JPS60501425A - 生物に由来する水溶液中のコロイド粒子の特異的除去の後に分析質を直接検出する方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物に白米する水浴敏中のコロイド粒 子の特典的除云の友に分子ｒ質を直接恢不発明は、億々のフラクションで生物学 げＪポリマー（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ’　）　Ｋ　結ＱしてｇＥ物に日米する漱 不中ｒ（存在し、この１７ラクシヨンの′４で定圧１３′り及び／又は定型的に 測定すべき１分析負（Ａｎａｌｙｔｓ　）を検出するための方法に闇する。この 方法の原理は、人ｍｍのリボ蛋白質電の脂質の実験の例で絖明ざｎ、る。

７Ｘに小俗の脂肪、トリグリセリド、コレステリン及び牌脂負は、人、［［ＩＬ 架の７に注媒中で、ミセル須１以戟分皿溝リボ蛋日實中に移送さ几る。ヒトの空 腹時血清中には種々のリボ蛋白５ＪＬ８＋が検出できる。これらは、すべて、ト リグリセリド、コレステリン、牌カσ質及び爵建の蛋白質いわゆるアポリポ蛋Ｅ ４質を含有している。人ゝ血清甲に検出し５る三大リボ蓋白質ｉ＋は、その比重 が異なる。従ってこれらは超世田皮すボ鈑白質Ｌ　ＶｅｒｙＬｏｗ　Ｄｅｎｓｉ ｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅ、　：　ＶＬＤＬ　）、ｔＷ［リボ蛍白質（Ｌ ｏｗ　Ｄｅｎａｉｔｙ　Ｌｉｐｏ、ｐｒｏｔｅｉｎｅ、　：　ＬＤＬ　）及び高 密、度リボ蛋白３ｉ　、（Ｈｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｅ　：　ＨＤＬ　）と称される。アηでリボＭｉ　Ｅ４Ｊ［も同体に略字で識別 さχ【る櫨々の評に労けらｎる〔例えば、アポリポ黛白貴Ａ（Ａｐｏ−人〕、ア ポリボ蛋白質Ｂ　（Ａｐｏ　−Ｂ　）、アポリボ蛋白’ＸＣＣＡｐＯ−Ｃ）、ア ポリポ黛白誓Ｄ　（Ａｐ。

−Ｄ）、及びアポリボ蛋白質ＢＨ（Ａｐｏ　−ｎ　）　’Ｊ。奇似的に、これら アポリポ黛白買群は、大抵、１群ではなく多くのりが蛋白質群に分配されている 。例えばＷａＬはＡｐｏ　−Ａ、　Ａｐｏ　−Ｂ、　Ａｐｏ　−Ｃ＆びＡｐｏ　 −Ｅ　′？：す４’ｊし、ＨＤＬを工Ａｐｏ　−Ａ、　Ａｐｏ　−Ｃ及びＡｐＯ −Ｅをざ有する。これに反して、ＬＤＬはもつほらＡｐＯ−Ｂ　Ｙ′ざ有する。

個々のリボ蛋白質群の病原的に′！＆は、皿當壁甲の脂肪、殊にコレステリンの 沈着に胸して異なる。ＬＤＬは大部分コレステリンから成る。血ぎ中のコレステ リンの沈着（アテログ不一ゼＡｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｅと称きｆ＋る過程）への その関与は最大でめることが雑誌さｎている。ＨＤＬは、燐脂買か多い。こ眉は 皿営の＃Ｉ胞からコレステリンを取り出し移送除去することを可能とする。

従って、これには、抗−アテロ＼人ゲンｒ′「用が汀Ｎ２゜れる。

臨尿化学検肴において、血漿又は血清中の高いＬＩＩＬ−磯度を有する人は、心 臓俯壌医患を起こしや丁い危険性が尚（、高いＨＤＬ−一度ケ有する人は、明ら かに発作の危険が僅かでｂる。従って、実験医学的診断学にとって、血清中の乍 コレステリンの測定だけでレエ７．Ｃ（、ＬＤＬ−フラクション中のもしくはＨ Ｄ、Ｌ−７ラタシヨン甲のコレステリンの測定も、人の地線σ）尺度υ）予知評 価のためには重要であることが立証された。殊に、ＬＤＬ１４’のコレステリン の測定は、極めて重要でめる血漿又は血清からのＩＬＤＬ−コレステリンの測距 は、通例＋１ｉｌｉ＠せ法で、例えばＭ遠心及び特休央験呈同でのポリアニオン 沈殿〔リピド、リサーチ・クリエックス鶴プログラム（ＬｉｐｉｃＬ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｃ１１ｎｉｃｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ〕、ＤＨｊｆｌｉＶ　Ｐｕｂｌｉｃ ａｔｉｏｎ　Ａ（Ｎ工Ｈ）７５〜６ン８、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａ、（１９７４ ）Ｊ又は血清中の全コレステリン、全トリグリセリＰ及びＨＤＬ−コレステリン の絨度からフリーデワルド（Ｐｉθｄθｗａｌｄ　）の式を用いる計算により来 施される〔クリニック・ケミストリイ（Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、）　ｉ　８．４９９（１９７２）参照Ｊ０こｒｒらの方法の大魚ば、 測定１区の１＆１１級的伸」定に基つく。それとい５のも、この際にほすべての 紳」定誤差かＬＤＬ−コンステリンに関する値の計算に人つ込むρ）らでめる。

意外にも、被検試料から、脂質をも含有する７Ｊ）、機構リボ蛋白質フラクショ ンには構しないリボ蛍白ｉ粒子″４−特異Ｉｆｆな免役反応により除去する際に 、待矩のリボ蛋白質フラクション中の脂質例えはコレステリンの直接測定が優れ た方法で失りできることか確認された。この方法は、その試薬が、もっばら除去 丁べきリボ蛍白質に対して回いている免役化学Ｉｊ：Ｊ符性タ荷することを前提 としている。例えばＡｐｏ　−Ａ及びＡｐｏ　−Ｃに対する免役化学灯り特性を 刊する純系は、Ａｐｏ−Ａ及びＡｐｏ　−Ｃを含有するＶＬＤＬ−及びＥ（ＤＬ −粒子と反応する。これに反して、アポリボ蛋白質を含有しないＬＤＬ−粒子と は反応しない。特異的免役化学的反応を用いてＸ試料中に存在する揮々のリボ蛋 白質群は相互に分−することができる。従って、残貿浴漱甲の脂負言、分は、免 役試薬が測定に起影１＃を及はさない菫の開運の脂＊を官有する前提のもとで、 未反応のリボ蛋白質フラクションの脂質言分に相当する。従って、この泗貿俗液 から、場合によってはを愼の考ムのもとに、脂質言分を直接測定することができ る。抗体合成のために免役化されるすべての動物種の血漿は、人血清中の相応す る分析−の定量は”Ｉ検出に影響を及ばずはずの生理学的脂ｌｘを官有するので 、これを予め免役試薬から除去し７：ければならない。当業者にＩＢじらｎ６て いるように、免役沈殿は、４℃〜４２−Ｇで、５〜９有オリに２５００及び−７ 〜８．６で行なわれる。

比敷検簀で４Ｍ耐されたように、前記１沃で笑ゐされている、例えは正常もしく は僅かに高い脂買鍼皮ン有する人に由来する血清又は血漿からのＬＤＬ又はＬＤ Ｌ甲のコレステリンの直接測定の分析端は、慣用万仄馨用いる測定と極めて一致 する。高い脂′ｉＬ一度体に尚いトリグリセリド績度では、別々の血清又はｍ！ Ｉｆ中のリポ蛋白貴フラクションのこの分離は、面相に結合していないＩｉｃ梁 を用いる免役沈殿により分−を冥應する芸には不完全である。従つ℃、この浣駅 ン、リボ蛋日貴校子のコロイド化学的安定性を低める１櫨以上の酵素の存在で笑 顔する際に有利であることが判明した。同時の；＃集的地理により、７１お俗解 した免投憤台体が同保忙沈殿され５る。

このために、櫨゛々の酵素の使用は有利でりることが判明した： ＩＯ３，２，１，１８ノイラミニダーゼＥＣ３，４，２２，２パパイン ”Ｃ３，４，２１，４プロナーゼ ｇｃ　３．１．４．１２　スフィンゴミエリナーゼＩＣ３，１，４，３ホスホリ バー−ｔ！’ＣＥＣ３，１，１，１３コレステリンエステラーゼ゛ＫＣ３，１， １−３）リグリセリドリバ〜ゼＥＣ３，１，１，１カルボキシルエステラーゼ測 定のために必要なｃＦＰ系麓は、免役沈殿の万人及びそれぞれの＃累の特異性及 び活性により次められる。

本＠明のも５１つの昧過は、成体中の１分析質のう１続（直接検出のために、水 浴液中の妨害性成分を遇択的忙除去するための試薬でるる。この拭娯は、この検 ｍＫＦｊ害注の成分に対する仇体乞含有することを特叡としている。これに反し て、これは、検出すべき分析質を含有しないが又は試料清液中の分析質の一度の 定量検出のための寄与をｉｆｔ算により考厘することのできるだけの童で官有す る。この抗体のＶ異性は、この方れそれの妨害性であり、従って除去すべき成分 に対して向いている。この際、この抗体は、この試薬生麺に。

俗解して存在していてよいか又は、同相に結合していてもよい。

Ｋ科′＃！漱の妨害性成分を免役沈殿により除去する場合に１この試薬は、妨害 性成分の衣面脣注を免役沈殿に好適になるよ５に変える１櫃以上の酵素を百五す るのが有オリでめる。使用＃素は、この万広の夾鬼の説明で％：記されるものに 相当する。児役吸盾による試材の仕上げの場合に、当業者に公知の仇体面足用の 同相（セルロース、セファロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ｉ？１ １４両さｎた多孔性ガラス尋）か使用可能であると判明した。

この方法の利点を次の例で説明する： 丙　１ トリグリセリドの少ない人血清な５μＣにヒトアポリポ款白質ＡＫ対する抗体を 有するウサギの脱脂負血清各５０μｍ！を混合した。室温で１時間味付の僕に、 混合物を実験室遠心機中で遠ノｂ分隘し、上置み漱中のコレステリン言分を慣用 の酵素側足法で測定した。同じ血清から、慣用の８遠ノし・及びポリアニオンＬ ｍの技術を用い、かつフリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｗａｌｄ　）による方法を用 いてＬＤＬ−コレステリンの言分ヲ測定した。

遣々のｍ溝試料の測定結果を比較θ）ために第１衣に￥げる。

例　２ 血清各ｓｏｉ？Ｉｔｏ、１ｓモルＮａＣＬ各１１Ｌｌで稀釈した。この浴液中で 、ヒト−Ａｐｏ　−Ａに対する抗体を官有するセファロースに結合した免役グロ グリン７ラクシヨンを懸濁させ、この浴液を１５分間戦（振り１面相ヲと心労離 し、上置み＠液中のコレステリン含分な化学的方法〔テクニツク・ビュレチン（ Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｂｕｌ−１θｔｉｎ　）　Ｎ　２４ａｓタリタウン（Ｔａ ｒｒｙｔｏｗｎ　）　１９７２年〕で側だした。結果を第１表のＬＤＬ−コレス テリンの測定と比較した。

例　６ 例２に記載の皿′ｆＰ！稀釈物５００μｌをセファロースに結合した同じ免役グ ロブリンを有する小カラムを通してクロマトグラフィにかげ、府岨赦”Ｐのコレ ステリン含分を測定した。クロマトグラフィによりＰＡ足さ扛た稀釈物の測定の ために、クロマトグラフィの前に前液に硝茄された塩化リチウム言分馨は離の前 及び後に但す足した。この実験の結果を第１表に稲光した。

例　４ 正常の又は病的に高められたコレステリン及び／又はトリグリセリドを含有する ６６のｉ々の血清ヲ、ヒトのアポリポ蛋白ｆＪＪＬＡ及、びＣＫ対する抗体及び ノイラミニダーゼ（１ＱｍＵ　）を２百封するＩｂ？、脂質仇皿稍を用いて例１ の記載と同様に央崩した。結果をフリーデワルド法でのＬＤＬ−コレステリン御 」頑と比較した。双万８ の測定法の間の相関係数は次のとおりであった：ｒ’　７””０．８９に＋０． ０７８の回帰ノ際に０．９７（ｙ：　免疫沈殿後のコレステリン濃度Ｃｊ９／Ｉ ｔ’）：Ｘ：　フリーデワルド式からの計算によるコレステリン濃度（ｇ／ｌ　 ）Ｊ。

例　５ 例１の記載と同じ方法で、人血清をトリグリセリドリパーゼ（５００ｆｎ［Ｊ） 及びカルボキシエステラーゼ（５Ｕ）の存在において、ヒ）　−Ａｐｏ、　−Ｂ に対する脱脂質抗血清と混合した。１時間後に混合物を遠心分版し、上澄み中の コレステリンの含分娶副だした。精米を第２表で、完全血液からのポリアニオン 沈殿によるＨＤＬ−コレステリン絢定の参考法と比教した、これら実施例の結果 は、本発明方法の檀々の変法を用いて、特定の免疫学的特性を胃する脂質不含の 拭系と反応しない人血清のリボ蛋白３１［群中のコレステリンの精確な直接測定 が、最小臥料童から、柱責のかル・る′ｊＡｗｅ工業的補助手段を用いることな しに町Ｕεでのることを示している。もちろん、他の脂質例えはトリグリセリド 又は燐脂質の含分の１１４定も同じリボ薫白貿ンラクション中で可能である。そ れというのも、この試業中にはこれら脂質も妨讐性には官有されていないからで ある。従って、この方法は、臨床化学的な脂肪代師障害の示差診断にとって著る しい利点を示し、殊にこの紺分析論は、慣用方床よりも着るしく聞手かつ社費特 表昭ＧＯ−５０１４２５（４） 的に好適である。

血清リボ蛋白質の分析論の例で説明さ几るこの方法の原理は、好適な奇異聞免役 特徴を有する試業乞用℃・る類似方法で、供物に白米する他の液体（例えば細胞 培養液、尿、リキュール等）甲の種々の免投原特性を有する生物学的ポリマー（ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ　）に納会している１分析質の横歪のために、問題す（、 分析又は準備の目的に使用することができる。

第　１　表 ＬＤＬ−コレステリンの測定 １　ｕ　ｎ＋　ｙ　ｖ ５、Ｑ９１１／１１　５．４１／７　５．２１　Ｅｌ／ｌ　５．５４１／ｉ　５ ．３４１１／１１−６６　’／　１．２０　／／　１−１９７／　１．１５　’ ｐ　１．０９　ｐｌ、６７　／／　’１．５３　ＩＩ　１．３２　／／　１．２ ４　／／　１．６２　ｌ／１−４８　／／　１．４７　Ｎ　１−４５　／／　１ ．４２　／／　１．３５　ｔｔＬ２４　ｔｔ　１．３０　ｓ　ｉ　二１２　ｔｔ 　１．０５　〃　１．０５　ｌ／１．１１　ｌ／１．２５　＃　１．１９１／　 １．４０　／／　１．１５　ｌ／１．１８　ｔｔ　１．１０　＃　１−１２　ｔ ｔ　１．２２　ｔｔ　１．２４　ｔｔｌ、４５　＃　１．４０　＃　１．３２　 ｐ　１．２５　ｗ　］、３５　ｔｔ２．１４　／／　２．２２１／　１．９１１ １１　＃　２．６０　／／　１．９５　ｌ／１−０１　１　１−０２　’　０． ９５　／／　１−１０　ｐ　Ｄ−９６／／１　：　ＬＤＬ−コレステリン（超遠 心による）１　：　ＬＤＬ〜コレステリン（フリーデワルドによる）■：コレス テリン、（＠１０万故による〕１ｖ：コレステリン（列ンの方法すしよる）Ｖ： コレステリン（例６の方法による）第　２　表 血清　１　ｊｌ ｊ　［１，４００めｌ／１　０．４３０ｆｔＬ１．２２０　１／　０．２６０　 ｌ／０．４２０　＃　０．４６０　ＩＩ Ｏ，３５０１Ｕ、３３ｔＪ　〃 ０．７６０　１　０．ｄ２０　〃 ０．３２０　１　０．３３［１＃ ０−５７０　＃　０．６６０　／／ ［＋、２８０　＃　Ｌｌ、３Ｕ０　１／ＬＬ６４０　１　Ｌｌ、７３０　ｌ／ ０．５８０　／／　１３．６５０　１／１：燐タングステン戚／　ＭｇＣｔ２’ に用いる沈殿の波の血清中のコレステリン一度 Ｉ［ニド　リグリセリドリパーゼ（ｆｆｉｃ３−１　−１−３）及びカル４ぐキ シルエステラーゼ（ｇｃ６．１−１．１）の存在に２けるアポリポ鈑白負ＢＫ対 するガンマグロブリンとの免役沈殿の後の血清中のコレステリン一度 図面の簡単な説明 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物に由来する水性液体の暫定フラクションから１分析質を直接測足するた めに、この分析質を同僚に含有する他の７ラクシヨンを免疫反応により除云し、 引ａぎ化学的又は生化学幻方法ヲ用いてこの分析質の直蕨検出を笑施することを １＃倣とする、供物に出来する水性液体の特定フラクションから１分析室′ｊｋ 直接測定する方法。 Ｚ　分析質の検出を妨けるフラクションの除去を、％異的抗体を用いる免役沈厳 又は兜投吸層により付な５、請求の範囲第１項記載の方法。 ６、除去すべき７ラクシヨンは、アポリポ黛白’ＪｊＡ又はＣ又は双方を共に官 有し、アポリボ蛋白質Ａ又はＣに対する抗体又はアポリボ蛋白質Ａ及びＣに対す る抗体と免疫反応を行なフリポ薫白負でぬる、請求の範囲第２項記載の方法。 ４、除云すべき７ラクシヨンは、アポリボ蛋白質６を官有し、アポリポ蓋白質Ｂ に対する抗体と免疫反応を行うリボ蛋白質でるる、請求の範囲第２項記載の方法 。 ５、更に、除去すべきフラクションのコロイド化ｆ的安定性を低下する作用をす る１遣以上の酢系を使用する、請求の範囲第１稠から第４唄までグ）いず几か１ 項に記載の方法。 ６、　酵素として、ノイラミニダーゼ、プロナーゼ、／（’　バイン、トリグリ セリドリパーゼ、カルボキシルエステラーゼ、コレステリンエステラーゼ、スフ インゴミエリナーゼ、ホスホリパーゼ又はこれらの混合物を特徴する請求の範囲 第５Ｊ：Ａ・に記載の方法。 ｌ　生物に由来する水性成体の特定フラクション中の１分析質を直接検出するだ めの試薬において、こｎは、この分析質を官有しないか又はこの分析質の足型測 定の考慮の隙に悪影Ｊｗ乞及はさ７．Ｃい童でｔ［ｉ−ることを特徴とする、生 物に由来する水性液体の特定７ラクシヨン中の１分析ｌｘを直接検出するための 試薬。 ａ　暫定フラクション中の１分析質の検出を妨げ、除六丁べき７ラクシヨンの免 疫原性デテルミナントに対して向いている奇異抗体を特徴する請求のａ１第７項 記載の試薬。 ９　アポリボ蛋白質Ａ又はＣに幻する抗体又はアポリポ鍬白質Ａ及びＣに河する 抗体を官有する、側ボの範囲第７唄又は第８項記載の、へ皿漿又は置溝からアポ リボ蛋白質Ａ又はＣ又にこれら双方を共にざ有するリボ蛋白質を除去するための 試薬。 １０、アポリポ蛋白質ＢＫ対する抗体な官有する、請求の範囲第７項又は第８項 に記載のアポリボ蛋白’ＩＢ含有リポ蛋白質を除去するためのｐ；栗。 １１、妨害性フラクションを除去するにめのうＬ体は酵解して又は固体相＆’Ｍ せしている、請求の範囲第７唄から第１０項までのいずれか１項に記載の試薬。 １２．付加的に、除去すべきフラクションのコロイド安定性を低下する作用を有 する１橿の醇巣又は酵素混合物を含有する請求の範囲第７項から第１１項までの いずれか１項に記載の試薬。 １３、酵素として、ノイラミニダーゼ、プロナーゼ、トリグリセリドリパーゼ、 カルボキシルエステラーゼ、コレステリンエステラーゼ、スフインゴミエリナー ゼ、ホスホリパーゼ又はこれらの混合物乞含有する、請求の範囲第１２項記載の 試薬。