CN109750042A - 系统性红斑狼疮辅助诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了系统性红斑狼疮辅助诊断标志物及其应用。最新研究表明，1ncRNAs可能在自身免疫性疾病的病程进展中发挥着重要的作用，为了发现新的与系统性红斑狼疮相关的分子标志物，本申请对系统性红斑狼疮患者以及正常对照组高通量转录组测序数据进行多中心、多样本的数据整合分析，发现了ENSG00000225964及其相关基因RSAD2，并验证了他们与系统性红斑狼疮的相关性，本申请为该病的诊断提供了新的靶点，为其临床应用奠定基础。

Description

系统性红斑狼疮辅助诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于疾病分子诊断领域，具体涉及系统性红斑狼疮辅助诊断标志物及其应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，病程迁延反复，主要临床特征为全身多器官多系统受累发生病变，特别是血清中会出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体沉积。根据我国的流行病学研究发现，狼疮的患病率约为70/10万。系统性红斑狼疮是一种多因素的复杂疾病，其病因和发病机制至今尚未明确，普遍认为其发病与遗传、免疫异常、性激素、环境因素、药物等相关。目前临床上诊断该病主要依靠其主要的临床表现和实验室检查指标，因为该病临床表现复杂多变，如果仅以某一症状或者某一化验指标异常等突出表现为标准，容易将原发疾病掩盖忽略，使该病的早期诊断出现错漏。

LncRNA可在表观遗传水平、转录水平、转录后水平和蛋白质代谢等多种层面调控基因的表达，其表达紊乱与人类多种疾病的发生发展有着密切联系，如肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等。最新研究表明，1ncRNAs可能在自身免疫性疾病的病程进展中发挥着重要的作用。在类风湿关节炎和自身免疫性甲状腺疾病中的研究进一步证实了这一观点，而SLE与1ncRNAs的关系也一直是研究热点，多篇报道对其进行了初步的研究。长链非编码RNA中GAS5、lnc-DC、linc0597和linc0949可能参与了SLE的发病过程，有望成为SLE疾病诊断的生物标志物，在SLE的诊疗过程中发挥作用。但现有发现的与SLE疾病相关的诊断标志物还远远达不到临床应用的数量。

为了进一步发现新的与SLE相关的分子标志物，本申请对SLE患者以及正常对照组血液样本高通量转录组数据进行多中心、多样本的数据整合分析，以期获得系统性红斑狼疮疾病发病关键的lncRNA和mRNA，差异表达基因的功能富集和信号通路富集及其差异表达基因所对应的蛋白成员之间的相互作用网络。深入研究系统性红斑狼疮疾病相关基因的调控机制，为系统性红斑狼疮的诊疗提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与系统性红斑狼疮相关的长链非编码RNAENSG00000225964。

优选的，ENSG00000225964序列与NC_000002.12具有95％以上序列同源性；更优选的，长链非编码RNA序列为NC_000002.12。

本发明的目的在于提供检测ENSG00000225964基因表达水平的试剂在制备系统性红斑狼疮诊断工具中的应用。

进一步，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测ENSG00000225964的表达水平。

测序技术主要为第二代测序技术(主要包括Roche 454焦磷酸测序、IlluminaSolexa测序和ABI SOLID测序)和第三代测序技术(主要包括单分子荧光测序和纳米孔测序)。

进一步，核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

进一步，采用第二代测序技术、第三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测ENSG00000225964的表达水平。

进一步，试剂包含与ENSG00000225964杂交的探针或用于荧光定量PCR核酸扩增的引物，优选的，引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

进一步，试剂检测的样本为外周血。

本发明的目的在于提供检测与ENSG00000225964相关的基因表达水平的试剂在制备系统性红斑狼疮诊断工具中的应用，与ENSG00000225964相关的基因为RSAD2。

进一步，试剂采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测RSAD2基因表达水平。

进一步，核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

进一步，采用第二代测序技术、第三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测RSAD2基因的表达水平。

进一步，试剂包含与RSAD2杂交的探针或用于荧光定量PCR核酸扩增的引物，优选的，引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个蛋白质或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。蛋白质和DNA的同源性常常通过它们序列的相似性来判定，相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列；当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

本领域技术人员将认识到，本发明并不局限于对ENSG00000225964的任何特定变体的基因表达进行定量。在一些实施方案中，其具有与ENSG00000225964序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导的引物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，lockednucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

附图说明

图1是lncRNA邻近mRNA的GO分析BP富集图；

图2是lncRNA邻近mRNA的GO分析CC富集图；

图3是lncRNA邻近mRNA的GO分析MF富集图；

图4是lncRNA邻近mRNA的KEGG富集图；

图5是lncRNA及其邻近mRNA差异表达图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1基于高通量转录组数据的整合分析

1、数据检索

GEO(Gene Expression Omnibus)数据库是由NCBI(美国国立生物技术信息中心)开发维护，GEO数据库作为最大的基因表达数据的数据库。通过检索关键词("lupuserythematosus,systemic"[MeSH Terms]OR systemic lupus erythematosus[AllFields])AND"Homo sapiens"[porgn]AND"gse"[Filter]进行数据检索，对检索出来的结果进行筛选，符合以下标准的数据集将纳入我们的研究中：

①所选数据集必须为全基因组的转录组数据；

②这些数据来自于系统性红斑狼疮病例组和健康对照组的血液；

③本研究均考虑经标准化或者原始数据集。

经筛选得到6套mRNA数据集和2套lncRNA数据集(见表1)。

表1 GEO数据检索结果

2、数据分析处理

预处理。对于一个探针捕获多个基因的数据我们进行删除处理，对于一个基因被多个探针捕获的情况，我们保留表达平均值最大的那一组数据。经过处理，2套数据共有的lncRNA个数为12177。

差异表达lncRNA分析。采用metaMA包分析，meta分析中p值合并所用方法为inverse normal method。共获得377个差异表达lncRNA(FDR<0.05)，其中表达下调192个，表达上调185个。

lncRNA-mRNA邻近关系分析。对差异表达lncRNA上下游100kb范围内搜索差异表达mRNA，得到217对lncRNA-邻近差异表达mRNA。

lncRNA邻近mRNA的GO和KEGG分析。使用GeneCoDis3(http://genecodis.cnb.csic.es/analysis)对lncRNA邻近mRNA(197个)进行GO功能富集和KEGG功能富集分析。FDR<0.05，KEGG富集结果如图1-4所示。通过GO分析可见，lncRNA邻近mRNA多富集在先天免疫反应生物学过程中。

通过上述综合分析，我们选取了长链非编码RNA中差异表达比较明显的ENSG00000225964及其邻近基因RSAD2作为我们进一步研究的对象，验证其与系统性红斑狼疮的相关性。

实施例2差异表达ENSG00000225964及其邻近基因RSAD2的荧光定量PCR验证

1、样本收集

样本收集，选取本医院确诊为系统性红斑狼疮患者的外周血23例，病例均符合美国风湿病协会修订的SLE诊断标，在患者使用细胞毒性药物、免疫抑制剂和大剂量糖皮质激素(>1mg/Kg/d)之前完成血标本采集。正常对照组18名，为健康体检者。均排除了感染、肿瘤、高血压、糖尿病等其它全身性疾病。各组间的性别、年龄差异无统计学意义。和研究对象说明研究目的，在取得其同意的情况下，用EDTA抗凝采血管分别抽取SLE病例及健康对照的外周静脉血各5ml，尽快进行血浆分离和PBMCs提取，编号后放入-80℃冰箱中冻存备用。

2、提取总RNA

(1)实验前准备好经DEPC水处理过的无RNA酶的枪头和1.5ml EP管；实验开始时提前30min打开超净台紫外灯；整个实验过程中佩戴好手套、帽子、口罩。

(2)取5μl DEPC原液和50ml高压灭菌的ddH₂O，配制0.1‰的DEPC水备用。

(3)取45ml无水乙醇和15ml 0.1‰DEPC水，配制75％的酒精备用。

(4)从-80℃冰箱中取出在PBMCs，置于冰上待其完全溶化后反复吹打至溶液透亮、无杂质。在台式高速离心机中4℃离心，12000g*10min。

(5)离心结束后小心取出，吸1ml左右的上清液至另一个1.5ml EP管中，随后加入0.2ml氯仿，做好标记并剧烈震荡2min。室温下静置5min后4℃离心，12000g*15min。

(6)小心取出离心后的EP管，吸上清液300-500μl到另一个1.5ml EP管中。

(7)在EP管中加入等体积的经-20℃预冷处理的异丙醇，做好标记并颠倒、混匀；-20℃助沉1h后取出，4℃离心，12000g*15min。

(8)取出离心好的EP管，轻轻倒去上清液，加1ml经-20℃预冷处理的75％酒精，用移液器反复吹打、清洗沉淀在管底的RNA,涡旋震荡后在4℃条件下7500g*5min离心，根据实际情况可重复洗涤RNA 2-3次。

(9)取出经洗涤、离心后的RNA EP管，轻轻倒去上清液后在微型离心机上离心30秒，用移液器吸出残余的液体，在室温下干燥5-10min。根据提取出的RNA量，加0.1‰的DEPC水30-40μl。

(10)待RNA完全溶解后，测定RNA浓度，-80℃保存备用。

3、逆转录：

使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

1)去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将Buffer 2 4.0μl，RT Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH2O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

4、qRT-PCR

(1)引物设计

根据Genbank中ENSG00000225964(NC_000002.12)和RSAD2序列(XR_001744973.2)序列设计qRT-PCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，内参选择GAPDH。具体引物序列如下：

ENSG00000225964基因：

正向引物为5’-CTCTTGATGTCCTTATGG-3’(SEQ ID NO.1)

反向引物为5’-TTCTCCTCTACCTAACTG-3’(SEQ ID NO.2)

扩增长度97bp。

RSAD2基因：

正向引物为5’-GTCATTAAGCACCATCCAA-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物为5’-GAAGACAACCTATCCTATCCT-3’(SEQ ID NO.4)

扩增长度180bp。

(2)qRT-PCR扩增检验

用Premix Ex Taq^TM II(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal CyclerReal Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认RealTime PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，59℃30s)×40。

5、统计学方法

实验都是按照每个样本重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％。结果如图5所示，与健康人群组相比，患病组中ENSG00000225964基因表达量有显著升高，为健康人群组的3.2倍，差异具有统计学意义(P<0.05)；患病组中RSAD2基因表达量有显著升高，为健康人群组的2.7倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。以18例健康人群组平均值为检测基线，23例系统性红斑狼疮患者中，18例ENSG00000225964基因表达量有显著升高，3例ENSG00000225964基因表达差异无统计学意义，2例表达下调；16例RSAD2基因表达量有显著升高，5例RSAD2基因表达差异无统计学意义，2例表达下调。显示ENSG00000225964和RSAD2基因对系统性红斑狼疮的诊断具有一定指导意义，有望成为临床或健康筛查中系统性红斑狼疮分子诊断的候选标志物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 石家庄市第一医院

<120> 系统性红斑狼疮辅助诊断标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcttgatgt ccttatgg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctcctcta cctaactg 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcattaagc accatccaa 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaagacaacc tatcctatcc t 21

Claims (10)

1.一种与系统性红斑狼疮相关的长链非编码RNA ENSG00000225964。

2.检测ENSG00000225964基因表达水平的试剂在制备系统性红斑狼疮诊断工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测ENSG00000225964的表达水平。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用第二代测序技术、第三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测ENSG00000225964的表达水平。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，试剂包含与ENSG00000225964杂交的探针或用于荧光定量PCR核酸扩增的引物，优选的，引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，试剂检测的样本为外周血。

7.检测与ENSG00000225964相关的基因表达水平的试剂在制备系统性红斑狼疮诊断工具中的应用，其特征在于，与ENSG00000225964相关的基因为RSAD2。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，试剂采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测RSAD2基因表达水平。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用第二代测序技术、第三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测RSAD2基因的表达水平。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，试剂包含与RSAD2杂交的探针或用于荧光定量PCR核酸扩增的引物，优选的，引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。