEQIDNO:1所示；
所述hsa-miR-551b的序列如SEQIDNO:2所示；
所述hsa-miR-487a的序列如SEQIDNO:3所示；
所述hsa-miR-518e的序列如SEQIDNO:4所示。
本发明提供了基于所述血浆miRNA分子标志物表达检测在制备诊断代谢综合征的试剂盒中的应用，包括：
以所述miRNA分子标志物作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中miRNA分子标志物的表达水平，判断代谢综合征是否发生，为代谢综合征的确诊及治疗过程提供重要信息。
本发明还提供了用于诊断代谢综合征的检测试剂盒，包括：
hsa-miR-526b-5p荧光定量PCR检测试剂盒、hsa-miR-551b荧光定量PCR检测试剂盒、hsa-miR-487a荧光定量PCR检测试剂盒、hsa-miR-518e荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明还提供了所述诊断代谢综合征的试剂盒所需的试剂。
具体地，
（1）hsa-miR-526b-5p荧光定量PCR检测试剂盒所需的试剂，包括：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-526b-5p正向引物和hsa-miR-526b-5p反向引物，所述hsa-miR-526b-5p正向引物的序列如SEQIDNO:6所示，所述hsa-miR-526b-5p反向引物为通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，其序列如SEQIDNO:5所示。
（2）hsa-miR-551b荧光定量PCR检测试剂盒所需的试剂，包括：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-551b正向引物和hsa-miR-551b反向引物，所述hsa-miR-551b正向引物的序列如SEQIDNO:7所示，所述hsa-miR-526b-5p反向引物为通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，其序列如SEQIDNO:5所示。
（3）hsa-miR-487a荧光定量PCR检测试剂盒所需的试剂，包括：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-487a正向引物和hsa-miR-487a反向引物，所述hsa-miR-487a正向引物的序列如SEQIDNO:9所示，所述hsa-miR-526b-5p反向引物为通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，其序列如SEQIDNO:5所示。
（4）hsa-miR-518e荧光定量PCR检测试剂盒临床诊断所需的试剂，包括：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-518e正向引物和hsa-miR-518e反向引物，所述hsa-miR-518e正向引物的序列如SEQIDNO:8所示，所述hsa-miR-518e反向引物为通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，其序列如SEQIDNO:5所示。
需要说明的是，RNU6作为较好的miRNA的内参，其表达量用于对目的miRNA的表达量进行相对定量，通过荧光定量PCR仪得到CT值，然后通过如下公式获得miRNA分子标志物的表达量：
ΔCT(代谢综合征) = CT(目的miRNA)–CT(内参RNU6)；
ΔCT(健康对照) = CT(目的基因)–CT(内参RNU6)；
其中，所述ΔCT表示miRNA分子标志物的表达量。
本发明具有如下的有益效果：
本发明提供的miRNA分子标志物的表达水平与代谢综合征明显相关，对判断代谢综合征是否发生具有重要意义，为代谢综合征的早期诊断及早期干预和治疗提供了指导。
本发明提供的检测试剂盒通过采用实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中miRNA分子标志物的表达水平，所述分子标志物检测方便，人为干预程度低，可控化程度高，诊断程序简单，经济实用，有利于临床诊断工作的开展。
附图说明
图1提供了本发明所述hsa-miR-526b-5p在代谢综合征与健康血浆样本中的表达量；
图2提供了所述hsa-miR-551b在代谢综合征与健康血浆样本中的表达量；
图3提供了所述hsa-miR-487a在代谢综合征与健康血浆样本中的表达量；
图4提供了所述hsa-miR-518e在代谢综合征与健康血浆样本中的表达量；
图中，MetS表示在代谢综合征血浆样本中的表达量，HealthyContol表示在健康血浆样本中的表达量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案的实施例进行具体说明。
实施例1
本实施例1提供了一种诊断代谢综合征的试剂盒，所述试剂盒以hsa-miR-526b-5p作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中hsa-miR-526b-5p的表达水平，判断代谢综合征是否发生。
所述试剂盒由如下试剂组成：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-526b-5p正向引物（SEQIDNO:6）和上海生工公司合成的成品通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物（SEQIDNO:5）。
利用本实施例1的试剂盒对5例代谢综合征血浆样本和5例健康对照组血浆样本进行检测，所述代谢综合征在临床检验中得到证实确诊，步骤如下：
1.血浆样本的采集与处理：用抗凝管采集全血样本，在凝血前以3000rpm的速度离心15min，转移上清，并对上清进行16000×g离心15min，再取上清即得血浆样本。
2.总RNA的提取：本发明实施例采用TRIzol LS(Invitrogen)提供的方法提取总RNA，具体包括：
取250ul所述血浆样本，加入750ul的TRIzol LS，吹打混匀，室温静置5min；
加入与200ul的氯仿，剧烈混匀，室温放置5min；
在4℃温度下进行12000×g离心15min，取水相；
加入500ul的异丙醇，12000×g离心10min，弃上清；
加入1ml无水乙醇，7500×g离心5min，弃上清后晾干；
以20ul的RNase-free water溶解，并用Nanodrop定量后，冻存于-80℃冰箱。
3. cDNA的合成：本发明实施例采用miScriptⅡRTKit（Qiagen）提供的方法逆转录合成cDNA，具体包括：
将5×miScriptHiSepecBuffer、10×miScriptNucleicsMix、miScriptReverseTranscriptaseMix、RNase-freewater和模板RNA组成20ul的反应体系，混匀反应体系后加入至PCR仪中，在37℃的温度下孵育60min，然后95℃的温度下灭活5min，获得cDNA。
4.定量PCR检测：本发明实施例定量PCR检测采用20ul的反应体系，其中所述SYBRGreen荧光定量PCR酶10ul、cDNA1ul、RNase-freewater8ul、hsa-miR-526b-5p正向引物和通用引物各0.5ul。反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃扩展30s，共40个循环。
采用本实施例1所述试剂盒对代谢综合征血浆样本和健康血浆样本进行检测的结果如下：
在代谢综合征和健康血浆样本中均能检测到hsa-miR-526b-5p的表达，但代谢综合征与健康血浆样本之间存在显著差异（P<0.05），具体见表1。
表1-hsa-miR-526b-5p表达量
Figure DEST_PATH_IMAGE002
通过表1可知，hsa-miR-526b-5p在代谢综合征血浆样本中的表达量相比健康血浆样本中的表达量下调，其log2FC为-8.85。
对代谢综合征和健康血浆样本中的表达量进行T检验，结果如图1所示。
通过图1可以看出，hsa-miR-526b-5p在代谢综合征血浆样本中的表达量明显低于健康血浆样本中的表达量，这与本发明试剂盒检测结果相同，表明本发明试剂盒以hsa-miR-526b-5p作为诊断标志物，可用于诊断代谢综合征，具有诊断方便、灵敏度和可控化程度高的优点。
实施例2
本实施例2提供了一种诊断代谢综合征的检测试剂盒，所述试剂盒以hsa-miR-551b作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中hsa-miR-551b的表达水平，判断代谢综合征是否发生。
所述检测试剂盒由如下试剂组成：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-551b正向引物（SEQIDNO:7）和上海生工公司合成的成品通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物（SEQIDNO:5）。
利用本实施例2的试剂盒对5例代谢综合征血浆样本和5例健康对照组血浆样本进行检测，步骤同实施例1。
采用本实施例2所述试剂盒对各代谢综合征血浆样本和健康血浆样本进行检测的结果如下：
在代谢综合征和健康血浆样本中均能检测到hsa-miR-551b的表达，但代谢综合征与健康血浆样本之间存在显著差异（P<0.05），具体见表1。
表1-hsa-miR-551b表达量
Figure DEST_PATH_IMAGE004
通过表1可知，hsa-miR-551b在代谢综合征血浆样本中的表达量相比健康血浆样本中的表达量下调，其log2FC为8.10。
对代谢综合征和健康血浆样本中的表达量进行T检验，结果如图2所示。
通过图2可以看出，hsa-miR-551b在代谢综合征血浆样本中的表达量明显低于健康血浆样本中的表达量，这与本发明试剂盒检测结果相同，表明本发明试剂盒以hsa-miR-551b作为诊断标志物，可用于诊断代谢综合征，具有诊断方便、灵敏度和可控化程度高的优点。
实施例3
本实施例3提供了一种诊断代谢综合征的检测试剂盒，以hsa-miR-487a作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中hsa-miR-478a的表达水平，判断代谢综合征是否发生。
所述检测试剂盒由如下试剂组成：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-478a正向引物（SEQIDNO:9）和上海生工公司合成的成品通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物（SEQIDNO:5）。
利用本实施例3的检测试剂盒对5例代谢综合征血浆样本和5例健康对照组血浆样本进行检测，步骤同实施例1。
采用本实施例3所述试剂盒对各代谢综合征血浆样本和健康血浆样本进行检测的结果如下：
在代谢综合征和健康血浆样本中均能检测到hsa-miR-487a的表达，但代谢综合征与健康血浆样本之间存在显著差异（P<0.05），具体见表3。
表3-hsa-miR-487a表达量
Figure DEST_PATH_IMAGE006
通过表1可知，hsa-miR-487a在代谢综合征血浆样本中的表达量相比健康血浆样本中的表达量下调，其log2FC为7.95。
对代谢综合征和健康血浆样本中的表达量进行T检验，结果如图2所示。
通过图2可以看出，hsa-miR-487a在代谢综合征血浆样本中的表达量明显低于健康血浆样本中的表达量，这与本发明试剂盒检测结果相同，表明本发明试剂盒以hsa-miR-487a作为诊断标志物，可用于诊断代谢综合征，具有诊断方便、灵敏度和可控化程度高的优点。
实施例4
本实施例4提供了一种诊断代谢综合征的检测试剂盒，以hsa-miR-518e作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中hsa-miR-518e的表达水平，判断代谢综合征是否发生。
所述检测试剂盒由如下试剂组成：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-518e正向引物（SEQIDNO:8）和上海生工公司合成的成品通用引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物（SEQIDNO:5）。
利用本实施例4的检测试剂盒对5例代谢综合征血浆样本和5例健康对照组血浆样本进行检测，步骤同实施例1。
采用本实施例4所述试剂盒对各代谢综合征血浆样本和健康血浆样本进行检测的结果如下：
在代谢综合征和健康血浆样本中均能检测到hsa-miR-518e的表达，但代谢综合征与健康血浆样本之间存在显著差异（P<0.05），具体见表1。
表1-hsa-miR-518e表达量
Figure DEST_PATH_IMAGE008
通过表1可知，hsa-miR-518e在代谢综合征血浆样本中的表达量相比健康血浆样本中的表达量下调，其log2FC为7.81。
对代谢综合征和健康血浆样本中的表达量进行T检验，结果如图4所示。
通过图4可以看出，hsa-miR-518e在代谢综合征血浆样本中的表达量明显低于健康血浆样本中的表达量，这与本发明试剂盒检测结果相同，表明本发明试剂盒以hsa-miR-518e作为诊断标志物，可用于诊断代谢综合征，具有诊断方便、灵敏度和可控化程度高的优点。
综合上述实施例可知，本发明提供的试剂盒以分别以hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-551b、hsa-miR-487a和hsa-miR-518e作为诊断标志物，这4种miRNA在在代谢综合征和健康血浆中的表达量具有显著差异，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中miRNA分子标志物的表达水平，即可判断代谢综合征是否发生，具有诊断方便，灵敏度高，准确率高，可控化程度高的特点。
虽然上述已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改和改进，这对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 西安交通大学医学院第一附属医院
<120> 血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> hsa-miR-526b-5p
<400> 1
cucuugaggg aagcacuuuc ugu 23
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> hsa-miR-551b
<400> 2
gcgacccaua cuugguuuca g 21
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> hsa-miR-487a
<400> 3
aaucauacag ggacauccag uu 22
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> hsa-miR-518e
<400> 4
aaagcgcuuc ccuucagagu g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 正向引物（RNU6）
<400> 5
agagaagatt agcatggccc ct 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物（hsa-miR-526b）
<400> 6
cctcttgagg gaagcacttt ctg 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 正向引物（hsa-miR-551b）
<400> 7
ggcgacccat acttggtttc ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 正向引物（hsa-miR-518e）
<400> 8
aaagcgcttc ccttcagagt g 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 正向引物（hsa-miR-478a）
<400> 9
ccgaatcata cagggacatc cagtt 25

Claims (10)

1.血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用，其特征在于，所述miRNA分子标志物包含hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-551b、hsa-miR-487a、hsa-miR-518e中的任一种，其中，
所述hsa-miR-526b-5p的序列如SEQIDNO:1所示；
所述hsa-miR-551b的序列如SEQIDNO:2所示；
所述hsa-miR-487a的序列如SEQIDNO:3所示；
所述hsa-miR-518e的序列如SEQIDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述的血浆miRNA分子标志物在制备诊断代谢综合征的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒以所述miRNA分子标志物作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆中miRNA分子标志物的表达水平，所述miRNA分子标志物在代谢综合征患者血浆中的表达水平低于在非代谢综合征患者血浆中的表达水平。
3.一种诊断代谢综合征的试剂盒，其特征在于，所述诊断代谢综合征的试剂盒以hsa-miR-526b-5p作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆hsa-miR-526b-5p的表达水平，所述hsa-miR-526b-5p在代谢综合征患者血浆中的表达水平低于在非代谢综合征患者血浆中的表达水平。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-526b-5p正向引物、hsa-miR-526b-5p反向引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，所述内参RNU6特异性引物的序列如SEQIDNO:5所示。
5.一种诊断代谢综合征的试剂盒，其特征在于，所述诊断代谢综合征的试剂盒以hsa-miR-551b作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆hsa-miR-551b的表达水平，所述hsa-miR-551b在代谢综合征患者血浆中的表达水平低于在非代谢综合征患者血浆中的表达水平。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-551b正向引物、hsa-miR-551b反向引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，所述内参RNU6特异性引物的序列如SEQIDNO:5所示。
7.一种诊断代谢综合征的试剂盒，其特征在于，所述诊断代谢综合征的试剂盒以hsa-miR-487a作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆hsa-miR-487a的表达水平，所述hsa-miR-487a在代谢综合征患者血浆中的表达水平低于在非代谢综合征患者血浆中的表达水平。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-487a正向引物、hsa-miR-487a反向引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，所述内参RNU6特异性引物的序列如SEQIDNO:5所示。
9.一种诊断代谢综合征的试剂盒，其特征在于，所述诊断代谢综合征的试剂盒以hsa-miR-518e作为诊断标志物，通过实时荧光定量PCR技术检测疑似代谢综合征患者血浆hsa-miR-518e的表达水平，所述hsa-miR-518e在代谢综合征患者血浆中的表达水平低于在非代谢综合征患者血浆中的表达水平。
10.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：
RNA提取试剂：TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater；
逆转录试剂：逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater；
荧光定量PCR试剂：SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、hsa-miR-518e正向引物、hsa-miR-518e反向引物；
内参定量试剂：内参RNU6特异性引物，所述内参RNU6特异性引物的序列如SEQIDNO:5所示。
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