CN108220427A - 一种用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的血浆microRNA标记物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸(PSP)的血浆microRNA标记物及应用。该标志物由let‑7d、或者miR‑424或者let‑7d与miR‑424的组合组成，该标志物可有效地从PSP群体中筛查出单纯肺型BHD个体。本结果的应用将优化PSP与肺型BHD综合征的临床鉴别诊断的策略，也能够为疾病的治疗靶点提供线索。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和诊断学领域，具体涉及用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的血浆microRNA标志物及应用。
背景技术
原发性自发性气胸(PSP)是一种病因不明、易复发、难治愈的外科急症。在无明显诱因且无潜在临床肺部疾病的情况下，胸膜脏层破裂及随之形成的肺部坍塌和缺氧。气体进入患者的胸膜腔，造成肺不张和低氧血症，重者可发生呼吸困难，危及生命。虽然PSP的发病分子机制至今不明，有一点临床共识是肺大泡(Cyst)的病理形成是PSP发生的共同结构基础。研究发现约有10％的PSP患者存在家族史，表明这些患者气胸的发生与遗传相关。多种遗传综合征都伴有气胸/肺大泡临床症状，如马凡氏综合征，埃勒斯-当洛综合征，高胱氨酸尿症和α1-抗胰蛋白酶缺乏症[5-8]。一般说来，气胸/肺大泡通常不是这些遗传综合征的初期和唯一表型，伴随着其他体征，使它们在临床上相对容易鉴别。
BHD综合征(BHDS，Birt-Hogg-Dube综合征)是一种常染色体显性遗传病，以皮肤纤维毛囊瘤、肺大泡和/或自发性气胸以及肾癌为主要临床特征[9]。BHDS的临床表型具有外显不全和多样性，导致BHDS患者仅仅表现出一种临床症状，如肺大泡/气胸。仅仅表现出肺部临床症状而无皮肤和肾脏表型的BHDS患者在临床上被当成单纯性PSP接受治疗。但是，有研究表明，单纯肺型BHD(BHD-PSP)病人具有高出正常人7倍的肾癌风险，并且他们的一级亲属也是高危人群。因此，必须从临床单纯性PSP病人群体中鉴别诊断出BHD患者，并对患者及其一级亲属进行严格的临床追踪，以便于对肾癌的早期识别和治疗。
目前，诊断单纯肺型BHDS病人的唯一有效手段是对其致病基因FLCN的遗传检测，包括Sanger测序和基因拷贝数检测。我们的研究表明，在中国PSP患病人群中，约有10％患者为FLCN突变携带者，即表现为单纯肺型的BHD病人。虽然遗传检测是诊断BHD-PSP最直接和精确的方法，但是，在大样本的PSP群体中有近90％并不是BHDS患者，却因被认为是疑似人群而进行flcn基因检测。基因检测目前还属于收费较高的检测项目，对于我国农村或偏远地区的人群来说，费用高昂。而基因检测技术，相比较其他临床检测技术，操作相对复杂，结果分析需要较长时间，直接使用基因检测对疑似BHD-PSP的群体进行诊断，是人力、物力和财力的巨大浪费。因此，需要一种有效、经济、易操作且带有扫描性质的技术对整个BHD-PSP疑似群体进行筛查。
成熟miRNA是一类进化高度保守的内源性非编码单链RNA，长约19～25个核苷酸，能够在转录后水平调控蛋白合成，参与多种生物学信号通路的调节。成熟miRNA的异常表达与多种人类疾病密切相关，在血液中又能稳定存在，可以作为无创性的生物标记物，相关试验研究在多种疾病中开展，包括癌症、损伤类疾病、甚至遗传病。
综上所述，临床PSP群体中有约10％是BHD-SPS，这一部分人群具有肾癌的高风险，且其一级亲属也存在相似风险，必须早期鉴别诊断，以利于肾癌的早期识别和防治。而现有诊断技术只有flcn基因的遗传检测，若在临床推广具有成本高却收益低、操作相对复杂且耗时长等不足。因此，可以利用临床样本，找到与BHD综合征相关且普通原发性自发性气胸表达存在差异的血浆miRNA，评估其作为标记物准确性。在此基础上，可以将检测血浆miRNA的表达水平作为一种筛查性诊断BHD-PSP的常规手段，扫描疑似BHD-PSP的群体，以提高后续flcn基因检测的效率，优化临床BHD-PSP诊断策略。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的血浆miRNA标志物，并以此为基础制备基于microRNA的、用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：从建好的组织样本库中选择BHD-PSP和非BHD-PSP样本，采用基因芯片技术检测miRNA表达水平，分析得到与BHD-PSP特异性相关的miRNA，从中选择显著变化、可以作为鉴别诊断BHD-PSP的miRNA作为候选诊断标记物，进一步验证后，在血浆中检测候选生物标记物的表达水平并评估它们用于BHD-PSP诊断的准确性、最终确认为鉴别诊断BHD-PSP的生物标记物。进一步的，以此为基础制备基于microRNA的、用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的试剂盒。
本发明有益效果：
1.本发明验证了作为BHD-PSP临床筛查性诊断的miRNA生物标记物。其中以let-7d和miR-424在血浆中的表达水平作为联合指标，其灵敏性和特异性达到90％以上，可有效地从PSP群体中筛查出单纯肺型BHD个体。本结果的应用将优化PSP与BHD-PSP临床鉴别诊断的策略，也能够为疾病的治疗靶点提供线索。
2.本发明还提示miRNAs在孟德尔遗传病存在非典型的临床表型而难以鉴别时，可能成为一种有效的临床鉴别诊断和相关机制研究的重要标志物。
附图说明
图1.BHD-PSP与PSP肺组织中miRNAs差异性表达分析及验证。
图2.BHD-PSP与PSP血浆中miRNAs差异性表达分析及诊断准确性评估。
具体实施方式
实施例1
一、实验材料与方法
1)肺大泡病灶组织和血浆中的总miRNA提取(Ambian试剂盒)：a.称取不超过20mg肺大泡组织，快速剪成小块，立即加入预冷的200ul Disruption Buffer；b.在上述裂解液中加入200ul Denaturing Solution，充分混匀；c.将上述混合液冰上放置5min；(血浆样本提取时，则直接吸取血浆样本400ul，并在其中加入外源性cel-miR-39)d.在上述混合液中加入400ul酚氯仿(Acid-Phenol：chloroform)，涡旋仪涡旋60s后，室温，13300rpm离心10min；e.取上清入干净的指形管并计算体积，在上清中加入1/3体积的无水乙醇，充分混匀；f.将上述混合液过柱(Filter Cartridge)，室温，10000rpm离心30s，收集滤液，并计算体积；g.将2/3滤液体积的无水乙醇加入，充分混匀，10000rpm离心30s，弃滤液；h.向离心柱中加入700ul miRNAWash Solution Buffer 1，10000rpm离心15s，弃滤液；i.向离心柱中加入500ul miRNAWash Solution Buffer 2/3，10000rpm离心15s，弃滤液，重复一次；j.换新的指形管，室温，13300rpm离心1min；将离心柱转移至新的1.5ml收集管中，对柱心加入40ulElution Buffer(95℃预热)，室温10000rpm离心1min，收集滤液即为miRNA溶液。
组织样本中miRNA的microarray芯片筛查：使用罗氏公司Universal ProbeLibrary(UPL)通用探针库探针，共检测376种miRNA，其原理简述如下：在成熟miRNA上接上一条含茎环结构的逆转录引物，在RNA逆转录合成cDNA之后，用通用型的探针来进行荧光定量PCR，确定miRNA的相对表达量。
2)外周血血浆和血细胞的分离：a.用EDTA抗凝管采集所有样本新鲜外周血约5ml。b.将新鲜外周血1700g，4℃离心10min，小心收集上层血浆，避免触及下层红细胞和白细胞。c.将收集的上层血浆再用2000g，4℃离心10min，取上清。d.将血浆和细胞层沉淀均冻存于-80℃冰箱备用。
4)血浆miRNA的RT-qPCR检测：a.miRNA逆转录合成cDNA。将提取的miRNA逆转录合成cDNA(PrimeScript RT-PCR Kit,Takara)，过程如下：根据测定的浓度，计算好miRNA模板量。逆转录体系为30ul，模板总量1500ng。根据逆转录试剂盒说明，依次配制逆转录试剂盒组分，另外加入let-7d，miR-424，miR-199a-3p，U6及cel-miR-39的逆转录引物(Roche)。逆转录条件为：42℃15min，85℃5sec。b.荧光定量PCR：以cDNA为模板，采用Roche UPL探针实时定量PCR方法，对的let-7d，miR-424，miR-199a-3p，U6及cel-miR-39在组织和细胞中的表达水平进行分析。每份样本做三个复孔。采用StepOne v2.1软件和相对定量的方法分析实验数据，以U6为内参基因。
Q-PCR反应体系及条件如下：
let-7d的PCR引物序列引物序列：AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT；miR-424的PCR引物序列：GCTCGACAGCAGCAATTCATGT。
5)诊断准确性评估：血浆中不同组之间miRNA表达水平采用了Tukey’s testfollowed by the Duncan's multiple range test进行统计学比较。受试者工作特征曲线(Receiver-operator characteristic，ROC)是以flcn基因检测结果作为参比标准，将血浆中miRNA的表达量按照非参数假设制作的sensitivity％vs(100％-specificity％)分布图，并且计算了曲线下面积(area under ROC curve，AUC)。运用Logistic regression分析miRNA联合标记的诊断准确性。
二、实验结果
1)经组织芯片筛查分析发现，与PSP组相比，BHD-PSP肺组织中有11种增高、52种降低的miRNA。具体见图1中的热图A、倍数变化B和(表1、2)。其中3种表达增高倍数超过10倍的miRNAs：let-7d、miR-424和miR-199a-3p，被定为候选生物标记物。在经后续的14例普通PSP和14例BHD-PSP的组织样本验证后，发现3种miRNAs在BHD-PSP组中均显著增高，let-7d，miR-424和miR-199a-3p的表达水平在BHD-PSP组中增高的倍数分别为4.9，6.5和11.2(图1中的C)。
表1 11种增高的miRNA信息
表252种降低的miRNA信息
2)检测36例BHD-PSP(BHD-PSP)、57例普通PSP(nBHD-PSP)及10例正常对照(NC)血浆中的的3种miRNA表达水平。发现与nBHD-PSP相比，在BHD-PSP组中let-7d，miR-424和miR-199a-3p的表达均显著性增高(图2A-C)，增高的倍数均值分别为5.2，4.3和3.1(P<0.01)。与NC组相比，BHD-PSP组中let-7d和miR-424的表达均显著升高，增高倍数分别5.7和33.3。其中，let-7d在各组间的表达水平详见表3，miR-424在各组间的表达水平详见表4，miR-199a-3p在各组间的表达水平详见表5.经ROC曲线评估后，发现let-7d和miR-424的AUC为0.941和0.826，表明将血浆中let-7d或miR-424的表达水平作为单一诊断BHD-PSP标记物，具有较高准确性。为了优化诊断效果，将let-7d和miR-424联合，其AUC值提升至0.956，可作为诊断筛查BHD-PSP的生物标记物。
表3BHD-PSP(BHD-PSP)、普通PSP(nBHD-PSP)及正常对照(NC)的let-7d
表4 BHD-PSP(BHD-PSP)、普通PSP(nBHD-PSP)及正常对照(NC)的miR-424
表5BHD-PSP(BHD-PSP)、普通PSP(nBHD-PSP)及正常对照(NC)的miR-199a-3p
三、结论
在对比普通PSP与BHD-PSP组织中miRNA表达后，发现共有63种差异表达的miRNA，包括11个上调和52个下调的miRNA；经扩大组织样本验证、血浆检测相应miRNAs的浓度并进行评估后发现联合检测血浆let-7d和miR-424的表达水平，可以有效诊断BHD-PSP。
Claims (8)
1.一种诊断标志物在制备用于鉴别BHD综合征与原发性自发性气胸患者的试剂盒的用途，所述标志物由编码microRNA:let-7d或者microRNA：miR-424的核酸分子组成。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述microRNA在BHD综合征患者血浆中的水平高于原发性自发性气胸患者，所述microRNA在BHD综合征患者血浆中的水平高于普通PSP患者，所述microRNA在原发性自发性气胸患者血浆中的水平高于普通PSP患者。
3.一种microRNA分子组合在制备分析BHD综合征和原发性自发性气胸患者试剂盒的用途，所述microRNA分子组合由let-7d和miR-424组成。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述microRNA分子组合在BHD综合征患者血浆中的水平高于原发性自发性气胸患者，所述microRNA分子组合在BHD综合征患者血浆中的水平高于普通PSP患者，所述microRNA分子组合在原发性自发性气胸患者血浆中的水平高于普通PSP患者。
5.用于特异性检测血浆中let-7d或者miR-424水平的试剂在制备用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的试剂盒中应用，其中所述特异性检测血浆中let-7d或者miR-424水平的试剂包括用于实时定量let-7d或者miR-424的PCR引物。
6.如权利要求5所述的用于特异性检测血浆中let-7d或者miR-424水平的试剂在制备用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的试剂盒中应用，其特征为所述用于实时定量let-7d或者miR-424的PCR引物序列分别为：AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT和GCTCGACAGCAGCAATTCATGT。
7.用于特异性检测血浆中microRNA分子组合let-7d和miR-424水平的试剂在制备用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的试剂盒中应用，其中所述特异性检测血浆中microRNA分子组合let-7d和miR-424水平的试剂包括用于实时定量let-7d和miR-424的PCR引物。
8.如权利要求7所述的用于特异性检测血浆中microRNA分子组合let-7d和miR-424水平的试剂在制备用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的试剂盒中应用，其特征为所述用于实时定量microRNA分子组合let-7d和miR-424的PCR引物序列分别为：AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT和GCTCGACAGCAGCAATTCATGT。
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