CN111187836B - 泌尿上皮癌的检测套组及微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌检测套组中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种泌尿上皮癌的检测套组，包含至少一检测微型核糖核酸的引物或探针，微型核糖核酸选自由miR‑19b‑1、miR‑636、miR‑150、miR‑155、miR‑183、miR‑378、miR‑210、miR‑487和其组合所组成的群组。本揭示内容并提供泌尿上皮癌的检测套组在用于检测泌尿上皮癌的用途。亦提供一种泌尿上皮癌的检测方法，包含测量受试者的样本中的微型核糖核酸表现量，微型核糖核酸选自由miR‑19b‑1、miR‑636、miR‑150、miR‑155、miR‑183、miR‑378、miR‑210、miR‑487和其组合所组成的群组。

Description

泌尿上皮癌的检测套组及微型核糖核酸组合物在制备用于预 测泌尿上皮癌检测套组中的应用
技术领域
本揭示内容是涉及癌症相关的微型核糖核酸的检测套组及检测方法。
背景技术
微型核糖核酸(miRNA)是一种内源性长度约19到25个核苷酸的非编码RNA分子，其主要通过转录后抑制或诱导信使核糖核酸(mRNA)的降解来调节靶基因的表达。癌症中微型核糖核酸(miRNA)的特定的表现型式可以视为一种生物指标，有利于肿瘤的诊断、分类、分期以及预后的评估。从各种生物体液样本中检测微型核糖核酸，可作为许多类型的癌症的非侵入式诊断的标记。
泌尿上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)是发生在尿路上皮的恶性肿瘤的总称。泌尿上皮癌的发生部位是遍及尿路整体，包含肾盂、输尿管、膀胱及尿道。泌尿上皮癌是由病变的泌尿上皮细胞所衍生而成，因此也称为移行上皮细胞癌(Transitional cellcarcinoma，TCC)。泌尿上皮癌一般好发于男性、膀胱、老年(60-70岁)，但近年来，上泌尿道泌尿上皮癌(肾盂癌、输尿管癌,upper urinary tract UC,UUC)也有增加趋势，而且女性族群也日渐增加。
目前公知的关于泌尿上皮癌的诊断，除了病史询问、理学检查外，最重要的就是尿液检验、尿液细胞学检查和泌尿道影像检查(包含：超音波、静脉显影剂泌尿道摄影、腹部及骨盆腔电脑断层或核磁共振)。此外，对于高度怀疑的患者，侵入性的泌尿道内视镜检查(包含膀胱镜及输尿管镜)也是必要的，肿瘤的确诊则需要进一步切片经病理显微镜检查后，才能确定肿瘤的种类与恶性程度。泌尿上皮癌的初期症状不明显，主要是以血尿和腰痛来表现，且确诊时癌症往往已较晚期，而且目前没有适当的肿瘤标记供诊断和追踪治疗之用，造成罹病较晚发现和死亡率较高。
发明内容
有鉴于此，本揭示内容提供了一种检测泌尿上皮癌的检测套组和检测方法，有助于泌尿上皮癌的诊断和追踪治疗。
本揭示内容的一态样为提供一种用于泌尿上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)的检测套组，包含：至少一检测微型核糖核酸(miRNA)的引物或探针，微型核糖核酸选自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487、及其组合所组成的群组。
在一些实施方式中的检测套组，其中微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、和miR-378。
在一些实施方式中的检测套组，其中miR-19b-1的序列为SEQ ID NO:1，miR-636的序列为SEQ ID NO:2，miR-150的序列为SEQ ID NO:3，miR-155的序列为SEQ ID NO:4，miR-183的序列为SEQ ID NO:5，miR-378的序列为SEQ ID NO:6，miR-210的序列为SEQ ID NO:7，miR-487的序列为SEQ ID NO:8。
本揭示内容的另一态样提供了泌尿上皮癌的检测套组在用于检测泌尿上皮癌的用途，所述用途的接受者为接受透析治疗的病人。
本揭示内容的又另一态样为提供引物或探针的组合物在制备用于泌尿上皮癌的检测套组在检测泌尿上皮癌的用途。
在一些实施方式中的引物或探针的组合物的用途，用于接受透析治疗的病人。
本揭示内容的另一态样为提供一种泌尿上皮癌的检测方法，包含：测量受试者的样本中的微型核糖核酸表现量，微型核糖核酸选自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487、及其组合所组成的群组。
在一些实施方式中的检测方法，其中微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、和miR-378。
在一些实施方式中的检测方法，其中测量所述受试者的该样本中的微型核糖核酸表现量包含：加入与微型核糖核酸的反转录产物会特异性结合的探针或引子；以及进行去氧核糖核酸扩增反应(例如PCR反应)。
在一些实施方式的检测方法，更包含：分析计算受试者罹患泌尿上皮癌的风险，包括根据微型核糖核酸的表现量以计算受试者的一评分。
在一些实施方式的检测方法，其中计算受试者的评分包含计算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-150/miR-210、miR-19b-1/miR-378、或miR-210/miR-183。
在一些实施方式的检测方法，其中计算受试者的评分包含计算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-19b-1/miR-378、和miR-210/miR-183。
在一些实施方式的检测方法，其中计算所述受试者的评分还包括以一公式得到评分值，其中公式为：
Logit P＝-4.762+(2.852×miR-155/miR-150)+(0.337×miR-378/miR-150)+(1.276×miR-636/miR-150)+(1.578×miR-19b-1/miR-378)。
在一些实施方式的检测方法，其中所述受试者为接受透析治疗的病人。
本发明的优点在于：本发明可以帮助有罹患泌尿上皮癌风险的受试者来更好监控或是预测癌症。相较于传统的肿瘤标志物，本发明以体液(例如血浆)中的微型核糖核酸作为泌尿上皮癌的标志物，具有稳定性好、非侵入性或微创易获取、灵敏性和特异性高的优点。本发明所提供的套组和检测方法在泌尿上皮癌的诊断及追踪具有高的临床应用价值。
附图说明
图1为根据本揭示内容的一些实验例，筛选用于检测泌尿上皮癌的微型核糖核酸的流程；
图2A为根据本揭示内容的一些实验例，显示在非泌尿上皮癌的受试者和泌尿上皮癌病人的样品中的miR-155/miR-150比值；
图2B为根据本揭示内容的一些实验例，显示在非泌尿上皮癌的受试者和泌尿上皮癌病人的样品中的miR-378/miR-150的比值；
图2C为根据本揭示内容的一些实验例，显示在非泌尿上皮癌的受试者和泌尿上皮癌病人的样品中的miR-636/miR-150的比值；
图2D为根据本揭示内容的一些实验例，显示在非泌尿上皮癌的受试者和泌尿上皮癌病人的样品中的miR-150/miR-210的比值；
图2E为根据本揭示内容的一些实验例，显示在非泌尿上皮癌的受试者和泌尿上皮癌病人的样品中的miR-19b-1/miR-378的比值；
图3A为根据本揭示内容的一些实验例的接受者操作特征曲线(receiver-operating-characteristic curve，ROC)曲线；
图3B为根据本揭示内容的一些实验例，显示非泌尿上皮癌的受试者和泌尿上皮癌病人的风险相关的评分；
图3C为根据本揭示内容的一些实验例，显示miRNA的组合用于检测泌尿上皮癌的敏感性和特异度；
图4为根据本揭示内容的一些实施方式，泌尿上皮癌的检测方法的流程；其中，符号说明：
100：方法
102、104、106、108、110、112：步骤200：方法
202、204、206、208、210：步骤。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所公开的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。
在本说明书和所附的请求项中，单数的「一」和「该」包括至少一个或是一个以上的指示物，除非内容另有明确的规定。还应注意的，用语「或」，一般上在运用时其意义包括「和/或」，除非内容另有明确的规定。
泌尿上皮癌在一般人的发生率并不高，但是在接受透析治疗(洗肾)的病人却相当常见，复发的比率也较高。此外，值得注意的是，在国外以肾脏细胞癌较多，但在中国台湾却以泌尿道上皮细胞癌为主。
泌尿上皮癌基本的治疗是做患侧的肾脏输尿管全切除手术，目前此项手术大都采用微创手术(腹腔镜手术或达文西机器手臂辅助手术)，可以比传统开刀手术有更好的伤口外观、较少的流血、较少的疼痛及较快的恢复期。只要一发现血尿立刻求诊没有延误的话，病人的五年存活率可达九成。若是病人有特殊状况，例如只剩下一个肾脏或是另一侧无癌症的肾脏功能也极度不佳，而预期施行标准的肾脏全切除手术后会马上洗肾的话，则可以视情况做局部切除手术而保留肾脏。此外此癌症对于化学治疗及放射治疗也有不错的反应。因此也会在手术前后结合以上两项的治疗，使癌症的治疗达到最好的效果。例如第三期或第四期的病人，会先施行化学治疗使肿瘤范围缩小后再施行手术，如此会有机会得到更佳的完全治愈率。
因此，如果能越早发现泌尿上皮癌，便愈能提升病人的存活率。
本揭示内容的一些实验例为分析泌尿道上皮细胞癌发生率高的接受透析治疗的病人，来进行长期的追踪研究，包括病人的临床表现，生化、血液及影像学检查，微型核糖核酸于血液尿液及组织的变化，疾病和肿瘤的发生和进展，以及治疗的追踪和评估，并分析确认微型核糖核酸在其中所扮演的角色。
请参见图1，绘示筛选与泌尿上皮癌相关的微型核糖核酸的流程图。
方法100起始于步骤102，收集接受透析治疗病人的血浆样品。由于这群病人有高的泌尿上皮癌发生率，因此比较这群病人中，无泌尿上皮癌病人和有泌尿上皮癌病人的微型核糖核酸表现量的差异。
步骤104为从血浆样品中萃取总微型核糖核酸。微型核糖核酸在人类的组织与细胞样本中非常稳定，不易被降解，在许多体液中如血液、唾液、尿液等样本都可以侦测得到微型核糖核酸。本揭示内容的一些实验例是从病人的血液样本中分离出血浆(plasma)，之后检测血浆中的微型核糖核酸。
之后步骤106为将总微型核糖核酸反转录为互补的去氧核糖核酸(cDNA)。
之后步骤108为进行微型核糖核酸阵列实验，将反转录的cDNA以微型核糖核酸晶片检测，检测晶片所涵盖的可检测微型核糖核酸的表现。例如， Array HumanMicroRNA A Cards v2.0晶片可用于检测近三千种人类微型核糖核酸的表现。
之后，步骤110为资料分析和挑选候选基因。由微型核糖核酸阵列实验的结果，可以挑出在无泌尿上皮癌病人和有泌尿上皮癌病人之间，表现量有明显差异的特定的微型核糖核酸。例如，有些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌病人的样品中表现量较高，另一些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌病人的样品中表现量较低；这些特定的微型核糖核酸可做为检测泌尿上皮癌的候选基因。
之后，方法100的步骤112为验证候选基因。进一步地再对这些候选基因做验证，例如进行即时PCR定量实验，量测这些个别的候选基因在非泌尿上皮癌受试者和泌尿上皮癌病人之间的表现量。另外，也用新的受试者群的样品再做验证。
在本揭示内容中，利用接收者操作特征曲线(ROC curve)获得检测泌尿上皮癌的特异性和准确度。例如：利用「prism」这套软体绘制接收者操作特征曲线，输入的资料为正规化后的微型核糖核酸的表现量；在计算部分皆使用预设值进行，接着挑选概似比(likelihood ratio)最大情况下相对应的值当作阀值(cut off)，藉由阀值进而得出灵敏度与特异性以及准确度。
此外，在一些实验例中，还包含测试不同的微型核糖核酸的组合，对于各个微型核糖核酸的表现量做数值运算，并以多元逻辑回归分析方式(例如：罗吉斯回归分析)，建立模型公式，以用于分析计算泌尿上皮癌的风险。
实验例
病人检体收集
病人检体来自坜新医院接受长期透析(规则透析超过3个月)的病人，选择100人进行为期3年的追踪研究，包括基础的微型核糖核酸分析，每年追踪至研究结束；并配合病人的临床表现，每月定期的生化血液检验，每半年的免疫学检查，和每年的放射影像检查，以进一步分析微型核糖核酸与泌尿上皮癌的相关性。此外，对于已经发现肿瘤的病人，则分析微型核糖核酸的表现和抗体在有无肿瘤的病人之间的差异，判断是否可以作为筛选诊断肿瘤的生物标记，于肿瘤治疗的过程中，是否可以作为治疗效果及预后评估的工具，并用于治疗后的追踪标记。
以常规的方式，萃取病人的血浆检体中的总微型核糖核酸(total miRNA)，并且反转录为互补去氧核糖核酸(cDNA)。
进行反转录与微型核糖核酸阵列
确认由检体萃取的总微型核糖核酸的品质合乎标准之后，进行微型核糖核酸阵列的实验。阵列的实验的步骤包括：取用检体总微型核糖核酸样本600奈克(nanogram，ng)，按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptase原厂所提供的步骤进行反转录(ReverseTranscription RT)，接着将反转录的产物(RT product，即cDNA)，依照 ArrayHuman MicroRNA A Cards v2.0原厂所提供的步骤进行微型核糖核酸阵列的实验。
资料分析及确认候选基因
资料的正规化共使用了两种方法，第一种是用RNU6(U6 small nuclear RNA)作正规化，这个方式是利用微型核糖核酸阵列中的RNU6的CT值当作参考点，通过2-△CT这一个公式转换成表现量，其中的△CT为「目标微型核糖核酸的CT值减去RNU6的CT值」。第二种方法是利用微型核糖核酸阵列中，所有被侦测到的微型核糖核酸的CT值的平均当作参考点，通过2-△CT这一个公式转换成表现量，其中的△CT为「目标微型核糖核酸的CT值减去平均的CT值」。
接着再把得到数据用R语言做丛集(cluster)分析以及计算倍率。利用R语言中的「gplots」套件的「plot」函式绘制。横轴(x axis)摆放的是倍率或是差异，倍率或是差异的计算是采用各组平均的方式进行，利用得泌尿上皮癌(UC)的组当作实验组，没有得泌尿上皮癌(non UC)当作控制组，将实验组(UC)的数据除以控制组(non UC)的数据，即可得到倍率或是差异。纵轴(y axis)摆放的是T检定后经过-log10处理的P值，T检定是使用R语言预设的「t.test」函式进行。
在一实验例中，8个接受透析治疗的病人的样品进行微型核糖核酸阵列实验，其中4个病人罹患泌尿上皮癌，4个病人没有罹患此癌症。下表一为这8个病人的特征表。
表一
分析以上8个病人的微型核糖核酸阵列的资料后，挑选出8个微型核糖核酸基因：miR-19b-1、miR-183、miR-636、miR-155、miR-378、miR-487a、miR-150、和miR-210。参见下表二，这些基因的表现量上的差异的分析可分为三种类型，其中专有的表现(Unique)指的是只在泌尿上皮癌病人(UC)或非泌尿上皮癌病人(non-UC)表现的微型核糖核酸；单变数分析(Single analysis)指通过U6-snRNA正规化后在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人(non-UC)之间在表现量上有显著差异的微型核糖核酸；比值分析(Ratio analysis)指通过U6-snRNA正规化后的二个微型核糖核酸的组合的数据在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人之间有显著差异。
表二
为了进一步验证初步筛选的结果，再用新的受试者做验证。收集了52个受试者的样品，分离出血浆。之后萃取血浆中的总微型核糖核酸，并且进行反转录。之后量测在反转录后的样品中，上述8个微型核糖核酸的表现量，所用的检验试剂为Taqmen miRNA assay(美商应用生命系统(Applied Biosystems))。
下表三为这52个病人的特征表。
表三
之后由上表三的病人群组中的样品，进行Real-time PCR，得到的前述8种微型核糖核酸表现量数据。将这些表现量数据进行运算，更确认一些miRNA的比值(二种RNA的表现量的比值，例如：miR-155/miR-150)，在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人有差异。这些特定的微型核糖核酸表现量的比值，会有助于用于分析计算泌尿上皮癌的风险。
下表四示出一些在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人呈现差异的微型核糖核酸比值，其中，这些微型核糖核酸比值的接受者操作特征曲线的曲线下面积至少大于0.6。
表四
曲线下面积 P值
miR-155/miR-150 0.751 0.004857
miR-378/miR-150 0.714 0.01673
miR-636/miR-150 0.701 0.02436
miR-150/miR-210 0.685 0.03848
miR-19b-1/miR-378 0.676 0.04897
miR-19b-1/miR-487a 0.668 0.2200
miR-210/miR-183 0.658 0.012
miR-19b-1/miR-155 0.656 0.215721
miR-487a/miR-155 0.65 0.218336
miR-636/miR-487a 0.644 0.098878
miR-210/miR-487a 0.641 0.136675
请参看图2A至图2E，分别显示上述表三中的五种微型核糖核酸的比值在非泌尿上皮癌受试者和泌尿上皮癌病人的数值分布情形，其中「*」和「**」记号表示在两群受试者之间，微型核糖核酸的比值的差异为显著的，其中「˙」表示离群值，「*」表示P值小于0.05，「**」表示P值小于0.01。
参看图2A，显示miR-155/miR-150比值，在泌尿上皮癌的受试者显著高于在非泌尿上皮癌受试者。
参看图2B，显示miR-378/miR-150比值，在泌尿上皮癌的受试者显著高于在非泌尿上皮癌受试者。
参看图2C，显示miR-636/miR-150比值，在泌尿上皮癌的受试者显著高于在非泌尿上皮癌受试者。
参看图2D，显示miR-150/miR-210比值，在泌尿上皮癌的受试者显著低于在非泌尿上皮癌受试者。
参看图2E，显示miR-19b-1/miR-378比值，在泌尿上皮癌的受试者显著低于非泌尿上皮癌受试者。
接下来，还利用这些特定的微型核糖核酸的表现量比值，利用多元逻辑回归分析，例如：罗吉斯回归分析(Logistic regression)，建立检测泌尿上皮癌的模型公式，如下所示：
Logit P＝-4.762+(2.852×miR-155/miR-150)+(0.337×miR-378/miR-150)+(1.276×miR-636/miR-150)+(1.578×miR-19b-1/miR-378)
参看图3A，其为上述表三的病人群组的数据，利用上述模型公式，绘制得出的ROC曲线图。ROC曲线图中的曲线下面积(AUC)越接近于1，代表灵敏度和特异性越高。图3A显示曲线下面积(AUC)为0.882，因此本揭示内容的模型公式具有极高的准确度。
参看图3B，显示以上述模型公式所得到的评分(Signature score)，在泌尿上皮癌受试者非常显著地高于在非泌尿上皮癌的受试者。
参看图3C，显示运用上述模型公式，检测泌尿上皮癌的敏感性为80％，特异性为83.7％。
因此，由上述的实验结果可知，本揭示内容中，以miR-19b-1、miR-183、miR-636、miR-155、miR-378、miR-150、miR-210、或miR-487的表现量，可作为泌尿上皮癌的检测标记，因为这些微型核糖核酸的表现量与泌尿上皮癌呈显著相关。并且，例如可利用这些微型核糖核酸表现量的组合，或是可利用两个微型核糖核酸的比值，因为这些数据在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人之间呈现差异。
在本揭示内容中，利用miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-19b-1/miR-378这些比值，代入模型公式所得出的评分，在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌受试者之间具有更显著的差异。
因此，本揭示内容提供了以miR-19b-1、miR-183、miR-636、miR-155、miR-378、和miR-150、miR-210、或miR-487作为泌尿上皮癌的检测标记，因此可用于开发检测泌尿上皮癌的套组和方法。之后，对于怀疑有泌尿上皮癌可能性的病人，可以检测这些微型核糖核酸的表现量，或是用于追踪已接受治疗的病人，以判断治疗的效果或评估肿瘤是否复发。
在本揭示内容的一些实施方式中，泌尿上皮癌的检测套组包含：检测微型核糖核酸的引物或探针，微型核糖核酸选自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487、及其组合所组成的群组。
在一些实施方式中的检测套组，所检测的微型核糖核酸为选自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、和miR-487所组成的群组中的至少二者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、或此八个微型核糖核酸。
在一些实施方式中的检测套组，所检测的微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、和miR-378。
在一些实施方式中的检测套组，所检测的微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、和miR-378。
在一些实施方式中的检测套组，可用于检测泌尿上皮癌，例如：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌及尿道癌。
在一些实施方式中，引物或探针特异性地与欲检测的微型核糖核酸结合，其中miR-19b-1的序列为SEQ ID NO:1，miR-636的序列为SEQ ID NO:2，miR-150的序列为SEQ IDNO:3，miR-155的序列为SEQ ID NO:4，miR-183的序列为SEQ ID NO:5，miR-378的序列为SEQID NO:6，miR-210的序列为SEQ ID NO:7，miR-487的序列为SEQ ID NO:8。
在一些实施方式中的所检测的序列，其中miR-19b-1为hsa-miR-19b-3p；miR-636为hsa-miR-636；miR-150为hsa-miR-150-5p；miR-155为hsa-miR-155-5p；miR-183为hsa-miR-183-5p；miR-378为hsa-miR-378a-5p；miR-210为hsa-miR-210-3p；miR-487为hsa-miR-487a-3p。
在一些实施方式中的检测套组，套组可能为试剂盒的型式，并且还包括PCR反应的常用试剂，如缓冲液，dNTP、MgCl2、纯水和Tag酶等。还可以含有标准品和/或对照品。
在一些实施方式中的检测套组，其中的探针或引子可能固定于固体载体，例如晶片。
在本揭示内容的一些实施方式中，泌尿上皮癌的检测方法，包含：测量受试者的样本中的微型核糖核酸表现量，微型核糖核酸选自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487、和其组合所组成的群组。
在一些实施方式中，更包含分析计算受试者罹患泌尿上皮癌的风险。
在本揭示内容的一些实施方式中，提出了制备用于泌尿上皮癌的检测套组在检测泌尿上皮癌的用途，包含：测量受试者的样本中的微型核糖核酸表现量，微型核糖核酸选自miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487、和其组合所组成的群组。
请参看图4，为根据一实施方式的检测泌尿上皮癌的方法的流程。方法200首先为步骤202，收集受试者的检体。检体类型可能例如为血液、血清、或血浆、尿液、唾液、或腹水液等。之后步骤202为萃取检体中的总微型核糖核酸。步骤206为进行反转录，将总微型糖核酸反转录为互补的去氧核糖核酸。
方法200的步骤208为进行PCR反应(例如：real-time PCR)，检测微型核糖核酸选自miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487，或其组合的表现量。
之后方法200的步骤210为分析计算受试者罹患泌尿上皮癌的风险。由于所检测的微型核糖核酸的表现量为泌尿上皮癌的标记，因此可用于评估受试者罹患此癌症的可能性高或低。
在一些实施方式中的检测方法，所检测的微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、miR-487中的至少二者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、或此八个微型核糖核酸。
在一些实施方式中的检测方法，所检测的微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、和miR-378。
在一些实施方式中的检测方法，所检测的微型核糖核酸为miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、和miR-378。
在一些实施方式中的检测方法，可用于检测泌尿上皮癌，例如：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌及尿道癌。
在一些实施方式中的检测方法，其中测量受试者的样本中的微型核糖核酸表现量包含：加入与所述微型核糖核酸的反转录产物会特异性结合的探针或引子；以及进行PCR反应。
在一些实施方式的检测方法，分析计算受试者罹患泌尿上皮癌的风险包括根据微型核糖核酸的表现量计算受试者的评分。
在一些实施方式的检测方法，计算评分的方式包含经由量测到的微型核糖核酸表现量，经过计算，得出受试者的风险相关的评分，根据此评分可以决定受试者的罹癌风险。
在一些实施方式中，计算评分是利用两种微型核糖核酸的表现量的比值。
在一些实施方式中，计算评分是利用多组微型核糖核酸的表现量的比值。
在一些实施方式中，利用miR-150/miR-155、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、或miR-19b-1/miR-378的值来计算罹病风险的评分。例如：以表现量比值分析计算，miR-150/miR-155的值<7.930时，表示此受试者有罹患泌尿上皮癌风险，且转换分数设定为1分；miR-150/miR-378的值<7.145时，表示此受试者有罹患泌尿上皮癌风险，且转换分数设定为1分；miR-150/miR-183的值<181.4时，表示此受试者有罹患泌尿上皮癌风险，且转换分数设定为1分；miR-19b-1/miR-183的值<1.627时，表示此受试者有罹患泌尿上皮癌风险，且转换分数设定为1分。之后，受试者的总转换分数越高，即代表罹患泌尿上皮癌的可能性越高。
在一些实施方式中，计算受试者的评分包含计算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-150/miR-210、miR-19b-1/miR-378、或miR-210/miR-183。
在一些实施方式中，其中计算受试者的评分包含计算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-19b-1/miR-378、和miR-210/miR-183。
在一些实施方式中，其中计算受试者的评分还包括以一公式得到评分值，其中此公式为：
Logit P＝-4.762+(2.852×miR-155/miR-150)+(0.337×miR-378/miR-150)+(1.276×miR-636/miR-150)+(1.578×miR-19b-1/miR-378)
在一些实施方式的检测方法，其中的受试者为罹患泌尿上皮癌风险较高的人，例如接受透析治疗的病人。
在一些实施方式中，如果受试者的风险相关的评分为正值，例如高于0、高于0.5、高于1、或更高，代表受试者有较高的罹患泌尿上皮癌的风险；如果受试者的风险相关的评分低于-2、低于-3、低于-4、低于-5、或更低，代表受试者有较低的罹患泌尿上皮癌的风险。
在一些实施方式的检测方法，其中样本为血液、血清、或血浆、尿液、唾液、或腹水液。
在一些实施方式中，与检测单独的微型核糖核酸相比，检测由较多的微型核糖核酸组成的群组更能提高泌尿上皮癌诊断的灵敏度和特异性。
本揭示内容的实施方式可以帮助有罹患泌尿上皮癌风险的受试者，例如接受透析治疗的病患，可以更好监控或是预测癌症。相较于传统的肿瘤标志物，体液(例如血浆)中的微型核糖核酸作为泌尿上皮癌的标志物，具有稳定性好、非侵入性或微创易获取、灵敏性和特异性高的优点。本揭示内容所提供的套组和检测方法在泌尿上皮癌的诊断及追踪具有高的临床应用价值。
虽然本发明已以实施方式公开如上，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视随附的权利要求所界定为准。
序列表
<110> 马念涵，张焕祯，台达电子工业股份有限公司
<120> 泌尿上皮癌的检测套组及微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌检测套组中的应用
<140> CN201910299262.5
<141> 2019-04-15
<150> TW107140464
<151> 2018-11-14
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
aguuuugcag guuugcaucc agc 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ugugcuugcu cgucccgccc gca 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gugaauuacc gaagggccau aa 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
acuggacuug gagucagaag gc 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
cugugcgugu gacagcggcu ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
aaucauacag ggacauccag uu 22

Claims (10)

1.一种泌尿上皮癌的检测套组，其特征在于，包含检测多种微型核糖核酸的引物或探针，所述微型核糖核酸是由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、和miR-487所组成的群组中的至少五者所组成，其中所述引物或探针用于检测泌尿上皮癌。
2.如权利要求1所述的泌尿上皮癌的检测套组，其特征在于，其中所述微型核糖核酸由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155和miR-378所组成。
3.如权利要求1所述的泌尿上皮癌的检测套组，其特征在于，其中所述miR-19b-1的序列为SEQ ID NO:1，所述miR-636的序列为SEQ ID NO:2，所述miR-150的序列为SEQ ID NO:3，所述miR-155的序列为SEQ ID NO:4，所述miR-183的序列为SEQ ID NO:5，所述miR-378的序列为SEQ ID NO:6，所述miR-210的序列为SEQ ID NO:7，所述miR-487的序列为SEQ IDNO:8。
4.一种微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，包含：
测量一样本中的微型核糖核酸表现量，所述微型核糖核酸是由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、miR-210、和miR-487所组成的群组中的至少五者所组成；以及
分析计算该样本的受试者罹患泌尿上皮癌的风险。
5.如权利要求4所述的微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，其中所述微型核糖核酸由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155和miR-378所组成。
6.如权利要求4所述的微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，其中测量该样本的受试者的该样本中的微型核糖核酸表现量包含：
加入与所述微型核糖核酸的反转录产物会特异性结合的探针或引子；以及
进行去氧核糖核酸扩增反应。
7.如权利要求4所述的微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，所述分析计算该样本的受试者罹患泌尿上皮癌的风险包括根据所述微型核糖核酸的表现量以计算所述受试者的一评分。
8.如权利要求7所述的微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，其中计算所述受试者的所述评分包含计算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-150/miR-210、或miR-19b-1/miR-378。
9.如权利要求7所述的微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，其中计算所述受试者的所述评分包含计算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、和miR-19b-1/miR-378。
10.如权利要求9所述的微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌的检测套组中的应用，其特征在于，其中所述计算所述受试者的所述评分还包括以一公式得到所述评分值，其中所述公式为：Logit P＝-4.762+(2.852×miR-155/miR-150)+(0.337×miR-378/miR-150)+(1.276×miR-636/miR-150)+(1.578×miR-19b-1/miR-378)。
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