NO177444B - Fremgangsmåte for immunometrisk bestemmelse av et antigen, samt utstyrspakke for slik bestemmelse - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for immunometrisk bestemmelse av overflateantigener som er karakteristiske for populasjoner eller subpopulasjoner av celler, og en utstyrspakke for bestemmelse av slike gener. Fremgangsmåten for immunometrisk bestemmelse og den tilsvarende utstyrspakke er på samme måte tiltenkt måling av selve cellene ved bestemmelsen av deres overflateantigener som mellomledd. Disse målinger/ bestemmelser er anvendbare i diagnostikk.

Kunnskapen om antigener eller markører av den cellulære overflate har gjort enorme fremskritt med klargjørelsen av den lymfocytære hybridisering og oppdagelsen av monoklonale anti-stoffer av KOEHLER OG MILSTEIN, (Nature, 1975, 256, 495-497).

De monoklonale antistoffer har særlig muliggjort tilsynekomst og analyse av markører av overflate- eller membranantigener for celler fra den mest varierte opprinnelse. Disse markører (eller antigener) kan være av forskjellig natur: proteiner, glyko-proteiner eller glykolipider. De studerte karakteristika vedrører altså hovedsakelig markører for vev eller organer, markører for differensieringstilstander eller for aktivering av normale celler og for identifisering eller for typebestemmelse av normale eller cancerøse celler. Et spesielt viktig anvendelsesområde er studiet av hematopoetiske cellelinjer (erytrocytære, megakyrocytære, granulocytære, monocytære, lymfocytære).

Således har for eksempel de monoklonale antistoffer muliggjort nøyaktig angivelse av overflate-karakteristika for henholdsvis T- og B-lymfocytter. De tilsvarende markører, alene eller i kombinasjon, identifiserer stadier for differensiering og funksjonell spesialisering av lymfocytter. Ved internasjonal overenstemmelse er overflatemarkørene for humane leukocytter blitt klassifisert i grupper eller differensieringsklasser (CD) definert i henhold til underkomité IUIS-OMS, 1984 og beskrevet i tids-skriftet til Verdens Helseorganisasjon 1984, 62 (5), 813-815.

Identifisering av disse markører, som er gjort mulig takket være monoklonale antistoffer, har gjort det mulig å nå frem til deres struktur og deres biologiske funksjoner. For eksempel deltar molekylene til markører CD4 og CD8 i leukocytære adhesjons-funksjoner og befinner seg på overflaten av T-lymfocytter med henholdsvis en hjelpe- og induserende funksjon (markør CD4) eller med cytotoksisk og suppresiv funksjon (markør CD8).

Oppnåelsen av disse kunnskaper har muliggjort anvendelse av disse markører, takket være antistoffer som gjenkjenner dem, til diagnostikk og undersøkelse av forskjellige patologiske tilstander, hvorav særlig maligne hemopatier (leukemier, lymfomer, etc.) og tilstander med dysfunksjon av immunsystemet (autoimmune sykdommer, medfødte eller ervervede immunologiske defekter som AIDS etc.) (BRETON-GORIUS og VAINCHENKER, Le Biologiste, 1987, XXI, nr. 167 63-70, SHAW, Immunology today, 1987, 8 (1), 1-3)

De monoklonale antistoffer er idag uerstattelige redskaper i den anvendte kliniske biologi til cellulære analyser.

Det eksisterer metoder for telling av celler som anvender merking av overflateantigenene, men disse metoder er ofte lange, laboratoriemessig krevende, vanskelige å iverksette, og resultatene er ofte usikre.

De fremgangsmåter som er kjent og anvendt for å måle normal eller modifisert ekspresjon av overflateantigener i cellen, kan deles i to grupper. I den første gruppen blir antigenene målt ved hjelp av komplisert og spesialisert laboratorieutstyr, på grunnlag av strømcytometri (se spesielt PONCELET og Coll., J. Immunol. Methods, 1985, 85, 65-74) eller kvantitative mikroskopiteknikker (POULTER og Coll. J. Immunol. Methods, 1987, 98, 227-234. Iverk-settelsen av disse fremgangsmåter for evaluering av antigener i cellen er basert på måling av signaler brakt av anticellulære antistoffer bundet på en direkte eller indirekte måte til et reagens merket med fluorescerende stoffer (eller fluorokromerende) slik som isotiocyanatet av fluorescein eller rhodamin, eller enzymer slik som peroksidase eller alkalisk fosfatase. Anvendelse av disse fluorescerende eller enzymatiske reagenser, forbundet med passende skyllingstrinn, fører altså til fremkomst av fluorescens eller farginger som er strengt begrenset til de cellulære membraner og ikke diffunderer inn i omgivelsene. Den fortløpende anvendelse av disse fremgangsmåter i laboratoriet forblir begrenset av nødven-digheten av en spesialisert og kostbar apparatur (fluorescens-mikroskop eventuelt forbundet med en bildeanalysator, kryostat, flux-cytometer). Dessuten gjør analysen og tydningen av de immunologiske merkninger av cellene ved hjelp av disse fremgangsmåter det nødvendig med kompetanse av en spesialist i cytologi.

En annen gruppe av fremgangsmåter for måling av antigenene er basert på kvantitativ evaluering av markører for den helhetlige cellepopulasjon. Disse fremgangsmåter muliggjør måling av anti-gener ved hjelp av merking enten direkte eller indirekte som altså oftest blir utført i 2, 3 eller 4 trinn. I alle tilfeller bærer det anvendte reagens i løpet av det første merkingstrinn en markør som enten er av isotopisk natur, for eksempel jod 125, for bestemmelse av radioimmunometrisk type BROW og Coll. J. Immunol. Methods, 1979, 31 201 - STOCKER et HEUSSER J. Immunol. Methods, 1979, 26, 87-95) eller et enzym for bestemmelse av immunoenzymometrisk type, oftest peroksidase, alkalisk fosfatase eller /3-galaktosidase, (VAN LEUVEN et Coll., J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109-116 - MORRIS Transplantation, 1983, 36(6), 719 - BAUMGARTEN J. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98).

Fremgangsmåtene i denne siste gruppe er nokså besværlige, laboratoriemessig krevende og risikable å anvende på grunn av nødvendigheten av tallrike skyllinger og sentrifugeringer av cellematerialet; det er noen ganger nødvendig på forhånd å fjerne det fargete miljø som er et resultat av den enzymatiske reaksjon i lys av den spektrofotometriske sluttmåling; til slutt er den kjemiske fiksering av cellene, som er den vanligst anvendte, tilgrunnliggende for irreversibel ødeleggelse av disse antigener som er spesielt følsomme for vanlige kjemiske fikseringsmidler, slik som glutaraldehyd eller metanol (DROVER et Coll. J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).

Det er kjent i litteraturen at man kan måle et antigen som bærer flere antigene determinanter, d.v.s flere epitoper, idet man fikserer dette antigen ved hjelp av en av sine epitoper ved hjelp av et antistoff immobilisert på en fast bærer og idet man til en annen epitop for antigenet binder et annet antistoff som bærer en enzymatisk radioisotopisk markør som muliggjør bestemmelse.

En slik teknikk, ofte kalt sandwich-teknikken, er spesielt beskrevet i patentet eller patentsøknader FR 2487 983,

FR 2 500 166, EP 119 736. Ingen av disse dokumenter beskriver anvendelsen av denne teknikken for hele celler, selv om ordet "celle" av og til er inkludert i listen over antigener som denne fremgangsmåten anvender.

I patentene ovenfor er de forskjellige antigener, som er mål for de beskrevne eksempler, alle og utelukkende proteinmolekyler, løselige i vann og fysiologiske væsker, slik som hormoner, enzymer eller sirkulerende tumormarkører. Motsatt er det klart at en celle ikke er et molekyl og at den adskiller seg fra dette ved i det minste en betraktelig mye større størrelse og ved det faktum at den ikke er løselig i det fysiologiske miljø. Således, inntil denne dag, er sandwich-teknikken aldri blitt anvendt til hele celler.

Dessuten er immunologisk innsamling av celler på en fast bærer beskrevet i patentsøknad WO 86/02091 hvori målet er å eliminere uønskete celler i benmargsprøver bestemt til trans-plantasjoner. I nevnte patentsøknad ble innfanging av celler utført på flytende mikrokule, og gjør det nødvendig at de anvendte antistoffer er bundet til en fast bærer ved hjelp av en kompleks makromolekulær struktur, kalt nettrelé, istand til å sikre en begunstiget orientering av antistoffet som det cellulære antigen tilsvarer. Ingen anvendelse av denne teknikk for kvantitativ måling av et antigen er angitt i denne søknad.

Den immunologiske innfanging av celler er på samme måte beskrevet i patentsøknad WO 84/03151 for en analytisk anvendelse.

I dette patent er målet å identifisere vevsgrupper som de under-søkte celler hører til (operasjon som hovedsakelig er kalt HLA-type-angivelse). Innfanging av celler utføres ved hjelp av anti-stoffer plassert i en spesiell geometri på meget spesialiserte bærere (mikroskoplameller). Resultatene oppnåes ved enkel visuell observering av bæreren og fører til svar som "alt eller ingenting". Således fører ikke systemene for immunologisk innfanging av celler beskrevet til idag til analytiske anvendelser som muliggjør kvantitativ bestemmelse av et antigen uttrykt på membranen av visse celler. Dessuten kan alle disse systemer mangle spesifisitet, da de beror på gjenkjennelsen av celler ved hjelp av et unikt antistoff.

Fremgangsmåten som er mål for den foreliggende oppfinnelse, har betraktelige fordeler i forhold til alle de tidligere kjente og anvendte teknikker, da den muliggjør måling på kvantitativ måte av alle antigener i en cellepopulasjon i en enkelt analysetid. Denne bestemmelse utføres på celler som ikke har gjennomgått noen kjemisk eller fysisk inngripen og som er i sin tilstand av fysiologisk integritet. Dessuten har fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen karakteristika av meget høy spesifisitet, særlig for systemer med dobbelt immunologisk gjenkjennelse, idet man anvender to forskjellige antistoffer spesifikke for to forskjellige anti-gener båret på samme celle. Denne fremgangsmåte er enkel, hurtig og reproduserbar. Den er helt tilpasset analyse av et stort antall prøver, hvilket muliggjør anvendelse til diagnostiske formål i laboratorier for klinisk geologi med stor kapasitet.

Således beskriver foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for immunometrisk bestemmelse av overflateantigener fra en cellulær populasjon eller underpopulasjon valgt blant tumorceller og blodceller, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at den består av: a) immobilisering av cellepopulasjonen som bærer antigenet som skal bestemmes eller en cellepopulasjon som omfatter underpopulasjonen som bærer antigenet som skal bestemmes, på en fast bærer, ved å anvende ett eller flere monoklonale anti-stoffer på forhånd fiksert ved kovålent binding eller ved fysisk absorbsjon på nevnte bærer og i stand til å gjenkjenne et antigen til stede på overflaten av celler forskjellige fra antigenet som skal bestemmes, og,

i samme trinn, direkte merking av den cellulære populasjon eller underpopulasjon som skal bestemmes, ved hjelp av minst ett monoklonalt antistoff spesifikt for antigenet som skal bestemmes, idet nevnte antistoff bærer en radioisotopisk

eller enzymatisk markør/

b) observering av en inkubasjonsperiode; c) skylling av bæreren for å eliminere ikke immobiliserte celler og overskudd av antistoff; d) i tilfellet hvor antistoffet bærer en enzymatisk markør, tilsetning av det eller de nødvendige reagenser (substrat og

kromogen) for å åpenbare enzymets aktivitet,

e) avlesning av resultatene, enten ved telling av radioaktivitet eller ved måling av lyssignaler (farging eller fluorescens)

idet man eventuelt refererer seg til et standardskjema.

Videre beskriver foreliggende oppfinnelse en utstyrspakke for anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, som er karakterisert ved at den omfatter følgende komponenter: a) en fast bærer på hvilken det ved kovalent binding eller ved fysisk adsorbsjon er fiksert ett eller flere monoklonale

anti-stoffer rettet mot overflateantigener fra den cellepopulasjon som skal bestemmes forskjellig fra det

karakteristiske antigen som skal bestemmes;

b) én eller flere løsninger som hver inneholder et monoklonalt antistoff som er spesifikt for nevnte antigen som er karakteristisk for den cellulære populasjon eller underpopulasjon som skal bestemmes, merket med en radioaktiv markør eller en

enzymatisk markør;

c) i tilfellet med antistoff merket med en enzymatisk markør,

én eller flere løsninger som inneholder de reagenser som er

nødvendige for å åpenbare enzymets aktivitet;

d) eventuelt en tilleggskomponent som består av en bufferløsning for vasking og/eller prøver som muliggjør standardisering og

kvalitetskontroll av bestemmelsen.

Begrepet celle, anvendt i den foreliggende beskrivelse og i patentkravene som følger, inkluderer humane celler, animale celler, celler av protozoer og celler av mikroorganismer (bakterier eller sopper). Vedrørende blodceller inkluderer den foreliggende oppfinnelse de nukleære opptredende elementer, liksom leukocytter og de anukleære opptredende elementer, slik som de røde blodlegemer eller blodplater.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvender hele celler, d.v.s. ikke lyserte.

Disse celler har ikke gjennomgått noen fysisk eller kjemisk inngripen, og de blir anvendt i en tilstand av fullstendig fysiologisk integritet. Denne situasjon utgjør hovedgarantien før integritet av membranmarkører valgt som mål for bestemmelse.

Som fast bærer kan man anvende alle anordninger tilpasset håndtering av cellulære suspensjoner og fortrinnsvis rør, spesielle magnetiske bærere eller faste eller bløte mikrotitrerinsplater av polyetylen, polystyren, polyvinylklorid eller nitrocellulose som har mikrobrønner. De monoklonale antistoffer bestemt til immobilisering av cellene, kan være fiksert på fast bærer, enten ved kjemisk kovalent binding eller fysisk absorbsjon i henhold til klassiske teknikker godt kjent for fagmannen på området, slik som de som er beskrevet av STOCKER et HEUSSER J. immunol. Methods, 1979, vol. 26 p. 87-95. Med fordel kan bæreren på forhånd være mettet ved hjelp av et protein.

I henhold til oppfinnelsen må det eller de monoklonale antistoff (er) som er fiksert på den faste bærer, muliggjøre immunologisk innfanging av cellepopulasjonen hvoriblant befinner seg den eller de cellepopulasjon(er) som bærer antigenene som skal bestemmes. Når denne populasjon består av humane celler, er de foretrukne monoklonale antistoffer for immunologisk innfanging antistoffene anti-HLA fra klasse I som er spesifikke for den felles gruppe av antigener HLA A, B og C til stede på leukocytter og tallrike andre cellulære linjer i organismen. Blant disse antistoffer er det som er kalt S-klasse I, forhandlet av BIOSYS, spesielt foretrukket.

I andre tilfeller hvor de undersøkte celler er humane celler og i alle fall når cellene ikke er humane, kan de monoklonale antistoffer som passer til de undersøkte celletyper på samme måte anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Uttrykket "et monoklonalt antistoff merket med en radioisotop markør" betegner at det monoklonale antistoff bærer enten på et rent element av dens struktur, for eksempel restene av tyrosin-bestanddeler, eller på et passende radikal som er blitt fiksert på det, en radioaktiv isotop som muliggjør bestemmelse ved telling av radioaktiviteten som er forbundet med det.

Uttrykket "et monoklonalt antistoff merket med en enzymatisk markør" betegner at det monoklonale antistoff er bundet til et enzym som, forbundet med anvendelse av passende reagenser, tillater kvantitativ måling av dette monoklonale antistoff.

Substratet og reagensene er valgt på en slik måte at slutt-produktet for reaksjonen eller sekvensen av reaksjoner forårsaket av enzymet og ved anvendelse av disse stoffer er: enten et farget eller fluorescerende stoff som diffunderer i cellenes væskemiljø omgivelser og som er mål for den henholds-vise spektrofotometriske eller fluorimetriske sluttmåling,

eller et farget, uløselig stoff som avsetter seg på cellene adskiller dem fra dem som er fiksert til og som kan være mål enten for en fotometrisk måling ved refleksjon eller for en synsmessig evaluering, eventuelt i forhold til en standardi-sert fargeskala.

Utstyrspakken kan som tilleggskomponent inneholde en buffer-løsning bestemt til skylling av det faste stoff etter immobilisering og merking av celler med det eller dé antistoffer som bærer den valgte markør.

Utstyrspakken kan også som tilleggskomponenter inneholde prøvene som er nødvendige for standardisering av bestemmelsen såvel som kvalitetskontroll av bestemmelsen.

Utstyrspakken og den immunometriske fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen anvender seg på en foretrukket måte av bestemmelsen av overflateantigener til elementer som opptrer i humant blod, særlig leukocytter, og mer spesielt lymfocytter, T-lymfocytter, T4-lymfocytter, T8-lymfocytter, B-lymfocytter, slik som granulocytter, monocytter og blodplater.

En annen, foretrukket anvendelse er bestemmelse av overflateantigener for patogene mikroorganismer, for eksempel Candida albicans.

Dessuten er utstyrspakken og den immunometriske fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen spesielt anvendbare til bestemmelse av overflateantigener for tumorceller, særlig cancer-celler fra urin-veiene og celler i maligne hemopatier.

Utstyrspakken og den immunometriske fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen tillater måling av signaler (radioaktivitet eller absorbert eller utsendt lys) som samtidig avhenger av antall celler som er til stede i den undersøkte cellulære populasjon og tettheten av det målte antigen på overflaten av disse celler. Målingen av disse signaler muliggjør en kvantitativ evaluering av det totale antall molekyler av dette antigen som er båret av den undersøkte cellulære populasjon eller underpopulasjon, idet dette antigen spiller en strukturell eller funksjonell rolle.

For eksempel, i tilfelle med leukocytære markører, som er spesielt viktige i hematologi, vet man at hos friske individer,

i majoriteten av situasjoner, varierer ikke gjennomsnittsverdien av den antigeniske tetthet vesentlig fra en prøve til en annen for den samme cellulære populasjon. Det eksisterer altså en god korrelasjon mellom cytologisk telling av celler som bærer det betraktede antigen og det signal som er målt i henhold til oppfinnelsen, som er proporsjonal med det totale antall antigen-molekyler som er til stede i den undersøkte prøve. Derimot, ved visse patologiske tilstander, kan tettheten av overflateantigener variere for den samme cellulære populasjon uten at antallet eller proporsjonen av positive celler varierer merkbart. Slike patologiske tilstander blir mer effektivt klargjort ved anvendelse av den immunometriske fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen eller ved anvendelse av utstyrspakken i henhold til oppfinnelsen, enn det vil ved en konvensjonell fremgangsmåte med cytologisk telling.

En annen anvendelse av oppfinnelsen fremkom ved at en mikrotitreringsplate ble valgt som fast bærer. Utstyrspakken og den immunometriske fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen kan altså på en fordelaktig måte anvendes til bestemmelse på en enkelt plate av en rekke overflateantigener som er karakteristiske for forskjellige underpopulasjoner som utgjør den undersøkte celle-populasjon. For dette formål kan man på den ene side anvende mikrotitreringsplater ferdig til anvendelse, hvorpå det på forhånd er fiksert ett eller flere monoklonale antistoffer i stand til å tilbakeholde alle celler i den undersøkte populasjon og på den annen side anbringe en rekke monoklonale antistoffer bundet til en passende markør og hver spesifikke for et antigen karakteristisk for en av underpopulasjonene som skal evalueres. Således kan man i en eneste operasjon og på samme bærer oppnå den kvantitative bestemmelse av alle de antigener som er nødvendige for karakterisering av de valgte underpopulasjoner.

Denne anvendelse av den foreliggende oppfinnelse er illu-strert ved karakterisering av det antigene utstyr for celler som har interesse i klinisk biologi. Et første tilfelle er representert ved bestemmelse av vevsgrupper som karakteriserer et gitt individ, kjent under den vanlige typebetegnelse HLA.

Et annet tilfelle er representert ved typeangivelse av tumorceller, spesielt for syke angrepet av maligne hemopatier, slik som leukemier eller lymfomer. Denne diagnostiske undersøk-else, systematisk praktisert, består i å karakterisere typen og opprinnelsen av pasientens tumorceller ved tilstedeværelse eller fravær på cellene av en rekke valgte, konvensjonelle overflateantigener.

Ved å anvende utstyrspakken i henhold til oppfinnelsen, som omfatter en mikrotitreringsplate på hvilken det på forhånd er fiksert ett eller flere monoklonale antistoffer i stand til å fiksere alle cellene i den undersøkte populasjon og løsninger av forskjellige monoklonale antistoffer merket med en enzymatisk eller radioisotopisk markør, hver spesifikk for et antigen som er til stede på tumorcellene, kan man identifisere og evaluere kvantitativt de antigener som er karakteristiske for pasientens tumorcellepopulasjon, og således knytte dem til en av de store grupper av cancere og særlig maligne hemopatier, karakterisert klinisk. Anvendelsen av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen muliggjør også hurtig utførelse, og én eneste bærer, kvalitativ og kvantitativ undersøkelse av den antigene utrustning av tumorcellene.

For å illustrere en annen anvendelse av oppfinnelsen kan man nevne tilfeller med humane T-lymfocytter, for hvilke det eksisterer særlig 2 underpopulasjoner av celler: lymfocytter som er karakterisert ved tilstedeværelse av markør CD4, og som man kaller T4-positive lymfocytter eller enklere T4-lymfocytter og lymfocytter karakterisert ved tilstedeværelse av markør CD8, som man kaller T8-positive lymfocytter (eller T8-lymfocytter).

Målingen av tallforholdet T4/T8 har stor diagnostisk interesse i klinisk biologi. Det er faktisk kjent at forandringer i forholdet T4/T8 opptrer i flere lidelser i immunsystemet, slik som de dysimmunotære sykdommer, kroniske infektiøse sykdommer, virale infeksjoner og særlig lidelser på grunn av HIV (virus fra

AIDS).

Utstyrspakken og den immunometriske fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen kan anvendes til bestemmelse av antigener i sin helhet, som er karakteristiske for populasjonen av T-lymfocytter og/eller antigener karakteristiske for underpopulasjoner av T4- og T8-lymfocytter. I dette tilfelle utfører man spesifikk immobilisering av T-lymfocytter i den undersøkte prøve, på en fast bærer, og samtidig utfører man direkte merking av overflateantigener på T4-lymfocytter ved et monoklonalt antistoff anti-CD4 som bærer en radioisotopisk eller enzymatisk markør; på samme måte utføres den direkte merking av overflateantigener til T8-lymfocytter ved et monoklonalt antistoff anti-CD8 som bærer en passende markør.

For bestemmelse av totale T-lymfocytter anvender man fortrinnsvis monoklonalt antistoff anti-CD7 (også kalt anti-T2) som bærer en passende markør.

For å oppnå spesifikk immobilisering av T-lymfocytter i prøven anvender man fortrinnsvis étt eller flere monoklonale anti-stoffer som alene eller i kombinasjon er i stand til å gjenkjenne helheten av T-celler i prøven, hvilket er tilfelle med de kjente antistoffer anti-leukocytter (eller anti-CD5) eller antistoffer som gjenkjenner samlingen av populasjon T (kalt "pan T") slik som antistoff anti-CD2 (eller anti-Tll), anti-CD5 (eller anti-Tl), anti-CD7 (eller anti-T2) eller andre antistoffer pan-T som ennå ikke er knyttet til en differensieringsklasse i henhold til kriteriene OMS.

Man kan med fordel anvende den immunometriske fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen til bestemmelse av antigener karakteristiske for populasjonen av T-lymfocytter og T4- og T8-lymfocytter på flere områder av samme faste bærer. Målingen av signalene ved telling av radioaktivitet, fotometrisk måling i transmisjon eller refleksjon, eller måling av fluorescens tillater lett og direkte beregning av tallforholdet CD4/CD8.

På samme måte kan man på samme faste bærer bestemme underpopulasjonene kalt T-lymfocytter og B-lymfocytter, som utgjør samlingen av den lymfocytære linje.

Man kan for eksempel ved absorbsjon fiksere et monoklonalt antistoff eller en blanding av monoklonale antistoffer spesifikke for den totale mengde av overflateantigener til T-celler på side-veggene i mikrobrønner. De monoklonale antistoffer muliggjør senere immobilisering i mikrobrønnene av hele populasjonen av T-celler i den undersøkte prøven. Flakene som blir fremstilt på denne måte, kan lyofiliseres og lages til stokkløsninger fortrinnsvis ved 4°C. Dette trinn kan utføres industrielt, og man kan således anbringe plater ferdig til anvendelse i utstyrspakkene som er anvendbare enten til totale T-lymfocytter eller til hele underpopulasjonen av T-lymfocytter.

Prøvene som inneholder celler som skal bestemmes og som kommer fra blod eller av annen passende biologisk væske, normal eller patologisk, kan anvendes som sådan eller etter behandling, særlig ved sentrifugering i tetthetsgradient i henhold til alle-rede kjente fremgangsmåter og spesielt i et miljø med sterk tetthet som for eksempel FICOLL-PAQUE, forhandlet av Pharmacia. For måling av lymfocytter i blod kan man på samme måte behandle blodprøven som skal bestemmes med en løsning kalt lysebuffer som lyserer de røde blodlegemer.

Alikvote mengder av den passende cellulære suspensjon blir plassert i kontakt med den faste bærer, for eksempel i mikro-brønner på en mikrotitreringsplate fremstilt på forhånd, samtidig som løsningen som utgjør endel av utstyrspakken og som inneholder det spesfikke monoklonale antistoff for den tilsiktede cellulære populasjon og som bærer en passende markør, d.v.s. en radioisotopisk eller enzymatisk markør. Således kan en radioisotopisk markør fremstilles for eksempel ved å merke det monoklonale antistoff med jod 125 eller jod 131, for eksempel i nærvær av kloramin T i henhold til en kjent fremgangsmåte (F.C. GREENWOOD, W.M. HUNTER et Coll, Biochem. J., 1963, 89, 114); eller også kan en enzymatisk bærer fremstilles ved å konjugere det monoklonale antistoff med et enzym som f.eks. alkalisk fosfatase, peroksidase, /3-galaktosidase eller acetylcholinesterase, i henhold til kjente fremgangsmåter (se for eksempel M. 0'SULLIVAN Methods in Enzymology 1981, 73., 147 eller i henhold til en fremgangsmåte som er utledet fra denne. I disse tilfeller, for å unngå visse ulemper knyttet til håndte-ringen av radioaktive stoffer og til varigheten som er begrenset til reagensenes effektivitet, vil enzymene fortrinnsvis bli anvendt med radioisotopiske markører.

Inkubasjonstiden, d.v.s. varigheten som er nødvendig for samtidig immobilisering og merking av celler, er fortrinnsvis mindre enn eller lik en time. I løpet av denne tidsperiode kan den faste bærer eventuelt sentrifugeres for å forbedre immobiliseringen av cellene. Den faste bærer, for eksempel mikrotitreringsplaten, blir deretter skyllet for samtidig å eliminere de ikke fikserte celler og det monoklonale antistoff som bærer en enzymatisk eller radioisotopisk markør i overskudd.

Når man anvender en radioisotopisk markør, som for eksempel jod 125, blir radioaktiviteten forbundet med cellene, talt i en gammateller i henhold til enhver passende måte og for eksempel etter løseliggjøring av cellene ved hjelp av en alkalisk løsning (for eksempel en natriumhydroksydløsning) og oppsamling av løsningen som inneholder radioaktivitet ved hjelp av en absorberende tampong.

Når man anvender en enzymatisk bærer på det monoklonale antistoff, vil fremkomsten av et farget eller fluorescerende produkt oppnåes ved til den faste bærer hvorpå den cellulære populasjon som bærer antigenet som skal måles, er fiksert, å tilsette en løsning som inneholder enzymsubstratet og ett eller flere hjelpereagenser som muliggjør at man til slutt som reaksjonsprodukt oppnår enten et farget produkt løselig i miljøet eller et farget, uløselig produkt, eller et løselig fluorescerende produkt som det er blitt forklart foran. Man måler videre lys-signalet som kommer fra prøvene som er blitt behandlet på denne måte, ved hjelp av apparaturen tilpasset hvert tilfelle: henholdsvis fotometer ved transmisjon eller refleksjon eller fluorimeter. Når den faste bærer er en mikrotitreringsplate, kan avlesningen av lyssignaler utføres sekvensielt i alle brønnene på samme plate ved å anvende automatiserte avlesere for løpende anvendelse i laboratorier for biologi, slik som for eksempel Titertek plateavleseren eller Fluoroscan plateavleseren, til henholdsvis spektrofotometriske eller fluorometriske avlesninger.

Når man som enzymatisk bærer anvender alkalisk fosfatase blir bindingen av dette enzym til det monoklonale antistoff utført i henhold til fremgangsmåten fremsatt av Boehringer Mannheim - Biochemica. De foretrukne substrater til dette enzym er paranitrofenylfosfat for en spektrofotometrisk sluttavlesning eller 4-metyl-umbelliferylfosfat for en fluorimetrisk avlesning eller 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat for å oppnå et produkt med uløselig farge-reaksjon. Man kan på samme måte som enzymatisk sonde anvende /3-galaktosidase for hvilket de foretrukne substrater da er ortonitrofenyl beta D-falaktopyranosid eller 4-metyl-umbelliferyl-£-D-galaktopyranosid.

Fortrinnsvis kan man binde de monoklonale antistoffer til peroksidase. I dette tilfellet er bindingsprosedyren utledet fra den som er beskrevet av M.B. WILSON og P.K. NAKANE i Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Kolubar,

G. Wicks eds, Elsevier/North Holland. Amsterdam, 1978, s. 215-224. Modifikasjonene som er innført når det gjelder startprotokollen for fremstilling av det enzymatiske konjugat, har følgende punkter: forholdet molar peroksidase/antistoff er lik 3, mot 2 i

protokollen,

oksydering minsker trykket av glucidenheter i peroksidasen ved minsking på 33% av den foreslåtte konsentrasjon av natriumperj odat.

Reagensene som ble anvendt for å åpenbare peroksidasen konjugert til monoklonale antistoffer, inneholder oksygenert vann, enzymsubstrat og et passende kromogen, for eksempel ortofenylendiamin eller 2,2'-azino til (3-etyl-6-benzotiazolin sulfonsyre) eller ABTS for å oppnå et sluttreaksjonsprodukt som var farget og løselig i miljøet eller også 3,3' diamino benzidin eller 3-amino-9-etyl-karbazol eller 4-klor-alfa-naftol for å oppnå et uløselig sluttreaksjonsprodukt, eller også parahydroksyfenylpropionsyre for å oppnå et fluorescerende reaksjonsprodukt som er løselig i miljøet.

I henhold til en foretrukket utførelsesform omfatter utstyrspakken i henhold til oppfinnelsen, for bestemmelse av antigener karakteristiske for T-, T4- og T8-lymfocytter: a) en mikrotitreringsplate i hvis brønner man har fiksert ett eller flere monoklonale antistoffer, antilymfocytter T.

bl) en løsning som inneholder minst ett monoklonalt antistoff

antilymfocytter T merket med peroksidase.

b2) en løsning som inneholder minst ett monoklonalt antistoff

antigen-CD4 merket med peroksidase.

b3) en løsning som inneholder minst ett monoklonalt antistoff antigen-CD8 merket med peroksidase.

cl) en løsning som inneholder oksygenert vann, enzymsubstrat, i

en passende buffer.

c2) en løsning som inneholder kromogenet anvendt for å åpenbare ekspresjon av enzymets aktivitet.

En annen foretrukken utførelse av oppfinnelsen er anvendelse av monoklonale antistoffer bundet til acetylcholinesterase.

Acetylcholinesterase blir bundet til antistoffer ved fortrinnsvis å anvende en fremgangsmåte utledet fra den som er beskrevet i fransk patent nr. 2 550 799 eller en fremgangsmåte som skjematisk omfatter fremstilling av fragmenter av antistoffer ved hjelp av en kjent teknikk, modifisering av enzymet ved reaksjon med et passende heterobifunksjonelt middel og til slutt binding av produktene oppnådd på denne måte. Andre kjente fremgangsmåter for konstruksjon av immunoenzymatiske konjugater kan også anvendes i dette tilfelle.

Åpenbaringen av den enzymatiske aktivitet som er spesifikt knyttet til det cellulære antigen gjenkjent av konjugatet medacetylcholinesterase, utføres fortrinnsvis i henhold til den velkjente teknikk som anvender acetyltiocholin som substrat for enzymet og Ellmans reagens, eller 5,5-ditio-2 nitro-benzosyre som kromogen, i henhold til enhver variant tilpasset det undersøkte tilfellet, for eksempel den som er beskrevet av Pradelles et al. Anal. Chem. 57 (1985) 1170-1173.

De nevnte kromogener anvendes som sådanne eller i form av salter løselige i vann.

Resultatene av bestemmelse av antigener i henhold til oppfinnelsen kan uttrykkes på enhver måte som er passende for den utførte undersøkelse. Mer spesielt kan man uttrykke disse resultater enten i totalt antall molekyler av et spesielt antigen (for eksempel antigen CD4) presentert i et volum av den undersøkte prøve (for eksempel pr. mikroliter blod), eller i forhold til antall molekyler av et antigen eller antall molekyler av et annet antigen i den undersøkte prøven (for eksempel forholdet mellom antigen CD4 og antigenet CD8 - eller forholdet CD4/CD8 i den undersøkte blodprøve.

For å bestemme antall molekyler i et spesielt antigen i den undersøkte prøven vil man fortrinnsvis anvende en kalibrerings-skala som består av celler eller passende cellepreparater, som bærer antigenet som skal bestemmes og som på forhånd er blitt kalibrert ved hjelp av en kjent referansemetode. Disse standarder vil fortrinnsvis bestå av enten celler som er identiske i sin opprinnelse med celler som er mål for bestemmelsen, eller av celler fra etablerte cellelinjer som bærer det søkte antigen, eller av preparater, for eksempel av membraner, som stammer fra disse celler.

Disse standarder blir altså behandlet nøyaktig som prøvene som skal undersøkes. Signalene som kommer fra disse, tjener til å konstruere et standardiseringsskjerna som signalene målt med prøvene som skal undersøkes, blir ført tilbake til. De videre beregninger er konvensjonelle.

For å bestemme forholdet mellom antall molekyler i de to antigener i prøven som skal undersøkes, kan man anvende standar-diseringssystemet beskrevet ovenfor og til slutt beregne det søkte forhold. På en enklere måte kan man i tallrike tilfeller beregne direkte forholdet mellom spesifikke signaler oppnådd med hvert av de søkte antigener, korrigere de påkommende tilfeller med kjente faktorer slik som forholdet mellom dimensjoner av anvendte forsøks-prøver, og man oppnår direkte deres søkte forhold.

Den immunometriske målemetode i henhold til oppfinnelsen er enkel, hurtig og reproduserbar. Dens anvendelse er helt tilpasset analyse av et stort antall prøver. For å forstå fordelene ved sammenligning med andre beskrevne fremgangsmåter passer det å analysere de forskjellige trinn.

Immobilisering av cellene på den faste bærer er målingsfasen som vanligvis vil presentere mest vanskeligheter eller som er den mest kritiske å utføre. En ofte anvendt måte er kjemisk fiksering av cellene ved hjelp av glutaraldehyd eller metanol i skåler som kan eller ikke kan være behandlet med poly-L-lysin (VAN LEUVEN F. et Coll., J. Immunol, Methods, 1978, 23, 109). Allikevel kan de kjemiske fikseringer som således anvendes, minke eller til og med undertrykke den søkte spesifikke påvisning eller motsatt indusere falske positive merkinger av celler, noe som en meget alvorlig ulempe (DROVER et MARSHALL J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281) .

Dessuten nødvendiggjør utførelsen av fremgangsmåten ved kjemisk fiksering flere trinn: sentrifugering av cellene, fremstilling av blanding av fikseringsmiddel, fiksering og så skyllinger av de fikserte celler.

Tørking av cellene ved 37°C, fulgt eller ikke fulgt av en fiksering i metanol i mikrobrønnene er også blitt foreslått (BAUMGARTEN, J. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98). Faktisk vil dehydratisering av cellene ved 37°C, foruten at den kan forandre visse skjøre antigener, trenge gjennom den pericellulære plasma-membran, hvilket forenkler immunologisk merking av intracyto-plasmatiske antigener i tillegg til merking av overflateantiger, hvilket således fører til generende "bakgrunnsstøy" eller til falske positive resultater når man ønsker et mål begrenset til overflateantigenet.

Dessuten er reproduserbarheten av denne fremgangsmåte usikker; faktisk kan dekanteringen av cellene i mikrobrønnene for bestemmelsen og tørkingen av cellene variere fra ett eksperiment til et annet. Endelig tar denne bestemmelse lang tid å utføre da selve tørketrinnet av cellene alene nødvendiggjør en tidsperiode på mer enn to timer.

Immobiliseringen av lymfocytære populasjoner er også blitt oppnådd takket være anvendelse av polyklonale antistoffer absorbert i mikrobrønner (STOCKER et HEUSSER J. Immunol. Methods, 1979, 26, 87-95). Foruten å tillate immobilisering av celler som er fremmede for den ene populasjon som man ønsker å analysere, presenterer de polyklonale antistoffer også den ulempe at de reagerer med de antigener som skal bli målt ved hjelp av det merkede antistoff, hvilket like mye reduserer det signal som ble målt til slutt.

Anvendelse av høyt spesifikke og avgrensete monoklonale antistoffer absorbert eller fiksert til den faste bærer og særlig i målebrønner, tillater eksklusiv innfanging av søkte celler, idet de andre ikke tilbakeholdte celle-populasjoner blir eliminert i løpet av skyllingene som blir utført i slutten av merkingen av antigenene som skal bestemmes. Dessuten er det ikke noe kjemisk eller fysisk middel som forandrer karakteristikaene til antigenene i dette trinn, da de forskjellige operasjoner som var bestemt å fiksere cellene kjemisk eller fysisk til bæreren er undertrykket.

Således, i henhold til den foreliggende oppfinnelse, er det blitt funnet at immobilisering av celler ved hjelp av monoklonale antistoffer er en fremgangsmåte som muliggjør forenkling av immobiliseringstrinnet av celler som bærer antigenet som skal bestemmes, og alt dette gjør resultatene mer pålitelige.

De immunometriske målinger som blir anvendt på celle-populasjonene, utføres hovedsakelig ved merking av celler i henhold til indirekte metode i 2 eller 3 påfølgende trinn, idet markøren som bringer det spesifikke signal er fiksert på cellene i løpet av det siste trinn i merkeprosedyren. Under merkingen av cellene i to trinn anvender hovedreagensene som brukes, anti-stoffer, anti-immunoglobuliner (anti-Ig) bundet til /3-galaktosidase (COBBOLD og Coll. J. Immunol. Methods, 1971, 44, 125-133) eller til alkalisk fosfatase (HESSIAN J. Immuno. Methods, 1986, 91, 29-34 eller markert med jod 125 (SAVION J. Immunol. Methods, 1987, 97, 49-56). Teknikken for merking med reaktiv peroksidase anti-peroksidase utføres i 3 trinn (VAN LEUVEN 1978).

En annen fremgangsmåte, denne også i 3 trinn, innfører et monoklonalt antistoff som er spesifikt for den antigene markør som skal analyseres, så antistoff anti-Ig fra mus som bærer biotin og til slutt en konjugert streptavidin-peroksidase (BAUMGARTEN, 1986) eller streptavidin-alkalinsk fosfatase (IGIETSEME og Coll. J. Immunol. Methods, 1987, 97, 123-131).

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen som omfatter samtidig anvendelse i ett eneste trinn av en immunoinnfangings-prosess av hele celler, uten fysisk eller kjemisk inngripen på cellene og merking av alle eller endel av disse celler med ett eller flere monoklonale antistoffer som direkte bærer en radioisotopisk eller enzymatisk markør, muliggjør for første gang kvantitativ måling på selve cellene av valgte membran-antigener.

I henhold til oppfinnelsen muliggjør den direkte merking av de immobiliserte celler immunologisk: forenkling av fremgangsmåten for bestemmelse ved utelatelse av gjentatte intermediære håndteringer mellom de påfølgende merketrinn i tilfelle med indirekte merking: sentrifugeringer av cellene,:eliminering av reagenser for merking, gjenbringing i suspensjon;

innsparing av reagenser; - en forbedret pålitelighet ved forminsking av antall trinn og håndteringer;

vinn av tid;

mulighet for samtidig å behandle store antall prøver med anvendelse utelukkende av vanlige materialer og apparatur.

Inkuberingstiden for immobilisering av celle-populasjonen og samtidig direkte merking av antigener i den cellulære underpopulasjon som skal doseres, er kort. Den er mindre enn eller lik én time i tilfelle med bestemmelse av T-lymfocytter og under-populas joner av T4- og T8-lymfocytter.

Etter skylling av den faste bærer blir doseringen i egentlig forstand utført ved observasjon av et signal som er nøyaktig og enkelt å måle, med vanlig apparatur: radioaktivitet, absorbsjon eller lysemisjon.

Således presenterer helheten av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tallrike fordeler: den er hurtig, pålitelig, økonomisk og enkel.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen muliggjør bestemmelse av overflateantigener i en celle-populasjon i en stor skala av celle-konsentrasjoner.

Følsomheten til fremgangsmåten vis-å-vis celletallet avhenger av den antigeniske tetthet og den målte celle-populasjon. For hvert antigen kan man, hvis man ønsker, definere den minimale molare konsentrasjon i antigen som kan måles ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Således,•for eksempel når den faste, valgte bærer er en mikrotitreringsplate og når de undersøkte celler er humane lymfocytter, har man observert at man får signifikante målinger når antall analyserte celler er innbefattet mellom noen hundre og omtrent 200.000 pr. /il idet den nedre grense er bestemt av tettheten av antigenet målt på de undersøkte celler og følsomheten til den valgte påvisningsteknikk, mens den øvre grense hovedsakelig er avhengig av dimensjonen og geometrien av den faste bærer. Det samme gjelder når den faste bærer utgjøres av rør.

Man har verifisert at de registrerte signaler (telling av radioaktivitet eller fotometriske målinger) muliggjør oppnåelse av regelmessige og tilfredsstillende standardiseringskurver i funksjon av antall anvendte celler, under vanlige betingelser for håndtering.

Dessuten kan man forbedre følsomheten til fremgangsmåten om nødvendig ved samtidig å fiksere på samme overflateantigen flere forskjellige monoklonale antistoffer, spesifikke for flere forskjellige isotoper i samme antigen. Dette er blitt verifisert ved bestemmelse av CD4-antigener på celler fra linje Ischikawa (human T-linje) for hvilken man samtidig anvendte antistoffene 0KT4 og ST4 merket med jod 125. Det målte signal ble forsterket med omtrent 50% i forhold til oppnådde signaler med hvert av antistoffene anti-CD4 anvendt alene.

I eksemplene som følger anvender man på en indifferent måte følgende begreper eller deres forkortelser: BSA: albumin fra bovin serum eller bovin- serumalbumin

PBS: fosfatbufret saltvann med pH 7,4 POD: peroksidase

IgG: immunoglobulin G

IgM: immunoglobulin M

IgG anti-T eller anti-T: antistoff anti-lymfocytt T

IgG anti-CD4 eller anti-CD4: antistoff anti-antigen CD4

IgG anti-CD8 eller anti-CD8: antistoff anti-antigen CD8

cpm: tellinger pr. minutt dpm: spaltninger pr. minutt

EKSEMPEL 1

Immunoenzymometrisk bestemmelse av den molekylære konsentrasjon av antigen CD4 og CD8 ut fra prøver av humant blod som omfatter merking av antistoffer med peroksidase.

A) Fremmstilling av utstyrspakken for bestemmelse

a) Fremstilling av platen

Man anvender en mikrotitreringsplate av plast forhandlet

av NUNC (referanse 64394) som rommer 96 mikro-brønner. Man plasserer i hver mikrobrønn 200 ( Ml av en løsning som inneholder det rensede monoklonale antistoff anti-CD2 (kalt ST 11) anvendt for å immobilisere det totale antall T-lymfocytter, d.v.s. for å utføre deres immunologiske innfanging. Dette antistoff forhandlet av BIOSYS/ Compiegne, Frankrike under referanse ST 11, anvendes i en konsentrasjon på 10 nq/ ial i en fosfatbuffer saltløsning ved pH 7,474 (PBS) .

Adsorbsjonen av det monoklonale antistoff utføres ved

4°C i 12 timer. Man eliminerer antistoffet i overskudd ved omdreining av platen.

Man fremstiller en løsning som inneholder 0,1% gelatin og 0,5% BSA i en fosfatbufret saltløsning. Man tilsetter 250 iil av denne løsning pr. jug, for å mette overflaten av brønnene med protein, hvilket oppnåes etter en time ved 37°C: man vasker platene 3 ganger ved hjelp av fosfatbufret salt-løsning. De således fremstilte plater blir lyofilisert og

satt i stokkløsning ved 4°C i en liten, lukket plastpose.

b) Fremstilling av løsningen av konjugert monoklonalt antistoff peroksidase

Man anvender peroksidase (POD) forhandlet av Boehringer

Mannheim Biochemica (referanse 814 393).

Fremgangsmåten for binding mellom antistoff og peroksidase er beskrevet av M.B* WILSON og P.K. NAKANE i Immunofluorescence and Related Techniques (W. KNAPP,

K. KOLUBAR, G. WICK ed., 1978, Elsevier/Nord Holland, Amsterdam - s. 215-224), med unntak av at man for oksydering av peroksidase anvender 1,5 mg POD i 0,36 ml destillert vann og at man tilsetter 50 jixl av. en 0,2 M natriumperjodatløsning. Det således oppnådde produkt blir bundet til 2 mg IgG-anti-CD4 inneholdt i 500 /il karbonatbuffer. Etter behand-ling med natriumborhydrid og dialyse mot PBS blir konjugaget IgG-POD sterilisert ved filtrering på membran 0,22 /im og bevart under sterile betingelser ved en konsentrasjon på 0,5 mg IgG pr. ml ved 4°C i glassrør. Reagenset er stabilt i løpet av minst ett år.

På samme måte fremstiller man konjugat IgG-anti-CD8-POD.

Man kan på samme måte fremstille konjugater IgM-POD.

c) Fremstilling av åpenbaringsreagenset.

Åpenbaringsreagenset oppnåes på følgende måte: Man

fremstiller en 0,1 M citratbuffer ved å løse sitronsyre monohydrat på 2,1% i vann og justerere til pH 5 ved tilsetning av 7N natrium-hydroksyd. Man tilsetter så 30 mg ortofenylendiamin diklorhydrat til 20 ml av den oppnådde sitratbuf f er, så tilsetter man i siste øyeblikk 40 jul

oksygenert vann (substrat for enzymer) til 30% pr. 20 ml citratbuffer som inneholder ortofenylendiamin.

B) Immunometrisk fremgangsmåte

a) Separering av cellene

Man tar ut 2 ml av blodprøven som skal doseres. Man

blander den med 2 ml av den fosfatbufrete saltløsningen og man avsetter denne blanding på 3 ml FICOLL-PAQUE (forhandlet av Pharmacia). Ved sentrifugering ved 400 x g i 30 minutter ved romtemperatur dannes det en ring av suspensjon som inneholder de mononukleære celler. Man samler opp hele denne suspensjon i et volum på 1 ml og man fordeler 6 x 100 /il av den således oppnådde suspensjon i 6 mikrobrønner i den på

forhånd fremstilte plate,

t») Inkubering av cellene.

Man fortynner til en hundredel det konjugerte POD-antistoff oppnådd foran ved hjelp av PBS som inneholder en 1% proteinholdig stoff slik som BSA eller skummet tørrmelk og man tilsetter 100 /il av denne løsning pr. mikrobrønn, d.v.s.: 2 mikrobrønner fylles hver med 100 /il av løsningen av konjugat POD-anti-CD4. 2 mikrobrønner fylles hver med 100 ul av løsningen av konjugat P0D-anti-CD8. 2 kontroll mikrobrønner fylles hver med 100 jxl av løsningen med 1% proteinholdig stoff (blind for reaksjon)

For å forbedre fikseringen av celler på bæreren sentrifugerer man platen i 3 minutter ved 150 x g etter henstand i

en time ved romtemperatur.

c) Åpenbaring av det fikserte og målte enzym.

Man tømmer mikrobrønnene ved omdreining av platene. Man

skyller mikrobrønnene 4 ganger med 200 / il PBS. Man tilsetter i hver brønn 200 ul av åpenbaringsreagenset fremstilt til formålet like før. Man inkuberer i 20 min. ved romtemperatur i dempet belysning. Man måler den optiske tetthet i spektrofotometer ved 492 nm (Titertek Multiskan type 310 C - Flow

Laboratorier).

d) Standardisering og ekspresjon av resultater.

For å utføre standardiseringen av disse forsøk ble et

preparat av totale humanlymfocytter på forhånd kalibrert i anti-gener CD4 og CD8 ved den cytofluorometriske teknikk til PONCELET og al. (J. Immunol. Methods 1985, 85, 65-74 anvendt. De på forhånd uttatte, kjente alikvote mengder fra dette referansepreparat tjente til å utgjøre de to standardise-ringsskjemaene i forhold til henholdsvis antigen-CD4 og antigen-CD8, i forhold til hvilke antall antigener som svarte til hver prøve ble beregnet.

På en indikativ måte viser tabell 1 som følger heretter, 20 humane blodprøver som kommer fra friske givere, de oppnådde verdier for optisk tetthet, antall molekyler av de tilsvarende antigener CD4 og CD8 og forholdet mellom de antigentall som utledes fra disse (forhold CD4/CD8).

EKSEMPEL 2

Immunoenzymometrisk dosering av den molekylære konsentrasjon av antigenet CD4 og CD8 ut fra humane blodprøver som omfatter merking av antistoffer med alkalisk fosfatase.

Denne dosering utføres som den i eksempel 1. Fremstilling av konjugatet monoklonalt antistoff-alkalisk fosfatase utføres i henhold til fremgangsmåten angitt av Boehringer Mannheim - Biochemica (Ref. 567 744). Etter en times inkubering av cellene som skal doseres, med dette konjugat, åpenbarer man det fikserte enzym ved tilsetning av en løsning av 1 mg/ml paranitrofenylfosfat i en 1,2% dietanolaminbuffer i destillert vann justert til pH 9,8 med en fortynnet saltsyreløsning. Etter 2 timer ved 37°C måler man den optiske tetthet i spektrofotometer ved 405 nm.

Resultatene er beregnet og uttrykt som i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Immunoradiometrisk dosering av den molekylære konsentrasjon av antigen CD4 og CD8 ut fra humane blodprøver som omfatter merking av antistoffer med jod 125.

Fremstilling av merkete antistoffer med jod 125 utføres i henhold til teknikken beskrevet av F.C. Greenwood, V.M. Hunter og Coll., Biochem. J., 1963, 89, 114.

Man blander 50 /ig monoklonalt antistoff anti-CD4 eller anti-CD8 inneholdt i 50 /ul fosfatbufret saltløsning ved pH 7,2 med

37 MBq jod 125 i form av natriumjodid i 30 /ul av en løsning av kloramin T i en fosfatbufret saltløsning som inneholder 0,33 mg kloramin T pr. ml. Etter ett minutt under røring stopper man merkingsreaksjonen av det monoklonale antistoff ved å tilsette 100 /il av en løsning av natriummetabisulfitt dosert til 2,5 mg/ml. Den således fremstilte løsning blir plassert på en PD kolonne 10 (Pharmacia - Sephadex G25M), og man utvinner i effluensen frak-sjonen som inneholder det radiomerkete antistoff. Doseringen utføres ved til 4 mikrobrønner å tilsette et volum på 100 /il av den cellulære suspensjon som inneholder de mononukleære celler av humant blod fremstilt som i eksempel 1. Så tilfører man 100 /il av den fortynnete løsning av radioaktivt antistoff i en PVS buffer som inneholder 5% BSA, ved å tilsette 150 000 cpm pr. brønn; 2 mikrobrønner fylles hver med 100 /il av løsningen av konjugat anti-CD4-125-I, 2 mikrobrønner fylles hver med 100 fxl av løsningen av konjugat anti-CD8 125 I. Fikseringen av cellene forbedres ved sentrifugering av platen i 3 minutter ved 150 x g etter 1 times inkubering ved romtemperatur. Mikrobrønnene tømmes ved omdreining av platen. Man skyller mikrobrønnene 4 ganger med 200 /il PVS pr. brønn. Man tilsetter så 75 /il av 1 M natriumhydroksydløsning i hver brønn. Etter 10 minutter blir innholdet i hver brønn satt opp med en absorberende tampong med telling av radioaktiviteten i en gamma-teller (multibrønnteller LKB).

Resultatene beregnes og uttrykkes som i eksempel l, idet verdiene av de optiske tettheter erstattes med resultatene fra telling i dpm.

EKSEMPEL 4

Verifisering av metodens gyldighet.

På 20 på forhånd uttatte humane blodprøver måler man anti-gener CD4 og CD8 i humane T-celler ved å følge den immunometriske fremgangsmåte med peroksidase som beskrevet i eksempel 1. På de samme blodprøver bestemte man dessuten ved å anvende den konvensjonelle teknikk (W.W. ERBER et Coll. Lancet, 1984, (8385), 1042-1045) for cytologisk telling forholdet mellom antall T4 positive celler og antall T8 positive celler.

Korrelasjonskoeffisienten mellom forholdet CD4/CD8 oppnådd ved immunoenzymometrisk dosering og forholdet T4/T8 oppnådd ved cytologisk telling er r=0,72.

På samme måte sammenlignet man på 7 andre på forhånd uttatte humane blodprøver forholdet CD4/CD8 bestemt ved den immunoradio-metriske fremgangsmåte ved å anvende merking med jod 125 ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse og forholdet mellom celler T4/T8 bestemt ved telling av celler. Korrelasjonskoeffisienten er r=0,87.

I de 2 tilfeller viser de oppnådde korrelasjonskoeffisienter at på tross av et tilfredsstillende helhetssamsvar mellom resultatene i de 2 teknikker er informasjonen fremlagt ved de 2 rapporter ikke ekvivalent, hvilket er klart siden doseringen av antigener i henhold til oppfinnelsen tar med i beregningen ikke bare antall positive celler som det er tilfelle for den cyto-logiske metode, men også tettheten av det betraktede antigen på de positive celler i hver prøve. Informasjonen gitt ved den beskrevne teknikk ifølge foreliggende oppfinnelse er altså mer komplett enn den som er gitt ved den konvensjonelle referanseteknikk (W.W.ERBER et coil. Lancet, 1984, (8385), 1042-1045).

EKSEMPEL 5

Immunoenzymometrisk dosering av den molekylære konsentrasjon av antigenet CD4 og CD8 til T-lymfocytter ut fra humane blodprøver som omfatter merking av antistoffer med peroksidase.

Dette eksempel har til hensikt å vise at man kan nedsette den nødvendige varighet for dosering, i forhold til betingelsene beskrevet i eksempel 1, ved på den ene side å forandre fremgangsmåten for separasjon av celler og på den annen side den inkubasjonstid som er nødvendig for det immunologiske innfangingstrinn og for merking av cellene. A) Separasjonsprosedyrens innflytelse på cellene i totalt blod.

a) Teknikk med kort sentrifugering:

Man tar på forhånd ut 0,5 ml av blodprøven som skal

doseres, som man blander med 1,5 ml fosfatbufret saltløsning. I et hemolyserør på 5 ml tilsetter man 1,5 ml Ficoll-Pague, forhandlet av Pharmacia, og på overflaten av Ficoll-laget avsetter man blodprøven fortynnet i PBS. Etter 5 minutters sentrifugering ved 900 x g ved romtemperatur tar man ut ringen av suspensjon som inneholder de mononukleære celler i

et volum på 0,5 ml. Denne prøve tilsettes 1,5 ml PBS.

b) Teknikk ved lyses av erytrocytter:

En annen hurtig fremgangsmåte for separering av blodceller er anvendelse av en buffer som lyserer de røde blodlegemer. Lysebufferen, anvendt som eksempel, med følgende sammensetning:

ammoniumklorid: 8,29 g

kaliumbikarbonat: 1 g

dinatriumsalt av etylendiamintetraeddiksyre: 0,0307 g for 1 liter destillert vann, idet pH justeres til 7,3.

Man blander 5 ml lysebuffer og 0,250 ml blod. Etter 10 minutter under røring sentrifugerer man ved 600 x g i 10 minutter. Bunnfallet av de dannete celler blir tatt opp i 1 ml PBS buffer.

Ved videre å utføre doseringen av antigener CD4 og CD8, under betingelsene i eksempel 1, og ved sammenligning med referanse-protokollen beskrevet i eksempel 1 for isolering av mononukleære celler fra blod har man verifisert at begge disse to varianter av fremgangsmåten for separering av mononukleære celler fra totalt blod godt har muliggjort oppsamling av hele mengden av lymfocytter i de undersøkte blodprøver. B) Innflytelse av inkubasjonstid for den immunologiske innfanging og merking av cellene.

For å verifisere om tidsperioden på 1 time anvendt i eksempel 1 ikke kan reduseres for å akselerere doseringens forløp har man sammenlignet de oppnådde resultater for identiske prøver som hver inneholder 20 000 mononukleære celler pr. brønn, når man varierer denne tidsfrist på fra 10 minutter til 1 time i overensstemmelse med trinnet for innfanging og merking av cellene. Idet operasjons-betingelsene bortsett fra dette er som i eksempel 1 er de oppnådde resultater vist i tabell 2.

* Disse verdier for optisk tetthet tilsvarer blindprøven på reagenser oppnådd i fravær av celler. Prøveverdiene oppnådd i nærvær av celler og ved å utelate enten konjugatet eller substratet er ikke større enn de angitte verdier.

Disse resultater viser at:

det ikke spesifikke signal (blindprøve på reagenser) forblir ved alltid svake verdier, så meget lavere som tiden for

tilstedeværelse av konjugat er kortere.

det spesifikke signal har etter 10 minutters kontakt en verdi som kan utnyttes analytisk med presisjon og reproduserbarhet. Dette indikerer at det er mulig, i forhold betingelsene i eksempel 1, på en signifikant måte å redusere varigheten for utføring av dosering uten viktig tap i presisjon av resultatene.

I praksis og hvis man adderer de gevinster i tid som man kan oppnå på fremstillingsnivå for blodprøven og på nivå for immunologisk innfanging, er det mulig med utstyrspakken og fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å dosere antigenet CD4 og CD8 i prøvene fra totalt blod på bakgrunn av 10 eller 20 prøver pr. plate med 96 brønner, i en total tidsperiode (etter mottagelsen av prøvene i laboratoriet) som ikke passerer 1 time. Dette produktivitetsnivå er større enn nivået ved alle de alternative teknikker kjent til denne dag.

EKSEMPEL 6

Immunometrisk dosering av den molekylære konsentrasjon av antigen CD5 fra humane T-lymfocytter ut i fra humane blodprøver som omfatter merking av antistoffer med acetylcholinesterase.

A) Fremstilling av utstyrspakken for dosering.

a) Fast bærer.

Man anvender en mikrotitreringsplate fremstilt som

beskrevet i eksempel 1.

b) Konjugat monoklonalt antistoff-acetylcholinesterase.

Man anvender acetylcholinesterasen fra Electrophorus

electricus oppnådd i henhold til teknikken beskrevet i fransk patent nr. 2 550 799.

Dette enzym blir bundet til antistoff anti-CD5 kalt ST 1 og forhandlet av BIOSYS. Bindingen utføres i henhold til fremgangsmåten beskrevet av YOSHITAKE et al. Eur. J. Biochem. 101 (1979), 395-399.

c) Åpenbarings-reagens.

Dette reagens omfatter samtidig substratet av enzymet

(acetyltiocholin) og Ellman-reagenset og med følgende sammensetning:

Acetyltiocholin 7,5 x 10"*M

5,5'-ditio-2-nitrobenzosyre (DTNB) 5 x 10~<*>M

en natriumfosfatbuffer pH 7,4

Denne løsning blir fortynnet til 1/lOOe i destillert vann før anvendelse.

B) Immunometrisk fremgangsmåte.

a) De mononukleære celler separeres ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1. b) Inkubering av cellene for trinnet med immunologisk innfanging og merking varer 20 minutter som i eksempel 5.

c) Åpenbaring av det fikserte og målte enzym.

Man tilsetter 100 /il åpenbaringsreagens i hver mikrobrønn.

Absorbensen måles ved 412 nm etter 45 minutters inkubering.

De målte optiske tettheter for prøvene som inneholder kjente tall av T-celler er oppgitt i tabell 3. Under disse eksperimen-telle betingelser er blindprøven for reagenser spesielt svak og tilsvarer en optisk tetthet på 0,002 til 0,003.

Disse resultater bringer for dagen den ekstreme følsomhet av den således utførte teknikk. Faktisk tilsvarer den optiske tetthet på 0,030 oppnådd i brønnen som inneholder 540 T-lymfocytter (d.v.s. 32 millioner molekyler av antigen CD5) som er målbar med presisjon og lik 10 ganger bakgrunnsstøyen, omtrent 5.10"<17> mol antigen CD5 pr. doseringsbrønn. En slik følsomhet er av størrelsesorden som de beste kjente immunodoseringer, som anvender de mest følsomme radioaktive markører.

EKSEMPEL 7

Dosering av forskjellige antigener uttrykt på humane aktiviserte T-lymfocytter.

Aktivering av T-lymfocytter er en fysiologisk prosess som inntrer tidlig hver gang immunsystemet blir påvirket, som for eksempel ved infektiøse patologiske tilstander, ved organtrans-plantasjoner, i visse dysimmunitære sykdommer.

Denne naturlige prosess blir også lett igangsatt in vitro i laboratoriet i slike forsøk som særlig de blandete lymfocytære reaksjoner eller forsøk med lymfoplasttransformasjon. I dette siste tilfelle oppnåes polyklonal aktivering ved anvendelse av stoffmidler slik som fytohemagglutinin (PHA), konkanavalin A eller andre lektiner. Aktivering av T-lymfocytter følges av en sterk økning av ekspresjon av flere membran-markører og særlig antigen CD25 (reseptor for interleukin 2) eller antigen CD2. Disse antigener inneholder utmerkete markører i aktiveringstilstanden, og deres dosering har samtidig stor interesse i klinisk biologi og for laboratoriearbeid som angitt ovenfor, ved at i alle tilfellene anvendelse av radioaktive reagenser unngåes.

Disse antigener måles ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 med spesifikasjonene presisert i tabell 4.

Verdiene på de optiske tettheter målt ved 450 nm for 25.10<3 >anvendte mononukleære celler er gjengitt i tabell 5 nedenfor og sammenligner de samme celler uten stimulering av PHA og etter 3 dagers stimulering.

Disse resultater viser den betraktelige stigning av de spesifikke signaler for de 2 undersøkte antigener, når aktiver-ingen skjer.

EKSEMPEL 8

Dosering aV antigenene CD22 og HLA-Dr (eller HLA fra klasse II) til stede på B-lymfocytter.

Det foreliggende eksempel beskriver doseringen av antigener på celler fra linje RAJI som er en B-human lymfoidlinje beskrevet av PULVERTAFT i J. Clin. Pathol., 1965, 18, 261-274.

For immunologisk innfanging av celler har man i doserings-brønnene absorbert, som angitt i eksempel 1, enten antistoff S klasse II (BIOSYS) for dosering av antigener CD22, eller antistoff SB4 (BIOSYS) for dosering av antigener HLA i klasse II (eller HLA-Dr).

a) Dosering av antigen CD22:

Antistoff SB22 (BIOSYS) ble merket med jod 125 i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3. Doseringen av antigenet CD22 utføres som angitt i eksempel 3 for antigener CD4 og CD8, ved suksessivt å tilsette til mikrobrønnene: 5.10'' celler fra linjen RAJI, så IO<5> cpm av det merkete antistoff SB 22. Etter en tidsperiode på en time ved 4°C blir mikrobrønnene tømt ved omdreining av platen, så skyllet 4 ganger med 200 fil PBS pr. brønn til hver skylling. Radioaktiviteten som er fiksert på cellene, blir oppsamlet og talt som i eksempel 3. Man får således en telling på 760 dpm for brønnen som inneholder 5 x 10<*> celler RAJI med en blindprøve

for reagenser (uten celler) på 50 dpm.

b) Dosering av antigen HLA-Dr:

Man tilsetter suksessivt i brønnene IO<5> celler og det

konjugerte antistoff S-klasse II merket med peroksidase i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1. Doseringen utføres i henhold til samme fremgangsmåte som i eksempel 1. Man får således en optisk tetthet på 1,840 og en blindprøve på reagenser uten celler på 0,105.

EKSEMPEL 9

Anvendelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for måling av antigener båret av T-lymfocytter og B-lymfocytter fra humant blod.

A) Fremstilling av plater:

Man anvender mikrotitreringsplater fremstilt i eksempel 1, med det unntak at i hver brønn på mikroplaten absorberer man samtidig monoklonale antistoffer i stand til å fiksere i det minste den totale mengde av T-lymfocytter (S klasse I fra BIOSYS) og B-lymfocytter (S klasse II fra BIOSYS), idet hver blir anvendt i en konsentrasjon på 5 /xg/ml.

B) Immunometrisk dosering:

De mononukleære celler blir separert fra totalblod ved hjelp av Ficoll under betingelser som i eksempel 1 eller eksempel 5, så tilsetter man 80 000 mononukleære celler pr. brønn i 75 /il PBS buffer. T-lymfocyttene måles i disse brønner med antistoff ST 11 (anti-CD 2) fra BIOSYS; B-lymfocyttene måles i andre brønner med antistoff SB 3 (anti-CD 37) fra BIOSYS som gjenkjenner alle de perifere B-lymfocytter. Disse antistoffer blir på forhånd bundet til peroksidase i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1. Doseringen i egentlig forstand utføres som i eksempel 1.

C) Resultater.

Det absolutte antall av T-lymfocytter og B-lymfocytter inneholdt i den undersøkte prøven bestemmes ved at man refererer til standardiseringskurver oppnådd ved på identisk måte å behandle de mononukleære celler i hvilke T- og B-lymfocyttene ble talt ved en referanseteknikk.

Alternativt, ved hjelp av passende standarder, kan man også uttrykke resultatene i molare konsentrasjoner av antigener CD2 og CD37 i den undersøkte prøven.

EKSEMPEL 10

Dosering av antigenene GpIIb-IIIa og CD 9 i humane blodplater.

Denne dosering utføres i henhold til eksempel 3 ved å anvende de monoklonale antistoffer radioaktivt merket med jod 125.

Blodplatene isoleres fra humant blod ved sentrifugering i nærvær av perfusjonsvæske PLASMION (laboratorium R. Bellon). Man blander i et rør 5 ml blod pluss 5 ml fosfatbufret saltløsning (PBS) og 10 ml PLASMION. Røret blir så sentrifugert i 10 minutter ved 1500 omdreininger/minutt. Blodplatene samlet i supernatanten blir tatt opp ved aspirering med pipette. De skylles en gang i PBS ved å blande et volum av blodplatesuspensjonen med 10 ml PBS, og sentrifugeres så i 10 minutter ved 1000 x g. Til slutt tar man opp bunnfallet med blodplatene som resuspenderes i PBS (2 ml). Blodplatene telles og konsentrasjonen justeres til 2,5 millioner/ml PBS.

For å dosere antigen GpIIb-IIIa utfører man immunologisk innfanging av blodplater ved hjelp av monoklonalt antistoff I0B2 (Immunotech) og merking av antigen GpIIb-IIIa og ved monoklonalt antistoff P2 (Immunotech).

For å dosere antigen CD9 utfører man immunologisk innfanging ved hjelp av monoklonalt antistoff P2 og merking ved hjelp av monoklonalt antistoff IOB2. Man måler antall dpm for en prøve som omfatter 200 000 blodplater.

Resultatene er vist i tabell 6.

EKSEMPEL 11

Dosering av antigenet CD15 båret av humane granulocytter.

Antigen CD15 er en god spesifikk markør av humane granulocytter (også kalt polynukleære). Evaluering av disse celler ved hjelp av dette antigen kan praktiseres i blod, som for enhver annen leukocytær underpopulasjon. Den er på samme måte anvendbar for å påvise tilstedeværelse av granulocytter i urin, for eksempel i tilfeller med urinveisinfeksjoner slik som cystitter eller pyelonefritter. I det foreliggende eksempel ble bestemmelsen utført på granulocytter som stammet fra totalblod og separert som angitt senere.

Granulocyttene, samtidig som visse mononukleære celler, blir separert fra røde blodlegemer i henhold til en fremgangsmåte analog til den beskrevet i eksempel 10 for blodplatene, med unntak av at man lar røret som inneholder cellene stå i 45 minutter ved romtemperatur og at man får tilbake suspensjonen av leukocytter på 500 /il tatt opp i væskeoverflaten.

Granulocyttene blir immobilisert i brønner med ett monoklonalt antistoff spesifikt for antigen CD45 til stede på den cellulære membran i alle leukocyttene: man anvender antistoff anti-LCA (BIOSYS) absorbert i mikrobrønnene på titreringsplaten, som angitt i eksempel 1.

For dosering anvender man det monoklonale antistoff anti-CD 15 SMY-15a (BIOSYS) merket med peroksidase i henhold til teknikken i eksempel 1.

Således, med 12 500 totale celler tilsatt pr. brønn er det spesifikke signal for antigen CD15 fra granulocytter 0,616 etter korreksjon for den optiske bruttotetthet for en blindprøve for reagenser på 0,100 oppnådd ved tilstedeværelse av celler og ved fravær av enzymatisk konjugat, og forårsaket av endogene péroksidaser fra granulocytter.

EKSEMPEL 12

Evaluering av fenotypen fra en leukemi ved hjelp av den immunoenzymometriske fremgangsmåte.

Fenotypebestemmelse av tumorceller i en leukemisk pasient er en systematisk diagnostisk undersøkelse utført for å karakterisere typen og opprinnelsen av leukemiceller i pasienten (T, B, granulocytter, myeloblaster, etc). Denne undersøkelse utføres på klassisk måte ved hjelp av immunofluorescens-teknikken ved å anvende en samling av monoklonale antistoffer og ved å observere og telle positive celler i mikroskop. Man anvender på samme måte

.strømcytometri for å analysere merkingen av celler.

Anvendelse av monoklonale antistoffer ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen muliggjør identifisering av store, klinisk viktige grupper av akutte eller kroniske leukemier ved å frembringe en kvantitativ informasjon av de relative tettheter av de forskjellige undersøkte antigener.

I dette eksempel fremstilte man 6 monoklonale antistoffer, bundet til peroksidase, spesifikke for antigener til stede på leukemicellene:

ST 1 og ST 11 (BIOSYS): anti-CD 5 og anti-CD 2

SB 3 (BIOSYS): anti-CD 37

S-CALLA (SANOFI): anti-CALLA (eller anti-CD 10)

S-klasse II (BIOSYS): anti-HLA-Dr (eller anti-HLA fra

klasse II)

SMY 15 (BIOSYS): anti-CD 15

Mikrotitreringsplaten fremstilles ved absorbsjon på forhånd av en blanding av monoklonale antistoffer anti-CD 45 (S-LKA, BIOSYS) og anti-HLA fra klasse I (S-klasse I, BIOSYS).

Ved å anvende de 6 monoklonale antistoffer selektert ovenfor, evaluerte man fenotypen av en kronisk B-lymfoid leukemi (LLC-B) som dessuten er blitt karakterisert ved konvensjonell fremgangsmåte.

For 80 000 totale mononukleære celler tilsatt pr. brønn eller for kontrollbrønnene uten celler er de optiske tettheter målt ved 492 nm gjengitt i tabell 7 nedenfor. For kontrollbrønnen, som omfatter celler, men ingen antistoffer merket med peroksidase er den optiske tetthet 0,110.

Således bærer de studerte leukemiske celler rikelig av antigener CD5, CD37 og HLA fra klasse II, men de bærer ikke eller svært lite av antigener CD 15, CALLA og CD 2 som er karakteristisk for en LLC-B.

EKSEMPEL 13

Dosering av antigener forbundet med cancer i urinveissystemet.

Utstyrspakkene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er alt spesielt tilpasset til påvisning av tumorceller, særlig i typer av tumorer i urinveissystemet og anvendes gjerne til masseoppsporing i populasjoner med forhøyet risiko, for eksempel arbeidere i kjemisk industri eller andre meget utsatte grupper.

Det foreliggende eksempel viser anvendelse av oppfinnelsen til bestemmelse av et antigen forbundet med cancer i urinblæren på celler fra linje RT4 som stammer et humant urinært papillom (CC. Rigby et L.M. Franks, Brit. J. Cancer, 1970, 24, 746-754).

Platene bestemt til immunologisk innfanging av celler blir fremstilt som i eksempel 1, idet man i hver brønn absorberer det monoklonale antistoff S-klasse I (BIOSYS) som gjenkjenner et HLA antigen i klasse I og er i stand til å holde tilbake alle epitel-cellene.

Konjugatene fra merkingen oppnåes ved hjelp av fremgangsmåtene i eksempel 1 (for den enzymatiske merking) eller fra eksempel 3 (for den radioisotopiske merking) med det monoklonale antistoff 12F6 (Sanofi) som gjenkjenner et antigen forbundet med cancer i urinblæren.

For dosering fordeler man i 4 mikrobrønner 75 /il av den cellulære suspensjon (d.v.s. 50.10<3> celler pr. brønn).

I 2 brønner tilsetter man det konjugerte monoklonale antistoff

12 F 6 (SANOFI) bundet til peroksidase, i 2 andre brønner, antistoff 12 F 6 merket med jod 125 (100 000 cpm/brønn). Resultatene oppnådd ved å anvende den immunoenzymometriske eller deri radioimmunometriske fremgangsmåte er gjengitt i tabell 8.

EKSEMPEL 14

Immunoenzymometrisk dosering av et membranantigen fra soppen Candida albicans.

Cellene fra Candida albicans (serotype 17) kommer fra samlingen fra Pasteur-instituttet i Paris. Soppene blir dyrket i 18 timer på vanlig måte i et fast syntetisk miljø. Cellene blir talt og man fremstiller en celle-suspensjon som inneholder IO<5 >celler pr. ml bufferløsning PBS.

De anvendte monoklonale antistoffer anti-Candida albicans ble fremstilt ved lymfocytær hybridisering som beskrevet i avhandlingen til T. Chardes, Faculté de Pharmacie, Université de Montpellier I, 1988.

Antistoff CA4 anvendes til immunologisk innfanging, mens antistoff CA12 merket med peroksidase anvendes til dosering under betingelsene i eksempel 1.

Verdiene for de målte optiske tettheter ved 492 nm for brønnen som inneholder de tilsatte.celler og for kontrollprøven uten celler, er henholdsvis 1,025 og 0,080.

EKSEMPEL 15

Immunoenzymometrisk dosering utført på magnetiske kuler: dosering av antigen CD5 fra humane T-lymfocytter med et konjugert antistoff merket med acetylcholinesterase og en spesiell bærer dannet av magnetiske kuler.

Bæreren som ble anvendt for å fange inn cellene, består av magnetiske kuler DYNABEADS. De refererte kuler DYN-11101, forhandlet av BIOSYS, bærer et antistoff anti-CD 2 på overflaten som er i stand til å fiksere alle T-lymfocytter i den undersøkte prøven. Disse kuler blir så behandlet med en løsning av antistoff anti-CD2 før anvendelse for å forbedre doseringsutføringen. Til dette blir 10 ul av kulesuspensjonen blandet med 1 ml av en løsning av antistoff på 25 jug/ml PBS buffer i 1 time under forsiktig røring. Kulene blir så vasket 4 ganger med PBS buffer, så bevart i 4 ml PBS buffer.

For dosering tilsetter man suksessivt i et rør på 5 ml:

200 pl av kulesuspensjonen, 80 /il av suspensjonen av mononukleære celler separert fra totalblod ved hjelp av Ficoll-Paque (PHARMACIA) , så tilsetter man 280 ( j. 1 av konjugat antistoff STI merket med acetylcholinesterase, identisk med det som ble anvendt i eksempel 6.

Etter én time under forsiktig røring blir kulene separert ved hjelp av en magnet, og cellene som er fiksert på kulene, blir skyllet med PBS buffer (5 skyllinger).

Acetylcholinesterasen fiksert på cellene blir åpenbart på samme måte som i eksempel 6. Det oppnådde signal for optisk tetthet er 0,168 i nærvær av merkete celler; den oppnådde blind-prøve uten celler er på 0,062.

Claims (31)

1. Fremgangsmåte for immunometrisk bestemmelse av overflateantigener fra en cellulær populasjon eller underpopulasjon valgt blant tumorceller og blodceller, karakterisert ved at den består av: a) immobilisering av cellepopulasjonen som bærer antigenet som skal bestemmes eller en cellepopulasjon som omfatter under-populas j onen som bærer antigenet som skal bestemmes, på en fast bærer, ved å anvende ett eller flere monoklonale anti-stoffer på forhånd fiksert ved kovalent binding eller ved fysisk absorbsjon på nevnte bærer og i stand til å gjenkjenne et antigen til stede på overflaten av celler forskjellige fra antigenet som skal bestemmes, og, i samme trinn, direkte merking av den cellulære populasjon eller underpopulasjon som skal bestemmes, ved hjelp av minst ett monoklonalt antistoff spesifikt for antigenet som skal bestemmes, idet nevnte antistoff bærer en radioisotopisk eller enzymatisk markør; b) observering av en inkubasjonsperiode; c) skylling av bæreren for å eliminere ikke immobiliserte celler og overskudd av antistoff; d) i tilfellet hvor antistoffet bærer en enzymatisk markør, tilsetning av det eller de nødvendige reagenser (substrat og kromogen) for å åpenbare enzymets aktivitet, e) avlesning av resultatene, enten ved telling av radioaktivitet eller ved måling av lyssignaler (farging eller fluorescens) idet man eventuelt refererer seg til et standardskjema.

2. Fremgangsmåte for bestemmelse i henhold til krav 1, karakterisert ved at den faste bærer består av en mikrotitreringsplate i hvis brønner det eller de antistoff(er) er fiksert som er bestemt til å immobilisere cellene hvoriblant det befinner seg celler fra populasjonen eller underpopulasjonen som bærer antigenet som skal bestemmes.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at den faste bærer er en partikkelformig magnetisk bærer.

4. Fremgangsmåte i henhold til et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer som er bestemt til merking, bærer en enzymatisk markør.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at den enzymatiske markør er peroksidase og ved at enzymets aktivitet åpenbares ved hjelp av oksygenert vann og et kromogen valgt blant ortofenylendiamin, 2,2'-azino-bis (3-etyl-benzotiazolin-6-sulfonsyre) 3,3'-diamino-benzidin, 3-amino-9-etyl-karbazol eller et av deres vannløselige salter.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at den enzymatiske markør er alkalisk fosfatase og ved at enzymets aktivitet åpenbares ved hjelp av paranitrofenylfosfat, 4-metyl-umbelliferylfosfat eller ved 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at den enzymatiske markør er beta-galaktosidase og ved at enzymets aktivitet åpenbares ved hjelp av ortonitrofenyl-beta-D-galaktopyranosid eller 4-metyl-umbel1i fery1-beta-D-galaktopyranos id.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at den enzymatiske markør er acetylcholinesterase og ved at enzymets aktivitet åpenbares ved hjelp av acetyltiocholin og som kromogen 5,5'-ditio-2-nitro-benzosyre eller deres vannløselige salter.

9. Fremgangsmåte i henhold til et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer som er bestemt til merking, bærer en radioisotopisk markør med jod 125 eller jod 131.

10. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den totale varighet for utførelse av bestemmelsen er mindre enn eller lik 1 time.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det eller de monoklonale antistoffer som er fiksert på den faste bærer er HLA-antistoffer fra klasse I.

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 11, karakterisert ved at det monoklonale antistoff som er fiksert på den faste bærer er antistoffet kalt S-klasse I.

13. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at den er for bestemmelse av ett eller flere overflateantigener fra blodceller fra humant blod.

14. Fremgangsmåte i henhold til krav 13, karakterisert ved at blodceller fra humant blod er leukocytter, lymfocytter, T-lymfocytter, som bærer markør CD4, kalt T4-lymfocytter, T-lymfocytter som bærer markør CD8, kalt T8-lymfocytter, B-lymfocytter, granulocytter, blodplater.

15. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at den er for bestemmelse av et hvilket som helst eller flere av membran-antigenene fra tumorceller.

16. Fremgangsmåte i henhold til krav 15, karakterisert ved at tumorcellene er cancer-celler fra urinveisystemet eller celler fra maligne hemopatier.

17. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 til 3, karakterisert ved at den består i å immobilisere en cellepopulasjon på en mikrotitreringsplate ved hjelp av ett eller flere monoklonale antistoffer som er spesifikke for overflate-antigener fra denne populasjon, og i samme trinn direkte merking av de cellulære underpopulasjoner som utgjør den fikserte populasjon, ved hjelp av flere løsninger som hver inneholder et monoklonalt antistoff som hvert er spesifikt for et overflate- antigén fra en av de cellulære underpopulasjoner som skal bestemmes.

18. Fremgangsmåte i henhold til krav 17, karakterisert ved at den er for bestemmelse av antigener som er spesifikke for de lymfocytære underpopulasjoner T, T4, T8 og B.

19. Fremgangsmåte i henhold til krav 17, karakterisert ved at den er for karakterisering og bestemmelse av forskjellige antigener som utgjør det antigene utstyr på overflaten av tumorceller fra maligne hemopatier.

20. Utstyrspakke for anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 19, karakterisert ved at den omfatter følgende komponenter: a) en fast bærer på hvilken det ved kovalent binding eller ved fysisk adsorbsjon er fiksert ett eller flere monoklonale anti-stoffer rettet mot overflateantigener fra den cellepopulasjon som skal bestemmes forskjellig fra det karakteristiske antigen som skal bestemmesj b) én eller flere løsninger som hver inneholder et monoklonalt antistoff som er spesifikt for nevnte antigen som er karakteristisk for den cellulære populasjon eller underpopulasjon som skal bestemmes, merket med en radioaktiv markør eller en enzymatisk markør; c) i tilfellet med antistoff merket med en enzymatisk markør, én eller flere løsninger som inneholder de reagenser som er nødvendige for å åpenbare enzymets aktivitet; d) eventuelt en tilleggskomponent som består av en bufferløsning for vasking og/eller prøver som muliggjør standardisering og kvalitetskontroll av bestemmelsen.

21. Utstyrspakke i henhold til krav 20, karakterisert ved at komponent (a) er en fast bærer som består av en mikrotitreringsplate i hvis brønner det eller de antistoff(er) er fiksert som er bestemt til å immobilisere cellene hvoriblant det befinner seg celler fra populasjonen eller underpopulasjonen som bærer antigenet som skal bestemmes.

22. Utstyrspakke i henhold til krav 20, karakterisert ved at komponent (a) er en partikkel-formet magnetisk bærer.

23. Utstyrspakke i henhold til et hvilket som helst av kravene 20 til 22, karakterisert ved at komponent (a) består av en fast bærer på hvilken det er fiksert ett eller flere monoklonale antistoffer HLA fra klasse I.

24. Utstyrspakke i henhold til krav 23, karakterisert ved at det fikserte monoklonale antistoff er antistoffet med betegnelsen S-klasse I.

25. Utstyrspakke i henhold til hvilket som helst av kravene 20 til 22, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer i komponent (b) er merket med en radioisotopmarkør med jod 125 eller jod 131.

26. Utstyrspakke i henhold til hvilket som helst av kravene 20 til 22, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer i komponent (b) er merket med en enzymatisk markør.

27. Utstyrspakke i henhold til krav 26, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer i komponent (b) er merket med peroksidase og ved at komponent (c) i det vesentlige består av oksygenhoidig vann og et kromogen valgt blant ortofenylendiamin, 2,2'-azino-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre, 3,3'-diamino-benzidin, 3-amino-9-etyl-karbazol eller ett av deres vannløselige salter.

28. Utstyrspakke i henhold til krav 26, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer i komponent (b) er merket med alkalisk fosfatase og ved at komponent (c) består av paranitrofenylfosfat, av 4-metyl-umbelliferylfosfat eller av 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat.

29. Utstyrspakke i henhold til krav 26, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer i komponent (b) er merket med beta-galaktosidase og ved at komponent (c) består av /3-ortonitrofenyl-D-galaktopyranosid eller 4-metyl-jØ-umbelliferyl-D-galaktopyranosid.

30. Utstyrspakke i henhold til krav 26, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer i komponent (b) er merket med acetylcholinesterase og ved at komponent (c) i det vesentlige omfatter acetyltiocholin og 5,5'-ditio-2-nitro-benzosyre eller et av deres vannløselige salter.

31. Utstyrspakke i henhold til et av kravene 20 til 22, karakterisert ved at komponent (a) er en mikrotitreringsplate i hvis brønner det er blitt fiksert ett eller flere monoklonale antistoffer som er spesifikke for overflateantigener fra en cellulær populasjon og komponent (b) består av flere løsninger som hver inneholder et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et overflateantigen fra en cellulær underpopulasjon som utgjør den fikserte cellepopulasjon.