CN106568977A - 血清中sIL‑7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用 - Google Patents

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    • G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]

Abstract

本发明公开了一种血清中sIL‑7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用，其是将血清sIL‑7R蛋白作为标志物来诊断系统性红斑狼疮肾炎的。本发明通过酶联吸附法，荧光定量法通过蛋白，mRNA水平检测系统性红斑狼疮肾炎患者血清中sIL‑7R的含量，便于及时的做出诊断，极大程度上提高了就诊的准确度，使患者及时得到治疗，从而，大大提高临床诊断的准确性。

Description

血清中sIL-7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用
技术领域：
本发明涉及一种疾病诊断的应用，具体涉及一种血清中sIL-7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种典型自身免疫性结缔组织病,是免疫原型疾病的代表。常伴随多重临床表现以及组织、器官的受损，包括皮肤、关节、肾脏、血液系统等，可能与体内异常的自身免疫性反应有关。然而，截至目前SLE的具体发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、环境等因素相关。
白介素7(interleukin-7，IL-7)是IL-2细胞因子家族成员之一，是T淋巴细胞生长发育所必需的细胞因子，它可激活T细胞、B细胞、巨噬细胞以及树突状细胞。IL-7主要分泌于基质细胞，其中主要来源于红骨髓与胸腺。IL-7是一种特异性的糖蛋白，它对于未成熟的胸腺细胞的生长、增殖、分化发挥着重要的作用，对于维持人体外周血T细胞的平衡起到了不可替代的决定性作用。IL-7受体(IL-7R)由两个亚单元组成，IL-7Ra链(亦称CD127)和丫c链(亦称CD132)，前者可与胸腺基质淋巴生成素受体(TSLPR)构成异源二聚体与IL-7或胸腺基质淋巴生成素(TSLP)结合，后者可与其他IL-2家族细胞因子共享。IL-7信号通路的传导需要IL-7R两条链的共同参与。按IL-7R的结合状态，IL-7R又可分为膜结合型受体(mIL-7R)和可溶型受体(sIL-7R)，后者主要分泌于纤维母细胞,并且与自身免疫密切相关。IL-7Ra的两种不同形式与IL-7R基因的转录差异有关，sIL-7R基因的转录信使RNA(mRNA)经历了特征性的外显子6(exon 6)剪切。
异常的IL-7信号可普遍存在于特定免疫细胞的功能紊乱以及免疫耐受的失常，即可引起特定免疫细胞的功能失调以及免疫耐受的异常，常与自身免疫性疾病的发生有密切联系。IL-7、IL-7R已被证实参与多种自身免疫性疾病或疾病实验模型的形成，这包括类风湿性关节炎，I型糖尿病，实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，自身免疫性结肠炎，狼疮。已有研究表明，IL-7R(rs6897932)单核苷酸基因多态性(SNP)与多发性硬化症(MS)，I型糖尿病(T1D)等自身免疫性疾病的遗传易感性存在相关。此外，有研究显示，血清IL-7R在狼疮性肾炎以及类风湿性关节炎患者体内的表达存在异常。鉴于包括SLE在内的多种自身免疫性疾病之间存在同源的遗传背景、发病机制以及临床表现，我们认为异常的IL-7信号可能参与了SLE的发病机制，深入了解IL-7信号通路与SLE之间的关系具有重要的意义。
发明内容：
本发明的目的旨在提供一种新的标志物在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用。
本发明的技术方案是：血清sIL-7R作为诊断系统性红斑狼疮肾炎标志物的应用。
本发明研究主要是检测SLE肾炎患者组，SLE非肾炎患者组与健康对照组血清中sIL-7R含量是否存在差异，为确诊系统性红斑狼疮肾炎患者提供可靠依据。
本发明采用病例对照研究，利用高度特异的定量PCR技术，以及酶联免疫吸附试验法，检测SLE非肾炎患者组、SLE肾炎患者组、健康对照组血清中sIL-7R 水平，判断血清中sIL-7R与系统性红斑狼疮肾炎的相关性。具体试验中：利用高度特异的定量PCR技术，以及酶联免疫吸附试验法，检测系统性红斑狼疮非肾炎患者组，系统性红斑狼疮肾炎患者组和健康对照组血清中sIL-7R水平，以及结合临床资料，通过GraphPad软件分析SLEDAI、血清中C3补体、C4补体、anti-dsDNA、anti-nuclear antibody在系统性红斑狼疮肾炎患者和系统性红斑狼疮非肾炎患者中的关系，最后利用SPSS 17.0软件分析SLEDAI与sIL-7R、SLEDAI与ANA、SLEDAI与anti-dsDNA、SLEDA与anti-C1q的相关性。
上述结果分析得出SLE肾炎组患者血清sIL-7R表达上调，且与疾病的活动度和疾病进展相关，提高了系统性红斑狼疮肾炎的确诊率。因而，通过测定患者血清中sIL-7R的水平，就能及时的做出诊断，这样极大程度上提高了就诊的准确度，使患者及时得到治疗，从而，大大提高临床诊断的确诊率。
附图说明：
图1是本发明血清中sIL-7R在SLE肾炎患者组、SLE非肾炎患者组、健康组含量的诊断结果图；
图2是本发明SLEDAI、血清中C3补体、C4补体、anti-dsDNA、anti-nuclearantibody与SLE肾炎患者和SLE非肾炎患者的关系结果图；
图3是本发明SLEDAI与sIL-7R、SLEDAI与ANA、SLEDAI与anti-dsDNA、SLEDA与anti-C1q的相关性结果图。
具体实施方式：
本发明通过收集门诊系统性红斑狼疮病人134例，其中系统性红斑狼疮肾炎组(LN组)58例，系统性红斑狼疮非肾炎组(Non-LN)76例，收集其抗凝血2ml，2000r/min离心5分钟分层得到血浆、血细胞，分别分装于EP管中于-80 冰箱备用。血浆1:20倍稀释，用ELISA试剂盒对其含量检测，用全血中提取RNA试剂盒提取RNA，具体内容如下：
1.标本采集
所有病例均在实验前采集静脉血2ml，2000r/min离心5分钟，分装冻存标本，避免反复冻融。
病例资料见
表1：病例资料表
2.试剂
2.1 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产)
2.2 抗dsDNA抗体放射免疫分析药盒(由北京北方生物技术研究所生产)
2.3 补体C3测定试剂盒和补体C4测定试剂盒(由德国西门子医学诊断产品有限公司提供)
2.4 抗核抗体IgG(ANA-IgG)检测试剂盒(欧蒙-杭州医学实验诊断有限公司提供)
2.5 抗可提取性核抗原(ENA)抗体检测试剂盒(深圳市伯劳特生物制品有限公司提供)
2.6 抗中性粒细胞胞浆抗体IgG(ANCA-IgG)检测试剂盒(德国欧蒙公司提供)
2.7 抗心磷脂抗体IgG(ACA-IgG)检测试剂盒(深圳市安群生物工程有限公司提供)
2.8 人全血RNA提取试剂盒(AXYGEN生物有限公司提供)
3.设备
Beckman公司生产的Array-360全自动分析仪，－80℃低温冰箱，荧光显微镜(OLYMPUS牌，型号BX60)，离心机(北京医用离心机厂生产，型号LD4-2)，离心管，酶标仪等酶联免疫分析仪器(450nm、630nm)，计时器，自动洗板机，，10ul、100ul、1000ul等规格精密微量加样枪，一次性微量加样管，一次性手套。
4.试验方法
4.1 酶联免疫法(ELISA)检测s IL-7R蛋白水平
4.1.1 预处理
①将试剂和样本从冰箱中取出，平衡至室温(约30分钟)；
②将1份浓缩洗涤液加入到19分蒸馏水或去离子水中，混匀备用；
③使用稀释液稀释样本，稀释比例为1:101(即1ml稀释液中加入10uL样本，混匀)；
4.1.2 检测步骤
①设空白对照1孔、阴性对照2孔、阳性对照2孔、校准品各2孔，用微量加样枪依次加入100uL样本稀释液、阴性质控物、阳性质控物、校准品，其余各孔中加入100uL已稀释血清样本，封板，室温孵育1小时；
②弃去各孔中液体，分别加入300uL洗涤液，静置数秒(30s)后弃去，如此反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干；
③向每孔中加入100uL酶联物，封板，室温孵育30分钟；
④重复步骤(2)；
⑤向每孔中加入100uLTMB底物，室温避光孵育10分钟；
⑥向每孔中加入100uL终止液，在10分钟内于450nm测定OD值。如果选择双波长法测定，参考波长为630nm。
4.1.3 结果计算
绘制校准品OD值与标示浓度(AU/ml)的半对数曲线，即可由样本OD值计算其对应的蛋白浓度。
4.1.4 参考值(参考范围)
参考值：0～20AU/ml；检测一定数量(具有统计学意义)的阴性样本，结果的平均值加3倍标准偏差(即X+3SD)为参考值的上限。
4.2 放射免疫分析法检测抗dsDNA抗体
利用均相免疫反应原理，对病人血清中的抗体进行直接测定；血清＞7IU/ml为抗dsDNA抗体阳性。
4.3 散射比浊法检测补体C3、C4
采用散射比浊法检测补体C3、C4，严格按照操作说明进行操作C3正常参考范围0.9-1.8g/L,C4正常参考范围0.1-0.4g/L。
4.4 间接免疫荧光法(IIF)检测ANA-IgG
采用IIF法半定量检测抗ANA-IgG，包被抗原为：培养的人喉癌上皮细胞(Hep-2细胞)；临床常规检测，ANA滴度大于1：100为阳性。
4.5 免疫印记法检测抗ENA抗体
采用免疫斑点法定性检测抗ENA抗体，包括抗Sm抗体，抗U1RNP抗体，抗SSA抗体，抗SSB抗体，抗So1-70抗体及抗Rib-P蛋白抗体；临床常规检测， 出现显色区与标准带对照即可判定待测血清中含有何种抗体。
4.6 间接免疫荧光法(IIF)检测ANCA-IgG
采用IIF法半定量检测ANCA-IgG，包被抗原为：乙醇固定抗原片/甲醛固定抗原片/HEp-2细胞固定抗原片，临床常规检测，ANCA滴度大于1：100为阳性。
4.7 酶联免疫法检测ACA-IgG
标本加到包被有特异性抗原的微孔板上进行ELISA法常规检测，样品OD值≥临界值为阳性。
4.8.其他实验室检查：包括常规检测血常规、尿常规、血沉(ESR)、肝肾功能、胸片或胸部CT、超声心动图等。
4.9 人全血中提取RNA
①200-400μl全血加入1-2ml Buffer RL在离心管中混匀。
②冰浴10-15min。冰浴期间，温和混匀2次。3,000×g离心5min。
③用吸头尽可能丢弃上相。
④加入0.5ml(血样体积200μl)-1ml(血样体积400μl)Buffer RL，温和混匀，冰浴5min。
⑤加入400μl Buffer R-I，用吸头抽吸，混合均匀，加入200μl Buffer R-II，旋涡振荡1min,12,000×g离心10min。
⑥取上清至2ml离心管中(试剂盒内提供)。加入250μl异丙醇，混合均匀。
⑦将制备管置于2ml(试剂盒内提供)离心管中，转移步骤8中的混合液到制备管中，6,000×g离心1min。
⑧弃滤液，将制备管弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700 μlBuffer W1A，12,000×g离心1min。
⑨弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，在制备管中加入700μl Buffer W2，12,000×g离1min；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
⑩弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12,000×g离心1min。将制备管放入一干净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加60-100μlBuffer TE(DNase﹠RNase-free),室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。
5.临床资料收集
所有患者均进行详细的病史采集和体格检查，包括性别、出生年月、病程、症状和体征、诊疗经过等。
6.统计学处理
采用SPSS11.5统计软件包做统计分析，计量资料的对比采用t检验，阳性率的对比采用χ2检验，两变量间的关系采用Spearson相关性检验，多因素分析采用Logistic回归模型，P<0.05为差异有统计学意义。
7.实验结果：
7.1 血清中sIL-7R在SLE非肾炎组组、SLE肾炎组及健康对照组的结果比较
7.1.1 血清中ACLAb、ANA、Anti-Clq、Anti-dsDNA、ANA、Anti-Rib-P、Anti-Smith(Sm)、Anti-SSAAb、Anti-SSBAb、pANCA、cANCA、C3、C4在系统性红斑狼疮肾炎组和系统性红斑狼疮非肾炎组含量的结果比较
表2 血清中各种临床参数在系统性红斑狼疮非肾炎组组和系统性红斑狼疮肾炎组阳性率及含量检测结果
注：系统性红斑狼疮非肾炎组与系统性红斑狼疮肾炎组相比，C3、Anti-Clq、P＝0.000，均有统计学差异。
7.1.2 血清中sIL-7R在SLE肾炎组、SLE非肾炎组组、健康组的结果比较
如图1所示：为血清中sIL-7R在SLE肾炎组、SLE非肾炎组、健康对照组中含量的诊断结果图；
如图2所示，为SLEDAI、血清中C3补体、C4补体、anti-dsDNA、anti-nuclearantibody在SLE肾炎患者和SLE非肾炎患者中含量结果图；
如图3所示，为SLEDAI与sIL-7R、SLEDAI与ANA、SLEDAI与anti-dsDNA、SLEDA与anti-C1q的相关性结果示意图。
由上可知：图1中SLE肾炎患者血清中sIL-7R含量最高，同样，SLE非肾炎患者血清中sIL-7R含量高于健康组血清中sIL-7R含量；
图2中SLE肾炎患者SLEDAI分数高于SLE非肾炎患者，即血清中sIL-7R含量越高临床上SLE肾炎的病情越重；相反，系统性红斑狼疮肾炎患者C3含量低于系统性红斑狼疮非肾炎患者，即血清中C3含量越低临床上系统性红斑狼疮肾炎的病情越重。
图3中SLEDAI与sIL-7R、SLEDAI与ANA、SLEDAI与anti-dsDNA、SLEDA与anti-C1q呈正相关。
7.1.3 血清中sIL-7R在SLE肾炎组中的mRNA水平示意图
虽然无统计学差异，但SLE肾炎组的mRNA水平有高于SLE非肾炎组、健康 组的趋势。
结论：SLE肾炎组与SLE非肾炎组和健康组相比，血清中sIL-7R含量在SLE肾炎患者中明显高于SLE非肾炎患者和健康对照。此外，SLEDAI分数越高，系统性红斑狼疮肾炎患者的病情越活跃，血清中sIL-7R、ANA、anti-dsDNA、anti-C1q含量越高；相反，血清中C3含量越低，系统性红斑狼疮肾炎患者的病情越活跃；由此可见，系统性红斑狼疮患者血清中sIL-7R与多种临床指标有相关性，则表明血清中sIL-7R是可靠的血清学标记，可用于识别系统性红斑狼疮肾炎。

Claims (4)

1.血清中sIL-7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用，其特征在于：所述血清中sIL-7R用于诊断系统性红斑狼疮肾炎的应用。
2.根据权利要求1所述的血清中sIL-7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用，其特征在于：所述血清sIL-7R可作为系统性红斑狼疮肾炎诊断的标志物。
3.根据权利要求1所述的血清中sIL-7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用，其特征在于：通过测定患者血清中sIL-7R的mRNA水平，用于诊断系统性红斑狼疮肾炎。
4.根据权利要求1所述的血清中sIL-7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用，其特征在于：通过测定患者血清中sIL-7R的蛋白水平，用于诊断系统性红斑狼疮肾炎。
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Inventor before: Liu Xiaoming

Inventor before: Xue Qing

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