CN114752595A - 诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents

诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物，所述血清tsRNA标志物为tRF‑Ala‑AGC‑2‑M4。本发明还另外公开了诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法和应用，通过测序分析，对LN患者和健康对照组血清样本中差异表达的tsRNA进行筛选。本发明提供了一种tsRNA标志物tRF‑Ala‑AGC‑2‑M4，其在LN患者血清中高表达，并与LN的疾病活动度密切相关，具有辅助LN早期诊断和疾病监测的价值，亦为狼疮性肾炎方面tsRNA的深入研究奠定了基础；且检测时取样简单，灵敏度高，特异性强，有利于规模化临床应用。

Description

诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和应用。
背景技术
肾脏是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)受累最严重的器官之一。大多数SLE患者在确诊5年内出现狼疮肾炎(LN)。10％的LN患者发展为终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)，极大地加重了SLE患者的病情。显然，LN的早期诊断和及时治疗对预防疾病进展至关重要。
LN的临床诊断目前仍采用24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿蛋白/肌酐比、尿沉渣镜检、肾小球滤过率、抗双链DNA抗体、补体等多项指标联合评估，然而这些指标的灵敏度和特异性不够，带来了明显的临床滞后性。当前，肾活检是诊断LN的金标准。但该检查为侵入性检查，不易多次重复检查，并且出血风险高的患者也不宜检查。24h尿蛋白定量是临床常用检查方法，但也有一些不足。例如尿液收集时间不准确，留存期间尿液易丢失，患者依从性差等。因此，寻找新的灵敏度和特异性更高的标志物是解决LN患者早期诊断并及时治疗的有效途径。
tsRNA是产生于成熟tRNA或其前体的一种非编码RNA分子，其片段长度为18-40nt。tsRNA具有来自tRNA的二级结构和表面修饰，其含有多种信息并在多种组织中稳定存在。tsRNA具有广泛的生物学作用，包括细胞和组织的应激反应、蛋白质翻译调控、肿瘤发生、干细胞生物学、核糖体生物合成、转座子调控、表观遗传调控、凋亡抑制、免疫反应等方面。其表达类型、丰度及修饰与性别、种族、组织细胞类型和疾病状态等相关。然而，在自身免疫性疾病领域，还没有用于早期诊断的tsRNA标志物，尤其是狼疮性肾炎方面的研究尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明期望提供诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和应用，血清tsRNA的异常表达与LN的疾病活动程度密切相关，可以作为LN早期诊断或疾病监测的标志物；且为本发明方法筛选证实的可以用于LN诊断的tsRNA标志物，为LN标志物的研究提供了新的思路。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物，所述血清tsRNA标志物为tRF-Ala-AGC-2-M4，其序列为UCCCCGGCACCUCCACCA。
这里，tRF-Ala-AGC-2-M4为首个被证实的可用于诊断LN的tsRNA标志物，为狼疮性肾炎方面tsRNA的深入研究奠定了基础。
本发明还提供诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
1)对LN组和HC组血清标本进行测序，对测序数据进行均一化处理。选出差异倍数大于10，即Fold change>10，并且P值小于0.05的tsRNA；删除重复、错配、表达丰度过低的tsRNA，进行聚类、GO和KEGG分析，最终选出10个显著高表达的tsRNA；
2)对选出的10个高表达的tsRNA用逆转录荧光定量聚合酶链式反应RT-qPCR进行标本测试，再对测试得到的tsRNA通过RT-qPCR进一步标本验证，即得到目标tsRNA 。
3)采用受试者工作特征曲线ROC分析目标tsRNA的诊断效能，进一步将目标tsRNA与临床评价LN的疾病活动度指标SLEDAI-2000关联分析，鉴定其诊断能力。
这里，上述步骤中LN组为狼疮肾炎患者血清标本组；HC组为健康样本血清对照组。通过测序分析，对LN患者和健康对照组血清样本中差异表达的tsRNA进行筛选，筛选出tsRNA标志物tRF-Ala-AGC-2-M4，其在LN患者血清中高表达，并与LN的疾病活动度密切相关，具有辅助LN早期诊断和疾病监测的价值。
进一步地，标本数为n，LN血清标本数为130，其中，所述步骤1)中LN组n＝33；所述步骤2)中标本测试，Training，n＝24，标本验证Validation，n＝73；所述步骤1)中HC组，n＝23。
这里，所述步骤1)LN组n＝33与所述步骤2)n＝24、n＝73，表明本发明筛选方法中，LN血清标本数总计130；而所述步骤1)中健康对照组取样数为23。
进一步地，所述步骤1)采用Illumina NextSeq 500进行测序，并采用高通量基因表达数据库进行分析。
进一步地，所述步骤2)RT-qPCR检测工具为Bio-Rad CFX96 Deep Well Real TimeSystem。
进一步地，所述筛选方法使用的数据分析软件为Graphpad Prism 8.0、Microsoftoffice、SPSS24.0。
本发明还另外提供诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用，应用血清tsRNA标志物制备狼疮性肾炎诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括tsRN A标志物tRF-Ala-AGC-2-M4的特异性探针，探针序列为UCCCCGGCACC UCCACCA。
这里，血清tsRNA标志物在狼疮性肾炎诊断试剂盒中的应用，取样简单，且灵敏度高，特异性强，有利于规模化临床应用。
进一步地，所述诊断试剂盒还包括逆转录试剂和/或qPCR定量试剂。
这里，逆转录试剂包括5×gDNA Wiper Mix，10×RT Mix，HiScriptⅡEnzyme Mix，Stem-loop primer(2μM)；qPCR定量试剂包括2×miRNA Universal SYBR qPCR MasterMix，Forward Primer(10μM)，Reverse Primer(10μM)。
进一步地，所述逆转录试剂还包括逆转录引物，序列为GTCGTATCC AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGTGG。
进一步地，所述qPCR定量试剂还包括qPCR引物，序列分别为F：CGCGTCCCCGGCACCT；R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
本发明有益效果如下：1)本发明通过测序分析，对LN患者和健康对照组血清样本中差异表达的tsRNA进行筛选，提供一种tsRNA标志物tRF-Ala-AGC-2-M4，其在LN患者血清中高表达，并与LN的疾病活动度密切相关，具有辅助LN早期诊断和疾病监测的价值；2)本发明提供了首个被证实的用于诊断LN的tsRNA标志物，为狼疮性肾炎方面tsRNA的深入研究奠定了基础；3)本发明血清tsRNA标志物在诊断狼疮性肾炎中的应用，取样简单，且灵敏度高，特异性强，有利于规模化临床应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中LN与HC组间tsRNA差异表达火山图；
图2为本发明实施例1中LN与HC组间tsRNA差异表达的Venn对比图；
图3为本发明实施例2中LN与HC组间tRF-Ala-AGC-2-M4差异表达散点图；
图4为本发明实施例2中tRF-Ala-AGC-2-M4生物发生结构图；
图5为本发明实施例3中LN与HC组间tRF-Ala-AGC-2-M4含量检测图；
图6为本发明实施例3中tRF-Ala-AGC-2-M4诊断LN和HC的ROC曲线图；
图7为本发明实施例3中tRF-Ala-AGC-2-M4与LN疾病活动度的相关性分析图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。
实施例1
1、血清tsRNA的测序
从样本库中严格筛选符合条件的LN病人血清，采用RNA-seq对样本进行测序。步骤依次包括构建RNA文库、二代测序、高通量基因表达数据库大数据分析筛选tsRNA。根据Foldchange>10，且P<0.05选择tsRNA，删除重复、错配、表达丰度过低的tsRNA，再进行差异表达基因聚类分析、基因本体(Gene Ontology，GO)分析、京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，选出前10个显著高表达的tsRNA。
2、血清总RNA的提取
Trizol法提取LN病人血清总RNA：混匀血清，4℃条件下1700g离心10min；取100μL上清加入800μL Trizol，立即涡旋；静置5min后立即加入160μL氯仿涡旋混匀，静置7min；4℃条件下16000g离心20min；取450μL上清加入800μL异丙醇沉淀过夜；4℃条件下16000g离心20min后弃上清，加入1mL 75％乙醇轻微震荡清洗；4℃条件下16000g离心20min后弃上清，倒置于吸水纸上晾干7min；使用20μL DEPC水溶解RNA备用。
3、tsRNA的检测
使用茎环法合成目标tsRNA的cDNA：采用南京诺唯赞公司官网的引物设计软件miRNA Design V1.01设计目标tsRNA引物RT primer，序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGT GG，由南京金斯瑞公司合成；使用诺唯赞公司试剂盒miRNA 1stStrand c DNA Synthesis Kit(货号MR101)进行逆转录，配置10μL逆转录反应体系：5×gDNA Wiper Mix 1μL，10×RT Mix 1μL，HiScriptⅡEnzyme Mix 1μL，RT primer(2μM)0.5μL，tsRNA 2μL，RNase-free ddH2O4.5μL。PCR仪中反应程序如下：95℃，5min；50℃，15min；85℃，5min。获得目标tsRNA的cDNA。
使用诺唯赞公司miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(货号M Q101)定量试剂盒扩增cDNA，配置20μL扩增反应体系：2×miRNA Un iversal SYBR qPCR Master Mix 10μL，Forward Primer(10μM)0.4μL，Reverse Primer(10μM)0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 7.2μL。在Bio-Rad CFX96 Deep Well Real Time System荧光PCR仪中进行反应，程序如下：95℃预变性2min，95℃退火10s，60℃延伸30s，退火和延伸共40个循环；最后95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s条件下采集溶解曲线。
这里，qPCR引物同由南京金斯瑞公司合成。序列分别如下：
Forward Primer：CGCGTCCCCGGCACCT
Reverse Primer：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
使用Graphpad Prism 8.0、Microsoft office、SPSS24.0等软件进行数据分析。
图1为本发明实施例1中LN与HC组间tsRNA差异表达火山图，图2为本发明实施例1中LN与HC组间tsRNA差异表达的Venn对比图。结果表明，如图1所示，相比于健康对照组，血清中差异表达10倍以上的tsR NAs共126个，其中表达上调114个，表达下调12个。进一步绘制Venn图，如图2所示，有193个tsRNAs在HC和LN血清中都存在，而有78个tsRNAs只在HC血清中存在，151个tsRNAs只在LN血清中存在。
实施例2
tsRNA测序结果的临床验证
采集临床中诊断为LN的患者和体检中心的健康人血清各24例按照上述步骤2进行血清总RNA提取，按照上述步骤3对前10个高表达的tsRN A进行RT-qPCR检测。
图3为本发明实施例2中LN与HC组间tRF-Ala-AGC-2-M4差异表达散点图，图4为本发明实施例2中tRF-Ala-AGC-2-M4生物发生结构图，结果如图3所示，与HC组相比，tRF-Ala-AGC-2-M4在LN组血清中显著高表达(P<0.01)，与实施例1测序结果一致。采用tsRFun在线软件预测并绘制tRF-Ala-AGC-2-M4的生物发生结构图，如图4所示，tRF-Ala-AGC-2-M4在tRNA-Ala-AGC-2-1的T环处断裂，属于tRF-3a类型的tsRNA。
实施例3
目的tsRNA的临床应用
为了评价tRF-Ala-AGC-2-M4的临床诊断效能，从南京大学医学院附属鼓楼医院样本库中收集73例LN患者和46例健康体检者的血清标本，按照实施例1中步骤2和步骤3的方法进行临床样本RNA的提取与检测，对所有入组的LN病例均进行了系统性红斑狼疮疾病活动度评分(SLEDAI-2K)。
图5为本发明实施例3中LN与HC组间tRF-Ala-AGC-2-M4含量检测图，图6为本发明实施例3中tRF-Ala-AGC-2-M4诊断LN和HC的ROC曲线图。RT-qPCR结果如图5所示，tRF-Ala-AGC-2-M4在LN血清中显著高表达(P<0.05)。绘制ROC曲线，如图6所示，ROC曲线下面积为AUC＝0.7558，诊断分界值(Cut-off value)为4.28E-9pmol/μL，敏感度Sensitivity＝83.56％，特异性Specificity＝56.52％，95％置信区间95％CI为0.6692-0.8424，图6表明，tRF-Ala-AGC-2-M4对LN具有较高的诊断价值。
图7为本发明实施例3中tRF-Ala-AGC-2-M4与LN疾病活动度的相关性分析图，进一步通过Pearson相关分析确定tRF-Ala-AGC-2-M4与SLEDAI-2K的相关性。如图7所示，tRF-Ala-AGC-2-M4与SLEDAI-2K的相关系数为0.3270，P<0.05，表明tRF-Ala-AGC-2-M4与LN疾病活动度具有较强相关性。
经过上述的测序、验证和临床评估，结果表明，tRF-Ala-AGC-2-M4在LN血清中高表达，具有较好的诊断效能和疾病相关性，可以作为LN诊断的新型分子标记物，且检测取样简单，灵敏度高，特异性强，亦为LN方面tsRNA的深入研究奠定了基础。
以上所涉及发明方法的具体步骤不作限制及详细描述，以上所涉及试剂的具体成分不作详细描述，作为公知常识，本领域的技术人员能够理解。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uccccggcac cuccacca 18
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uccccggcac cuccacca 18
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactggtgg 50
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgtccccg gcacct 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtgcagggt ccgaggtatt 20

Claims (10)

1.诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物，其特征在于，所述血清tsRNA标志物为tRF-Ala-AGC-2-M4，其序列为UCCCCGGCACCUCCACCA。
2.诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)对LN组和HC组血清标本进行测序，对测序数据进行均一化处理。选出差异倍数大于10，即Fold change>10，并且P值小于0.05的tsRNA；删除重复、错配、表达丰度过低的tsRNA，进行聚类、GO和KEGG分析，最终选出10个显著高表达的tsRNA；
2)对选出的10个高表达的tsRNA用逆转录荧光定量聚合酶链式反应RT-qPCR进行标本测试，再对测试得到的tsRNA通过RT-qPCR进一步标本验证，即得到目标tsRNA。
3)采用受试者工作特征曲线ROC分析目标tsRNA的诊断效能，进一步将目标tsRNA与临床评价LN的疾病活动度指标SLEDAI-2000关联分析，鉴定其诊断能力。
3.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法，其特征在于，标本数为n，LN血清标本数为130，其中，所述步骤1)中LN组n＝33；所述步骤2)中标本测试，Training，n＝24，标本验证Validation，n＝73；所述步骤1)中HC组，n＝23。
4.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)采用Illumina NextSeq 500进行测序，并采用高通量基因表达数据库进行分析。
5.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)RT-qPCR检测工具为Bio-Rad CFX96 Deep Well Real Time System。
6.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法使用的数据分析软件为Graphpad Prism 8.0、Microsoft office、SPSS24.0。
7.诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用，其特征在于，应用血清tsRNA标志物制备狼疮性肾炎诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括tsRNA标志物tRF-Ala-AGC-2-M4的特异性探针。
8.根据权利要求7所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括逆转录试剂和/或qPCR定量试剂。
9.根据权利要求8所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用，其特征在于，所述逆转录试剂还包括逆转录引物，序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGTGG。
10.根据权利要求8所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用，其特征在于，所述qPCR定量试剂还包括qPCR引物，序列分别为F：CGCGTCCCCGGCACCT；R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
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