CN105785030A - 一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒 - Google Patents

一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒。本发明采用已明确的单一组分过敏原(天然提纯或重组制备)包被发光微球，以生物素标记抗人IgE抗体，与链霉亲合素预包被感光微球组成检测试剂。首先，待检血清、过敏原包被的发光微球、生物标记抗人IgE抗体共同温育，待检血清中特异性IgE抗体分别结合发光微球表面的抗原分子和生物素标记抗人IgE抗体；其次，加入预先包被有链霉亲合素的感光微球并继续温育，通过生物素与链霉亲合素结合；最后，用光激化学发光分析仪检测光信号强度。本发明具有操作简单、快速，易于自动化及其定量分析等多种优势。

Description

一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其是涉及一种血清特异性IgE(过敏原)光激化学发光免疫分析试剂盒。
背景技术
目前，变态反应性疾病的诊断主要依靠病史、体内皮肤点刺试验和体外血清特异性IgE检测，其中，血清特异性IgE具有安全性能高，不受临床用药影响，同时检测多种过敏原等众多优点。因此，血清特异性IgE定量或半定量检测已成为变态反应疾病确认过敏原的常规实验室指标。
第一，血清特异性IgE检测的原创方法是“放射性过敏原吸附试验(RAST)”。此方法是将相应过敏原溶液(混合组分)包被在固相材料(硝酸纤维膜，NC膜)表面，与待检血清(含特异性IgE)温育后，再加上放射性核素标记抗人IgE(标记二抗)温育。如血清中含有与过敏原对应的特异性IgE抗体，固相材料表面即形成“已知抗原-待检IgE抗体-放射性核素标记抗人IgE”复合物；用磷酸盐缓冲盐水洗涤NC膜，去除未结合标记抗体。再用放射性检测仪检测NC膜表面是否具有放射活性即可判断血清中是否存在特异性IgE抗体。第二，如今国内临床实验室血清特异性IgE检测普遍采用“斑点-酶联免疫试验”。此方法以NC膜作为固相载体，以“线状”方式于NC膜不同物理位置包被一系列食入性过敏原或吸入性过敏原并作为已知抗原。将预先包被抗原(过敏原)的NC膜置于反应池内与稀释后的待检血清温育；血清中待检特异性IgE抗体分别与不同位置的相应抗原结合；洗涤NC膜后再加入酶标抗体(碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体)，并与结合在膜表面的特异性sIgE结合；洗涤去除游离的标记抗体，加入显色底物即可根据NC膜的显色条带，结合参照标尺(过敏原包被信息)确定待检样本含有何种特异性IgE抗体。同时，显色条带可以经照相或扫描，再根据灰度值给出待检标本半定量结果并进行分级。第三，基于ImmunoCAP的UniCAP检测系统，ImmunoCAP采用新型固相载体的荧光酶免疫技术。此系统所用的胶囊状固相载体为亲水性聚合物，由一种经CNBr活化的纤维素衍生物合成，有极高与过敏原结合的能力，便于过敏原蛋白的包被。此外，检测系统还包括全自动检测设备，所有的操作步骤(加样、加试剂、孵育、清洗和计算)全部自动化完成。同时，ImmunoCAP采用β-半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体作为标记抗体，过敏原-特异性IgE-酶标记抗人IgE形成免疫复合物，洗涤后加入荧光底物。β-半乳糖苷酶作用于荧光底物4-甲基伞桂-β-半乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-o-galactoside)产生荧光。荧光强度与特异性IgE含量呈线性关系。根据标准曲线可得出待测血清中特异性IgE的含量。
根据是否需要分离结合标记物和游离标记物，标记免疫分析分为均相免疫分析和非均相免疫分析。上述三种血清特异性IgE(过敏原)检测技术均属于非均相免疫分析，测定信号前均需洗涤去除未参加免疫反应的游离标记抗体。分离洗涤过程复杂，可能造成样本间交叉污染，也会产生洗涤误差，从而影响检测结果准确性。此外，无论是斑点-酶联免疫试验，还是immunoCAP试验均采用“酶”标记抗人IgE抗体(前者为碱性磷酸酶，后者为β-半乳糖苷酶)。酶催化底物显示高效性，提高分析方法的灵敏度；但是，酶是生物活性蛋白，多种因素会影响酶的活性，同样影响检测结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒。本发明是基于光激化学发光免疫分析技术和单一组分过敏原特异性IgE检测理念，制备出的一种用于血清特异性IgE抗体(过敏原)检测的全定量光激化学发光免疫分析体外诊断试剂以及该诊断试剂的制备和使用方法。血清特异性IgE主要用于鉴定过敏原，包括食入性过敏原和吸入性过敏原，为变态反应性疾病的诊断提供病因学证据。此种体外诊断试剂的显著特点是血清特异性IgE的准确定量(或全定量)，以及光激化学发光技术所赋予的“免除洗涤和分离”的特性，以及简单快速以及大批量检测性能。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒，包括如下试剂，已知过敏原包被的发光微球、以生物素标记抗人IgE抗体、链霉亲合素包被的感光微球。
优选的，所述已知过敏原包被的发光微球溶液，浓度为3～7微克/毫升；所述生物素标记抗人IgE抗体溶液，浓度为0.3～0.7微克/毫升；所述链霉亲合素包被的感光微球溶液，浓度为35～45微克/毫升；优选的，所述已知过敏原包被的发光微球溶液，浓度为5微克/毫升；所述生物素标记抗人IgE抗体溶液，浓度为0.5微克/毫升；所述链霉亲合素包被的感光微球溶液，浓度为40微克/毫升。。
优选的，(1)称待检测过敏原的蛋白干粉，用0.09～0.11MpH7.8～8.2磷酸盐溶液配制，得到浓度为2～4毫克/毫升的蛋白溶液；优选的，0.1MpH8.0磷酸盐溶液配制，得到浓度为2毫克/毫升的蛋白溶液；
(2)取48～52微升浓度为18～22毫克/毫升的发光微球，置于1.3～1.8毫升塑料离心管中，加入0.08～0.12MpH7.5～8.5磷酸盐溶液，离心洗涤1-3次，15000～17000rpm，弃上清液，待用；优选的，取50微升浓度为20毫克/毫升的发光微球，置于1.5毫升塑料离心管中，加入0.1MpH8.0磷酸盐溶液，离心洗涤1-2次，16000rpm，弃上清液，待用；
(3)向上述离心管内加入步骤(1)配置的0.05～0.15毫克蛋白溶液，并用0.08～0.12MpH7.5～8.5磷酸盐溶液定容至180～220微升，再依次加入1～1.5微升质量分数8％～12％吐温20溶液、8～12微升新鲜配制的350～450mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置35～40℃温箱内反应48小时以上；优选的，向上述离心管内加入步骤(1)配置的0.1毫克蛋白溶液，并用0.1MpH8.0磷酸盐溶液定容至200微升，再依次加入1.25微升10％吐温20溶液、10微升新鲜配制的400mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置37℃温箱内反应48小时以上；
(4)用750～850mM氢氧化钠溶液配制溶度为55～75毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加8～12微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置35～40℃温箱内继续反应0.5～1.5小时；优选的，用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加10微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置37℃温箱内继续反应1小时；
(5)将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，15000～17000rpm离心10～20分钟，弃上清液，再加入150～250微升80～120mM，pH7.5～8.5的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，用pH7.5～8.5，0.05～0.15MTris-HCl缓冲液稀释至8～12微克/毫升；优选的，将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，16000rpm离心15分钟，弃上清液，再加入200微升100mM，pH8.0的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，用pH8.0，0.1MTris-HCl缓冲液稀释至10微克/毫升。
本发明同时提供一种使用如上所述的血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒进行分析的方法，包括如下步骤，
(1)将稀释的待检血清、稀释的发光微球溶液和稀释的生物标记抗人IgE抗体溶液于检测微孔中混合，置35～40℃温浴35～50分钟；同时，采用已标定IgE含量的发光微球标准品溶液代替过敏原包被的发光微球溶液，用于获得IgE活性单位与光信号强度数学函数关系；优选的，稀释的待检血清、稀释的发光微球溶液和稀释的生物标记抗人IgE抗体溶液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，优选的，1:1:1；
(2)继续加入链霉亲合素包被的感光微球，置于30～40℃继续温浴10～25分钟；稀释的待检血清与链霉亲合素包被的感光微球的体积比为1:5～1:9；优选的；稀释的待检血清与链霉亲合素包被的感光微球的体积比为1:7；置于37℃继续温浴15分钟；
(3)温浴结束后，采用光激化学发光分析仪检测光信号强度，采用标准化IgE发光微球溶液的光信号强度，获得IgE活性单位与光信号强度数学函数关系，待检标本过敏原特异性IgE的活性单位通过标准化数学函数计算。。
优选的，步骤(1)中，待检血清为按体积比1:10～1:30稀释的；所述发光微球溶液的浓度为4～6微克/毫升；所述生物标记抗人IgE抗体溶液为0.45～0.55微克/毫升；优选的，待检血清为按体积比1：20稀释的；所述发光微球溶液的浓度为5微克/毫升；所述生物标记抗人IgE抗体溶液为0.5微克/毫升。
优选的，步骤(3)中，光激化学发光分析仪用675～685纳米激发光照射检测体系，检测610～620纳米的光学信号；优选的，用680纳米激发光照射检测体系，检测615纳米的光学信号。。
本发明也提供了如上所述的血清特异性IgE(过敏原)光激化学发光免疫分析试剂盒在血清特异性过敏原检测中的应用。
本发明同时提供了如上所述的分析方法在血清特异性过敏原检测中的应用。
本发明的检测原理是采用已明确的单一组分过敏原(天然提纯或重组制备)包被发光微球，以生物素标记抗人IgE抗体，与链霉亲合素预包被感光微球组成检测试剂。首先，待检血清、过敏原包被的发光微球、生物标记抗人IgE抗体共同温育，待检血清中特异性IgE抗体分别与发光微球表面的抗原分子和生物素标记抗人IgE抗体特异性结合(已知抗原-待检IgE-生物素标记抗人-IgE抗体)；其次，加入预先包被有链霉亲合素的感光微球并继续温育，通过生物素与链霉亲合素结合，“桥联”感光微球和发光微球(二者间距离小于200纳米)；最后，用激发光照射检测体系，经活性氧途径传递能量，诱导发光微球的化学发光反应，即可检测光学信号，且信号强度与待检特异性IgE含量呈正比例函数关系。同时，用已知不同浓度IgE校准品-发光微球，与生物素标记抗人IgE抗体和链霉亲合素-感光微球建立IgE校准品与光学信号强度正比例函数关系(标准曲线)，通过此曲线对待检标本特异性IgE含量进行全定量分析。原理如图1所示。
相对于现有技术，本发明所述的一种血清特异性过敏原光激化学免疫分析试剂盒，具有以下优势：
(1)光激化学发光免疫分析属于均相免疫分析，是首次用于血清特异性IgE(过敏原)检测。整个检测过程不需“洗涤和分离”，具有操作简单、快速易于自动化等多种优势。
(2)光激化学发光免疫分析采用化学发光剂和镧系元素铕作为标记物质，且不标记过敏原或抗人IgE抗体，此类标记物抗干扰能力强，受环境影响小，同时不会影响抗原或抗体活性。此外，本技术发明采用生物素标记抗人IgE抗体，生物素分子小，几乎不会削弱抗人IgE抗体的生物活性。
(3)本技术发明采用单一组分过敏原检测理念，用单一已明确过敏原包被发光微球，检测结果能够说明受检患者对食物何种过敏原敏感，是一种还是几种同时存在。此种方式可以实现对过敏患者的“精准”检验，为“精准”脱敏治疗提供实验依据，符合精准医学的最新理念。同时，由于未采用传统的混合天然蛋白提取溶液作为已知抗原，防止因多种蛋白包被有效固相面积而产生“空间位阻”效应，也可有效防止某些蛋白会因相对比例较低而导致假阴性结果的出现。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明全定量光激化学发光免疫分析血清特异性IgE(过敏原)测定原理示意图；；
①为链霉亲合素包被的感光微球；②为生物素标记抗人IgE抗体；
②用已知过敏原包被的发光微球，④为待检过敏原特异性IgE抗体。
图2为本发明实施例中血清IgE标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。
以“禽蛋特异性IgE检测”为例进行说明，具体实施方式如下：
禽蛋是常见食物过敏原，禽蛋过敏是常见食物过敏反应，特别是婴幼儿具有较高发病率。禽蛋的主要过敏原包括：其中卵类粘蛋白(Ovomuciod，OM，Gald1，28kDa，11％)、卵白蛋白(Ovalbumin，OA，Gald2，45kDa，54％)、卵转铁蛋白(Ovotransferrin，OT，Gald3，77kDa，12％)。本实施例以“卵白蛋白(Gald2)”为例说明诊断试剂的组成、制备过程、使用方法、结果分析等。
(一)主要试剂
(1)发光微球溶液(卵清蛋白包被)
(2)生物素生物素标记抗人IgE抗体溶液(已商品化)
(3)感光微球溶液(链霉亲合素)(已商品化)
(4)血清样本稀释液(称Tris3.03克、NaCL4.38克、牛血清白蛋白10克，用400毫升蒸馏水溶解，用HCL或NaOH调pH8.0，加入Proclin300防腐剂0.25ml，最终用双蒸水定容至500毫升)
(二)发光微球包被抗原方法
(1)称卵清蛋白(sigma)干粉，用0.1MpH8.0磷酸盐溶液配制，浓度2毫克/毫升。
(2)取50微升(20毫克/毫升)发光微球，置于1.5毫升塑料离心管中，加入0.1MpH8.0磷酸盐溶液，离心洗涤1-2次，16000rpm，弃上清液，待用。
(3)向上述离心管内加入0.1毫克卵清蛋白溶液，并用0.1MpH8.0磷酸盐溶液定容至200微升，再依次加入1.25微升10％吐温20溶液、10微升新鲜配制的400mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置37℃温箱内反应48小时以上。
(4)用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加10微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置37℃温箱内继续反应1小时。
(5)将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，16000rpm离心15分钟，弃上清液，再加入200微升100mM，pH8.0的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，用pH8.0，0.1MTris-HCl缓冲液稀释至10微克/毫升。
(三)使用方法
检测过程分为两个阶段：
第一阶段，将25微升待检血清(按体积比1:20稀释)、25微升发光微球溶液(已包被过敏原，按体积比1:600稀释)和25微升生物标记抗人IgE抗体溶液(0.5微克/毫升)于检测微孔中混合，置37℃温浴45分钟。同时，采用已标定IgE含量的发光微球标准品溶液代替过敏原包被的发光微球溶液，用于获得IgE活性单位与光信号强度数学函数关系。
第二阶段，继续加入175微升感光微球溶液(表面包被链霉亲合素)，置37℃继续温浴15分钟。
温浴结束后，采用光激化学发光分析仪检测光信号强度(激发波长680nm,检测波长615nm)，采用标准化IgE发光微球溶液的光信号强度，获得IgE活性单位与光信号强度数学函数关系，待检标本过敏原特异性IgE的活性单位通过标准化数学函数计算。
(四)结果分析
1、血清IgE标准曲线结果，如图2所示；
2.临床标本检测结果，鸡蛋过敏血清卵清蛋白检测结果如下表所示：
注：血清sIgE大于0.35KU/L判断为过敏
上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：包括如下试剂，已知过敏原包被的发光微球、以生物素标记抗人IgE抗体、链霉亲合素包被的感光微球。
2.根据权利要求1所述的血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述已知过敏原包被的发光微球溶液，浓度为3～7微克/毫升；所述生物素标记抗人IgE抗体溶液，浓度为0.3～0.7微克/毫升；所述链霉亲合素包被的感光微球溶液，浓度为35～45微克/毫升；优选的，所述已知过敏原包被的发光微球溶液，浓度为5微克/毫升；所述生物素标记抗人IgE抗体溶液，浓度为0.5微克/毫升；所述链霉亲合素包被的感光微球溶液，浓度为40微克/毫升。
3.根据权利要求1所述的血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述特异性过敏原包被的发光微球包括如下制备步骤，
(1)称待检测过敏原的蛋白干粉，用0.09～0.11MpH7.8～8.2磷酸盐溶液配制，得到浓度为2～4毫克/毫升的蛋白溶液；优选的，0.1MpH8.0磷酸盐溶液配制，得到浓度为2毫克/毫升的蛋白溶液；
(2)取48～52微升浓度为18～22毫克/毫升的发光微球，置于1.3～1.8毫升塑料离心管中，加入0.08～0.12MpH7.5～8.5磷酸盐溶液，离心洗涤1-3次，15000～17000rpm，弃上清液，待用；优选的，取50微升浓度为20毫克/毫升的发光微球，置于1.5毫升塑料离心管中，加入0.1MpH8.0磷酸盐溶液，离心洗涤1-2次，16000rpm，弃上清液，待用；
(3)向上述离心管内加入步骤(1)配置的0.05～0.15毫克蛋白溶液，并用0.08～0.12MpH7.5～8.5磷酸盐溶液定容至180～220微升，再依次加入1～1.5微升质量分数8％～12％吐温20溶液、8～12微升新鲜配制的350～450mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置35～40℃温箱内反应48小时以上；优选的，向上述离心管内加入步骤(1)配置的0.1毫克蛋白溶液，并用0.1MpH8.0磷酸盐溶液定容至200微升，再依次加入1.25微升10％吐温20溶液、10微升新鲜配制的400mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置37℃温箱内反应48小时以上；
(4)用750～850mM氢氧化钠溶液配制溶度为55～75毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加8～12微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置35～40℃温箱内继续反应0.5～1.5小时；优选的，用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加10微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置37℃温箱内继续反应1小时；
(5)将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，15000～17000rpm离心10～20分钟，弃上清液，再加入150～250微升80～120mM，pH7.5～8.5的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，用pH7.5～8.5，0.05～0.15MTris-HCl缓冲液稀释至8～12微克/毫升；优选的，将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，16000rpm离心15分钟，弃上清液，再加入200微升100mM，pH8.0的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，用pH8.0，0.1MTris-HCl缓冲液稀释至10微克/毫升。
4.一种使用如权利要求1～3任一项所述的血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒进行分析的方法，其特征在于：包括如下步骤，
(1)将稀释的待检血清、稀释的发光微球溶液和稀释的生物标记抗人IgE抗体溶液于检测微孔中混合，置35～40℃温浴35～50分钟；同时，采用已标定IgE含量的发光微球标准品溶液代替过敏原包被的发光微球溶液，用于获得IgE活性单位与光信号强度数学函数关系；优选的，稀释的待检血清、稀释的发光微球溶液和稀释的生物标记抗人IgE抗体溶液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，优选的，1:1:1；
(2)继续加入链霉亲合素包被的感光微球，置于30～40℃继续温浴10～25分钟；稀释的待检血清与链霉亲合素包被的感光微球的体积比为1:5～1:9；优选的；稀释的待检血清与链霉亲合素包被的感光微球的体积比为1:7；置于37℃继续温浴15分钟；
(3)温浴结束后，采用光激化学发光分析仪检测光信号强度，采用标准化IgE发光微球溶液的光信号强度，获得IgE活性单位与光信号强度数学函数关系，待检标本过敏原特异性IgE的活性单位通过标准化数学函数计算。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于：步骤(1)中，待检血清为按体积比1:10～1:30稀释的；所述发光微球溶液的浓度为4～6微克/毫升；所述生物标记抗人IgE抗体溶液为0.45～0.55微克/毫升；优选的，待检血清为按体积比1:20稀释的；所述发光微球溶液的浓度为5微克/毫升；所述生物标记抗人IgE抗体溶液为0.5微克/毫升。
6.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于：步骤(3)中，光激化学发光分析仪用675～685纳米激发光照射检测体系，检测610～620纳米的光学信号；优选的，用680纳米激发光照射检测体系，检测615纳米的光学信号。
7.如权利要求1～3所述的血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒在血清特异性过敏原检测中的应用。
8.如权利要求4～6所述的分析方法在血清特异性过敏原检测中的应用。
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