CN109988834A - 血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p及应用 - Google Patents

血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血浆外泌体分子标志物has‑miR‑219a‑5p的制备及应用的试剂盒。该血浆外泌体分子标志物为has‑miR‑219a‑5p，该应用主要是指该分子标志物用于制备预测滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasia,GTN)对甲氨蝶呤单药化疗耐药性的试剂盒。通过定量检测女性血浆外泌体分子标志物has‑miR‑219a‑5p的水平来对绒毛膜癌患者甲氨蝶呤单药化疗的耐药性进行早期预测。本发明试剂盒应用简单、经济实用，对于GTN患者的化疗预测具有临床意义。

Description

血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p及应用
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种血浆外泌体has-miR-129-5p分子标志物在的制备及其在妊娠滋养细胞肿瘤患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测方面的应用。
技术背景
妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasia,GTN)，是一种来源于胚胎滋养细胞的恶性肿瘤，可继发于任何类型的妊娠。世界范围内的GTN发生率差异明显，且亚洲和拉丁美洲的发生率明显高于欧洲和北美洲。GTN恶性程度极高，发生转移早而广泛，在化疗药物问世前，其死亡率可高达90％以上。自从甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、放线菌素D(dactinomycin，ACT-D)、等一系列化疗药物有效应用于治疗GTN后，其治愈率已达80％～90％，使其成为通过化疗能治愈的首个人类实体肿瘤，因而化疗是其主要治疗手段，但仍有约10％－20％的GTN患者因发生耐药而达不到治愈目的。目前GTN的临床治疗多以FIGO2000妊娠滋养细胞肿瘤分期与预后评分系统为指导，但对于GTN化疗效果的评估，特别是化疗耐药性的预测仍难以令人满意。随着分子医学的发展，寻找GTN早期诊断及耐药性预测的分子标志物，以便对GTN患者进行分层精准治疗，从而提高其治愈率，已成为GTN研究的关注点。
外泌体(exosome)，最初是指网织红细胞分化过程中分泌的由多囊泡内体(MV)与质膜融合形成的直径为40-100nm的囊泡样结构。随后大量研究发现各种类型的细胞均能释放外泌体，并广泛分布于唾液、血浆和乳汁等各种体液当中。外泌体内携带有蛋白、RNA、DNA、细胞因子等多种生物活性物质，并能传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与疾病的发生发展密切相关。近年来，寻找以外泌体为依托的分子标志物已成为研究的热点，特别是外泌体来源的microRNA，由于其比血浆游离microRNA具有更好的稳定性，且在外泌体中靶向富集，其作为分子标志物的巨大潜力日益显现。本发明即是首次提出发现了一种血浆外泌体microRNA可以作为GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性预测的分子标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p，可用于对GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测方面的应用方法及制备的试剂盒。
血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p在制备GTN患者早期预测甲氨蝶呤单药化疗耐药性的试剂盒中的应用，
所述的has-miR-219a-5p的序列是：UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU。
所述的GTN早期预测甲氨蝶呤单药化疗耐药性的试剂盒为用于定量检测血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p的试剂盒，具体是实时荧光定量PCR检测试剂盒。
一种具有GTN早期甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测能力的试剂盒，包括血浆外泌体提取系统、外泌体microRNA提取系统、反转录系统、扩增系统和相对定量内参标准化系统。所述的试剂盒是通过定量检测血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p来早期预测GTN患者对甲氨蝶呤单药化疗耐药性；所述的has-miR-219a-5p的序列是：UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU。
所述的相对定量内参标准化系统由has-miR-129-5p组成；所述的has-miR-129-5p的序列是：CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。
所述的血浆外泌体提取系统包括：ExoQuickTMExosome Precipitation Solution；
所述的外泌体microRNA提取系统包括：QIAzolTMLysis Reagent(RNA裂解液)、三氯甲烷、Buffer RWT和Buffer RPE(RNA清洗液)、RNase-Free Water(无酶水)。
所述的反转录系统包括：5×miScript Buffer(5×反转录缓冲液)、10×NucleicsMix(10×核苷酸混合物)、miScript Reverse Transcriptase Mix(反转录酶)、RNase-FreeWater(无酶水)。
所述的扩增系统包括：2×SYBR Green PCR Master Mix(2×转录混合液)、10×MiScript Universal Primer(10×通用引物)、10×Primer(10×引物)、RNase-Free Water(无酶水)。
本发明的有益效果在于：本发明所提供的血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p能够用于GTN患者对甲氨蝶呤单药化疗耐药性的早期预测。通过对10例正常早期妊娠妇女(用NP代表)、10例GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感(用SP代表)和10例GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药患者(用RP代表)的血浆外泌体进行高通量二代测序发现has-miR-219a-5p的表达在正常早期妊娠妇女和GTN患者之间存在差异性表达(p<0.001)，且在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感和耐药患者之间也存在差异性表达(p<0.01)(图3)。后又进一步对50例正常早期妊娠妇女、37例GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感和22例GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药患者的血浆外泌体进行实时荧光定量PCR检测，确认了其在不同病人群体中差异性的存在(p<0.001)(图4)。本发明通过检测各人群中血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p的水平，能对妊娠女性做出GTN患者则可进行早期甲氨蝶呤单药化疗耐药预测，从而将对针对GTN患者个体化治疗方案的准确性提高至一个新的水平。同时，通过实时荧光定量PCR检测技术对GTN患者血浆外泌体has-miR-219a-5p水平的检测，取材便利，创伤性小，定量准确，相较于芯片技术、高通量测序等技术，此方法更简单快速，经济实用，适合临床开展。
附图说明
图1A是透射电镜拍摄的所提取的血浆外泌体的鉴定图。
图1B是Western Blot所示的血浆外泌体膜表面蛋白分子的条带图。
图2是Agilent2100生物分析仪分析的所提取的血浆外泌体RNA的鉴定图。
图3是通过高通量二代测序技术分析所提取的血浆外泌体microRNA种类，其中NP代表正常妊娠组，SP代表GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组，RP代表GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药组。
图4A是本发明所提供的相对定量内参标准化系统has-miR-129-5p在正常妊娠组和GTN患者组的样本中经qRT-PCR采用原始Ct值的分析图，其中NP代表正常妊娠组，PP代表GTN患者组。
图4B是本发明中血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p在正常妊娠组和GTN患者组的样本中经qRT-PCR相对定量分析图，其中NP代表正常妊娠组，PP代表GTN患者组；
图4C是本发明中血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组和GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组的样本中经qRT-PCR相对定量分析图，其中SP代表GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组，RP代表GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药组；
图5是本发明中血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组和耐药组的样本中的ROC诊断分析图。
具体实施方式
以下结合附图说明和具体实施方式进一步阐述本发明，而非限制本发明的保护范围。
实施例1：检测GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组、耐药组和正常妊娠组血浆样本中外泌体microRNA的表达。
具体实验过程及结果如下：
1、标本的收集及分组
(1)、标本的来源：本实例选取GTN化疗患者血浆样本20例，依据国际妇产科联盟妊娠滋养细胞肿瘤临床分期与预后评分系统(FIGO2000)，均是首次诊断为GTN，危险评分为低危，且未经化疗的患者。另外选取正常妊娠女性血浆样本10例，均来自于人工流产的自愿者。
以下为纳入标准：
1)GTN患者组
入组标准(符合下列全部条件)：
①签署知情同意书；
②临床诊断为妊娠滋养细胞肿瘤；
③没有接受放、化疗的初治病人(包括预防性化疗)；
④年龄20-45岁；
⑤体力分级：ECOG评分≥60分；
⑥血象(3天内)：WBC≥3.5×109/L，ANC≥1.5×109/L,Pt≥80×109/L,血清胆红素≤正常值高限的1.5倍，转氨酶≤正常值高限的1.5倍，BUN、Cr≤正常值高限；
⑦无严重内科合并症；
⑧患者能按方案要求接受随访。
排除标准(符合一下任何一条)：
①临床未明确诊断妊娠滋养细胞肿瘤；
②病理诊断为中间型滋养细胞肿瘤，包括PSTT和ETT；
③已进行放、化疗者(包括预防性化疗)；
④有严重的或不能控制的内科疾患，不适合化疗者；
⑤1年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗者。
2)正常对照组的入组标准(符合下列全部条件)：
①签署知情同意书；
②孕周8-12周入院要求终止妊娠者；
③年龄20-45岁；
④无内科合并症。
(2)标本的分组
根据FIGO2000首诊评定为低危的GTN患者，首次选用甲氨蝶呤(MTX)进行单药化疗。在每一疗程化疗结束后，至少每周一次检测血hCG，并结合影像学检查。在每疗程化疗结束至18日内，血hCG下降至少1个对数为有效(即敏感)；若连续2次检测血HCG水平呈平台(±10％)或上升(＞10％)为无效(即耐药)。
经长期随访后得到其化疗结局，在20例GTN单药化疗患者中，10例为甲氨蝶呤敏感，10例为甲氨蝶呤耐药。
2、血浆样本的处理
(1)采集管抗凝剂为EDTA或柠檬酸钠(即枸橼酸钠)，不能用肝素抗凝。
(2)采集操作按照外周血标准采集操作进行，采血后充分颠倒混匀，避免凝固，采血后标本放置在4℃冰箱。
(3)血浆的分离在采血后2小时内完成，4℃下4000g离心15min，收集上层血浆，采用1.5mlEP管分装，-80℃冻存，直至使用。
3、血浆外泌体的提取与鉴定
①将-80℃储存的血浆样品置于冰上融化，取250ml血浆至洁净1.5mlEP管内。
②4℃下16000g离心10min，以去除冷凝蛋白和细胞碎片，取其上清。
③加入等体积STAGOTM凝血酶原时间测定试剂(REF00667)，室温下放置10-15min后10000g离心5min，以去除血浆中的纤维蛋白原等。
④取上清于RNA-free洁净EP管中按1/4标本总体积加入ExoQuickTMExosomePrecipitation Solution(Catalog#EXOQ20A-1)试剂，充分混匀。
⑤加入RNase A使混合物的终浓度为10ug/ml，在4℃冰箱内放置至少12h。
⑥加入Rnase inhibitor murine,150units/ml，使浓度为40000units/ml，充分混匀。
⑦室温下1500g离心30min，吸弃上清。
⑧剩余物室温下1500g离心5min，再次弃去剩余上清。
⑨用200ulPBS清洗沉淀。
⑩用20ul灭菌PBS重悬外泌体沉淀，使外泌体充分溶解于PBS中。
4、外泌体microRNA的提取与质检
所有血浆外泌体microRNA的提取均按照Qiagen miRNeasy Micro Kit(Cat.No.217084)试剂盒所提供的操作步骤。提取完成后保存于-20℃，直至检测。
所提取的血浆外泌体microRNA使用InvitrogenTMQubit 2.0Fluorometer配合Qubit microRNA Assay Kit(Cat.No.Q32880)测定外泌体内microRNA浓度。
所提取的血浆外泌体microRNA使用Agilent 2100生物分析仪配合Agilent SmallRNA Kit(reorder-no 5067-1548)进行质检。
5、外泌体miRNA文库的建立与测序
实验流程按照Illumina公司提供的标准步骤执行。
小RNA测序文库制备采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,SanDiego,USA)试剂盒。
对构建好的文库采用Illumina·HiSeq2000/2500进行测序。
6、数据分析
通过高通量二代测序技术得到血浆外泌体样本中microRNA的表达谱。测序结果分析采用Bedtools 2.20.0进行，统计学分析采用SPSS20.0进行，当p<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异。分析内容为microRNA在各组血浆外泌体中表达的差异性分析。实验结果如下：
(1)所提取的血浆外泌体的鉴定；
如图1，通过透射电镜观察鉴定可知，所提取的血浆外泌体符合外泌体典型的大小(直径30～150nm)与结构(双凹圆盘状或杯状)。
(2)所提取的外泌体microRNA的质检；
如图2，通过Agilent 2100生物分析仪分析表明，血浆外泌体所提总RNA内主要是small RNA，其中microRNA约占80％左右，浓度在1～10ng/ul。
(3)microRNA在血浆外泌体中的特异性表达
如图3，通过Illumina·HiSeq/MiSeq进行高通量二代测序技术分析，表明在GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药组(用RP代表)、GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组(用SP代表)和正常妊娠组(用NP代表)所提取的血浆外泌体中均检测到has-miR-219a-5p存在表达。通过标准化分析后得到has-miR-219a-5p的表达量在正常妊娠组和GTN患者之间存在统计学显著性差异(p＝0.0007)，在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组和耐药组之间也存在统计学显著性差异(p＝0.0015)，说明其可作为区分正常妊娠和GTN患者及GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感和耐药患者的生物标志物，为后续实验提供基础。通过标准化分析后得到has-miR-129-5p(has-miR-129-5p的序列是：CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC)在正常妊娠组和GTN患者之间表达恒定，说明其具有作为相对定量内参的能力，为后续实验提供基础。
由此可知，has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组、耐药组和正常妊娠组血浆样本的外泌体中的表达存在显著统计学差异，可作为对GTN的早期诊断和对甲氨蝶呤单药化疗耐药性的预测分子标志物。
实施例2：验证has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组、化疗耐药组和正常妊娠组血浆样本中外泌体的表达差异和诊断效能。
具体实验过程及结果如下：
1、标本的收集及分组
本实例选取GTN化疗患者血浆样本79例，依据国际妇产科联盟妊娠滋养细胞肿瘤临床分期与预后评分系统(FIGO2000)，均是首次诊断为GTN，危险评分为低危，且未经化疗的患者。经长期随访后得到其化疗结局，其中47例为甲氨蝶呤敏感，32例为甲氨蝶呤耐药。另外选取正常妊娠女性血浆样本60例，均来自于人工流产的自愿者。
2、血浆样本的处理
(1)采集管抗凝剂为EDTA或柠檬酸钠(即枸橼酸钠)，不能用肝素抗凝。
(2)采集操作按照外周血标准采集操作进行，采血后充分颠倒混匀，避免凝固，采血后标本放置在4℃冰箱。
(3)血浆的分离在采血后2小时内完成，4℃下4000g离心15min，收集上层血浆，采用1.5mlEP管分装，-80℃冻存，直至使用。
3、血浆外泌体的提取
①将-80℃储存的血浆样品置于冰上融化，取250ml血浆至洁净1.5mlEP管内。
②4℃下16000g离心10min，以去除冷凝蛋白和细胞碎片，取其上清。
③加入等体积STAGOTM凝血酶原时间测定试剂(REF00667)，室温下放置10-15min后10000g离心5min，以去除血浆中的纤维蛋白原等。
④取上清于RNA-free洁净EP管中按1/4标本总体积加入ExoQuickTMExosomePrecipitation Solution(Catalog#EXOQ20A-1)试剂，充分混匀。
⑤加入RNase A使混合物的终浓度为10ug/ml，在4℃冰箱内放置至少12h。
⑥加入Rnase inhibitor murine,150units/ml，使浓度为40000units/ml，充分混匀。
⑦室温下1500g离心30min，吸弃上清。
⑧剩余物室温下1500g离心5min，再次弃去剩余上清。
⑨用200ulPBS清洗沉淀。
⑩用20ul灭菌PBS重悬外泌体沉淀，使外泌体充分溶解于PBS中。
4、外泌体microRNA的提取和质检
所有血浆外泌体microRNA的提取均按照Qiagen miRNeasy Micro Kit(Cat.No.217084)试剂盒所提供的操作步骤。提取完成后保存于-20℃，直至检测。
所提取的血浆外泌体microRNA使用InvitrogenTMQubit 2.0Fluorometer配合Qubit microRNA Assay Kit(Cat.No.Q32880)测定外泌体内microRNA浓度。
所提取的血浆外泌体microRNA使用Agilent 2100生物分析仪配合Agilent SmallRNA Kit(reorder-no 5067-1548)进行质检。
5、microRNA的逆转录
采用通用加尾法进行逆转录，具体操作参照Qiagen miScriptⅡRT Kit(cat.nos.218161)试剂盒所提供的说明书。
①配制miRNA样本
成分 体积/量
microRNA 10ng
RNase-free water Up to 12ml
总体积 12ul
②配制逆转录反应体系
20ul逆转录反应体系如下：
成分 体积/量
5X miScript Hiflex Buffer 4ul
10X miScript Nucleics Mix 2ul
miScript Reverse Transcriptase Mix 2ul
第1步miRNA样本 12ul
总体积 20ul
③进行逆转录反应
程序如下：
第一步：37℃60min；
第二步：95℃5min；
第三步：冰上静置。
仪器：48well geneAmp PCR system 9700。
④配制cDNA样本
向第③步反应产物加入200ul RNase-free water，得到稀释的cDNA样本。保存于-20℃，直至使用。
6、实时荧光定量PCR
①根据上海生工生物工程有限公司提供的加尾法上游引物，浓度为10uM。
名称 hsa-miR-219a-5p hsa-miR-129-5p
物种 Human human
编号 MIMAT0000276 MIMAT0000242
序列 UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC
引物序列 AGTGATTGTCCAAACGCAATTCT CTTTTTGCGGTCTGGGCTT
②配制qRT-PCR反应体系
具体操作参照Green PCR Kit(cat.nos.218076)试剂盒所提供的说明书。
25ul PCR反应体系如下：
成分 反应体系(96孔)
2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5ul
10×miScript Universal Primer 2.5ul
Specific Forward Primer(c＝10uM) 2.5ul
RNase-free Water 5ul
Diluted cDNA 2.5ul
总体积 25ul
③进行实时荧光定量PCR
反应程序如下：
第一步：95℃15min；
第二步：94℃15sec
55℃30sec
70℃30sec
共40个循环，终点采集荧光。
仪器：Applied biosystems 7900HT。
7、数据分析
qRT-PCR检测microRNA相对表达量的计算公式为RQ＝2-ΔΔCt，所有反应均做3个副孔，如Ct值差异较大(>0.5)，则重复一次。统计学分析采用GraphPad Prism6.0和SPSS20.0进行，当p<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异。分析内容为microRNA在各组血浆外泌体中表达的差异性分析和ROC诊断分析。
实验结果如下：
本实例通过以上实验方法验证了has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组、化疗耐药组和正常妊娠组血浆样本的外泌体中的表达存在显著统计学差异，可作为对GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药性的预测分子标志物。
1、相对定量内参hsa-miR-129-5p的确认：
结合实例1中的测序结果，通过对随机选取的79例GTN组和随机选取的60例正常妊娠组标本的检测结果进行分析可得(如图4A)，在各种标本之间表达恒定，确认可作为相对定量内参。
所述的has-miR-129-5p的序列是：CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。
2、has-miR-219a-5p在各组间差异性表达的验证：
结合实例1中的测序结果，通过对随机选取的79例GTN组和随机选取的60例正常妊娠组标本的检测结果进行分析可得，has-miR-219a-5p在GTN组血浆样本外泌体中的表达量明显低于正常妊娠组样本，结果具有显著统计学差异(如图4A)；通过对随机选取的47例GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组和随机选取的32例GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药组的检测结果进行分析可得，has-miR-219a-5p在甲氨蝶呤单药化疗耐药组血浆样本外泌体中的表达量明显低于甲氨蝶呤单药化疗敏感组样本，结果具有显著统计学差异(如图4B)。以上结果说明has-miR-219a-5p可作为对GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性的早期预测分子标志物。
所述的has-miR-129-5p的序列是：CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。
3、外泌体miR-219a-5p的ROC诊断分析：
结合实例1中的测序结果，通过对随机选取的47例GTN甲氨蝶呤单药化疗敏感组和随机选取的32例GTN甲氨蝶呤单药化疗耐药组的检测结果进行ROC诊断分析可得(如图5)，当外泌体miR-219a-5p的相对表达量≤0.215时，提示该患者可能对甲氨蝶呤单药化疗耐药，ROC曲线下面积AUC＝0.723，敏感度为81.3％，特异性为66.0％。
实施例3：血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p试剂盒的应用方法
本发明的试剂盒包括血浆外泌体提取系统、外泌体microRNA提取系统、反转录系统、扩增系统和相对定量内参标准化系统。该试剂盒通过定量检测GTN患者血浆外泌体has-miR-219a-5p的水平来早期预测GTN患者甲氨蝶呤单药化疗的耐药情况。
具体内容包括如下：
血浆外泌体提取系统包括：ExoQuickTMExosome Precipitation Solution；
外泌体microRNA提取系统包括：QIAzolTMLysis Reagent(RNA裂解液)、三氯甲烷、Buffer RWT和Buffer RPE(RNA清洗液)、RNase-Free Water(无酶水)。
反转录系统包括：5×miScript Buffer(5×反转录缓冲液)、10×Nucleics Mix(10×核苷酸混合物)、miScript Reverse Transcriptase Mix(反转录酶)、RNase-FreeWater(无酶水)。
扩增系统包括：2×SYBR Green PCR Master Mix(2×转录混合液)、10×MiScriptUniversal Primer(10×通用引物)、10×Primer(10×引物)、RNase-Free Water(无酶水)。
其中has-miR-219a-5p的序列为UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU，其PCR上游引物序列为AGTGATTGTCCAAACGCAATTCT。
相对定量内参标准化系统由has-miR-129-5p组成。
has-miR-129-5p的序列为CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC，其PCR上游引物序列为CTTTTTGCGGTCTGGGCTT。
本发明的试剂盒的使用步骤如下：
1、获取来源于被检测者的血浆样本；
2、提取血浆外泌体microRNA并质检；
3、利用特异性检测技术检测样本中分子标志物的表达；
4、对于检测者的甲氨蝶呤单药化疗耐药性进行早期预测。
具体操作如下：
1、血浆样本的采集与处理
(1)采集患者初次化疗前血样5ml，采集管抗凝剂为EDTA或柠檬酸钠(即枸橼酸钠)，不能用肝素抗凝。
(2)采集操作按照外周血标准采集操作进行，采血后充分颠倒混匀，避免凝固，采血后标本放置在4℃冰箱。
(3)血浆的分离在采血后2小时内完成，4℃下4000g离心15min，收集上层血浆，采用1.5mlEP管分装，-80℃冻存，直至使用。
2、血浆外泌体microRNA的提取和质检
具体操作采用实施例2中步骤3和步骤4。
3、检测样本中分子标志物的表达
具体操作采用实施例2中步骤5和步骤6。
4、数据分析
qRT-PCR检测microRNA相对表达量的计算公式为RQ＝2-ΔΔCt，所有反应均做3个副孔，如Ct值差异较大(>0.5)，则重复一次。统计学分析采用GraphPad Prism6.0和SPSS20.0进行。如图5所示，当检测样本中has-miR-219a-5p≤0.215时，预测绒毛膜癌患者可为甲氨蝶呤单药化疗耐药。
值得注意的是，具体实施方式仅是对本发明的说明，不应将其视为对本发明的技术方案的限制和限定，因此，采用本发明的实质内容而仅做局部改变，仍应落入本发明的保护范围内。
序列表
<120> 血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ugauugucca aacgcaauuc u 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
cuuuuugcgg ucugggcuug c 21

Claims (6)

1.一种GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测的血浆外泌体分子标志物，其特征在于，该标志物为has-miR-219a-5p，序列是：SEQ ID NO.1所示的UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU。
2.血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p在制备GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测的试剂盒为定量检测女性血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p的试剂盒。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的GTN患者甲氨蝶呤单药化疗耐药性早期预测的试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒，包括血浆外泌体提取系统、外泌体总RNA提取系统、反转录系统、扩增系统和相对定量内参标准化系统等；所述的试剂盒是通过定量检测女性血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p来对绒毛膜癌患者进行早期甲氨蝶呤单药化疗耐药性预测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的相对定量内参标准化系统由has-miR-129-5p组成；所述的has-miR-129-5p的序列是：SEQ ID NO.2所示的CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。
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