JP3040162B2 - 被検体のアッセイを妨害する物質の存在下における生体液中の被検体の測定法 - Google Patents

被検体のアッセイを妨害する物質の存在下における生体液中の被検体の測定法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、被検体のアッセイを妨害するような物質の
存在下での被検体の測定法に関する。本発明は、また、
かかる測定を実施するための器具に関する。本発明は、
生物液体試料中の、目的のリポタンパク質クラス中に含
まれる被検体；クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、アミラーゼ及びアルカリ性又は酸性ホスファター
ゼの目的とするアイソザイム；目的の免疫グロブリン、
さらにはその他の被検体の検出に用いることができる。
背景技術 A.総論 現代の医療業務においては、コレステロール、各種酵
素（クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、酸性
ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アミラー
ゼなど）、各種免疫グロブリンその他の物質など、各種
生物学的被検体に関する血清及び尿のルーチン臨床検査
が一般に欠かせない。
ルーチン検査に加えて、より特殊な（しかしもっと時
間のかかるのが一般的な）診断検査も行われる。例え
ば、酸性ホスファターゼのある種のアイソザイムの検出
が、前立腺ガン並びに各種白血病の指標として臨床的に
用いられている。血液又は血清中で検出されるアルカリ
性ホスファターゼのある種のアイソザイム濃度は骨及び
肝臓の代謝活性の指標となる。膵特異的アミラーゼの濃
度は膵炎の指標となる。クレアチンキナーゼのMB型アイ
ソザイム（CKMB）の血清中濃度並びに乳酸デヒドロゲナ
ーゼのアイソザイム濃度は心筋梗塞の指標となる（Clin
ical Chemistry（Kaplan,L.及びPesce,A.共編,The C.V.
Mosby Company,ミズーリ州セントルイス）454−483頁
（1989）掲載のNoel,S.他“Enzymes"）。同様に、特定
クラスのリポタンパク質に含まれるコレステロールの検
出が冠状動脈性心臓病の検査に用いられている（Clinic
al Chemistry（Kaplan,L.及びPesce,A.編,The C.V.Mosb
y Company,ミズーリ州セントルイス）968−1004頁（198
9）掲載のRussel他“Lipids"）。このような特殊な検査
は、既にルーチン検査の対象とされているある特定のク
ラスの被検体を対象とすることが多い。
生物液体試料中の被検体をアッセイする際の有効性
は、そのアッセイを妨害するような物質が存在すると低
下する（Clinical Chmistry（Kaplan,L.及びPesce,A.
編,The C.V.Mosby Company,ミズーリ州セントルイス）8
08−819頁（1989）掲載のKaplan,L.及びPesce,A.“Inte
rferences in Chemical Analysis"）。例えば、可視光
域で強い吸光度を示すヘモグロビン又はビリルビンのよ
うな化合物は被検体の分光学的分析を妨害するおそれが
ある（Kaplan,L.及びPesce,A.,同上）。
臨床検査においては、正確さを確保しかつ検査結果の
ばらつきを最小限に抑えるために、ルーチン検査である
と特殊検査であるとを問わず、慎重に開発された品質保
証及び品質管理の手順に忠実に従うことが要求される。
実際、検査結果のばらつき及び不正確さに関する懸念か
ら、米国保険会社福祉省（U.S.Dcpartment of Health a
nd Human Services）のHealth Care Financing Adminis
trationによって臨床検査機関の行政規則（regulatio
n）が追加されている。53 Federal Register 29590−29
632（1988年８月５日金曜日発行）（42 CFR part74以降
の改正案）;55 Federal Register 9538−9610（1990年
３月14日水曜日発行）（検査機関規則の改正、コメント
要請付最終規則）参照。これらの新行政規則は、臨床検
査機関にまた新たな責務を課したものである。従って、
かかる検査機関は品質管理基準を厳守していることを容
易に立証することのできる検査手順を必要と特殊検査は
（ルーチン検査とは対照的に）立証が容易であるかも知
れないが、かかる検査はその本質からして精緻なもので
あるため、ルーチン検査で用いられる検査プロトコルと
は全く異なる一連の検査プロトコルについての検査技術
者の熟練を要する。その結果、かかる特殊検査の品質管
理には一般により繁雑な実験手順と検査職員の訓練を要
する。
また、たとえ一回の検査毎に十分な品質管理を行った
としても、検査結果の解釈はさらに複雑になる。例え
ば、コレステロールについての検査結果から得られる診
断情報の重要性並びに検査機関の間のばらつきをなくす
必要性から、全国的集団調査に基づいて統一されたコレ
ステロール境値が設けられている。さらに、コレステロ
ールの測定法が標準化されるようにコレステロールに関
する全国的参照システム（national reference syste
m）が開発されており、National Reference System for
Cholesterolに値を照会できる。トリグリセリド類、リ
ポタンパク質、アポリポタンパク質に関しては全国的参
照システムが存在しないので、これらの脂肪に関連した
検査についての検査機関の間のばらつきをなくすために
なすべきことは沢山ある。現在、これらの検査及びコレ
ステロールについての特殊検査はNational Reference S
ystem for Cholesterolと直接には関係していない可能
性がある。
これまでの議論を基礎として、この「背景技術」の項
の残りの部分では、生体液中の被検体の検出分野におけ
る技術水準の例としてコレステロールの測定法について
述べる。本発明者等の知る限り、特定クラスのリポタン
パク質に含まれるコレステロールアッセイ法で、（ｉ）
疫学的観点から容易に解釈することができ、しかも（i
i）簡単・迅速に費用をかけずに実施できると同時に、
（iii）どんなルーチン臨床化学検査方式に例外なく適
用することのできるようなアッセイ法は先行技術には存
在しない。実際、上述のルーチン検査の対象とされてい
る特定クラスの被検体のアッセイ法でこれらの２つの基
準を満足するものがあるとは聞いたことがない。
B.コレステロール 生化学的背景 トリグリセリド及びコレステロールはリポタンパク質
粒子を介して血中に輸送される。これらのリポタンパク
質の異常は、それが遺伝的なものであろうと、環境に起
因するものであろうと、或いはこれら両者によるもので
あろうと、早発性の冠状動脈性心臓病（CHD）及びアテ
ローム性動脈硬化症に罹りやすい素因を含め、様々な障
害をもたらす（N.I.H.Publication Number 88−2925（1
988）;Schaefer及びLevy,The New England Journal of
Medicine 312,1300−1310（1985））。多くの病態の裏
に横たわる細胞メカニズム及び遺伝的メカニズムについ
ては過去30年間に詳細で見事な調査がなされてきた（Br
own及びGoldstein,Science 232,34−47（1986）並びにL
usis,J.Lipid Research 29,397−428（1988））。
リポタンパク質粒子の化学、生合成、機能、代謝、細
胞生物学及び分子生物学については詳細に概説されてい
る（Segrest,Jere P.及びAlbers,John J.編,Methods in
Enzymology 128（1986）、並びに、Albers,John J.及
びSegrest,Jere P.編,Methods in Enzymology 129（198
6））。
リポタンパク質粒子は、その密度、組成及び電気泳動
移動度に基づいて４つの主要クラスに分類される。かか
るクラスは、キロミクロン、超低密度リポタンパク質
（VLDL）、低密度リポタンパク質（LDL）及び高密度リ
ポタンパク質（HDL）である。LDL粒子とHDL粒子は密度
に基づいてさらに細かく分類できる。リポタンパク質粒
子はトリグリセリド、コレステロール、コレステロール
の脂肪酸エステル、リン脂質及びタンパク質から成る。
リポタンパク質のクラスが異なるとタンパク質の脂質に
対する比が変わるが、これによって物理的差異が生じ
て、これらの粒子を密度勾配遠心法によって分画するこ
とができるのである。
そのタンパク質成分はアポリポタンパク質として知ら
れており、様々な細胞機能を担っている。LDLコレステ
ロール濃度の増加及びHDLコレステロール濃度の低下
は、CHDの危険因子であることが明らかにされている。
その結果、上記主要クラスのリポタンパク質に含まれる
コレステロール含量についての臨床診断アッセイが広く
実施されており、これらのクラスの正常範囲についての
大量の統計学的データがCenters for Disease Control
から標準化された形で入手できる（McNamara及びSchaef
er,Clinica Chimica Acta 166,1−８（1987））。
コレステロールの測定 臨床検査機関では、血漿又は血清試料の脂質及びコレ
ステロールプロフィールの特徴を明らかにするため以下
のアッセイがルーチン化されて行われている：（ｉ）ト
リグリセリドはリパーゼ酵素（群）と呈色指示薬結合酵
素群の系を用いて測定される、（ii）総コレステロール
量はコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ及びその他の酵素群、並びにコレステロールの
酸化を色の変化として検出可能にする試薬を用いて酵素
的に測定される。また（iii）HDLコレステロールは、ポ
リアニオン（例えば硫酸化多糖など）と又はリンタング
ステン酸塩と２価カチオンの混合物を用いてVLDL及びLD
L画分を選択的に沈殿させた後の試料の上清を上記（i
i）の通り酵素的に測定する（Burstein他,J.Lipid Rese
arch 11,583（1970），並びにMulder他,Clinica Chimic
a Acta 143,29−35（1987））。VLDLコレステロール（V
LDL.C）とLDLコレステロール（LDL.C）は以下のFriedew
aldの式（Friedewald他,Clin.Chem.18,409−502（197
2））を用いて間接的に決定される： 総コレステロール＝HDL.C＋VLDL.C＋LDL.C LDL.C＝総コレステロール−（VLDL.C＋HDL.C） LDL.C＝総コレステロール−（トリグリセリド/5＋HD
L.C） 上記式は、（ｉ）キロミクロンが例えば絶食患者から
得られる血液試料中に全く存在しないこと、並びに（i
i）コレステロールとトリグリセリドとの間に一定の関
係が存在することを前提としているが、これは高トリグ
リセリド状態においては正しくないことが知られている
（Cohn他,Clinical Chemistry 34,2456−2459（198
8）；並びにRao他,Clinical Chemistry 34,2532−2534
（1988））。
このように上述の分析法には幾つかの欠点がある。
（ｉ）VLDL.C及びLDL.Cは直接測定されるのではなく、
式から推計されること。（ii）Friedewaldの式は臨床上
関連のある状態、即ちトリグリセリド濃度の増加した状
態（＞400mg/100ml）においては不正確であること（Coh
n他,Clinical Chemistry 34,2456−2459（1988）；並び
にRao他,Clinical Chemistry 34,2532−2534（198
8））。（iii）HDL.Cの測定が、ポリアニオンと又はリ
ンタングステン酸塩と２価カチオンによるVLDL及びLDL
粒子の選択的沈殿並びに分離された上清の総コレステロ
ールの測定に依存していること。一般に、特定クラスの
リポタンパク質に含まれるコレステロールの測定には、
標準化された参照システムがない。
Mulder他は、LDL沈殿の再溶解物に含まれるコレステ
ロールの直接測定法について報告しているが（Clinica
Chimica Acta 143,29−35（1987））、かかる測定法は
ルーチン診断調査においては実施されていない。
もっと最近の研究成果では、クラス別にリポタンパク
質を分離して定量するため、個々の臨床関連リポタンパ
ク質粒子に特有のアポリポタンパク質に対する抗体（ポ
リクローナルもしくはモノクローナル抗体）を用いるも
のがある（Tikkanen他,J.Lipid Research 24,1494−149
8（1983）；並びにOrdovas他,J.Lipid Research 28,121
6−1224（1987））。
研究機関においては、リポタンパク質を定量するため
に、放射免疫拡散法、ラジオイムノアッセイ及びエレク
トロイムノアッセイ（electroimmunoassay）などの様々
な免疫分析法が用いられているが、これらの技術は繁雑
すぎて多数の試料を迅速に取扱わねばならないという状
況の臨床診断には用いることができない。この欠点に対
しては酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）を用
いて対処し得る可能性があり、この問題は活発に研究さ
れている領域である（Ordovas他,J.Lipid Research 28,
1216−1224（1987））。
しかしながら、これらの免疫法の幾つかにはまたは別
の欠点があり、ELISAも例外ではない。それは、これら
の方法が特定クラスのリポタンパク質に関連したエピト
ープを定量するもので、コレステロール濃度を測定する
ものではないことである。この事態の重要性は、コレス
テロール値（酵素的手法で測定したもの）との相関関係
を確立するために、免疫法で分析した試料でしかも疫学
的に解釈可能なものを非常に数多く必要とすることであ
る。従って、ELISA式検査法が臨床診断業界に受け入れ
られるまでには長い準備期間を要する。
生体液中の物質の濃度を測定するために固定化抗体を
利用する方法が知られている。Longeneckerは、抗体と
色素タンパク質の付加生成物を用いる比色免疫検定法に
基づく生体液中又は細胞中の抗原性物質の測定について
報告している（米国特許第4302536号明細書（198
1））。大西と伊東は、目的の標識物質と特異的結合物
質との間の均一競争反応を利用した免疫検定法について
報告している（欧州特許第327,918号明細書（198
9））。Freytagと石川は、重合酵素−抗体複合体を用い
る高感度免疫検定法について報告している（米国特許第
4657853号明細書（1987））。日本は、液体試料中のト
ランスフォーミング増殖因子（TGF）の濃度を固定化TGF
抗体と酵素標識TGF抗体を用いて検知する免疫検定法に
ついて報告している（特開昭59−226864号公報（198
4））。GomezとWicksは、125Iで標識した抗体を用いて
免疫複合体混合物を沈降させることによる、血清中のク
レアチンキナーゼについての免疫検定法について報告し
ている（米国特許第4353982号明細書（1982））。
幾つかのグループによって、特定のリポタンパク質ク
ラスを選択的に免疫沈降させた後、溶液中に残るリポタ
ンパク質クラスに含まれるコレステロールを定量する方
法が調べられている。Heuck他は、ApoB（アポリポタン
パク質Ｂ）に対する抗体を使用してLDL及びVLDLを沈降
させた後、上清に残ったHDL中のコレステロール濃度を
測定することを報告している。HDL及びVLDLを沈降させ
るためにアポリポタンパク質AI及びＣ（ApoA I,ApoC）
に対する抗体も用いられており、しかる後に上清に残る
LDL中のコレステロール濃度が測定される（Heuck他,Cli
n.Chem.31,252−258（1985））。Kerscher他は、HDLに
対する抗体を用いてHDL及びVLDLを沈降させ、遠心によ
って沈殿を分離した後、上清のLDL中のコレステロール
濃度又は他の成分濃度を分析することを報告している
（Kerscher他，米国特許第4746605号明細書（1988）；
ドイツ連邦共和国特許第3215310号（1983）；並びにKer
scher他,Clin.Bioch.18,118−125（1985））。リポタン
パク質を免疫沈降させた後、溶液中に残るリポタンパク
質クラスのコレステロール含量を測定するために、固定
化抗体も含め、アポリポタンパク質及び全リポタンパク
質双方に対する抗体が用いられている（Ziegenhorn他，
カナダ国特許第1211707号明細書（1986））。ただし、
この文献には、抗体の固定化される具体的な器具又は構
造について何も記載されていない。
発明の概要 本明細書に開示された発明は、一つの具体的態様にお
いては、生物液体試料中の被検体を、かかる被検体のア
ッセイを妨害するような物質の存在下で、検出する方法
を提供する。この具体的態様は、妨害物質を選択的に免
疫沈降させる抗体を用い、次いで非反応体に含まれる被
検体のアッセイを行うことによって、実施される。別の
具体的態様においては、本発明は上記方法を実施するた
めの使い捨て器具を提供する。
本発明は多種多様な生物被検体の検出に応用でき、例
えば別のリポタンパク質クラスに含まれるコレステロー
ル存在下における目的リポタンパク質クラスに含まれる
コレステロールの検出のみならず、目的のアイソザイム
以外のアイソザイム存在下でのクレアチンキナーゼ、乳
酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ又はアルカリ性もしく
は酸性ホスファターゼの当該目的アイソザイムの検出；
目的の免疫グロブリン以外の免疫グロブリン存在下での
当該目的免疫グロブリンの検出に用いることができる
が、これらに限定されるものではない。
図面の簡単な説明 本発明の上述の特徴的事項は、添付図面と共に以降の
詳細な説明を参照することによってもっと容易に理解さ
れるであろう。添付図面において、 図１は、実施例１で用いた抗血清を得るための抗原と
して使用したリポタンパク質の逐次密度勾配超遠心分離
の説明図である。
図２は、実施例１の記載に従って、19人のヒト血漿試
料について得られた抗ND−LDL血清沈降法とデキストラ
ン硫酸法との間の上清コレステロール値の相関図であ
る。
図３は、実施例１の記載に従って８人のヒト血漿試料
について行った免疫沈降法の実験間の精度を示すグラフ
である。
図４は、実施例１の記載に従って、上清コレステロー
ル推計法によって測定した凍結乾燥抗ND−LDL血清によ
るヒト血漿ApoB含有リポタンパク質粒子の沈降の時間経
過を示すグラフである。
図５は、図４と同様のグラフであるが、実施例１に記
載の通り、沈降剤は凍結乾燥していない抗血清である。
図６は、実施例１に従って得られた上清コレステロー
ル及びApoBの濃度のグラフである。
図７は、実施例２に記載した本発明の具体的態様にお
ける反応器具の縦断面図である。
図８は、本発明における抗体固定化用の各種固体担体
マトリックスを図示したものである。
図９は、図７の反応器具（70）の内側反応チャンバー
（74）の縦断面図である。
図10は、図７の反応器具（70）の外側回収チャンバー
（72）の縦断面図である。
図11は、実施例３に記載した本発明の器具の別の具体
的態様の斜視図である。
図12は、図11の反応器具の詳細を図説したものであ
る。
図13は、本発明における抗体固定化用の各種固体担体
マトリックスを図示したものである。
図14は、図12の回収−反応ピペット（114）の縦断面
図である。
図15は、図12のドッキング部材（116）の縦断面図で
ある。
図16は、作業台に設置した図11の反応器具の縦断面図
である。
図17は、作業台に図11の反応器具一式を全部設置した
試料調製系の縦断面図である。
図18は、図11の反応器具に類似しているが若干性能の
向上した反応器具の具体的態様の切断図である。
図19は、図18の反応ピペット（202）の縦断面図であ
る。
図20は、図18のフィルター部分と関連部品の拡大図で
ある。
具体的態様の詳細な説明 本発明は、一つの具体的態様において、生物液体試料
中の被検体を、かかる被検体のアッセイを妨害するよう
な物質の存在下で、免疫分離法を利用して検出する方法
を提供する。本発明においては、抗体を使用して被検体
のアッセイを妨害する物質の選択的免疫反応を生ぜし
め、次いで非反応体のアッセイによって被検体を検出す
る。本発明の一つの具体的態様においては、上記の免疫
反応−分離を迅速かつ安価に実施するために、ある反応
器具が用いられる。上記免疫反応に用いられる抗体は凍
結乾燥してもよいし、適当な担体上の標品として使用し
てもよい。この目的に適した様々な担体及び分離法が利
用できる。従って、抗体は、免疫反応体の非反応体から
の分離を容易にするような量、密度、表面積又は電荷の
不溶性担体の表面に結合させてもよい。不溶性担体の例
としては、マイクロポーラス（microporous）ビーズ、
ラテックス粒子、磁性粒子、制御孔径ガラス（controll
ed pore glass）、架橋デキストランや架橋多糖類や架
橋アクリルアミドから得られるゲルマトリックス、マイ
クロポーラスフィルター又はマイクロポーラスメンブラ
ンがある。その他の適当な不溶性担体としては、コイル
状ストリップや反応器具自体の内壁が挙げられる。抗体
は、もっと容易に沈降し得る免疫複合体を被検体と形成
するように、可溶性の高分子量ポリマーに結合させても
よい。適当なポリマー担体の例は、多糖類、タンパク
質、ポリヌクレオチドなどである。この方式により、免
疫分離を速度論的に促進することもできる。免疫沈降用
の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
も或いはこれらのいずれかもしくは両者の混合物であっ
てもよく、これらが十分な特異性を有していて交差反応
性に欠け、広範な基質濃度で定量的に吸収する能力を有
し、免疫反応複合体を分離する能力を有していさえすれ
ばよい。
本発明を用いて生物液体試料中の被検体を精製すれ
ば、現在臨床的に使用されている既存のルーチン診断検
査の効率を高めることができる。本発明は、さらに、こ
れらのルーチン検査をより特異的なものにするための伝
統的方法を提供するが、かかる特異的検査は特殊検査方
式に取って代えることができるので、本発明ほ結果的に
品質管理、費用の低減の達成並びにあるクラスの被検体
に含まれる特異的被検体の検査の実用化に役立つ。
本発明は、コレステロールの検査に応用した場合、先
行技術に対して幾つかの利点を有する。本発明の具体的
態様は、ある免疫分離したリポタンパク質クラス中のコ
レステロールの慣用酵素技術に基づく測定に関して用い
られる。本発明では既存のルーチン臨床検査法が利用で
きる（免疫分離リポタンパク質クラスに応用される）の
で、本発明の好ましい具体的態様による検査結果を全国
的参照システムと直接関係付けることができる。（本発
明の具体的態様が今回提供するその他の免疫アッセイに
はアポリポタンパク質の定量が含まれるが、これに関す
る統計的に有意な臨床データ、即ち集団中の正常範囲、
は未だ利用できていない。）従って、本発明の実施によ
り得られる分析データは既存のデータベースに直接関係
付けることができ、免疫特異性の利点をコレステロール
診断業が享受するまでの準備期間を劇的に短縮すること
ができる。さらに、本発明により、その分析方針に則っ
た場合の個々のコレステロール測定についての内対照を
与えるような分析方針を企画することが可能になる。例
えば、血漿又は血清試料をリポタンパク質画分の分離を
行わずに先ず総コレステロール量について分析する。続
いて、原試料のアリコートを、順次或いは原試料の別個
のアリコートについて、各種の特異抗体標品による免疫
沈降に付す。個々の状況下において、すべての画分のコ
レステロール結果を合計し、その合計値を未分画時の値
と比較することによって、検査方針を検証することが可
能である。本発明における抗体の使用は、リポタンパク
質クラスの高度に特異的な分画を可能にする。
本発明の実施に際しては、ポリクローナル及びモノク
ローナル抗体の混合物が使用できる。抗体は、例えばEL
ISA法に必要なプラスチック表面への良好な結合性な
ど、他の免疫技術に適した特性に最適化する必要はな
い。さらに、本発明のアッセイは安定化抗体を含む器具
で実施することができ、それによって迅速で安価で効率
的な分析ができる。これは全てのルーチン臨床検査系に
遍く応用できる。以下に述べる具体的態様は、主に、特
定のリポタンパク質クラス中のコレステロールの検出に
ついて説明したものであるが、以下に示す通り、本発明
はその他多種多様な被検体の検出にも均等に適用でき
る。
A.抗原の調製 1.狭密度幅リポタンパク質画分 New England Medical Center Blood Bankで採取され
たCPD中の保存ヒト血漿を、抗原として用いるリポタン
パク質分画の調製に使用した。推定密度1.006（g/ml）
の血漿を以下の逐次超遠心法によって分画した。
38ml血漿＋1ml密度1.006のKBr8本をBeckmanクイック
シールチューブに入れ、Ti60ローターを用いて４℃、45
×103rpmで18〜22時間遠心した。遠心後にチューブを氷
上に保存し、下層との界面近くでチューブ上部を切断し
て1.006浮遊リポタンパク質画分を分取した。1.006下層
画分を集め、Whatmanフィルター（グレード＃１）を通
して重力濾過した。濾液の体積を測定し、密度を次の式
１に従って固体KBr（真空炉乾燥品）で1.03に調節し
た。
gKBr＝Vi×（Df−Di）／｛１−（ｖ×Df）｝ ……１ Vi＝初期体積 Df＝最終密度 Di＝初期密度 v＝KBrの部分比容積 血漿（今度は密度1.03）の第２回目の超遠心を上記と
同一の条件下で実施し、ここでも遠心後氷上に保存して
おいたチューブをスライスして上層の画分を分離した。
1.03下層画分を集め、前回と同様に濾過し、密度を式１
に従って1.05g/mlに調節した。第３回目の超遠心作業を
上記と同一の条件下で実施し、回収したチューブを氷上
に置いてから上部リポタンパク質層を分離した。この上
層は下層とのちょうど界面でスライスした。この1.05上
層画分を回収したが、これは狭密度幅LDL（ND−LDLと略
す）と呼ぶLDL画分を含んでいる。
1.05下層画分を集め、前回と同様に濾過し、KBrで密
度を1.107に調節した（式１）。この材料を、次の条件
下で第４回目の超遠心にかけた。Ti60ローター中、４
℃、50×103rpm、42〜48時間。回収したチューブを上記
の通りに維持し、下層との界面近くでスライスして上部
リポタンパク質層を分取した。
1.107下層画分を集め、濾過し、密度を1.19に調節し
た（式１）。この画分を、４回目の遠心操作と同一の条
件下で第５回目の超遠心にかけた。回収したチューブを
上記の通りに維持し、上層の下方界面近くでスライスし
て、狭密度幅HDL（ND−HDL）を含む1.19上層画分を得
た。
図１に、逐次超遠心法によるリポタンパク質粒子の分
画の概略図を示す。上記で得た狭密度幅の画分を洗浄
し、超遠心を繰返すことによって再分画した。ND−LDL
（1.05上層画分）は、Ti60ローターを用い、４℃、45×
103rpmで18〜22時間、1.05の密度において再度遠心し
た。上層画分を回収し、再度遠心し、再び回収して遠心
してから最終的に回収してPBSに対して透析した。一般
的には、20〜25mlの再分画ND−LDLを3.0のPBSに対し
て４℃で18時間透析する。PBSの処方は次の通りであ
る。
10倍保存液：溶液Ａ＝80g NaCl 2.0g KCl 1.97g CaCl2・6H2O 1.0g MgCl2・6H2O 0.01g NaN3 （1.0の脱イオン水中） ：溶液Ｂ＝11.5g Na2HPO4 2.0g KH2PO4 0.01g NaN3 （1.0の脱イオン水中） 最終PBS溶液:100mlの溶液Ａ＋100mlの溶液B,脱イオン
水で900mlとし,1NのNaOHでpH7.4に調整した後，最終容
器1.0に調整。
ND−HDL画分（1.19上層）は、Ti60ローターを用い、
４℃、50×103rpmで18〜22時間、1.107の密度において
再度遠心した。上層画分を回収し、同一条件下で再度遠
心した。最後に上層面分をPBSに対して透析した。この
透析の一般的条件は、４℃で18時間、3.0のPBS中に10
〜15mlの試料を入れることである。
基本的にLaemmliの記載した系（1970）を用いた変性
条件下の４〜22.5％ポリアクリルアミドグラジエントゲ
ル電気泳動によって、透析した狭密度幅画分の純度をチ
ェックした。個々の画分のタンパク質含量はLowry法又
はBiorad試薬を用いる常法により決定した。上述の狭密
度幅リポタンパク質画分の調製法は、Schumaker,V.N.及
びPoppione,O.L.の方法（Methods in Enzymology 128,1
55−170（1086））の改良法である。
こうして単離される狭密度幅リポタンパク質画分の収
率は一般には、266mlの血漿から、タンパク質1.2mg/ml
のND−LDLが31ml、かつタンパク質2.5mg/mlのND−HDLが
12mlである。
2.アポタンパク質の精製 精製ND−LDLを出発材料として、調製用15％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、次いで分離ApoBバンド
を切出すことによって、ApoBを単離した。電気泳動が完
了した時点で、E.Harlow及びD.Lane編のAntibodies.A L
aboratory Manual（Cold Spring Harbor Press,1988）
に記載された通り、タンパク質のバンドが見えるように
ゲルを酢酸ナトリウムで染色した。ApoBを含むゲル部分
を小刀又は剃刀で切出し、基本的に上掲のAntibodiesに
記載された方法に従い、アクリルアミドゲルを内径先細
りの針に繰返し通して均質化した。均質化ポリアクリル
アミド中のApoBを免疫化に使用するまで４℃で保存し
た。
約10mlの精製ND−HDLを出発材料として、基本的にBre
wer他の方法（Methods in Enzymology 128,223−246（1
986））に従い、セファクリルＳ−200上でのクロマトグ
ラフィーでApoA I及びApoA IIを精製した。分離したApo
A IとApoA IIのそれぞれの画分をBiorad検定法でタンパ
ク質について定量し、変性条件下での調製用15％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。タンパク質バンド
を上述の通り、目に見えるようにして、切出し、免疫化
に備えた。
B.免疫化 1.狭密度幅LDL画分:1mg/mlタンパク質溶液1mlを同体積
の完全フロイントアジュバントと混合したものを用いて
複数のヤギに筋肉内注射した。これらのヤギには、大体
２〜４週間隔で、最初に不完全フロイントアジュバント
中の1mgタンパク質（当量）、次いで不完全フロイント
アジュバント中の0.5mgタンパク質（当量）を二次免疫
注射した。
上述の通り調製した均質化ポリアクリルアミド中のア
ポタンパク質Ｂを用い、不完全フロイントアジュバント
中の約0.5mg ApoBを２〜３週間毎に注射することによっ
て、高い抗体力価に維持した。
2.狭密度幅HDL画分:5mg/mlタンパク質溶液0.5mlを同体
積の完全フロイントアジュバントと混合したものをヤギ
の一次免疫に用いた。１度目の二次免疫には5mg/ml溶液
0.5mlを同体積の不完全フロイントアジュバントと混合
したものを用い、２度目の二次免疫には上記免疫原濃度
の50％を用いた。
精製したApoA I及びApoA IIをヤギの免疫に使用して
対応する抗血清を得ることは本発明の範囲に含まれる。
同様に、狭密度幅HDL免疫原を補うために、精製ApoC
I〜IIIを使用することは本発明の範囲に含まれる。
さらに、ヤギの免疫に精製ApoEを独立して又は狭密度
幅HDLの補足抗原として免疫学的常法により使用して、
対応する抗血清を得ることは本発明の範囲に含まれる。
C.抗血清の特徴付け及び精製 二次免疫後の最初の試験採血で血清約２〜10mlを得
た。この抗血清を、単離VLDL、LDL、HDL及びヒト全血漿
に対するウェスタンブロット法（下記に述べる）で特徴
付けした。この方法で、抗狭密度幅LDL血清が精製HDLの
アポタンパク質と交差反応するような物質を含んでいな
いことが明らかになった。ND−LDL抗血清は、VLDL、LDL
及び全血漿に含まれるApoBとしか交差反応を示さなかっ
た。
抗狭密度幅HDL血清は、HDL及び全血漿中のApoA Iとの
反応性並びにHDL、VLDL及び全血漿中のApoC群及びApoE
との反応性を示した。ApoBとの交差反応性成分が少量検
出されたが、これはND−HDLセファロースカラム上での
免疫クロマトグラフィーによって除去できる。このカラ
ムは次のようにして調製する。
（ｉ）リガンド（HDL）のカップリング 凍結乾燥CNBr活性化セファロース4B（Pharmacia社）
の粉末を3g秤量する。この粉末を50ml遠心チューブの中
で11mlの1mM HClに再懸濁する。ガラス濾過器上でゲル
を1mM HClで15分間洗浄する（減圧してゆっくりと滴下
させる;1g粉末当り200ml使用する）。カップリング緩衝
液（0.1M NaHCO3,0.5M NaCl,pH8.3）2.0中でリガンド
（HDL）10〜20mlを４℃で一晩透析し、遠心チューブ中
のゲルと振盪機上で４℃で一晩混合する（1g粉末当り5m
lのカップリング緩衝液を使用する）。
（ii）グルタルアルデヒド架橋 セファロース−HDLビーズを2000×ｇで15分間遠心し
てビーズを沈降させるか或いはガラス濾過器を通してビ
ーズを回収し、ビーズを４倍量の溶液２と共に１時間イ
ンキュベートした。ビーズを濾別し又は沈降させて回収
し、上清を捨て、ビーズを４倍量のNaHCO3及びグルタル
アルデヒドと１時間インキュベートした。カップリング
したセファロースを４倍量の1M Tris−HCl（pH7.8）中
でインキュベート（４℃，一晩）して、未反応アルデヒ
ド基をブロックした。セファロースを回収し、pHを変え
て３サイクル洗浄した。各サイクルは、0.1M酢酸緩衝液
pH4.0,0.5M NaCl、次に0.1M Tris pH8.0,0.5M NaClであ
った。セファロースを緩衝液Ａに懸濁し、室温で一晩イ
ンキュベートした。このセファロースを懸濁液Ａに再懸
濁して４℃で保存した。
溶液： １） NaCHO3,0.25M,pH8.8 ２） 溶液１中に0.015％グルタルアルデヒド ３） 1M Tris−HCl,pH7.8 ４） 緩衝液Ａ 10mM KPO4 150mM NaCl 1mM EDTA 0.1％ NP40 McConathy,W.J.他（1985）、Cuatrecasas,P.（1970）
並びにKowal,R.及びParsons,R.G.（1980）の記載した手
順に基本的に従って、このカラムでND−HDL IgGをアフ
ィニティー精製した。
Corning Agarose Universal Electrophoresis System
（登録商標）を用いて非変性条件下でアガロースゲル電
気泳動しておいたリポタンパク質粒子に対する免疫反応
性を調べることによって、抗血清をさらに特徴付けた。
電気泳動に続いて、10〜20mlの抗血清（対照及び試料抗
血清を別個に試験）をゲルの垂直ウェルに満たし、密封
した湿潤環境下において室温で約18時間インキュベート
した。不透明な沈降線の存在についてゲルを検査して、
試料抗血清と対照抗血清の特異性を決定した。室温で穏
やかに振盪しながら約200mlのPBSに１〜２回浸漬するこ
とによってゲルをPBSと平衡化した。ゲルを室温で16〜2
0時間風乾して、クーマシーブルーで染色した。
抗ND−LDL血清はβ泳動度リポタンパク質領域のみと
交差反応性を示し、α泳動度領域又はアルブミンとの反
応性は全く検出されなかった。
抗血清を脱脂して、硫安分画、超遠心並びにプロテイ
ンＡ又は適当な上記の免疫アフィニティー材料（即ち、
ND−HDL又はND−LDL）上でのアフィニティークロマトグ
ラフィーを含めた一般的技術の組合せを用いてIgG画分
をさらに精製した。
ND−LDL抗血清の精製は以下の手順のウェスタンプロ
ット法でモニターした。リポタンパク質粒子を上記の通
りSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、下記の
条件を用いてニトロセルロース膜（S ＆ S社製）に電気
的に転写した。即ち、転写条件は40ボルトで16〜18時間
であり、転写緩衝液は20mM Tris pH8.3,150mMグリシン,
20％メタノールである。ニトロセルロース膜にND−LDL
抗血清を反応させて、仔ウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼの結合した二次抗体を用い、ホスファターゼ基質−発
色団複合体とインキュベートすることにより、交差反応
性を検出した。発色は目で観察した。これらの手順は基
本的には、Vogel他（1979）並びにMason他（1978）の記
載した通りである。
最後に、−55℃−−57℃で65ミリトールまで一晩Virt
is Freezemobile 24凍結乾燥機を用いて、抗ND−LDL血
清を凍結乾燥した。
実施例 実施例１ 抗ND−LDL血清を用いてヒト血漿中のβリポタンパク
質の免疫沈降を検査し、先行技術と比較した。上述の通
り調製した抗ND−LDL血清50μを含む1.5mlのポリプロ
ピレン製円錐形チューブに200μの新鮮ヒト血漿を加
えた。内容物を穏やかに混合して、室温で30分間インキ
ュベートした後、Beckman微量遠心機で目盛りを12にセ
ットして15分間遠心した。上清を採取して、先端に綿を
詰めたピペットチップを通して重力濾過した。この濾液
を、Abbott ACA 200化学分析機及びAbbott A−Gentコレ
ステロール試薬を用いてコレステロールに関してアッセ
イした。ただし、コレステロール測定法は同一の結果を
与えるものでなければならない。図２は、19人のヒト血
漿試料についての免疫沈降の上清（HDL）のコレステロ
ール値（mg/dl）の、対照βリポタンパク質沈降剤とし
てWarnick他の記載（1985）に基本的に従ってデキスト
ラン硫酸（分子量50kd）を用いて得た値と比較したとき
の相関関係を図示したものである。図３に、２度に分け
て試験（二重反復）した８人の血漿試料についての抗体
免疫分離法の実験相互間の精度を示す。別のバッチの精
製・凍結乾燥抗ND−LDL血清を使用して、ヒト血漿試料
についての免疫分離反応の時間経過を調べた。図４は、
200μの血漿との反応に300μ抗血清を用いた時の時
間経過の結果を示したものであり、デキストラン硫酸対
照上清値は58.5mg/dlであった。同じバッチの抗血清を
凍結乾燥する前に、そのヒト血漿に対する免疫沈降能に
ついて調べた。その結果を図５に示す。この血漿に関し
てはデキストラ硫酸対照値は42mg/dlであった。
アポタンパク質イムノアッセイ法を用いて、免疫分離
法とデキストラン硫酸法との間のリポタンパク質粒子の
分離に関する相対的特異性を評価した。図６に、上清
（濾液）中のコレステロール値（上述の通り）の減少に
よってモニターした抗ND−LDL血清によるリポタンパク
質粒子の免疫沈降、並びにOrdovas他の方法（1987）で
測定したアポタンパク質Ｂイムノアッセイによってモニ
ターした抗ND−LDL血清によるリポタンパク質粒子の免
疫沈降を示す。抗ND−LDL血清350μにおける上清のコ
レステロール値は32.9mg/dlであり、デキストラン硫酸
対照値は30.0mg/dlであった。イムノアッセイからは、
次のような結果が得られた：抗血清350μにおいてバ
ックグラウンドを超えるような濃度のApoBは上清中では
検出できなかったが、デキストラン硫酸法の上清は上清
中に1.2mg/dlのApoBが残留しているという結果を与え
た。
実施例２ 反応させた試料を遠心した後で上清を分離して濾過す
るという実施例１の分離法の別法として、本発明に従っ
て免疫反応及び分離を双方ともに達成するための特殊な
反応器具を用いることもできる。図７は、かかる器具の
具体的態様を図説したものである。図8,図９及び図10は
この具体的態様の個々の部品について説明したものであ
る。この器具は次の３つの部品からなる。即ち、（ｉ）
外側回収チャンバー（72）（図10に単独で示す）：これ
は試料調製完了時に濾液を回収する。（ii）外側反応チ
ャンバー（74）（図９に単独で示す）：これは外側回収
チャンバー（72）の中に（例えば、回収チャンバー（7
2）のねじ付ショルダー（73）の上に置かれる、反応チ
ャンバーのフランジ形成部（71）により）支持されてい
て、その基底部に適当なフィルター材料が組込まれてい
る。並びに、（iii）固定化抗体部材（76）：これは、
例えば図８に例示した通り抗体で被覆しても、ビーズで
もコイル状ストリップであってもよく、反応チャンバー
（74）の中に収められる。その他抗体の固定化に適した
如何なる手段を用いてもよく、例えば抗体で反応チャン
バー（74）の内部表面を被覆してもよい。前述の如く遠
心する前に反応チャンバー（74）に簡便に蓋をすること
ができるように、反応チャンバー（74）はフランジ（7
1）にヒンジ式に取付けられるキャップ（75）を含んで
いる。
本発明の免疫反応−分離法は上記器具を用いて以下の
操作で実施できる。血清又は血漿又は血液試料をピペッ
トで反応チャンバー（74）（図７）に入れ、反応チャン
バー（74）上のキャップ（75）を閉じ、試料を固定化抗
体と混合してインキュベートすることによって免疫反応
を起こさせる。適当な時間に器具を遠心して、フィルタ
ー上に粗残渣と固体抗体担体が残って、非反応体が濾液
として回収チャンバー中に移るようにする。遠心後に、
反応チャンバーを取り外して回収チャンバーの蓋をして
もよいし（図10のねじ付ショルダー（73）に捩じ込むス
クリューキャップを使用する）、或いは濾液又はそのア
リコートをルーチン検査法で非反応体（群）についてア
ッセイしてもよい。
実施例３ 本発明に従う反応器具の別の具体的態様を図11〜図15
の符号（110）で図示する。図11は、器具（110）のドッ
キング部材（116）を示したものであり、ここではドッ
キング部材（116）に当該器具の反応ピペット（114）が
格納されている。ドッキング部材はその底部にフィルタ
ー（118）を有している。反応ピペット（114）は、例え
ばビーズ又はコイル状ストリップ上に（図13）或いは図
８について説明したような手段によって固定化された抗
体の事前包装標品を含んでいる。反応ピペット（114）
は、一片のプラスチックの他の適切な材料を二次加工し
たものでよく、図12に示す通り、上部に可撓性バルブ部
分（121）、反応部分（122）、固定部分（126）及び開
口部（123）を含んでいる。バルブ部分（121）を押込ん
だり離したりすることによって、反応部分（122）に正
圧又は負圧の差圧を与えることができ、液体を開口部
（123）を介して反応部分（122）に交互に吸込んだり、
排出したりすることができる。ここでは可撓性バルブを
正圧又は負圧の差圧の供給源として示したが、他の適当
な供給源を用いてもよい。反応ピペット（114）は、バ
ルブ部分（121）を使って血清又は血漿又は血液の試料
を吸込むことによって、使用する（図12及び図14）。ド
ッキング部材（116）（これはピペットチップを改造し
たものであってもよい）は、免疫反応時に回収−反応ピ
ペット（114）を保持するために用いられる（図12及び
図15）。反応ピペット（114）の固定部分（126）を確保
するため、ドッキング部材（116）はその内部表面に図1
5にドッキング部材の上縁リップの回りのバンドとして
示したような弾性材料の内輪（151）を含んでいる。た
だし、弾性材料は内部表面のもっとも広い部分を覆って
いてもよく、内部表面の全長又は適当な部分に拡がって
いてもよい。ドッキング部材（116）の基底部には（図1
5）、細胞や粗残渣を保持するための適当なフィルター
材料（118）を製造時又は製造後に設置する。
操作上、反応ピペット（114）は、可撓性バルブ部分
（121）（図14）の制御された圧縮によって、ある体積
の液体試料が吸引されるように設計する。吸引された試
料はこうして反応ピペット（114）内の固定化抗体（11
2）と接触するようになる。次に、反応ピペット（114）
をドッキング部材（116）（図12及び図15）の中に設置
して、固定部分（126）を内輪（151）とかみ合わせる。
混合が起こり、器具（110）を作業台（160）（図16）に
設置して適当な時間インキュベートする。
インキュベーション終了時に、作業台（160）から器
具（110）を取り外して、可撓性バルブ部分（121）の圧
縮によって、反応ピペット（114）の未反応内容物をド
ッキング部材（116）の下の別の試料容器に排出する。
図17は、複数の器具（110）が作業台（160）に設置さ
れた時の完全設置状態の試料調製系を示すものであり、
この系は分析用試料調製のためのキット形式で用いるこ
とができる。作業台（160）及び器具（110）及び／又は
器具の構成部材は、ユーザーが別の試料処理系を識別で
きるように色分けしてあってもよい。
別法として、作業台（160）は個々のドッキングチャ
ンバーを含むように改造してもよく、インキュベーショ
ン時に個々の反応器具をこの中に懸架して、作業台内の
呼気装置から濾液が回収されるようにしてもよい。試料
の排出後、上記装置を取り外して回収された濾液を分析
する。
図18は、図11〜図17の反応器具に類似しているが若干
性能の向上した反応器具（200）の具体的態様を示した
ものである。器具（200）は反応ピペット（202）及びサ
ンプルカップ（206）を含んでいる。反応ピペット（20
2）（図19）は、吸気バルブ（204）、担体マトリックス
に結合した抗体（208）、反応ピペット（202）中に上記
固定化抗体を保持するための成形リング（210）及び生
物液体試料が出入りするための液体試料口（212）を含
んでいる。図20に拡大して示したフィルター部材（22
0）は、ワイパー（224）、フィルター保持器（226）、
フィルター（228）及びフィルター取付台（230）を含ん
でいる。この具体的態様の操作は、図11〜図17について
述べた具体的態様の操作と同様である。回収した濾液又
は免疫反応体はルーチン検査法でアッセイすることがで
きる。
反応チャンバーの有効容積を該チャンバー内に含まれ
る安定化抗体の量との関係で考慮すれば、上記で説明し
た反応器具の具体的態様の効率を向上させることができ
る。詳細には、この関係は、目的とする被検体の妨害物
質が完全に免疫反応を起こし、反応チャンバーの有効容
積を満たすような生物液体試料から、予想される如何な
る量の妨害物質も除去されるような十分な抗体が存在す
るようにすべきである。反応チャンバーの物理的寸法を
限定してその有効容積を調節することに加えて、図11〜
図20の具体的態様においてはバルブ（121）又は（204）
の圧縮で排気される最大容積を限定することによって反
応チャンバーの有効容積が限定されている。排気量につ
いては、バルブの寸法の限定又はバルブを押し潰し得る
量に例えばバルブに大きな固体を挿入するなどの物理的
制約を設けることによって限定することができる。
これまでの記載は主に固定化抗体を含む器具について
のものであるが、抗体に必要とされることは適切に安定
化することを免疫分離反応時にチャンバー内に入れるこ
とだけである。従って、凍結乾燥抗体を反応チャンバー
内の水溶性又は浸透性構造体中に入れてもよい。或い
は、抗体を、反応チャンバーと液体による連絡のある容
器内の懸濁液中に保存して、器具使用時に生体液と接触
するようにしてもよい。上記容器は使用時に壊すことの
できるものでもよいし、器具使用時まで懸濁液が環境か
ら密閉されておくように反応チャンバーを設計してもよ
い。
これまで主に特定リポタンパク質クラス中のコレステ
ロールの検出について説明してきたが、本発明は、ある
酵素の目的とするアイソザイムの他のアイソザイム存在
下における検出又は目的とする免疫グロブリン以外の免
疫グロブリン存在下での目的免疫グロブリンの検出な
ど、あるクラスの分子群中の目的被検体の検出に広範囲
に応用できる。例えば、本発明は、クレアチンキナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ並びにアルカリ
性又は酸性ホスファターゼの目的アイソザイムの検出に
応用できる。本発明は、図７〜図20の反応器具に使用す
る抗体が妨害物質に対する抗体でなければならないこと
以外は、上述のコレステロール検査の場合と同様の手法
で実施し得る。抗体は公知方法で調製し得る。
ただし、目的とする被検体が、ある検査法を適用でき
るあるクラスの分子群中に存在する目的としない分子群
から分離される場合に、当該クラスの分子群（被検体を
含む）についてのルーチン検査法が存在していれば、本
発明に従って分離した後に、目的被検体を当該クラスの
分子群についてのルーチン検査法を用いてアッセイする
ことができる。例えば、本発明をルーチン検査の「前置
（front end）」として用いれば、膵特異的アミラーゼ
を検出するためにアミラーゼのルーチン検査法を用いる
ことができる。換言すれば、本発明の具体的態様は他の
アミラーゼアイソザイムからの膵特異的アミラーゼの分
離に用いることができ、例えば膵特異的アミラーゼ以外
のアミラーゼのすべてのアイソザイムに対する抗体を用
いて分離し、その後、試料中の膵特異的アミラーゼ濃度
を同定するためのルーチン検査法を用いて濾液をアッセ
イすることができる。同様の方策を用いて、それに対し
てのルーチン検査法の存在するようなあるクラスの分子
群中の目的被検体をアッセイすることができる。
本発明は、被検体の分光学的アッセイその他のアッセ
イを妨害する可能性のあるビリルビンやヘモグロビンな
どの物質の除去にも使用し得る。このような事例におい
ては、ビリルビン及びヘモグロビンに対する抗体を用い
て、それらの試料からの免疫分離を（本発明を用いて）
行った後に、先行技術によるアッセイを行う。
望ましくない交差反応を避けることさえできれば、ど
んな望ましくない物質も本発明によって免疫分離し得る
ので、本発明において用いることのできる抗体はある特
定の分子に対するものである必要はない。
フロントページの続き (72)発明者 ポゴーゼルスキ、ドナルド・イー アメリカ合衆国、03060 ニュー・ハン プシャー州ナシュー、トッド・ロード 29 (56)参考文献 特開 昭60−173470（ＪＰ，Ａ) 特開 昭48−5926（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−154397（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501963（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／251（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/48

Claims (44)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物液体試料中に存在する目的被検体の量
    を、その被検体に関連する妨害物質の存在下で測定する
    方法にして、 （ｉ）反応チャンバー及び回収チャンバーを有する使い
    捨て反応器具を得、ここにおいて、当該反応チャンバー
    は、当該回収チャンバー内に配置され得るものであり、
    且つ、前記生物液体試料中に含まれる妨害物質の実質的
    にすべてを結合するための安定化抗体を含むものであ
    り、 （ii）前記妨害物質を前記安定化抗体と反応させるため
    に、前記反応器具の前記反応チャンバーに前記生物液体
    試料を加え、当該妨害物質と当該安定化抗体との選択的
    免疫反応を生じさせ、 （iii）前記被検体を含む実質的にすべての非反応体
    を、フィルターを通して前記反応チャンバーから除去し
    て前記回収チャンバーに移し、その際、前記安定化抗体
    に結合した妨害物質は、前記反応チャンバー中に保持
    し、且つ （iv）前記被検体を含む非反応体について、当該被検体
    の臨床アッセイを行う 段階を含んでなる方法。
  2. 【請求項２】前記段階（ｉ）の前に、前記生物液体試料
    中に存在する前記妨害物質の実質的にすべてと免疫反応
    するのに十分な量の前記安定化抗体を前記反応チャンバ
    ーに加える段階を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記安定化抗体が固定されている、請求項
    １又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記安定化抗体が凍結乾燥されている、請
    求項１又は２に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記妨害物質が、ビリルビン及びヘモグロ
    ビンからなる群から選択される、請求項１に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】前記臨床アッセイが、あるクラスに属する
    分子に適用可能であり、ここにおいて、前記被検体は、
    そのクラスに属するある一種の分子であり、前記妨害物
    質は、そのクラスに属する他の種の分子である。請求項
    １に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記被検体が、ある目的リポタンパク質ク
    ラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他の
    リポタンパク質クラス中のコレステロールである、請求
    項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記被検体が、ある酵素のある目的アイソ
    ザイム（イソ酵素）であり、前記妨害物質が、当該酵素
    の目的としないアイソザイムである、請求項６に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】前記被検体が、ある目的免疫グロブリンで
    あり、前記妨害物質が、他の免疫グロブリンである、請
    求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記被検体が、乳酸デヒドロゲナーゼの
    ある目的アイソザイムである、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記被検体が、クレアチンキナーゼのあ
    る目的アイソザイムである、請求項８に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記被検体が、アミラーゼのある目的ア
    イソザイムである、請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記被検体が、アルカリ性ホスファター
    ゼのある目的アイソザイムである、請求項８に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】前記被検体が、酸性ホスファターゼのあ
    る目的アイソザイムである、請求項８に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記反応チャンバーが、前記生物液体試
    料を収容するための第一部分と、当該反応チャンバー中
    の諸成分が出入りするための第二部分とを含んでおり、
    ここにおいて、前記フィルターは、前記反応チャンバー
    内において第一部分と第二部分との間に設置されてお
    り、ここにおいて、前記回収チャンバーは、当該第二部
    分と液体で連絡し、且つ、前記段階（iii）は、前記妨
    害物質を非反応体から分離させ、一方、前記安定化抗体
    と反応した前記妨害物質を前記フィルターによって前記
    反応チャンバー中に保持させるために、前記反応器具を
    遠心分離する段階であり、ここにおいて、前記非反応体
    は、前記フィルターを通過し濾液として回収チャンバー
    に移る液体中に含まれている、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記被検体が、ある目的リポタンパク質
    クラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他
    のリポタンパク質クラス中のコレステロールである、請
    求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記安定化抗体が不溶性担体上に固定さ
    れている、請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記安定化抗体が、可溶性高分子量担体
    に結合されている、請求項15に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記安定化抗体が凍結乾燥されている、
    請求項15に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記反応チャンバーが、第一部分と第二
    部分とを含んでおり、ここにおいて、前記反応チャンバ
    ーは、液体が交互に当該反応チャンバーに吸い込まれた
    り当該反応チャンバーから排出されたりできるように、
    正及び負の差圧を当該反応チャンバーに供給するための
    第一部分と液体で連絡した差圧手段を含んでおり、前記
    液体は、前記反応チャンバーの第一部分から排出され、
    次に、第二部分とフィルターを通って前記回収チャンバ
    ーに移る、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記臨床アッセイが、あるクラスに属す
    る分子に適用可能であり、ここにおいて、前記被検体
    は、そのクラスに属するある一種の分子であり、前記妨
    害物質は、そのクラスに属する他の種の分子である、請
    求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記被検体が、ある目的リポタンパク質
    クラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他
    のリポタンパク質クラス中のコレステロールである、請
    求項20に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記安定化抗体が不溶性担体の表面上に
    固定されている、請求項20に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記安定化抗体が、可溶性高分子量担体
    に結合されている、請求項20に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記安定化抗体が凍結乾燥されている、
    請求項20に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記フィルターが、前記反応チャンバー
    に脱着可能に取付けられ得、且つ、前記段階（iii）
    が、前記反応チャンバーの内容物を前記差圧手段を用い
    て当該フィルターに向って排出することによって実現さ
    れる、請求項20に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記被検体が、ある目的リポタンパク質
    クラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他
    のリポタンパク質クラス中のコレステロールである、請
    求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】被検体のアッセイを妨害するような物質
    の存在下で生物液体試料中の被検体を検出するための使
    い捨て反応器具にして、 （ａ） 前記生物液体試料を入れるための反応チャンバ
    ー、 （ｂ） 前記妨害物質に対する安定化抗体であって、前
    記反応チャンバー内に配置された安定化抗体、 （ｃ） 前記反応チャンバーの出口において、当該反応
    チャンバーの内容物を濾過するためのフィルター、ここ
    において、当該フィルターは、前記反応チャンバーと液
    体で連絡し、液体と未反応の被検体を通過させる大きさ
    の孔を有する、及び （ｄ） 前記被検体を含む非反応体を収容するための回
    収チャンバー、ここにおいて、前記反応チャンバーは、
    この回収チャンバー内に配置され得る を含んでなる器具。
  29. 【請求項２９】前記アッセイが、あるクラスに属する分
    子に適用可能であり、ここにおいて、前記被検体は、そ
    のクラスに属するある一種の分子であり、前記妨害物質
    は、そのクラスに属する他の種の分子である、請求項28
    に記載の器具。
  30. 【請求項３０】前記被検体が、ある目的リポタンパク質
    クラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他
    のリポタンパク質クラス中のコレステロールである、請
    求項28に記載の器具。
  31. 【請求項３１】前記被検体が、ある酵素のある目的アイ
    ソザイム（イソ酵素）であり、前記妨害物質が、当該酵
    素の目的としないアイソザイムである、請求項29に記載
    の器具。
  32. 【請求項３２】前記被検体が、ある目的免疫グロブリン
    であり、前記妨害物質が、目的としない免疫グロブリン
    である、請求項29に記載の器具。
  33. 【請求項３３】更に、前記安定化抗体が固定されている
    不溶性担体を含む、請求項28に記載の器具。
  34. 【請求項３４】更に、前記安定化抗体が結合している可
    溶性担体を含む、請求項28に記載の器具。
  35. 【請求項３５】前記安定化抗体が凍結乾燥されている、
    請求項28に記載の器具。
  36. 【請求項３６】前記反応チャンバーが、前記生物液体試
    料を収容するための第一部分と、当該反応チャンバー中
    の諸成分が出入りするための第二部分とを含んでおり、
    ここにおいて、前記フィルターは、前記反応チャンバー
    内において前記第一部分と前記第二部分との間に設置さ
    れており、前記回収チャンバーは、当該第二部分と液体
    で連絡する、請求項28に記載の器具。
  37. 【請求項３７】前記被検体が、ある目的リポタンパク質
    クラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他
    のリポタンパク質クラス中のコレステロールである、請
    求項36に記載の器具。
  38. 【請求項３８】前記反応チャンバーが、第一部分と第二
    部分とを含んでおり、ここにおいて、前記反応チャンバ
    ーは、液体が交互に当該反応チャンバーに吸い込まれた
    り当該反応チャンバーから排出されたりできるように、
    正及び負の差圧を当該反応チャンバーに供給するための
    前記第一部分と液体で連絡した差圧手段を含んでおり、
    前記液体は、前記反応チャンバーの当該第一部分から排
    出され、次に、前記第二部分を通り、その後前記フィル
    ターを通って前記回収チャンバーに移る、請求項28に記
    載の器具。
  39. 【請求項３９】前記回収チャンバー及び前記フィルター
    が、前記反応チャンバーに脱着可能に取付けられ得る、
    請求項38に記載の器具。
  40. 【請求項４０】前記被検体が、ある目的リポタンパク質
    クラス中のコレステロールであり、前記妨害物質が、他
    のリポタンパク質クラス中のコレステロールである、請
    求項38又は39に記載の器具。
  41. 【請求項４１】更に、前記安定化抗体が固定されている
    不溶性担体を含む、請求項38又は39に記載の器具。
  42. 【請求項４２】更に、前記安定化抗体が結合している可
    溶性高分子量担体を含む、請求項38又は39に記載の器
    具。
  43. 【請求項４３】前記安定化抗体が凍結乾燥されている、
    請求項38又は39に記載の器具。
  44. 【請求項４４】前記安定化抗体の量が予め決められてお
    り、しかもその量は、前記妨害物質が完全に免疫反応す
    ることにより、前記反応チャンバーに入れられることが
    予想されるどのような生物液体試料からも当該妨害物質
    が除去されるのに十分な量である、請求項38又は39に記
    載の器具。
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