KR101805927B1 - 검체의 전처리 방법, 및 생체 관련 물질의 측정 방법 - Google Patents

검체의 전처리 방법, 및 생체 관련 물질의 측정 방법 Download PDF

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Abstract

(과제) 제 1 담체인 자성 입자에는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정되어 있고, 이 자성 입자가 검체에 혼합되어 현탁된다. 현탁 후, 피펫팁에 현탁액이 빨려 올라가 자석이 피펫팁에 근접한다. 비특이적 반응 인자가 결합한 자성 입자를 자석에 의해 원격적으로 구속하고 잔액을 웰에 배출하여 검체에 함유되는 협잡물의 제거 처리가 종료된다. 웰에 배출된 처리가 완료된 검체는 면역학적 측정에 제공된다. 처리가 완료된 검체에 항체가 고정된 자성 입자가 혼합되어 현탁된다. 현탁액이 피펫팁에 빨려 올라가 자석을 사용하여 항원이 결합한 자성 입자가 분리된다. 항원이 결합한 자성 입자는 세정되어, 제 2 담체를 함유하는 효소 표지화액에 혼합 현탁된다. 현탁 후, 표지화되어 항원이 결합한 자성 입자는 기질액에 혼합되어, 발광 강도 등이 측정된다.

Description

검체의 전처리 방법, 및 생체 관련 물질의 측정 방법{METHOD FOR PRETREATING SPECIMEN AND METHOD FOR ASSAYING BIOLOGICAL SUBSTANCE}
본 발명은 생체 관련 물질을 함유하는 검체를 측정에 제공하기 전에 전처리하는 방법, 및 검체 중의 생체 관련 물질의 측정 시스템에 관한 것이다.
모노클로날 항체 제조법이 확립된 이래, 검체 중에서 목적하는 생체 관련 물질을 측정하는 방법으로서, 엔자임 이뮤노 엣세이 등의 면역학적 측정법이 주요한 측정법으로 되어 있다. 이와 같은 면역학적 측정법은, 높은 특이성을 갖기 때문에 직접 측정이 가능해지고, 또한 고감도로 측정할 수 있다. 그리고 최근, 이들 측정법은, 채취한 검체의 세트 후부터 측정 결과를 얻을 때까지 측정 시스템에 의해 자동화되어 있다. 또, 측정을 보다 신속화하기 위해서, 종래보다 고상화 항체나 콘주게이트의 농도를 높인 시약이 개발되고 있다. 그러나, 보다 고농도의 시약을 사용함으로써, 종래 측정시에 관계하지 않았던 비특이적 반응이 일어나는 경우가 많아졌다.
비특이적 반응의 원인으로서, 대상 물질의 다양성, 면역 유사 물질의 존재, 항원의 다양성, 나아가 항체의 다양성이 고려된다. 면역학적 측정계에는 여러 가지의 비특이적 반응을 일으키는 물질로서 IgA, IgM, IgG 형의 이호 (異好) 항체 (이종 동물간에 반응하는 항체 : HAMA 항체, BSA 항체 등), 생체 성분 (예를 들어, 류머티즘 인자, 클리오글로블린, M 단백질 등) 이 존재하여, 면역학적 측정에 있어서 비특이적 반응의 결과로서 위양성을 나타내는 경우가 있다 (비특허문헌 1, 2, 3 참조). 또한, 세균의 표면에는 당 사슬 등의 암 관련 항원이 존재하기 때문에, 세균에 감염된 증례에서는, 암으로 이환하고 있지 않음에도 불구하고, 암의 검사에 있어서 위양성을 나타내는 경우가 적지 않다. 또한, 암환자에게서 장기를 적출할 때의 수술 중의 세균 감염 등에 의한 비특이적 반응에 의해 위양성을 나타내는 경우도 있다.
또, 임신시나 간장, 신장 등의 질병 이환시에 비특이적 반응이 일어나는 경우가 많다. 또한, 최근 개발되고 있는 상당수의 시약에 리콤비넌트 항원이 사용되고 있는데, 이들 리콤비넌트 항원의 제조시에 사용되고 있는 세균 성분의 존재에 의해, 이들 세균에 대한 항체가 측정계에 영향을 미치는 것도 알려져 있다. 일반적으로, 면역학적 측정을 실시할 때에 이들 비특이적 반응 물질에 대한 저해 물질이 더해지는데, 시약 중에 더해지는 양에는 한도가 있기 때문에 반드시 충분히 만족스러운 저해 효과가 얻어지는 것은 아니다. 이 때문에, 현재 사용되고 있는 측정 시스템에서는, 비특이적 반응 인자를 제거하는 것이 곤란하여, 비특이적 반응을 충분히 저해시켜 측정하는 것은 곤란하다.
Marlen Bouillon, et al.Reduced frequency of blood donors with false-positive HIV-1 and -2 antibody EIA reactivity after elusion of low-affinity nonspecific natural antibodies.TRANSFUSION. volume 42 August 2002 1046-1052. Johan Bjerner, et al.Incidence and Prevention.Clinical Chemistry. 48 : 4 613-621 (2002). Michael Covinsky, et al.An IgM λ Antibody to Escherichia coli Produces False-Positive Results in Multiple Immunometric Assays Michael Covinsky.Clinical Chemistry. 46 : 8 1157-1161 (2000).
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로, 측정에 제공되는 검체 중에서 협잡물을 미리 제거할 수 있는 전처리 방법, 및 당해 전처리된 검체를 사용하는 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, 검체를 전처리 한 후에 측정을 실시함으로써 고감도로 생체 관련 물질을 측정할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉 본 발명은,
검체 중의 생체 관련 물질의 측정 시스템으로서,
검체에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질, 그 협잡물을 불활성화하는 물질, 또는 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체와,
생체 관련 물질의 검출용 시약이 고정된 담체, 및 생체 관련 물질의 검출용 시약을 고상화하여 이루어지는 담체에서 선택되는 제 2 담체를 구비한 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명에 있어서는, 생체 관련 물질은, 항원 혹은 항체이거나, 또는 핵산이어도 된다.
또, 검체 중의 협잡물은 비특이적 반응 인자이어도 되고, 비특이적 반응 인자는, 면역 글로블린, M 단백질, 이호 항체 및 류머티즘 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개이어도 된다.
제 1 담체로서는, 예를 들어, 자성 입자, 겔, 수지 및 멤브레인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 들 수 있다. 또, 이 자성 입자는 분주 (分注) 노즐에 장착되는 분주팁 내에 수용 가능한 것이 바람직하고, 이 경우, 이 자성 입자를 사용하여 분주팁 내에서 분리, 세정, 현탁 등의 처리를 실시하는 것이 바람직하다.
또, 생체 관련 물질의 검출용 시약은, 상기 생체 관련 물질에 대한 표지 항원 혹은 표지 항체, 또는 상기 생체 관련 물질의 증폭용 프라이머 및 프로브를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양태에서는, 검출용 시약의 고상화는 동결 건조에 의해 실행하는 것이 바람직하다.
또, 검체, 제 1 담체, 및 제 2 담체는, 각각 별개의 웰 또는 팁 등의 수용부에 수용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 시스템은 검체를 수용하는 수용부 (웰 또는 팁) 와, 제 1 담체가 수용된 수용부와, 제 2 담체가 수용된 수용부를 대략 직선 형상으로 배열한 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 시스템은 검체를 수용하는 검체 수용부와, 제 1 담체가 수용된 수용부와, 제 2 담체가 수용된 수용부를 일체적으로 카트리지화한 것을 특징으로 한다.
상기 시스템에 있어서, 수용부는 밀폐 가능하게 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 카트리지는, 검체에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질, 그 협잡물을 불활성화하는 물질, 또는 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 미리 수용한 수용부와, 생체 관련 물질의 검출용 시약이 고정된 담체, 및 생체 관련 물질의 검출용 시약을 고상화하여 이루어지는 담체에서 선택되는 제 2 담체를 수용한 수용부와, 검체를 수용하는 검체 수용부를 구비한 것을 특징으로 한다.
상기 카트리지에 있어서, 제 1 담체는 자성 입자인 것이 바람직하다.
또, 이 카트리지에 있어서, 고상화는 동결 건조에 의해 실행하는 것이 바람직하다.
이 카트리지에 있어서, 수용부는 밀폐 가능한 것이어도 된다.
또한, 이 카트리지는 검체를 수용하는 검체 수용부와, 제 1 담체가 수용된 수용부와, 제 2 담체가 수용된 수용부를 대략 직선 형상으로 배열한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전처리 방법은 검체 중의 생체 관련 물질을 측정하기 전의 검체의 전처리 방법으로서, 검체 중에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질, 그 협잡물을 불활성화하는 물질, 또는 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 이용하여 상기 검체를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
또한, 본 발명의 전처리 방법은 생체 관련 물질의 검출용 시약이 고정된 담체, 및 생체 관련 물질의 검출용 시약을 고상화하여 이루어지는 담체에서 선택되는 제 2 담체를 조제하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 전처리 방법에 있어서, 생체 관련 물질은 항원 혹은 항체, 또는 핵산이어도 된다.
협잡물로서는, 예를 들어, 비특이적 반응 인자를 들 수 있다.
또, 비특이적 반응 인자는 면역 글로블린, M 단백질, 이호 항체, 및 류머티즘 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개이어도 된다.
제 1 담체로서는, 예를 들어, 자성 입자, 겔, 수지 및 멤브레인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 들 수 있다.
또, 생체 관련 물질의 검출용 시약은, 상기 생체 관련 물질에 대한 표지 항원 혹은 표지 항체, 또는 상기 생체 관련 물질의 증폭용 프라이머 및 프로브를 포함하는 것이 바람직하다.
또, 이 전처리 방법에 있어서는, 고상화는 동결 건조에 의해 실행하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서는, 전처리된 검체를 측정 디바이스에 제공하여, 검체 중의 생체 관련 물질을 측정해도 된다.
또, 측정은 면역학적 측정 또는 핵산 증폭법에 의한 측정이 바람직하다.
핵산 증폭법으로서는, 예를 들어, PCR 법, 또는 등온 증폭법을 들 수 있다. 핵산의 증폭시에는, 미네랄 오일 등의 소수성 유체에 의해, 표적 핵산 함유 용액과 증폭 시약의 혼합물을 웰이나 팁 등의 수용부 내에 시일 (밀봉) 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 검체의 전처리와 이 처리된 검체의 측정은 연속하여 실행할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산 증폭 장치에서는,
(a) 검체를 수용하는 검체 수용부와,
(b) 검체로부터 표적 핵산을 보충하는 포착 입자를 수용하는 제 1 수용부와,
(c) 표적 핵산의 검출용 시약을 수용하는 제 2 수용부와,
(d) 상기 검체를 검체 수용부에 분주하는 분주 기구, 상기 검체와 보충 입자를 혼합하여 검체로부터 표적 핵산을 추출하는 기구, 및 상기 추출된 표적 핵산과 검출용 시약을 혼합하는 기구와,
(e) 상기 제 2 수용부에 표적 핵산과 검출용 시약의 혼합 유체보다 비중이 작은 소수성 유체를 주입하는 기구, 상기 각 수용부를 덮는 덮개를 탈착시키는 기구, 표적 핵산을 형광시키기 위한 조사광을 투사하는 기구 및 그 조사광을 받은 표적 핵산으로부터의 광을 받아 표적 핵산을 검출하는 기구, 그리고 이들 기구를 조합한 기구로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 기구를 구비한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 매우 고감도로 생체 관련 물질을 측정할 수 있다.
종래의 검체의 측정 시스템에서는, 협잡물이 검체로부터 충분히 제거되지 않고 생체 관련 물질의 측정이 실시되었는데, 본 발명에 의해, 협잡물을 제거할 수 있어, 생체 관련 물질의 측정 감도를 높이는 것이 가능해진다. 또, 본 발명에 의해, 검체의 전처리, 및 전처리된 검체의 생체 관련 물질의 측정을 자동적이고 연속적으로 실시할 수 있다. 또한 종래에는 협잡물의 개입을 피하기 위해서 측정용의 검체에 협잡물을 실활시키는 시약을 수동으로 첨가할 필요가 있었는데, 본 발명에 의해 이와 같은 시약을 수동으로 첨가할 필요는 없어 매우 간편하게 측정 결과를 취득하는 것이 가능해진다.
도 1 은 제 1 담체와 제 2 담체의 조합을 예시한 설명도이다.
도 2 는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 이용하여 협잡물을 제거하는 양태를 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 3 은 협잡물을 분해하는 물질에 의해 협잡물을 분해하는 양태를 개략적으로 나타낸 설명도이다.
도 4 는 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 이용하여 생체 관련 물질을 추출하는 양태를 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 5 는 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 2 담체를 이용하여 생체 관련 물질을 추출하여 표지화하는 양태를 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 6 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용한 전처리에서 검체에 함유되는 항원의 검출까지의 전체 공정을 개략적으로 나타낸 설명도이다.
도 7 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 담체를 이용한 전처리에서 검체에 함유되는 항원의 검출까지의 전체 공정을 개략적으로 나타낸 설명도이다.
도 8 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 설명하는 설명도이다.
도 9 는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트이다.
도 10 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 칼럼을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 설명하는 설명도이다.
도 11 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 칼럼을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트이다.
도 12 는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 멤브레인을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 설명하는 설명도이다.
도 13 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 멤브레인을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트이다.
도 14 는 환원제가 고정된 겔을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 설명하는 설명도이다.
도 15 는 환원제가 고정된 겔을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트이다.
도 16 은 핵산과 친화성을 갖는 프로브가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 추출 처리를 설명하는 설명도이다.
도 17 은 핵산과 친화성을 갖는 프로브가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 핵산 추출 처리의 플로우 차트이다.
도 18 은 항원에 대한 항체가 고정된 자성 입자, 항원에 대한 항체가 고정된 플레이트, 항원에 대한 항체가 고정된 비즈를 모식적으로 설명하는 설명도이다.
도 19 는 제 2 담체를 이용하여 항원을 포착하여 표지화하여 검출하는 양태에 대해 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 20 은 자성 입자를 사용하여 실시되는 면역학적 측정을 설명하는 설명도이다.
도 21 은 항원 분별 고정 튜브를 이용하여 실시되는 면역학적 측정을 설명하는 설명도이다.
도 22 는 측정 시스템을 기능적으로 정리한 블록도이다.
도 23 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 전처리가 실행된 후에 계속해서 면역학적 측정을 실행할 때의 플로우 차트이다.
도 24 는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 칼럼을 이용하여 전처리가 실행된 후에 계속해서 면역학적 측정을 실행할 때의 플로우 차트이다.
도 25 는 전처리용의 자성 입자나 기질역을 미리 수용한 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 개략도이다.
도 26 은 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 작동 형태에 대해 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 27 은 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 전처리 공정에 대해 나타낸 설명도이다.
도 28 은 카트리지를 이용한 측정 공정에 대해 나타낸 설명도이다.
도 29 는 개별 형태의 카트리지에 대해 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 30 은 검체로부터의 핵산의 추출에서 제 2 담체의 조제까지의 전처리 공정을 개략적으로 나타낸 설명도이다.
도 31 은 라인 형상으로 나열된 복수의 웰이 12 열 나열된 처리부에 대해 개략적으로 설명하는 설명도이다.
도 32 은 측정 시스템을 기능마다 도시한 기능 블록도이다.
도 33 은 측정 시스템에 의해 실행되는 처리 공정을 나타낸 플로우 차트이다.
도 34 는 카트리지를 이용하여 핵산을 전처리할 수 있는 측정 시스템의 개략도이다.
도 35 는 마스터믹스처를 수용한 웰을 카트리지의 길이 방향을 따라 일부 절단한 카트리지의 사시 단면도이다.
도 36 은 측정 샘플이 수용된 웰과 마스터믹스처가 수용된 웰을 카트리지 본체로부터 분리하는 양태에 대해 설명하는 설명도이다.
도 37 은 라인 형상으로 나열된 복수의 웰을 사용하여 핵산의 검출을 실행하는 양태에 대해 설명하는 설명도이다.
도 38 은 웰이 배열된 복수의 처리 라인을 갖는 카트리지와, 이 카트리지 위를 처리 라인을 따라 이동하는 노즐 유닛을 나타낸 사시도이다.
도 39 는 펌핑 개구와, 트리거광 조사용 광파이버와, 검출용 렌즈를 구비한 노즐 유닛 선단부의 사시도이다.
도 40 은 노즐 유닛 선단부를, 광파이버의 연신 방향과 평행한 평면에서 절단한 단면도이다.
도 41 은 핵산 검출 장치를 기능 블록마다 정리한 기능 블록도이다.
도 42 는 펌핑 개구와, 트리거광 조사용 광파이버와, 검출용 렌즈를 구비한 노즐 유닛을 1 개만 구비한 핵산 검출 장치를 개략적으로 나타낸 사시도이다.
도 43 은 처리 라인마다 구비된 분주용의 노즐과 단일한 핵산 검출기를 별개로 구비한 핵산 검출 장치의 주요부를 나타낸 사시도이다.
도 44 는 처리 라인마다 핵산의 검출기를 구비한 핵산 검출 장치의 사시도이다.
도 45 는 분주용의 노즐의 외부에, 광파이버를 구비한 양태에 대해 나타낸 단면도이다.
도 46 은 단일한 검출기와, 이 검출기에 각 검출용 웰을 선택적으로 대응시키는 전환 장치를 구비한 핵산 검출 장치의 개략을 나타낸 설명도이다.
도 47 은 혈청에 대한 AFP 의 첨가에 기초하는, AFP 값을 구하기 위한 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 48 은 PBS 완충액에 대한 AFP 의 첨가에 기초하는, AFP 값을 구하기 위한 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
1. 개요
본 발명은 검체 중의 표적 물질을 측정하기 위해서, 기능이 상이한 복수 종류의 담체를 이용한 검체의 측정 시스템 및 검체의 전처리 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측정 시스템은, 생체 관련 물질을 함유한 검체에 대해 사용할 수 있고, 기능이 상이한 복수의 담체를 이용하여 검체를 처리하여 표적인 생체 관련 물질의 측정을 높은 정밀도로 실행하는 것이다. 기능이 상이한 복수의 담체로서는, 예를 들어, 검체에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질, 협잡물을 불활성화하는 물질, 또는 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체와, 생체 관련 물질의 검출용 시약이 고정된 담체, 및 생체 관련 물질의 검출용 시약을 고상화하여 이루어지는 담체에서 선택되는 제 2 담체를 이용할 수 있다. 「친화성을 갖는」이란 물질 (물질 A, B) 끼리의 상호간에 화학적 또는 물리적으로 상호 작용하여 관계가 강해지는 것을 의미한다. 또, 「불활성화한다」란, 보유하는 기능을 나타내지 않는 것을 의미한다. 물질 A 와 물질 A 에 대해 친화성을 갖는 물질 B 의 조합으로서, 예를 들어, 항원과 항체, 리간드와 수용체, 핵산과 그 상보 사슬 등을 들 수 있다. 협잡물을 제거하기 위한 제 1 담체로서는, 예를 들어, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 물질 (자성 입자, 칼럼, 여과재, 고분자 재료 등) 을 구비한 것을 들 수 있다. 또, 협잡물을 분해하기 위한 제 1 담체로서는, 예를 들어, 비특이적 반응 인자를 분해하는 환원제를 구비한 것을 들 수 있다. 또, 생체 관련 물질을 추출하기 위한 제 1 담체로서는, 예를 들어, 생체 관련 물질인 핵산과 친화성을 갖는 프로브가 고정된 자성 입자 등을 들 수 있다. 이들 예시한 제 1 담체를 이용함으로써, 검체로부터의 협잡물의 제거나 검체로부터의 생체 관련 물질의 추출을 실행할 수 있다.
도 1 에 나타내는 바와 같이, 제 1 담체로서 검체에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 담체, 협잡물을 불활성화하는 물질이 고정된 담체, 또는 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 담체의 3 종을 들 수 있고, 제 2 담체로서 생체 관련 물질의 검출용 시약이 고정된 담체, 생체 관련 물질의 검출용 시약을 고상화하여 이루어지는 담체의 2 종을 들 수 있고, 이 때문에 제 1 담체와 제 2 담체의 조합은 적어도 여섯 가지로 생각되고, 이들의 조합을 이용하여 검체를 처리함으로써 여러가지 처리 양태를 형성할 수 있다.
도 2 ∼ 5 에 본 발명의 시스템에 있어서의 원리의 개략적인 설명도를 나타낸다. 예를 들어, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 제 1 담체로서 검체에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 담체를 이용하여 검체를 처리함으로써 담체가 협잡물을 포착하고, 이 담체를 회수 (제거) 함으로써 검체로부터 협잡물을 제거할 수 있다. 또, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 제 1 담체로서 검체에 함유되는 협잡물을 불활성화하는 물질 (비활성화 물질) 이 고정된 담체를 이용함으로써 검체 중의 협잡물을 분해할 수 있고, 이로 인해 결과적으로 검체로부터 협잡물을 제거할 수 있다. 생체 관련 물질의 취득 후, 제 2 담체로서 생체 관련 물질 검출용의 시료가 고정된 담체를 이용함으로써, 검체 중의 생체 관련 물질을 검출할 수 있다. 또, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 제 1 담체로서 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 담체를 이용함으로써 검체로부터 생체 관련 물질만을 추출할 수 있어, 생체 관련 물질의 측정시 등에 있어서의 협잡물에 의한 저해를 방지할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 상기에 예시한 담체 이외의 제 1, 제 2 담체의 조합도 가능하여, 각각의 조합에 따라 상이한 처리를 검체에 대해 실시할 수 있다. 또, 협잡물과 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 이용한 후, 다시 생체 관련 물질과 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 이용하여 검체를 처리해도 된다.
제 1 담체를 이용하여 생체 관련 물질이 취득된 후, 제 2 담체를 이용하여 생체 관련 물질을 측정할 수 있다. 제 1 담체는, 검체 중의 생체 관련 물질의 고순도화 또는 추출 등을 실시하기 위한 담체로서, 본 발명의 전처리에 사용되는 담체이다. 제 2 담체는, 생체 관련 물질을 검출하기 위한 측정 시약이 고정되거나, 또는 고정화되어 이루어지는 담체이다. 본 발명에 있어서는, 제 2 담체를 조제하지 않고 별도 시약과 반응시켜 측정 공정을 실시할 수도 있는데, 장치에 의한 전자동화를 실시하는 것을 고려하면, 제 2 담체를 미리 조제해 두는 것이 바람직하다. 또, 제 2 담체 뿐만 아니라 제 1 담체도 미리 조제해 둠으로써 더욱 높은 효율로 편리성이 높은 작업을 실현할 수 있다.
도 5 에 나타내는 바와 같이, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는 물질 (친화성 물질) 이 고정된 제 2 담체를 생체 관련 물질에 결합시키고, 또한 표지화 물질이 고정된 제 2 담체를 생체 관련 물질에 결합시켜 생체 관련 물질을 검출한다. 또한, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는 제 1 담체를 이용한 경우에는, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는 제 2 담체의 사용을 생략 가능한 경우가 있어, 이 경우에는 제 1 담체를 이용한 처리가 실시된 검체에 대해 표지화 물질이 고정된 제 2 담체를 즉시 사용할 수 있다.
또, 본 발명의 전처리 방법은, 검체 중의 생체 관련 물질을 측정하기 전의 검체의 전처리 방법으로서, 검체 중에 함유되는 협잡물에 대해 친화성을 갖는 물질, 그 협잡물을 불활성화하는 물질, 또는 검체 중의 생체 관련 물질에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 1 담체를 이용하여 상기 검체를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 전처리는, 검체 중에 함유되는 협잡물을 제거하는 것, 및 검체 중에 함유되는 생체 관련 물질을 추출 또는 정제하는 것 모두 의미하는 것이다.
또한, 본 발명의 전처리에는, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는 물질, 및/또는 생체 관련 물질을 표지화하는 물질이 고정된 제 2 담체를 조제하는 공정을 포함할 수 있다. 제 2 담체의 조제는, 제 1 담체에 의한 처리와 동시에 또는 시기를 전후하여 실시할 수 있다. 생체 관련 물질이 항원 또는 항체인 경우에는, 후의 측정 공정에서 항체 또는 항원을 표지화하여 검출하기 위한 준비가 갖추어지고, 또 생체 관련 물질이 핵산인 경우에는, 후의 공정에서 핵산을 표지화하여 검출하기 위한 준비가 갖추어지게 된다.
이상에 서술한 바와 같은 전처리를 실행한 후에, 측정 공정이 실행된다. 측정 대상인 생체 관련 물질이 항원 또는 항체인 경우, 제 1 담체로서 검체 중의 협잡물과 친화성을 갖는 물질이 고정된 자성 입자, 겔, 멤브레인 등의 유지체를 들 수 있고, 제 2 담체로서 당해 항원에 대한 항체가 고정된 물질 (자성 입자, 비즈 등) 을 들 수 있다.
또, 생체 관련 물질이 DNA, RNA 등의 핵산인 경우에서는, 제 1 담체로서 검체 중의 DNA/RNA 와 친화성을 갖는 물질이 고정된 것을 들 수 있고, 제 2 담체로서 추출, 분리 또는 정제된 DNA/RNA 의 특정한 염기 배열 부분을 증폭 측정하기 위해서 필요한 반응 시약 (프로브, 프라이머, 마스터믹스처 등) 이 고상화된 것을 들 수 있다.
더욱 구체적으로는, 예를 들어, 생체 관련 물질이 종양 마커 (예를 들어 CA19-9) 인 경우, 측정시에 있어서의 위양성 반응을 방지하기 위해서, 제 1 담체로서 반응 저해 물질이 되는 IgM 등을 제거하기 위한 협잡물과 결합하는 물질 (예를 들어, IgM 항체) 을 고정시킨 담체 (자성 입자 또는 비자성 고체) 가 사용된다. 그리고, 제 2 담체로서 종양 마커 항체 (예를 들어 항 CA19-9 항체) 를 고정시킨 자성 또는 비자성 고체가 사용된다. 측정은, 제 2 담체가 포함되는 용기에, 제 1 담체를 이용하여 처리된 생체 관련 물질 (상기 예에서는 CA19-9) 및 기질 용액을 추가하여 측정한다.
또, 측정 대상의 생체 관련 물질이 핵산 (예를 들어 인플루엔자 바이러스 RNA) 인 경우, 제 1 담체로서 바이러스 RNA 의 추출, 분리 또는 정제를 실시하기 위한 자성 입자가 사용되고, 제 2 담체로서 상기 추출, 분리 또는 정제된 RNA 의 특정한 염기 배열 부분을 PCR 그 밖에 증폭 측정하기 위해서 필요한 반응 시약을 구비한 담체가 사용된다. 측정은, 제 2 담체가 포함되는 용기에, 제 1 담체를 이용하여 처리된 생체 관련 물질 (상기 예에서는 인플루엔자 바이러스 RNA) 및 증폭용 반응 시약을 첨가하여 실시한다.
본 발명은 1 개의 양태에 있어서, 이와 같은 검체 중의 비특이적 반응 인자를 제거하는 처리, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는, 및/또는 생체 관련 물질을 표지화하는 물질이 고정된 제 2 담체를 조제하는 처리를 1 개의 장치로 연속하여 실시하는 것이다. 이것을 실현한 장치를, 본 발명에서는 측정 시스템이라고 한다.
도 6 에 나타내는 바와 같이, 측정 시스템에서는, 전처리 공정으로서, 생체 관련 물질을 함유하는 검체의 처리 공정, 예를 들어 협잡물을 제거하는 공정과, 제 2 담체를 조제하는 공정이 실행되어 검체 중의 생체 관련 물질을 검출하는 공정은, 검체 중의 생체 관련 물질을 표지화하는 표지화 반응 공정과 표지화된 생체 관련 물질을 측정하는 측정 공정을 갖는다. 따라서, 측정 시스템에서는, 크게 나누어 (i) 제 1 담체를 이용한 검체의 처리 공정, (ii) 제 2 담체의 조제 공정, (iii) 전처리 후에 실시되는 측정 공정의 3 개의 공정이 실행되고, 기본적으로는 (i) 의 공정을 전처리라고 한다. 단, (ii) 의 공정을 (i) 의 공정과 함께 전처리 공정이라고 할 수 있다. (i) 의 공정은, 측정 대상의 생체 관련 물질의 고순도화 또는 추출을 실시하는 시험관 내 환경을 정리하는 처리이고, (ii) 의 공정은 생체 관련 물질을 검출하기 위한 시약이 포함되는 시험관 내 환경을 정리함으로써 이해할 수 있고, 검체 중의 생체 관련 물질을 측정 가능하게 하기 위한, 말하자면 샘플 및 샘플 측정 시약의 준비 공정을 의미한다. 도 6 은 제 2 담체의 조제를 전처리 공정에 포함하여 표시한 것이다.
제 1 담체를 이용하여 검체를 처리하는 공정은, 협잡물의 제거 공정, 생체 관련 물질의 고순도화 또는 추출 공정을 의미한다. 이 공정은 제 2 담체의 조제에 알맞게 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, (a) 자성 입자를 사용하여 원하는 생체 관련 물질을 선택적으로 수집하는 수법, (b) 소망하는 복수 종류의 생체 관련 물질을 동시에 수집하는 수법 등이 가능하다. 검출의 대상인 생체 관련 물질이 항원 또는 항체 등의 단백질인 경우에는, 주로, (1) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수법, (2) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 어피니티 겔을 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수법, (3) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 필터를 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수법, (4) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 플라스틱 담체를 이용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수법, 및 (5) 환원제가 고정된 겔을 사용하여 비특이적 반응 인자를 분해하는 수법, 등의 양태가 있다. 또, 생체 관련 물질이 DNA 나 RNA 등의 핵산인 경우에는, 표적 핵산과 결합 가능한 프로브가 고정된 자성 입자를 사용하여 표적 핵산을 추출하는 수법 등이 있다.
본 발명의 측정 시스템은 전처리 공정에 계속해서 연속적으로 면역학적 측정 또는 핵산 측정 등의 측정을 실행할 수 있다. 측정 시스템은, 노즐, 분주팁인 피펫팁, 복수의 웰이 배열된 웰 플레이트 등의 수용부, 펌프 기구 등을 구비한다. 수용부는 자성 입자액, 세정액, 효소 표지액, 기질액 등을 수용할 수 있다. 피펫팁 이동시의 움직임은 모터나 모터 컨트롤러 등에 의해 자동 제어할 수 있다. 웰의 재질은 검출 방법을 감안하여 적절하게 선택하면 된다. 예를 들어, CLIA 검사나 CLEIA 검사의 경우에는, 상호의 발광 영향을 받지 않는 불투명한 재질로 형성하고, EIA (ELISA) 검사의 경우에는, 투과광을 취급하는 관계상, 투명한 재질로 형성하면 된다. 또한, 후술하는데, 비특이적 반응 인자를 포착하는 자성 입자란, 예를 들어, 비특이적 반응 인자에 대한 항체를 표면에 고정시킬 수 있고, B/F 분리 (결합체와 비결합체의 분리) 등을 실시하기 위한 자성 물질을 말한다.
도 6 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 어피니티 겔을 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수법을 이용하여 검체를 처리하고, 이어서 자성 입자를 사용하여 원하는 생체 관련 물질을 선택적으로 수집하는 수법을 이용하여 생체 관련 물질의 표지화를 실시하는 프로세스의 전체를 나타내는 것이다. 단, 제 2 담체의 조제는, 도 6 에 나타내는 순서가 아니어도 되고, 협잡물의 제거 공정 중 또는 제거 공정 전이어도 된다. 도 6 에 나타낸 양태와는 다른 처리를 실시한 경우에 대해서는, 도 7 에 나타내었다. 도 7 은, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수법을 이용하여 검체의 전처리를 실행하고, 이어서 자성 입자를 사용하여 원하는 생체 관련 물질을 선택적으로 수집하는 수법을 이용하여 생체 관련 물질의 검출을 실시하는 프로세스의 전체를 나타내는 것이다. 측정 대상인 생체 관련 물질이 핵산인 경우에는, 검체 중의 표적 핵산을 측정하는 공정 전에, 제 1 담체를 이용하여 핵산을 추출하는 공정이 실행된다. 이하에, 전처리 공정, 및 측정 공정 등의 각 공정 등에 대해 더욱 상세하게 설명한다.
2. 생체 관련 물질 및 검체
본 발명에 있어서 「생체 관련 물질」이란, 측정 공정에 있어서의 검출의 대상이 될 수 있는 물질로서, 미생물, 바이러스, 세포, 핵산, 다당, 단순 단백질, 복합 단백질, 저분자 등의 모든 생체 물질을 의미한다.
미생물에는 진균류 및 진정 세균 및 고 (古) 세균이 포함된다. 진균류로서는, 예를 들어, 사카로미세스속, 아스페르길루스속, 칸디다속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 진정 세균으로서는, 예를 들어, 마이코박테리움속, 에세리히아속, 바칠루스속, 리스테리아속, 비브리오속, 살모네라균속, 슈드모나스속, 스튜디오필로코커스속, 미코플라스마속, 리케차속, 클라미디아속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다. 고 세균으로서는, 예를 들어, 서모플라스마속, 할로박테리움속, 메타노박테리움속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 사카로미세스·세레비시에종, 아스페르길루스·니듈란스종, 칸디다·아르비칸스종, 마이코박테리움·튜버클로시스종, 마이코박테리움·아비움종, 마이코박테리움·인트라셀라종, 마이코박테리움·칸사시종, 에세리히아·코리종, 바칠루스·세레우스종, 바칠루스·안스라시스종, 리스테리아·모노사이트게네스종, 비브리오·파라헤모리티커스종, 비브리오·콜레라종, 살모네라균·티푸스종, 슈드모나스·에레기노사종, 스타필로코커스·아우레우스속, 미코플라스마·뉴모니아종, 리케차·프로바제키종, 클라미디아·트라코마티스종 등을 예시할 수 있다.
바이러스로서는, 예를 들어, 아데노바이러스과, 박테리오파지과, 레트로바이러스과에 속하는 바이러스 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 아데노바이러스, T7 양 바이러스, B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 인간 면역 부전 바이러스, 노로바이러스, 인간 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스 등을 예시할 수 있다. 세포는 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 모두 포함된다. 핵산으로서는, DNA, RNA, 인공 핵산 등을 들 수 있다. 다당으로서는, 전분, 글리코겐, 키친, 카리기난 등을 들 수 있다. 단백질로서는, 항원, 항체, 효소, 색소 단백질 그 밖에 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 저분자로서는, 뉴클레오티드 3 인산 또는 데옥시뉴클레오티드 3 인산 등의 뉴클레오티드, 글루코오스 또는 갈락토오스 등의 당, 글루타민산 또는 리신 등의 아미노산, 플루오로세인 또는 에티듐브로마이드 등의 색소, 에피네프린 또는 펩티드 호르몬 또는 스테로이드 등의 호르몬을 들 수 있다. 단, 상기 생체 관련 물질은 예시이지, 이들 물질에 한정되는 것은 아니다. 검체는 이들 생체 관련 물질을 함유하는 한 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들어, (i) 담, 객담, 타액, 구강 세정액, 위액, 흉강 세정액, 혈액, 혈청, 혈장, 분편, 뇨, 수액, 정액 등의 임상 재료, (ii) 세포 용해액, 조직 용해액, 세포 배양물, 조직 배양물 등의 생물 재료, (iii) 가정 배수, 공업 배수 등의 배수, (iv) 해양수, 하천수, 지수, 호수, 지하수 등의 환경수, (v) 음료수, 음식 등 세정액, 및 생체 관련 물질이 존재할 수 있는 도구의 세정 용액이 검체에 함유된다. 「생체 관련 물질이 존재할 수 있는 도구의 세정 용액」이란, 생체 관련 물질의 존재를 확인하고자 하는 지점을 닦아낸 도구의 세정 용액, 또는 생체 관련 물질의 존재를 확인하고자 하는 지점을 씻어 흘린 세정 용액을 의미하고, 예를 들어, 조리용 부엌칼의 세정액, 걸래 (주방 행주) 로 물건을 닦아낸 후의 세정 용액 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 협잡물의 제거 처리에 의해 제거되는 비특이적 반응 인자는, 처리 대상이 되는 검체에 따라 여러 가지 생각되는데, 검체로서 혈청을 사용할 때에는, 면역 글로블린, 이호 항체, 류머티즘 인자 (RF), M 단백질 등이 비특이적 반응 인자가 된다. M 단백질은, 단클론성 (모노클로날) 면역 글로블린과 동일한 의미로서 1 종류의 면역 글로블린이 증가한 경우에 보이는 그 단백질을 가리키고, 예를 들어, 골수종이 생산하는 면역 글로블린 단백질은, 다발성 골수종을 대표하는 형질 세포 이상 증식증 환자의 혈청 중에 출현하는 M 단백질이다. 또한 M 단백에는, M 단백을 생산하는 골수종에 의해 IgA, IgM, IgG, IgE, 및 Bence-Jones 단백의 5 종이 있다. 또, 이호 항체 (heterophilic antibody : HA) 는 인간 항체-동물 항체로서, 건강한 인간에게도 통상, 수 퍼센트의 비율로 존재한다. 이호 항체에는 인간 항체-마우스 항체 (HAMA), 인간 항체-양 항체 (HASA), 인간 항체-염소 항체 (HAGA) 등이 있다. 이들 이호 항체가 검체 중에 존재하는 경우, 마우스, 염소, 양, 혹은 염소 항체를 사용한 면역학적 측정에 있어서 위양성이나 위음성의 비특이적 반응을 수용하게 된다. 검체로부터 핵산을 검출하는 경우에는, 항체 대신에 핵산의 상보 영역 또는 상보 영역을 포함하는 핵산을 사용하여 목적하는 핵산을 검출할 수 있다. 검출시에 사용되는 핵산의 증폭에는, 예를 들어 PCR 법을 적용할 수 있는데, 이것에 한정되지 않고 목적에 알맞게 적절하게 다른 증폭 방법 (LAMP 법 등의 등온 증폭법) 을 이용하면 된다.
3. 제 1 담체를 이용한 검체 처리
이 처리에 의해, 면역학적 측정 분야에서 종래, 회피할 수 없었던 위양성 반응 또는 위음성 반응의 원인이 되는 비특이적 반응 인자를 미리 제거할 수 있기 때문에, 매우 특이적 또한 고감도로 생체 관련 물질을 검출할 수 있다. 제 1 담체로서, 자성 입자, 겔 형상 부재, 멤브레인, 수지 부재, 섬유체 등을 이용할 수 있고, 각각 적절하게 구분하여 사용하면 된다. 후술하는 바와 같이, 협잡물의 제거 처리 후, 처리가 완료된 검체는 면역학적 측정 공정에 제공된다. 또, 이 처리에 의해 핵산의 측정 분야에서는 표적 핵산을 선택적으로 추출할 수 있고, 측정시의 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 제 1 담체로서는, 핵산 포착용의 프로브가 고정된 자성 입자 등을 사용할 수 있다.
3-1. 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자에 의한 협잡물의 제거 처리
도 8 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 나타내는 도면이다. 도 8 에 나타내는 바와 같이, 피펫팁 (분주팁) (10) 은, 예를 들어, 끝이 가늘고 폭이 좁고 긴 대략 원통 형상으로 형성되어, 측정 시스템에 자유롭게 착탈되도록 장착된다. 자성 입자는, 예를 들어, 분주용의 노즐에 장착된 피펫팁으로, 분리, 세정, 현탁 등을 실시할 때 사용된다. 도 8(a) 에 나타내는 바와 같이, 피펫팁 (10) 은, 웰 (12) 에 삽입되는 선단부 (10a), 측정 시스템의 노즐 (도시 생략) 에 고정되는 마운트부 (10b), 선단부 (10a) 와 마운트부 (10b) 사이에 형성되고, 외부 자장에 의해 자성 입자를 수용하는 수용부 (10c) 를 갖는다. 선단부 (10a) 의 내경은 가장 작고, 수용부 (10c) 는, 예를 들어, 소직경부와 대직경부로 이루어지고, 소직경부의 내경은 선단부의 내경보다 크고, 대직경부의 내경은 마운트부의 내경보다 작고, 그리고 마운트부 (10b) 의 내경이 가장 크다. 피펫팁의 용량 사이즈는 웰의 사이즈에 맞추어 적절하게 결정하는 것이 바람직하지만, 예를 들어 수 마이크로 리터에서 수백 마이크로 리터의 용량으로 하면 편리성의 향상을 기대할 수 있다.
협잡물의 제거 처리를 실행하는 측정 시스템은, 수용부 (10c) 의 외주에 접리 가능하게 형성되고 자성 입자를 자력에 의해 구속하는 자석 (M), 피펫팁 (10) 의 마운트부 (10b) 가 장착되는 노즐, 노즐에 장착된 피펫팁 (10) 에 액체의 흡입이나 배출을 실행시키기 위한 펌프 기구 등을 구비한다. 여기서, 자석 (M) 은 수용부 (10c) 중 소직경부에서 자성 입자를 구속할 수 있다 (도 6, 도 7 참조).
도 8(b) 에 나타내는 바와 같이, 피펫팁 (10) 이 웰 (12) 에 삽입되었을 때, 피펫팁 (10) 과 웰 (12) 사이에는, 예를 들어 0.2 ㎜ ∼ 0.5 ㎜ 정도의 클리어런스가 형성되어 있다. 이로써 피펫팁 삽입시에 있어서의 검체의 외부와의 접촉 에어리어를 최대한 작게 할 수 있어, 잡균 혼입의 위험성을 저감시키고 있다. 또한, 피펫팁 (10) 의 형상은 적절하게 변경해도 되는데, 피펫팁 (10) 이 웰 (12) 에 삽입되었을 때의 웰 (12) 과 피펫팁 (10) 사이의 클리어런스는 좁은 것이 바람직하다.
자성 입자 (14) 는 자성을 갖고, 그 크기는, 예를 들어 0.1 ㎛ ∼ 100 ㎛, 바람직하게는 0.1 ㎛ ∼ 10 ㎛ 정도의 사이즈로 형성되어 있다. 자성 입자 (14) 의, 사이즈, 질량, 재료, 구조, 그 성질 (상자성, 초상자성, 강자성 등, 페리 자성, 자력의 크기) 등은, 그 처리 목적에 따라 임의로 정하면 된다. 이 자성 입자는, 수산화철, 산화철 수화물, 산화철, 혼합 산화철, 혹은 철, γ-Fe2O3, Fe3O4 등에 의해 형성할 수 있다.
도 9 는, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 9 에 나타내는 바와 같이, 측정 시스템이 상기 웰과 피펫팁을 사용하여 검체의 전처리를 실시하는 경우, 먼저, 웰에 수용된 검체를 피펫팁 (10) 으로 소정량 흡인한다. 다음으로, 이 검체가 흡인된 피펫팁 (10) 을 전처리용 자성 입자액이 수용된 웰 (12) 로 이동시키고, 전처리용 자성 입자액을 수용한 웰 (12) 에 피펫팁 (10) 내의 검체를 배출한다. 피펫팁 (10) 을 사용하여 검체와 전처리용 자성 입자액의 혼합 조작을 반복하고, 흡입 및 배출시켜 유동 교반하면서 균일한 현탁액을 형성한다. 교반 종료부터 소요 시간 정치 (靜置) 하여, 전처리용 자성체에 고정된 비특이적 반응 인자에 대한 항체에, 검체 중의 비특이적 반응 인자를 결합시킨다. 소정 시간 경과 후, 정치된 현탁액을 피펫팁 (10) 내로 흡입하는 공정을 실행한다.
도 8(c) 에 나타내는 바와 같이, 피펫팁 (10) 에 흡입된 현탁액은 피펫팁 (10) 의 수용부 (10c) 에 수용된다. 현탁액에 현탁한 전처리용 자성 입자 (14) 는, 피펫팁 (10) 외부의 자석 (M) 의 자장에 의해 수용부 (10c) 의 내벽면 상의 일정 부위에 원격적으로 고정된다.
현탁액이 피펫팁 (10) 내에 수용된 후, 전처리용 자성 입자 (14) 는 자석 (M) 으로부터의 자장에 의해 한 지점에 고정된 상태에서, 나머지의 액체가 웰 (12) 내로 배출된다. 이로써, 비특이적 반응 인자 (15) 가 결합한 전처리용 자성 입자 (14) 를 검체로부터 제거하여, 검체로부터 협잡물이 제거 처리된 측정 샘플을 취득할 수 있다. 이와 같이 비특이적 반응 인자 (15) 에 대한 항체가 고정된 자성 입자 (14) 를 비특이적 반응 인자의 제거에 이용함으로써, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자가 비특이적 반응 인자에 조우하는 빈도를 높일 수 있어, 효율적으로 비특이적 반응 인자를 포착하여 제거할 수 있다.
3-2. 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 어피니티 칼럼에 의한 협잡물의 제거 처리
도 10 은 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 칼럼을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 나타내는 도면이다. 도 11 은, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 칼럼을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 10 및 도 11 에 나타내는 바와 같이, 칼럼 함유 피펫팁 (20) 은 비특이적 반응 인자를 제거하기 위한 칼럼 (24) 을 갖는다. 도 10(a) 에 나타내는 바와 같이, 칼럼 함유 피펫팁 (20) 의 외형, 치수, 재료는 상기 피펫팁 (10) 과 동일하게 형성되어 있다. 칼럼 (24) 에는 펠릿 형상으로 형성된 다수의 어피니티 수지 (26) 가 함유되고, 각 어피니티 수지 (26) 에는 비특이적 반응 인자를 포착하기 위한 항체가 결합되어 있다. 도 10(b) 에 나타내는 바와 같이, 칼럼 (24) 에, 웰 (12) 에 수용된 검체를 통과시킴으로써 검체 중의 비특이적 반응 인자가 상기 항체와 결합하여 칼럼 (24) 으로 포착된다. 칼럼 함유 피펫팁 (20) 내에 검체를 흡입한 후에 칼럼 함유 피펫팁 (20) 으로부터 검체를 배출하는 공정을 소정 횟수 반복함으로써, 보다 많은 비특이적 반응 인자를 칼럼 (24) 으로 포착할 수 있다. 도 10(c) 에 나타내는 바와 같이, 검체의 흡입 및 배출을 소정 횟수 실행한 후에 웰 (12) 에 배출함으로써, 검체로부터 비특이적 반응 인자를 제거한 측정 샘플을 제공할 수 있다.
3-3. 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 멤브레인 등의 여과재에 의한 협잡물의 제거 처리
도 12 는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 멤브레인을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 나타내는 도면이다. 도 13 은, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 멤브레인을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 12 및 도 13 에 나타내는 바와 같이, 멤브레인 함유 피펫팁 (30) 은 비특이적 반응 인자를 제거하기 위한 멤브레인 (34) 을 갖는다. 도 12(a) 에 나타내는 바와 같이, 멤브레인 함유 피펫팁 (30) 의 외형, 치수, 재료는 상기 피펫팁 (10) 과 동일하게 형성되어 있다. 이 멤브레인 (34) 은 시트 형상으로 형성되고, 멤브레인 (34) 에는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정되어 있다. 도 12(b) 에 나타내는 바와 같이, 멤브레인 (34) 에 검체를 통과시킴으로써, 검체 중의 비특이적 반응 인자는 상기 항체와 결합하여 멤브레인 (34) 으로 포착된다. 멤브레인 함유 피펫팁 (30) 내에 웰 (12) 내의 검체를 흡입한 후에 멤브레인 함유 피펫팁 (30) 으로부터 검체를 배출하는 공정을 소정 횟수 반복함으로써, 보다 많은 비특이적 반응 인자를 멤브레인 (34) 으로 포착할 수 있다. 도 12(c) 에 나타내는 바와 같이, 검체의 흡입 및 배출을 소정 횟수 실행한 후에 웰 (12) 에 배출함으로써, 검체로부터 비특이적 반응 인자를 제거한 측정 샘플을 제공할 수 있다.
3-4. 환원제가 고정된 겔에 의한 협잡물의 제거 처리
도 14 는 환원제가 고정된 겔을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리를 나타내는 도면이다. 도 15 는, 환원제가 고정된 겔을 이용하여 실시되는 협잡물의 제거 처리의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 14 및 도 15 에 나타내는 바와 같이, 겔 함유 피펫팁 (40) 은 비특이적 반응 인자를 분해하기 위한 겔 (43) 을 갖는다. 도 14(a) 에 나타내는 바와 같이, 겔 함유 피펫팁 (40) 의 외형, 치수, 재료는 상기 피펫팁 (10) 과 동일하게 형성되어 있다. 이 겔 (43) 에는, 비특이적 반응 인자를 분해하기 위한 환원제 (협잡물을 불활성화하는 물질) 가 고정되어 있다. 환원제로서는, 예를 들어, 트리스(2-카르복실에틸)포스핀 (TCEP), 글루타티온 등을 사용할 수 있다. 도 14(b) 에 나타내는 바와 같이, 환원제가 고정된 겔에 검체를 통과시킴으로써 검체 중의 비특이적 반응 인자가 환원제에 의해 분해된다. 겔 함유 피펫팁 (40) 내에 웰 (12) 내의 검체를 흡입한 후에 겔 함유 피펫팁 (40) 으로부터 검체를 배출하는 공정을 소정 횟수 반복함으로써, 보다 많은 비특이적 반응 인자를 환원제로 분해할 수 있다. 도 14(c) 에 나타내는 바와 같이, 검체의 흡입 및 배출을 소정 횟수 실행한 후, 웰 (12) 에 배출함으로써 비특이적 반응 인자를 제거한 검체를 제공할 수 있다. 또한, 상기에서는 겔에 환원제를 유지시키고 비특이적 반응 인자를 분해한 예를 나타냈지만, 겔에 비특이적 반응 인자에 대한 항체를 유지시켜도 된다. 이 경우, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 겔에 의해 비특이적 반응 인자를 포착하여 제거할 수 있다.
3-5. 기타 (플라스틱 부재에 의한 처리)
상기 양태 이외에도, 예를 들어, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 플라스틱제의 지지체에 고정되어 있는 것이어도 검체를 전처리할 수 있다. 예를 들어, 지지체에는, 예를 들어 복수의 오목한 구멍이 매트릭스 형상으로 배열되고, 이 오목한 구멍 내에 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 미리 고정되어 있다. 검체 중의 비특이적 반응 인자가 이 오목한 구멍 내에 수용되면 검체 중의 비특이적 반응 인자가 이것에 대한 항체와 결합하여 고정된다. 이 오목부 내에 피펫팁 선단부를 침지시켜 액체를 빨아 올림으로써, 검체로부터 비특이적 반응 인자가 제거된 측정 샘플을 제조할 수 있다.
3-6. 핵산 포착용의 프로브가 고정된 자성 입자를 사용한 표적 핵산의 추출 처리
도 16 은 핵산 포착용의 프로브가 고정된 자성 입자 (제 1 담체) 를 이용하여 실시되는 표적 핵산의 추출 처리에 대해 개략적으로 설명하는 설명도이다. 또, 도 17 은 핵산 보충용의 프로브가 고정된 자성 입자를 사용하여 실시되는 표적 핵산의 추출 처리에 있어서의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 16 에 나타내는 바와 같이, 측정 시스템이 웰과 피펫팁을 사용하여 검체의 전처리를 실시하는 경우, 먼저, 웰에 수용된 검체를 피펫팁 (220) 으로 소정량 흡인한다. 다음으로, 이 검체가 흡인된 피펫팁 (220) 을 전처리용 자성 입자액이 수용된 웰 (222) 로 이동시키고, 전처리용 자성 입자액을 수용한 웰 (222) 에 피펫팁 (220) 내의 검체를 배출한다. 피펫팁 (220) 을 사용하여 검체와 전처리용 자성 입자액을 흡입 배출시켜 균일하게 혼합한 현탁액을 형성한다. 교반 종료부터 소정 시간 정치하여, 전처리용 자성 입자 (224) 에 고정된 프로브에, 검체 중의 표적 핵산 (225) 을 결합시킨다.
도 16(c) 에 나타내는 바와 같이, 소정 시간의 정치 후, 현탁액은 피펫팁 (220) 으로 흡입되고 수용부 (220c) 에 수용된다. 현탁액에 포함되는 전처리용 자성 입자 (224) 는, 피펫팁 (220) 외부의 자석 (M) 의 자장에 의해 수용부 (220c) 의 내벽면 상의 일정 부위에 원격적으로 고정된다. 현탁액이 피펫팁 (220) 내에 수용된 후, 전처리용 자성 입자 (224) 는 자석 (M) 의 자장에 의해 한 지점에 고정된 상태에서, 나머지의 액체가 웰 (222) 내로 배출된다. 이로써, 표적 핵산 (225) 이 결합한 자성 입자 (224) 를 검체로부터 취출하여, 검체로부터 표적 핵산을 추출할 수 있다. 이와 같이 표적 핵산과 결합 가능한 프로브가 고정된 자성 입자를 표적 핵산의 추출에 사용함으로써, 효율적으로 표적 핵산을 포착하여 추출할 수 있다.
웰 플레이트 상에는 복수의 웰 (12) 이, 예를 들어, 일렬, 또는 매트릭스 형상으로 배열되어 있다. 특정한 웰 (12) 에는 검체가 미리 수용되고, 이것과 별도의 웰에는 비특이적 반응 인자에 대한 항체 (이후, 전처리용 항체라고 한다) 가 고정된 소요량의 자성 입자 (이후, 전처리용 자성 입자라고 한다) 를 포함하는 액체 (이후, 전처리용 자성 입자액이라고 한다) 가 미리 수용되어 있다.
본 발명에 있어서, 측정 샘플의 검출 공정으로 이행하기 전에, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는 물질이 고정된 제 2 담체를 조제하는 공정이 실행된다. 도 18 은, 항원에 대한 항체가 고정된 자성 입자, 항원에 대한 항체가 고정된 플레이트, 항원에 대한 항체가 고정된 비즈를 모식적으로 설명하는 설명도이다. 검출 공정으로 이행하기 전에 제조되는 제 2 담체로서는, 예를 들어 도 18 에 나타내는 바와 같이, (a) 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 가 고정된 자성 입자 (G), (b) 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 가 고정된 플레이트 (P), (c) 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 가 고정된 비즈 (B) 등을 들 수 있다. 도 18(a) 에 나타내는 바와 같이, 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 를 자성 입자 (G) 에 고정시킴으로써, 제 2 담체를 제조할 수 있다. 또, 도 18(b) 에 나타내는 바와 같이, 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 를 플레이트 (P) 에 고정시킴으로써, 또 다른 양태의 제 2 담체를 제조할 수 있다. 또한 도 18(c) 에 나타내는 바와 같이, 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 를 비즈 (B) 에 고정시킴으로써, 또 다른 양태의 제 2 담체를 제조할 수 있다. 이와 같이 제 2 항체를 미리 제조함으로써, 다음의 측정 공정을 순조롭게 실행할 수 있어, 검출 정밀도의 향상 등을 기대할 수 있다. 제조된 제 2 항체에는, 항원 (45) 이 특이적으로 결합 가능하고, 항원 (45) 에는 또한 형광 반응 또는 발광 반응을 일으키는 표지 물질 (47) 이 항원에 대한 다른 항체 (2 차 항체) 를 개재하여 특이적으로 결합 가능하게 되어 있다.
4. 생체 관련 물질의 측정
생체 관련 물질의 측정 공정은, 생체 관련 물질의 표지화 공정과, 이 표지화된 생체 관련 물질의 검출 공정을 포함한다. 이하에 각 공정에 대해 설명한다.
4-1. 표지화 반응 공정
표지화 반응 공정은 표적 생체 관련 물질의 측정 공정에 포함되고, 제 2 담체를 이용하여 실시된다. 도 19 는, 제 2 담체를 이용하여 항원을 포착하여 표지화하여 검출하는 양태에 대해 개략적으로 설명하는 설명도이다. 도 19 에 나타내는 바와 같이, 표지화 반응 공정에서는, 검체로부터 협잡물의 제거 등의 처리가 이루어진 측정 샘플로부터 생체 관련 물질을 포착하여 표지가 부여된다. 생체 관련 물질로서 예를 들어 항원을 포착하는 경우, 그 표지로서, 항원 (45) 에 결합하는 항체 (46) 가 사용된다. 항원 (45) 에 표지 (47) 를 결합시킨 후, 후술하는 검지 공정이 실시된다. 도 19(a), 도 19(b) 에 나타내는 바와 같이, 제 2 담체로서 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 가 고정된 자성 입자 (G) 를 사용한 경우, 및 제 2 담체로서 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 가 고정된 플레이트 (P) 를 사용한 경우에는, 예를 들어, 표지화된 항원의 검출은 광 전자 증배관 (PMT) (48) 을 사용함으로써 항원의 검출을 실행할 수 있다. 또, 도 19(c) 에 나타내는 바와 같이, 제 2 담체로서 항원 (45) 에 대한 항체 (46) 가 고정된 비즈 (B) 를 사용한 경우에는, 예를 들어, 광파이버를 이용한 포톤카운터를 사용함으로써 항원의 검출을 실행할 수 있다. 이하에, 검체로부터 항원을 포착하여 표지가 되는 항체를 부여하는 2 개의 전형적인 양태에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.
4-1-1. 항원에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용한 항원의 표지화
여기서는 제 2 담체로서, 항원에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 단일한 항원을 포착하여 표지화하는 양태에 대해 설명한다. 검체의 고순도화 처리 후, 측정 시스템은 표지화 반응 공정을 포함하는 측정 공정을 갖는 면역학적 측정을 실행한다. 웰 플레이트 상의 제 1 웰 (제 1 수용부) 에는 검출 목적인 항원에 대한 항체 (이후, 특이적 반응 항체라고 한다) 가 고정된 소요량의 자성 입자 (이후, 특이적 반응용 자성 입자라고 한다) 를 포함하는 액체 (이후, 특이적 반응용 자성 입자액이라고 한다) 가 미리 수용되고, 또 다른 제 2 웰 (제 2 수용부) 에는 항원에 대한 표지화 항체 (이후, 표지 항체라고 한다) 를 포함하는 액체 (이후, 표지화액이라고 한다) 가 미리 수용되고, 또 다른 제 3 웰에는 기질액이 수용되어 있다.
도 20 은 자성 입자를 사용하여 실시되는 면역학적 측정을 나타내는 도면이다. 도 20 에 나타내는 바와 같이, 협잡물의 제거 등의 전처리에 사용된 피펫팁과 동일한 새로운 다른 피펫팁 (50) 을 노즐에 바꿔 부착하여 별도의 웰 내에 수용된 특이적 반응용 자성 입자액을 피펫팁 (50) 내로 흡입한다. 도 20(a) 에 나타내는 바와 같이, 특이적 반응용 자성 입자액을 내측에 유지한 피펫팁 (50) 은, 측정 샘플을 수용한 웰 (12) 로 이동 제어되어 선단부를 이 웰 (12) 에 침지시킨다. 자석 (M) 이 피펫팁 (50) 으로부터 서서히 이간되어 특이적 반응용 자성 입자를 자장에 의한 구속으로부터 풀어, 특이적 반응용 자성 입자액을 측정 샘플에 혼합시킨다. 특이적 반응용 자성 입자액과 측정 샘플의 혼합액을 흡입 및 배출하여 특이적 반응용 자성 입자가 균일하게 현탁한 현탁액이 형성된다. 도 20(a) ∼ 도 20(b) 에 나타내는 바와 같이, 현탁액의 형성 후, 현탁액은, 예를 들어 37 ℃ 에서 일정 시간 정치 (인큐베이션) 되어, 현탁액 내의 항원과 특이적 반응용 자성 입자에 고정된 특이적 반응 항체가 특이적 반응하여 결합한다. 또한, 상기에서는 특이적 반응용 자성 입자액을 피펫팁 (50) 에 흡입하여 측정 샘플이 수용된 검체 수용부 (웰) (12) 에 더했는데, 측정 샘플을 피펫팁 (50) 에 흡입하여 특이적 반응용 자성 입자액이 수용된 웰에 첨가해도 된다.
도 20(b) 에 나타내는 바와 같이, 정치 후, 현탁액이 피펫팁 (50) 내에 수용된다. 현탁액이 피펫팁 (50) 내에 수용된 후, 자석 (M) 이 피펫팁 (50) 의 수용부의 외주에 가까워져, 항원이 결합한 특이적 반응용 자성 입자 (이후, 항원 결합 자성 입자라고 한다) 가 피펫팁 (50) 의 수용부 내의 한 지점에 모인다. 항원 결합 자성 입자의 수집 후, 나머지 액체는 웰 (12) 에 배출되어 항원 결합 자성 입자만이 피펫팁 (50) 내에 유지된다.
도 20(b) 에 나타내는 바와 같이, 항원 결합 자성 입자를 유지한 피펫팁 (50) 은, 항원 결합 자성 입자를 유지하면서 세정액을 수용한 웰 (60) 로 이동 제어된다. 피펫팁 (50) 선단부가 웰 (60) 내의 세정액에 침지된 후, 자석 (M) 이 피펫팁 (50) 의 수용부의 외주로부터 서서히 이간되어 피펫팁 (50) 내의 항원 결합 자성 입자가 세정액과 혼합된다. 항원 결합 자성 입자가 혼합된 세정액은 피펫팁 (50) 에 의해 흡입 및 배출되어 유동 교반된다. 교반 후, 항원 결합 자성 입자가 혼합된 세정액이 피펫팁 (50) 내로 흡입되어, 피펫팁 (50) 의 수용부의 외주에 자석 (M) 이 접근하여 항원 결합 자성 입자가 한 지점에 모인다. 항원 결합 자성 입자가 한 지점에 배치가 구속된 후, 나머지의 액체가 웰 (60) 에 배출된다.
도 20(c) 에 나타내는 바와 같이, 액체 배출 후, 피펫팁 (50) 은 항원 결합 자성 입자를 유지한 상태에서, 항원에 대한 표지화 항체 (효소 표지 항체) 를 포함하는 표지화액을 수용한 웰 (62) 로 이동 제어된다. 피펫팁 (50) 의 선단부가 표지화액에 침지된 후, 자석 (M) 이 피펫팁 (50) 의 수용부의 외주로부터 서서히 이간되어 항원 결합 자성 입자의 구속이 해제된다. 항원 결합 자성 입자가 혼합된 표지화액을 흡입 및 배출시킴으로써, 항원 결합 자성 입자와 표지화액을 혼합하여 균일하게 현탁할 수 있다. 현탁 후, 현탁액은, 예를 들어 37℃ 에서 일정 시간 정치함으로써 항원에 효소 표지 항체를 결합시킬 수 있다.
도 20(d) 에 나타내는 바와 같이, 일정 시간 정치 (인큐베이트) 후, 피펫팁 (50) 은 웰 (62) 내의 현탁액을 천천히 피펫팁 (50) 내로 흡입한다. 피펫팁 (50) 내에 현탁액을 수용한 후, 자석 (M) 이 피펫팁 (50) 에 접근하여, 수용된 현탁액에 현탁한 자성 입자를 한 지점에 구속한다. 이 효소 표지 항체가 결합한 자성 입자 (이후, 표지화 항체 결합 자성 입자라고 한다) 의 구속 후, 표지화 자성 입자를 제외한 액체가 웰 (62) 에 배출되어, 표지화 항체 결합 자성 입자만이 피펫팁 (50) 에 남는다.
이 후, 도 20(e) 에 나타내는 바와 같이, 피펫팁 (50) 은, 표지화 항체 결합 자성 입자를 유지한 상태에서 세정액을 수용한 별도의 웰 (64) 로 이동 제어되어, 자석 (M) 이 서서히 피펫팁 (50) 으로부터 이간되어 웰 (64) 내의 세정액과 표지화 항체 결합 자성 입자가 혼합된다 (도 20(f) 참조). 이미 서술한 세정 공정과 동일 순서로 표지화 항체 결합 자성 입자의 세정이 실행된 후, 표지화 항체 결합 자성 입자를 유지한 피펫팁 (50) 이 기질액을 수용한 웰 (67) 로 이동 제어되어, 후술하는 검출 공정 (도 20(g) 참조) 이 개시된다.
또한, 상기에서는 항원에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 협잡물의 제거 등의 처리가 완료된 검체에 혼합하여 항체에 항원을 결합시킨 후에, 표지화액을 사용하여 항원에 효소 표지 항체를 결합시켰지만, 표지화의 순서는 이것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미리 효소 표지 항체 및 항체가 고정된 자성 입자를 사용해도 된다.
4-1-2. 항체 고정 비즈를 복수 사용한 복수 종류의 항원의 동시적 표지화 반응 공정
상기 항목 [4-1-1] 에서는 단일한 항원을 포착하여 표지화했지만, 이 공정에서는 한 번에 복수 종류의 항원을 포착하여 표지화하는 양태에 대해 설명한다. 도 21 은, 항원 분별 고정 튜브를 이용하여 실시되는 면역학적 측정을 나타내는 도면이다. 도 21 에 나타내는 바와 같이, 관 형상으로 형성된 투명한 항원 분별 고정 튜브 (70) 는, 항원에 대한 항체가 미리 고정된 제 2 담체인 비즈 (이후, 항체 고정 비즈라고 한다) 와, 일정 개수의 항체 고정 비즈를 간격을 두고 배치되는 스페이서 비즈 (72) 를 수용하고, 각 비즈는 튜브를 따라 일렬로 배열되어 있다. 항체 고정 비즈는 예를 들어, 제 1 항체가 고정된 제 1 항체 고정 비즈 (74) 와, 제 2 항체가 고정된 제 2 항체 고정 비즈 (76) 와, 제 3 항체가 고정된 제 3 항체 고정 비즈 (78) 가 각각 예를 들어 3 개씩 연속하여 나열되고, 각 종류의 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 간에는 스페이서 비즈 (72) 가 배열되어 있다. 또한, 비즈의 배열은 적절하게 변경해도 되고, 경우에 따라 스페이서 비즈는 생략할 수 있다.
항원 분별 고정 튜브 (70) 는, 상단부에 측정 시스템의 노즐에 마운트되는 마운트부 (도시 생략) 가 형성되고, 하단은 액체의 흡입 및 배출이 가능하도록 개구되어 있다. 본 발명의 측정 시스템에는 펌프 기구가 구비되어, 노즐에 마운트된 항원 분별 고정 튜브 (70) 에 액체를 흡입시키거나, 또는 배출시킬 수 있게 되어 있다.
도 21(a) 에 나타내는 바와 같이, 항원 분별 고정 튜브 (70) 의 하단이 웰 (12) 에 침지되어, 웰 (12) 내의 협잡물의 제거 등의 처리가 이루어진 측정 샘플이 항원 분별 고정 튜브 (70) 로 흡입되면, 제 1 ∼ 제 3 항체에 각각 대응하는 제 1 ∼ 제 3 항원이 항체에 결합하여 제 1 ∼ 제 3 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 로 포착된다. 검체의 흡입 및 배출을 소정 횟수 반복함으로써 각 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 에 항원을 확실하게 결합시킨다.
도 21(b) 에 나타내는 바와 같이, 검체의 흡입 및 배출을 소정 횟수 반복한 후, 별도의 웰 (80) 의 세정액을 흡입하여 제 1 ∼ 제 3 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 를 세정한다. 도 21(c) 에 나타내는 바와 같이, 제 1 ∼ 제 3 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 의 세정 후, 별도의 웰 (84) 내에 수용된 효소 표지화액에 항원 분별 고정 튜브 (70) 의 하단이 침지되어, 효소 표지화액이 항원 분별 고정 튜브 (70) 내로 흡입된다. 효소 표지화액은 제 1 ∼ 제 3 항체에 결합하는 각 항원에 대응하여 효소 표지 항체가 3 종류 혼합되어 있고, 항원 분별 고정 튜브 (70) 내에 효소 표지화액이 흡입되면 각 효소 표지 항체는 각 항원에 결합한다. 도 21(d) 에 나타내는 바와 같이, 효소 표지화액의 흡입 및 배출이 소정 횟수 실행되면, 별도의 웰 (84) 에 수용된 세정액의 흡입 및 배출이 실시되어 항원 및 효소 표지 항체가 결합한 제 1 ∼ 제 3 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 의 세정이 실시된다. 도 21(e) 에 나타내는 바와 같이, 세정 후, 기질액을 수용한 웰 (86) 에 항원 분별 고정 튜브가 이동 제어되어 후술하는 검출 공정이 개시된다. 상기에서는 3 종의 효소 표지 항체의 혼합액이 사용되었지만, 효소 표지화는, 상이한 종류의 효소 표지 항체가 수용된 3 개의 웰에 대해, 순서대로 효소 표지 항체의 흡입 및 배출과 세정으로 이루어지는 공정을 실시함으로써 대체해도 된다.
이와 같이 복수 종류의 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 가 배열된 항원 분별 고정 튜브 (70) 를 사용하여 검체를 처리함으로써, 한 번에 복수의 항원을 포착할 수 있어, 다항목 동시 검출을 가능하게 함과 함께, 검체 중의 항원의 검출 시간을 짧게 할 수 있다.
상기에서는 항원에 대한 항체가 고정된 비즈 (74, 76, 78) 에 협잡물의 제거 등의 처리가 이루어진 검체를 접촉시켜 항체에 항원을 결합시킨 후에, 표지화액을 사용하여 항원에 효소 표지 항체를 결합시켰는데, 표지화의 순서는 이것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미리 효소 표지 항체를 고정시킨 비즈를 사용하여 항원의 보충 공정을 실행해도 된다.
4-2. 검출 공정
효소 표지 항체가 결합한 항원은, 기질액에 혼합되어 기질을 발색시켜, 흡광도 등의 검출이 실시된다. 이하에, 상기한 자성 입자를 사용하여 항원의 표지화를 실시한 경우와 항원 분별 고정 튜브를 사용하여 항원의 표지화를 실시한 경우의 각각으로 나누어 검출 공정을 설명한다.
4-2-1. 자성 입자 및 피펫팁을 이용한 검출
본 발명의 측정 시스템은, 예를 들어 웰의 측면에 특정 파장의 광속을 조사하는 광 조사부, 광 조사부로부터 조사된 광속을, 웰을 개재하여 수광하는 수광부, 수광부로부터 출력되는 신호를 처리하여, 예를 들어 흡광도 데이터, 혹은 발광 강도 데이터를 형성하는 신호 처리 회로 등을 구비한다.
도 20(g) 에 나타내는 바와 같이, 표지화 항체 결합 자성 입자를 유지한 피펫팁 (50) 은, 기질액을 수용한 웰 (67) 로 이동 제어된다. 웰 (67) 내의 기질액에 피펫팁 (50) 의 선단부가 침지된 후, 자석 (M) 이 피펫팁 (50) 의 수용부의 외주로부터 이간되어 표지화 항체 결합 자성 입자의 구속이 해제되어, 표지화 항체 결합 자성 입자가 기질액과 혼합된다. 표지화 항체 결합 자성 입자가 기질액과 혼합된 후, 피펫팁 (50) 내에 대한 혼합액의 흡입 및 웰 (67) 에 대한 혼합액의 배출이 소정 횟수 실행되어, 표지화 항체 결합 자성 입자가 균일하게 분산된 현탁액이 형성된다. 이로써 표지화 항체 결합 자성 입자와 기질액을 균일하게 반응시킬 수 있다.
표지화 항체 결합 자성 입자를 기질액과 반응시켜 기질을 발색시키고, 그 후, 예를 들어, 웰 (67) 의 측면으로부터 특정 파장의 광속을 조사하여 그 흡광도가 검출된다. 또한, CLIA 검사와 같이, 발광 상태가 매우 짧은 검사법의 경우에는, 액수납부를 구성하고, 그 액수용부에 필터와 흡수 패드를 배치 형성하여, 피펫팁으로부터 액수용부 내에 전공정에서 흡인한 세정액과 함께 자성 입자를 토출하여, 필터에 자성 입자를 포집시킨 후, 노즐로부터 과산화수소수 (H2O2) 등의 발광 유발액을 공급하여 그 자성 입자를 발광시켜, 분주시의 발광을 PMT 등의 광학 측정 장치로 측정해도 된다.
4-2-2. 항원 분별 고정 튜브를 이용한 검출
도 21(e) 에 나타내는 바와 같이, 제 2 담체인 항원 분별 고정 튜브 (70) 를 사용하여 복수의 항원을 포착한 경우에는, 복수의 항원의 검출을 한 번에 실행할 수 있다. 본 발명의 측정 시스템에는 특정 파장의 광속을 조사하는 복수의 광 조사부, 항원 분별 고정 튜브 (70) 를 통해 각 광 조사부로부터의 광속을 수광하는 복수의 수광부, 수광부로부터의 출력 신호를, 예를 들어 증폭시켜 디지털화하여 발광 강도 데이터를 형성하는 신호 처리 회로 등이 구비되어 있다. 먼저, 기질액이 수용된 웰 (86) 에 항원 분별 고정 튜브 (70) 의 하단이 침지되고, 기질액이 항원 분별 고정 튜브 (70) 내로 흡입된다. 기질액의 흡입 및 배출을 소정 횟수 실행하여 충분히 발광 반응시킨다. 광 조사부 및 수광부는, 예를 들어, 각 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 에 대응하여 형성되어 있다. 광 조사부 및 수광부는 각 항체 고정 비즈 (74, 76, 78) 를 통해 대향하도록 배열되어 있다. 광 조사부로부터의 광속이 항원 분별 고정 튜브 (70) 의 각 비즈 (74, 76, 78) 를 통해 수광부에 의해 수광되어, 수광부로부터의 출력 신호를 기초로 하여, 각 비즈 (74, 76, 78) 마다의, 예를 들어 흡광도 데이터 혹은 발광 강도 데이터가 형성된다.
측정 시스템
5-1. 면역학적 측정 시스템
본 발명은 검체의 전처리를 실시하는 전처리 수단, 및 전처리 수단에 의해 전처리된 검체에 대해 면역학적 측정을 실시하는 면역학적 측정 수단을 포함하는 측정 시스템을 제공하는 것으로, 면역학적 측정 수단은 표지화 반응 수단, 및 검출 수단을 구비한다. 본 발명의 측정 시스템은, 검체의 전처리 공정에서 검출 공정까지 전자동화되어, 검체 중의 생체 관련 물질을 자동적으로 검출할 수 있다. 이미 상기에서 설명한 바와 같이, 전처리 공정, 그리고 측정 공정 (표지화 반응을 포함하는 경우도 있다) 은 각각 복수의 변형이 고려되어, 이들 전처리 공정 및 측정 공정의 조합에 따라 측정 시스템이 구성된다.
상기 서술한 바와 같이, 본원의 특징인 협잡물의 제거 수단은 주로 5 양태 있고, (i) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수단, (ii) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 어피니티 겔을 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수단, (iii) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 필터를 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수단, (iv) 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 플라스틱을 사용하여 비특이적 반응 인자를 포착 제거하는 수단, (v) 환원제가 고정된 겔을 사용하여 비특이적 반응 인자를 분해하는 수단 등의 양태가 가능하다. 표지화 반응 공정은, 주로 2 양태 있고, (i) 자성 입자 및 피펫팁을 이용한 표지화 반응 수단, (ii) 항원 분별 고정 튜브를 이용한 표지화 반응 수단이 가능하게 되어 있다.
검출 공정은, 표지화 반응 수단에 있어서 선택된 수단에 따라 선택되고, 예를 들어, 표지화 반응 수단에 있어서 (i) 자성 입자 및 피펫팁을 이용한 표지화 반응 수단을 선택한 경우에는, 자성 입자 및 피펫팁을 이용한 검출 수단을 선택하는 것이 바람직하고, 표지화 반응 수단에 있어서 (ii) 항원 분별 고정 튜브를 이용한 표지화 반응 수단을 선택한 경우에는, 항원 분별 고정 튜브를 이용한 검출 수단을 선택하는 것이 바람직하다. 또, (i) 자성 입자 및 피펫팁을 이용한 표지화 반응 수단과, (ii) 항원 분별 고정 튜브를 이용한 표지화 반응 수단의 양방을 탑재한 측정 시스템의 제조도 가능하다. 단, 이 경우, 노즐에 대한 피펫팁과 항원 분별 고정 튜브의 교체 부착 기구를 추가로 탑재하거나, 혹은 피펫팁용의 노즐과 항원 분별 고정 튜브용의 노즐의 양방을 탑재한다. 이상과 같이 협잡물의 제거 수단, 표지화 반응 수단, 및 검출 수단의 조합 순서로 적어도 열 가지 이상의 측정 시스템을 설계할 수 있고, 사용 목적 등에 따라 적절하게 개변하여 제조하면 된다. 이하에, 특히 바람직한 양태에 대해 나타낸다.
도 22 는 전처리 공정을 실행한 후에, 측정 공정을 실행하는 측정 시스템의 블록도이다. 이하에 자성 입자를 사용한 시스템에 대해 설명한다. 측정 시스템 (100) 은, 중앙 제어부 (102), 팁 위치 제어부 (104), 팁 마운트 제어부 (106), 자장 제어부 (108), 온도 제어부 (110), 펌핑 제어부 (112), 계시부 (114), RAM (116), ROM (118), 표시 패널 (120), 조작 인터페이스 (122) 등을 구비한다.
팁 위치 제어부 (104) 는, 서로 직행한 XYZ 축을 구비하여, 스텝 모터나 서보 모터에 의해 노즐의 위치를 제어한다. X 축 및 Y 축은 웰 플레이트와 거의 평행하게 서로 직행하고, Z 축은 웰 플레이트와 거의 수직을 이루고 있다. 노즐의 이동에 있어서는, 예를 들어, 웰 플레이트와 거의 평행한 이들 X 축 상 및 Y 축 상에서의 이동과, 웰 플레이트와 거의 수직인 Z 축 상에서의 이동의 2 단계로 노즐이 작동된다.
ROM (118) 에는 각종 제어 프로그램이 저장되어 있다. 사용자가 조작 인터페이스 (122) 를 통해 선택한 동작 모드에 따라 ROM (118) 으로부터 제어 프로그램이 RAM (116) 에 전개되고, 중앙 제어부 (102) 는 이 RAM (116) 에 전개된 제어 프로그램을 기초로 하여 시스템 (100) 의 각 부를 컨트롤하고 있다.
표시 패널 (120) 은 사용자에 대해 제시할 필요가 있는 항목을 표시한다. 예를 들어, 검체의 협잡물의 제거 처리시의 펌핑 횟수, 자성 입자 현탁 후의 정치 시간, 펌핑시의 유속의 완급, 흡입량 및 배출량, 피펫팁의 이동 속도의 완급 등은 표시 패널 (120) 에 표시할 수 있어, 사용자는 이 표시로 확인할 수 있다. 만약 각종 설정 내용을 변경하고자 하는 경우에는, 조작 인터페이스 (122) 의 조작을 통해 변경할 수 있다.
계시부 (114) 는 ROM (118) 으로부터 판독 출력된 프로그램에 따라 시간의 카운트를 실시한다. 시간의 카운트는, 예를 들어, 인큐베이트를 실시할 때나 펌핑을 실시할 때 등에 실시되고, 이로써 각 공정이 정확하게 실행된다.
자장 제어부 (108) 는 자석 (130) 의 배치를 관리하여 피펫팁에 부여하는 자장의 힘을 제어한다. 자장 제어부 (108) 는, 서로 직행한 XYZ 축을 구비하고, 스텝 모터나 서보 모터에 의해 자석 (130) 의 배치를 관리하고 있다. X 축 및 Y 축은 웰 플레이트와 거의 평행하게 서로 직행하고, Z 축은 웰 플레이트와 거의 수직을 이루고 있다. 자석 (130) 의 이동에 있어서는, 예를 들어, 웰 플레이트와 거의 평행한 이들 X 축 상 및 Y 축 상에서의 이동과, 웰 플레이트와 거의 수직인 Z 축 상에서의 이동의 2 단계로 자석 (130) 의 배치의 조절이 가능하게 되어 있다. 통상은 X 축 상 및 Y 축 상에서의 이동만을 실시하지만, 옵션으로 Z 축 상의 이동도 가능하게 되어 있다.
온도 제어부 (110) 는 히터 (136), 서멀 센서 (138) 등을 구비하여, 피펫팁에 수용된 액체의 온도를 관리한다. 히터 (136) 는 온도 제어부 (110) 로부터의 공급 전력에 의해 발열하고, 서멀 센서 (138) 는 피펫팁 내에 수용된 액체의 온도에 따라 온도 제어부 (110) 에 온도 신호를 송출한다. 온도 제어부 (110) 는 서멀 센서 (138) 로부터의 온도 신호를 기초로 하여 온도를 검지하여 히터 (136) 에 대한 공급 전력을 조절한다.
팁 마운트 제어부 (106) 는 노즐에 대한 피펫팁의 장착, 및 노즐로부터의 피펫팁의 탈착을 실시한다. 팁 마운트 제어부 (106) 는 웰 플레이트로부터 어느 정도 떨어진 장소에 배치되어, 만일 피펫팁 교환시에 피펫팁으로부터 액체가 비산된 경우에 콘터미네이션이 발생하지 않게 되어 있다. 팁 마운트 제어부 (106) 는 피펫팁을 파지하는 파지부와, 별도의 새로운 피펫팁을 준비하는 팁 준비부를 구비한다. 파지부가 피펫팁을 파지하면서 노즐이 Z 축을 따라 상승하면 노즐로부터 피펫팁이 탈착된다. 이어서, 노출이 된 노즐이 X 축 및 Y 축 상에서 이동하여 새로운 피펫팁의 상방으로 이동한다. 팁 준비부에서는 새로운 피펫팁이 마운트부를 상측에 선단부를 하측으로 한 상태에서 자세가 유지되어 있고, 노즐이 Z 축을 따라 하강함으로써 노즐에 새로운 피펫팁의 마운트부가 장착된다. 또한, 노즐과 핍펫팁의 걸어맞춤 양태로서는, 예를 들어, 클릭과 이 클릭이 끼워 넣는 절결을 이용한 걸어맞춤 형태, 보스와 리브를 이용한 걸어맞춤 형태, 수 나사와 암 나사를 이용한 걸어맞춤 형태 등이 있어, 적절하게 선택하면 된다.
펌핑 제어부 (112) 는 펌프 (140) 및 압력 센서 (146) 를 구비하고, 노즐 및 이 노즐에 장착된 피펫팁을 개재하여 실시되는 액체의 흡입과 배출을 제어한다. 펌프 (140) 는 실린더 형상으로 형성된 하우징과 이 하우징으로 자유롭게 이동할 수 있도록 끼워맞추어진 피스톤, 이 피스톤을 구동시키는 모터를 구비하고, 하우징 내는 노즐의 개구와 연통되어 있다. 피스톤의 움직임은, 예를 들어 서보 모터에 의해 제어되고, 서보 모터의 구동은 펌핑 제어부 (112) 로부터의 구동 제어 신호에 의해 제어되어 있다. 피스톤이 작동하면 노즐의 개구를 통해 액체의 흡입 또는 배출이 가능해진다.
노즐의 개구 내에는 압력을 검지하는 압력 센서 (146) 가 형성되고, 압력 센서 (146) 는 펌핑 제어부 (112) 에 압력 신호를 송출한다. 펌핑 제어부 (112) 는 이 압력 센서 (146) 로부터의 압력 신호를 기초로 하여 압력을 모니터링하고 있다. 이와 같은 구성에 의해, 예를 들어, 피펫팁의 선단부가 웰 내의 검체에 침지되었을 때, 펌핑 제어부 (112) 에 의해 검지된 압력이 미리 정해진 임계값을 웃돌고, 이것에 따라 서보 모터에 구동 제어 신호가 송출된다. 검체의 흡입시 및 배출시에도 압력 센서 (146) 로부터는 상시, 펌핑 제어부 (112) 에 압력 신호가 송출되고, 이로써 펌핑 제어부 (112) 는 높은 정밀도로 서보 모터의 구동을 컨트롤할 수 있어, 검체의 흡압이나 배압이 지나치게 낮거나 지나치게 높거나 하는 것을 모니터링하여, 이로써 미리 정해진 범위 내에서 흡입, 및 배출이 실행되고 있는지 관리할 수 있다. 또한, 협잡물의 제거 처리 수단은, 자장 제어부 (108), 펌핑 제어부 (112), 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자 등에 의해 구성된다. 교반 수단은, 피펫팁, 펌핑 제어부 (112), 펌프 (140), 압력 센서 (146) 등에 의해 구성된다. 또, 분취 수단은 자장 제어부 (108), 자석 (130) 등에 의해 구성된다.
상기 구성의 작용에 대해 설명한다. 협잡물의 제거 처리 공정이 개시되면, 웰 (12) 의 검체에 피펫팁의 선단부가 침지되고, 압력 센서 (146) 로부터의 압력 신호를 기초로 하여 펌프 (140) 가 작동한다. 피펫팁 내에 검체가 흡입된 후, 피펫팁이, 전처리용 자성 입자액이 수용된 웰 (12) 로 이동 제어되어, 피펫팁 선단이 전처리용 자성 입자액에 침지된다. 압력 센서 (146) 로부터의 압력 신호를 기초로 피펫팁의 선단부의 침지가 검지되면, 펌프 (140) 의 피스톤이 작동하여 펌핑이 개시된다. 펌핑이 개시되면, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자가 확산되어 현탁액이 형성된다.
현탁액이 형성되고 나서 소정 시간 경과 후, 펌프 (140) 를 작동시켜 현탁액을 피펫팁 (10) 내로 빨아 올린다. 피펫팁 (10) 으로 빨아 올려져 펌프 (140) 가 정지된 후, 자석 (130) 이 피펫팁의 수용부에 근접하여, 전처리용 자성 입자가 내벽면 상의 한 지점에 고정된다. 전처리용 자성 입자가 자석에 의해 한 지점에 고정된 상태에서, 펌프 (140) 가 작동하여 액체가 웰 내로 배출된다. 이로써, 협잡물이 제거되고 또한 비특이적 반응 인자가 결합한 전처리용 자성 입자를 검체로부터 분취하여 측정에 제공되는 측정 샘플을 제조할 수 있다.
검체에 함유되는 협잡물이 제거된 측정 샘플의 취득 후, 측정 샘플에 특이적 반응용 자성 입자를 첨가하여 검체로부터 항원을 추출하고, 다시 항원 결합 자성 입자를 효소 표지 항체로 표지화하여 표지화 항체 결합 자성 입자를 취득한다. 취득된 표지화 항체 결합 자성 입자를 기질액에 첨가하여 흡광도 등이 검출된다.
이와 같이, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자가 혼합된 검체가 펌핑됨으로써 검체가 교반되어, 자성 입자가 검체 중에서 이동하기 때문에 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자가 검체 중의 비특이적 인자와 조우하는 빈도가 높아져, 비특이적 반응 인자에 대한 항체에 비특이적 반응 인자를 보다 확실하게 결합시킬 수 있다. 그리고, 자석을 사용하여 비특이적 반응 인자가 결합한 자성 입자를 검체로부터 분취함으로써, 검체 중으로부터 비특이적 반응 인자를 효율적으로 제거할 수 있다. 또, 검체의 전처리에서 면역학적 측정까지를 일괄하여 연속적으로 실시할 수 있어, 사용자에게 편리성이 높은 시스템을 제공할 수 있다. 또한, 면역학적 측정 공정에서 사용되는 펌핑 기구, 팁, 웰에 알맞게 검체의 전처리를 실행하도록 한 점에서, 면역학적 측정 공정에 전처리 공정을 통합한 시스템을 구축했을 때의 펌핑 기구 등을 겸용할 수 있기 때문에 시스템의 거대화를 억제할 수 있다.
또, 상기한 바와 같이, 펌핑시에 구동하는 피스톤의 움직임은 압력 센서 (146) 로부터의 압력 신호를 기초로 서보 모터에 의해 제어되어 있기 때문에, 펌핑시에 흡입되는 액체의 양, 배출되는 액체의 양, 흡압, 및 배압은 높은 정밀도로 제어할 수 있어, 액체의 유동을 신속하게 컨트롤할 수 있다. 이로써, 상기한 자성 입자의 확산을 단시간에 실행할 수 있어, 전처리 시간의 단축화 등이 가능해진다. 또, 검체의 펌핑은, 피펫팁의 선단 개구가 검체에 침지된 상태에서 실시되기 때문에, 검체의 기포 발생 저감이나 검체가 접촉하는 분위기의 검체 중에 대한 혼잡을 저감시킬 수 있다.
또, 펌핑은 피펫팁 및 웰을 사용하여 실행되고, 이들 피펫팁이나 웰의 사이즈는 표지화 반응 공정이나 측정 공정에 있어서 사용되는 피펫팁 및 웰의 사이즈에 맞출 수 있어, 피펫팁 및 웰의 사이즈를 각각 통일함으로써 측정 시스템의 컴팩트화를 기대할 수 있다. 또한, 상기에서는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하지만, 비특이적 반응 인자가 고정된 마이크로 사이즈의 소구 (小球) 를 사용해도 된다. 이 경우, 이 소구를 통과하지 않는 메시 사이즈를 갖는 필터 등을 사용함으로써 검체로부터 비특이적 반응 인자가 고정된 소구를 분리할 수 있다.
또, 항원에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 표지화 반응 공정을 실행하는 측정 시스템은, 자석의 이동 패턴 등이 상이한 것 이외에는 기본적으로 도 22 에 나타낸 구성과 동일해진다.
이와 같은 장치를 사용함으로써, 예를 들어 전처리 공정에서는, 펌핑에 의해 검체는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 담체 또는 환원제가 고정된 담체를 유통시키기 때문에, 검체의 펌핑 횟수에 응답하여 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 담체 또는 환원제가 고정된 담체를 유통하는 횟수가 증가하여 비특이적 반응 인자가 비특이적 반응 인자에 대한 항체 또는 환원제에 조우할 가능성이 높아진다. 이로써, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 담체를 이용한 경우에는, 비특이적 반응 인자에 대한 항체에 비특이적 반응 인자를 보다 확실하게 결합시켜 담체에 비특이적 반응 인자를 포착시킬 수 있고, 환원제가 고정된 담체를 이용한 경우에는, 비특이적 반응 인자를 보다 확실하게 분해할 수 있다. 또, 상기한 바와 같이, 펌핑시에 구동하는 피스톤의 움직임은 압력 센서로부터의 압력 검지 신호를 기초로 서보 모터에 의해 제어되어 있기 때문에, 펌핑시에 흡입되는 액체의 양, 배출되는 액체의 양, 흡압, 및 배압은 높은 정밀도로 제어할 수 있어 액체의 유동을 신속하게 컨트롤할 수 있다. 이로써, 상기한 비특이적 반응 인자의 포착 또는 비특이적 반응 인자의 분해를 단시간에 실행할 수 있어, 전처리에 필요로 하는 시간을 보다 짧게 할 수 있다. 또, 펌핑은 피펫팁 및 웰을 사용하여 실행되고, 이들 피펫팁이나 웰의 사이즈는 표지화 반응 공정에서 사용되는 피펫팁 및 웰의 사이즈에 맞출 수 있어, 피펫팁 및 웰의 사이즈를 각각 통일시킴으로써 측정 시스템을 보다 컴팩트한 것으로 할 수 있다. 또한, 여기서 설명한 시스템은 어디까지나 일례로, 적절하게 변경해도 된다.
이와 같이 측정 시스템을 이용하여 면역학적 측정을 자동으로 실시하는 경우, 전처리에 있어서의 검체의 흡입이나 배출은 피펫팁의 선단부가 웰 내에 침지된 상태에서 실시함으로써 기포의 발생이나 검체의 비산을 저감시킬 수 있다. 또, 제 1 담체를 이용한 협잡물의 제거 처리 공정, 제 2 담체의 조제 공정, 그리고 표지화 반응 공정 및 측정 공정 모두가, 웰 내와 피펫팁 내, 혹은 웰 내와 피펫팁 내와 항원 분별 고정 튜브 내와 같은 장치 내가 한정된 장소에서 일관하여 실행되기 때문에, 처리 공정이 간략화됨과 함께, 잡균 등의 혼입을 저감시킬 수 있을 가능성이 높아, 콘터미네이션의 저감을 기대할 수 있다.
상기 실시형태에서는, 검체로부터, 비특이적 반응 인자를 제거하는 양태를 예시했지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 검체로부터 목적으로 하는 항원을 추출해도 된다. 목적으로 하는 항원과 특이적 반응하는 항체가 고정된 자성 입자를 검체에 첨가하여 현탁시키고, 현탁 후, 검체를 피펫팁 내로 흡입하여 피펫팁에 자석을 가까이하여 자성 입자를 구속한다. 자성 입자 구속 후, 피펫팁 내의 액체를 배출하고, 자성 입자와 결합한 항원을 세정함으로써, 협잡물을 없앨 수 있다. 이와 같은 전처리도 가능하다.
5-2. 핵산의 측정 시스템
또, 상기에서는, 면역학적 측정 전에 검체로부터 비특이적 반응 인자를 제거하는 전처리 공정을 실시하는 측정 시스템을 예시했지만, 본 발명은, 핵산의 측정 시스템에 사용할 수도 있다. 핵산의 측정 시스템으로서, 예를 들어 스탠포드 타입의 시스템에서는, 프로브 DNA 가 배열된 마이크로 어레이 팁 상에, 타겟 DNA 용액을 스포팅하여 하이브리다이즈시키고, 타겟 DNA 용액이 스포팅된 마이크로 어레이 팁을 수광 소자나 이미지 센서 등으로 검출하여 검출 데이터를 취득한다. 이 취득된 검출 데이터의 시그널을 보다 명확화하기 위해서, 프로브 DNA 와 타겟 DNA 의 하이브리다이제이션을 보다 확실하게 할 필요가 있다. 마이크로 어레이 팁 상의 프로브 DNA 와 타겟 DNA 의 확실한 하이브리다이제이션을 위해서는, 검체 중의 협잡물을 어떻게 제거할 수 있는가가 중요한 과제의 하나가 되어, 마이크로 어레이 팁 상에 스포팅되는 타겟 DNA 용액 중에 혼입한 협잡물이 적으면 적을수록, 퀄리티가 높은 검출 데이터를 취득할 수 있다. 이 타겟 DNA 용액 중의 협잡물을 제거하는 전처리로서 본 발명을 이용할 수도 있다.
예를 들어, 타겟 DNA 용액에 함유되는 협잡물을 제거하기 위해서, 웰에 타겟 DNA 를 함유한 검체를 수용하고, 검체 중의 협잡물과 친화성을 갖는 물질이 고정된 자성 입자를, 피펫팁을 사용하여 웰 내의 검체에 첨가하여 펌핑한다.
펌핑 후, 검체를 피펫팁 내로 흡입하고, 자석을 피펫팁에 가까이하여 자성 입자를 구속한다. 자성 입자를 구속하면서 액체를 웰에 배출함으로써, 검체로부터 협잡물을 제거할 수 있다. 이 협잡물이 제거된 검체로부터 타겟 DNA 용액을 제조함으로써 타겟 DNA 용액에 함유되는 협잡물을 저감시킬 수 있다. 또, 이 타겟 DNA 용액의 조제 공정에서 검출 데이터를 취득하는 공정까지를 1 개의 시스템으로 일관하여 자동화함으로써 처리 공정이 간략화됨과 함께, 콘터미네이션의 방지 이외에 편리성의 향상을 기대할 수 있다. 여기서는 타겟으로서 DNA 를 예시했지만, 이 기술은 cRNA 나 mRNA 등의 다른 핵산 타겟의 조제시에도 사용할 수 있다.
실시양태
상기에서 설명한 바와 같이, 전처리 공정, 및 측정 공정에 있어서의 각각의 양태의 조합을 변경함으로써, 여러가지 양태의 측정 시스템의 제조가 가능해진다. 전처리 공정, 표지화 반응 공정, 및 측정 공정이 가능한 조합 중 일례에 대해 이하의 실시양태에 예시한다.
[실시양태 1]
항원으로서 소화 기계의 암 검사시에 이용되는 CA19-9 를 사용한 것을 예시한다. 당연히 본 발명은 이들 실시양태에 한정되는 것은 아니다. 도 23 은, 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자를 사용하여 전처리가 실행된 후에 계속해서 면역학적 측정을 실행할 때의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 23 에 나타내는 바와 같이, 검체로서 혈청을 사용하여, 검체에 함유되는 글로블린 (비특이적 반응 인자) 과 결합 가능한 프로테인 A (비특이적 반응 인자에 대한 항체) 또는 프로테인 G (비특이적 반응 인자에 대한 항체) 중 적어도 어느 일방이 고정된 자성 입자 (이후, 전처리용 자성 입자라고 한다) 를 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 자성 입자로서 사용하여 검체의 전처리를 실시한다.
먼저, 웰 내의 혈청 중에 전처리용 자성 입자 (제 1 담체) 를 혼합하여 흡인과 토출을 반복하여 현탁한다. 현탁 후, 피펫팁의 수용부에 현탁액을 빨아 올리고, 수용부에 자장을 부여하여 자성 입자를 수용부의 한 지점에 구속하여 잔액을 웰에 배액한다. 이로써, 검체에 함유된 글로블린을 전처리용 자성 입자의 프로테인 A 또는 프로테인 G 에 포착시켜 제거할 수 있다. 보다 고정밀도로 글로블린을 제거하고자 하는 경우에는 이 협잡물의 제거 처리 공정을 적절하게 반복하면 된다. 또한, 검체에 함유되는 글로블린 등을 보다 높은 정밀도로 제거하는 경우에는, 효소 등의 단백 제거제의 병용 등도 유효하다.
글로블린을 제거하여 취득된 혈청에, 항 CA19-9 항체를 표면에 고정시킨 특이적 반응용 자성 입자 (제 2 담체) 를 혼합하여 현탁한다. 처리가 완료된 혈청 중의 CA19-9 항원은 항 CA19-9 항체에 결합하고, 이로써 CA19-9 항원이 특이적 반응용 자성 입자에 포착된다. 피펫팁의 수용부에 현탁액을 빨아 올리고, 수용부에 자장을 부여하여 항원 결합 자성 입자를 수용부의 한 지점에 구속하여 잔액을 웰에 배액한다. 수용부에 유지되어 CA19-9 항원이 결합한 항원 결합 자성 입자를, 별도의 웰에 수용된 세정액에 혼합하여 세정한다. 세정 후, CA19-9 항원이 결합한 항원 결합 자성 입자에 자장을 부여하여 세정액으로부터 분리한다. 세정액으로부터 분리된 항원 결합 자성 입자를, 별도의 웰에 수용된 효소 표지 항 CA19-9 항체액에 혼합하여 현탁한다. 이로써, CA19-9 항원은, 항 CA19-9 항체 및 효소 표지 항 CA19-9 항체와 샌드위치 결합의 형성이 가능해진다.
샌드위치 결합한 CA19-9 항원을 갖는 표지화 항체 결합 자성 입자에 자장을 부여하여 표지화 항체 결합 자성 입자를 현탁액으로부터 분리한다. 분리된 표지화 항체 결합 자성 입자를 세정액이 들어간 별도의 웰에 혼합하여 세정한다. 세정 후, 샌드위치 결합한 CA19-9 항원을 갖는 표지화 항체 결합 자성 입자에 자장을 부여하여 세정액으로부터 분리한다. 표지화 항체 결합 자성 입자를 별도의 웰에 수용된 기질액에 혼합하여 현탁한다. 효소 반응 시간의 경과 후, 현탁액을 측광하여 흡광도, 발광 강도 등을 측정한다.
[실시양태 2]
도 24 는 비특이적 반응 인자에 대한 항체가 고정된 칼럼을 사용하여 전처리가 실행된 후에 계속해서 면역학적 측정을 실행할 때의 플로우 차트를 나타내는 도면이다. 도 24 에 나타내는 바와 같이, 실시양태 1 과 동일하게, 검체로서 혈청을 사용하여, 검체에 함유되는 글로블린과 결합 가능한 프로테인 A 또는 프로테인 G 중 적어도 어느 일방이 고정된 어피니티 칼럼 (제 1 담체) 을 사용하여 혈청의 처리를 실시한다. 웰 내의 혈청을 칼럼 함유 피펫팁 내로 흡입하고, 어피니티 칼럼을 통해 피펫팁에 수용된 혈청을 웰에 배출한다. 이와 같은 혈청의 흡입 및 배출을 소정 횟수 실행함으로써 혈청에 함유된 글로블린을 어피니티 겔의 프로테인 A 또는 프로테인 G 에 결합시켜 제거할 수 있다. 웰에 배출된 처리가 완료된 혈청은 이 후, 실시양태 1 과 동일하게 반응 공정을 실시할 수 있다.
[실시양태 3]
본 양태에서는, 전처리는 도 8 ∼ 도 15 에서 이미 서술한 협잡물의 제거 처리 방법 중 어느 방법을 이용하여 실행하고, 측정은, 도 21 에 나타낸 항원 분별 고정 튜브를 사용하여 복수의 항원에 대해 각 항체 고정 비즈에 동시적으로 항원을 결합시켜 실행한다. 일정 시간 경과 후, 별도의 웰의 세정액을 흡입하여 항체 고정 비즈를 세정한다. 항체 고정 비즈의 세정 후, 효소 표지화액이 항원 분별 고정 튜브 내로 흡입된다. 효소 표지화액이 튜브 내로 흡입되어 각 항원에 효소 표지 항체가 결합한 후, 별도의 웰의 세정액을 흡입하여 항체 고정 비즈를 세정한다. 세정 후, 기질액이 항원 분별 고정 튜브 내로 흡입된다. 충분한 시간의 경과 후, 샌드위치 결합한 각 항체 고정 비즈의 흡광도, 또는 발광 강도 등이 측정된다.
이와 같이 복수 종류의 항체 고정 비즈가 배열된 항원 분별 고정 튜브를 사용하여 검체를 처리함으로써, 한 번에 복수의 항원을 포착할 수 있어, 조작을 간략화할 수 있음과 함께, 검체 중의 항원의 검출 시간을 극적으로 단축화할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 전처리는, 도 8 ∼ 도 15 에 예시한 협잡물의 제거 처리 방법 중 어느 방법을 이용하여 실행하고, 측정은, 전처리 후에, 종래의 ELISA 에 따라 실행해도 된다. 예를 들어, 도 8 ∼ 도 15 에 나타낸 협잡물의 제거 처리 방법 중 어느 방법을 이용하여 협잡물의 제거 처리를 실행한다. 별도의 웰에는 항원에 대한 항체가 미리 고정되어 있고, 협잡물의 제거 처리에 의해 비특이적 반응 인자가 제거된 혈청을 이 웰에 첨가하면, 처리가 완료된 검체 중의 항원이 웰의 항체에 결합 가능해진다. 세정 후, 효소 표지 항체를 함유한 표지화 액체를 이 웰에 첨가하여 항체 결합한 항원에 효소 표지 항체가 결합 가능해진다. 세정 후, 기질액을 첨가하여 발색시키고, 적절하게 발색 반응 정지액을 첨가한다. 발색한 웰이 흡광도 계측기에 세트되어 흡광도 등이 계측된다. 이와 같은 공정을 실행하는 측정 시스템도 가능하다.
[실시양태 4]
검체의 전처리에서 목적으로 하는 물질의 검출까지를 실시하기 위해서, 본 발명에 있어서는, 검체를 수용하기 위한 수용부, 협잡물을 검체로부터 제거하기 위한 자성 입자를 미리 수용해 두기 위한 수용부, 검체 중의 항원의 표지화용의 항체가 결합한 자성 입자를 미리 수용해 두기 위한 수용부, 기질액을 미리 수용한 수용부 등을 미리 일체화한 시약 카트리지를 사용하여 검체의 전처리를 포함하는 일련의 공정을 실시해도 된다. 또, 카트리지를 사용한 검체의 처리 시스템은, 협잡물의 제거 처리 공정뿐만 아니라, 이 협잡물의 제거 처리 공정에 계속되는 표지화 반응 공정이나 이 표지화 반응 공정을 포함하는 측정 공정을 일관하여 실행할 수 있도록 해도 된다. 이와 같은 카트리지를 사용한 측정 시스템에 대해 이하에 설명한다. 도 25 는, 전처리용의 자성 입자나 기질액을 미리 수용한 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 개략을 나타내는 도면이다. 도 26 은, 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 작동 형태에 대해 개략적으로 설명하는 도면이다. 도 25, 도 26 에 나타내는 바와 같이, 측정 시스템 (150) 은, 자석 (151), 분주 장치 (152), 히트 블록 (153), 검출 장치 (154), 배치 제어 장치, 중앙 제어 장치 등을 구비한다.
분주 장치 (152) 는 펌프 (160), 노즐 (162) 을 구비하고, 노즐 (162) 에는 피펫팁 (164) 을 자유롭게 착탈할 수 있도록 마운트할 수 있다. 검출 장치 (154) 는 광 전자 증배관 (이후, PMT 라고 한다) (172), 광원 (170) 을 구비하고, 광원 (170) 으로부터의 광을 PMT (172) 로 수광하고 이것에 응답하여 PMT (172) 로부터 신호가 출력된다. 도 26 에 나타내는 바와 같이, 예를 들어, 노즐 (162), 후술하는 PMT (172), 및 광원 (170) 은 중앙 제어 장치에 의해 수직 방향으로 이동 제어되고, 자석 (151) 이나 시약 카트리지인 카트리지 (180) 는 중앙 제어 장치에 의해 수평 방향으로 이동 제어된다.
카트리지 (180) 는, 폭이 좁고 길게 형성된 베이스 패널 (181) 과 복수의 수용부 (182) 를 구비하고, 패널 (181) 의 길이 방향의 일단으로부터 타단을 향해 복수의 수용부 (182) 가 배열되어 있다. 카트리지 (180) 는, 베이스 패널 상에 형성된 베이스 (181) 와 복수의 수용부 (182) 가 일체로 형성되어 있다. 각 수용부 (182) 는 베이스 패널 상에 개구되어, 피펫팁 (164) 의 수용이 가능하게 되어 있다.
카트리지 (180) 에 구비되는 수용부 (182) 로서, 전처리용의 자성 입자액이 수용된 수용부, 검체를 수용하기 위한 수용부, 표지화용의 항체가 결합한 자성 입자액을 수용한 수용부, 표지화용의 자성 입자에 결합한 항원을 세정하기 위한 세정액이 수용된 수용부, 발색 반응을 일으키기 위한 기질액을 수용한 수용부 등을 구비한다. 또한, 카트리지 (180) 에 구비되는 수용부로서 상기를 예시했지만, 수용부의 종류는 이것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 전처리만을 실행할 수 있도록 카트리지에 수용부를 구비해도 된다.
베이스 패널 (181) (예를 들어 그 중앙부) 에는 흡광도를 측정하기 위한 수용부 (182a) 가 형성되고, 이 수용부 (182a) 의 상측에는 PMT (172) 를 장착하기 위한 마운트 (184) 가 배치되어 있다. 베이스 패널 (181) 이나 수용부 (182) 는 알루미늄 시일 등에 의해 차광되고, PMT (172) 는 마운트 (184) 에 광밀하게 끼워맞추어진다. 검출용 수용부 (182a) 의 저부는 광원 (170) 과 광밀하게 끼워맞출 수 있고, 검출용 수용부 (182a) 의 저부에 끼워맞춰진 광원 (170) 으로부터 방사되는 조사광을 PMT 로 수광하여 포톤을 계수할 수 있다.
카트리지 (180) 는 도시되지 않은 카트리지 컨트롤러에 의해 노즐 (162) 이나 PMT (172) 에 대한 위치가 결정된다. 카트리지 컨트롤러는 카트리지 (180) 를 수평 방향으로 이동시켜 분주 장치 (152) 나 검출 장치 (154) 에 대한 카트리지 (180) 의 위치를 결정한다. 카트리지 (180) 의 배치가 제어됨으로써, 예를 들어 피펫팁에 대해 적절하게 카트리지를 배치시킬 수 있어, 협잡물의 제거 처리 공정, 표지화 반응 공정, 검출 공정에 있어서의 피펫팅이나 흡광도 측정을 순조롭게 실행할 수 있다.
카트리지 (180) 의 수용부 (182) 는, 예를 들어, 협잡물의 제거 처리를 실시하기 위한 제 1 부 (187) 와, 표지화 반응 공정이나 검출 공정을 실시하기 위한 제 2 부 (188) 를 갖는다. 또한, 카트리지 (180) 에 인큐베이션을 실시하기 위해서 히터 (153) 의 장착이 가능한 수용부를 형성하는데, 이 히터용의 수용부는 측정 시스템의 목적에 따라 적절하게 생략해도 된다.
카트리지 (180) 를 이용하는 측정 시스템 (150) 의 작용에 대해 이하에 설명한다. 카트리지 (180) 의 마운트 후, 미리 카트리지 (180) 의 제 1 수용부에 수용된 자성 입자액이 피펫팁 (164) 내로 빨아 올려져 제 2 수용부 내로 배출되어 펌핑된다. 도 27 은, 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 전처리 공정에 대해 나타낸 도면이다. 도 27 에 나타내는 바와 같이, 펌핑 후, 제 2 수용부 내의 액체가 피펫팁 (164) 내로 빨아 올려져 협잡물이 결합한 자성 입자가 자석 (151) 에 의해 분리되고, 협잡물이 제거된 측정 샘플이 제 3 수용부에 배출된다. 제 3 수용부에는, 표지화용의 자성 입자와 측정 샘플의 혼합액이 수용되고, 이 혼합액이 펌핑되어 피펫팁 내로 빨아 올려진다. 혼합액의 흡인 후, 자석에 의해 항원이 일체된 자성 입자가 분리되어, 제 4 수용부에 투입된다. 자성 입자와 일체된 항원은, 제 4 수용부 내에 미리 수용된 세정액에 의해 세정되고, 세정액과 항원의 혼합액은 피펫팁 내로 빨아 올려진다. 피펫팁 내로 빨아 올려진 이 혼합액으로부터 항원과 일체된 자성 입자가 자석 (151) 에 의해 분리되어, 항원이 검출용의 제 5 수용부 (182a) 에 투입된다.
도 28 은 카트리지를 이용하는 측정 시스템의 측정 공정에 대해 나타낸 도면이다. 도 28 에 나타내는 바와 같이, 제 5 의 수용부 (182a) 내에는 기질액이 미리 수용되어 있고, 이 기질액과 항원이 반응하여 발색되어 흡광도가 검출된다. 또한, 검체 중의 협잡물을 제거 처리할 때, 멤브레인, 어피니티 칼럼, 혹은 환원제가 고정된 겔을 사용하여, 검체에 함유되는 협잡물을 제거 처리하고자 하는 경우에는, 노즐 (162) 에 멤브레인을 구비한 피펫팁, 어피니티 칼럼을 함유하는 피펫팁, 혹은 환원제가 고정된 겔을 함유하는 피펫팁을 장착하여 검체를 처리한다. 예를 들어 도 28 에 나타내는 바와 같이, 멤브레인을 구비한 피펫팁 (190) 을 사용하여 검체에 함유되는 협잡물을 제거 처리하는 경우에는, 노즐 (162) 에 멤브레인을 구비한 피펫팁 (190) 을 장착하여 검체를 처리한다. 이로써, 측정 시스템 (150) 에 있어서의 협잡물의 제거 처리 수법의 변형을 확보할 수 있어, 시스템의 편리성을 높일 수 있다.
이상과 같이, 검체의 전처리 공정을 포함하는 일련의 공정에서 필요한 수용부를 미리 카트리지 (180) 에 형성하고, 이 카트리지 (180) 를 측정 시스템 (150) 에 마운트하여 사용함으로써, 사용자는 자성 입자액이나 세정액 등의 조제에 관련된 수고를 생략할 수 있어, 측정 시스템 (150) 의 운용에 있어서의 편리성을 높일 수 있다.
상기 양태에서는, 피펫팁을 수직 방향으로 이동시키고 카트리지를 수평 방향으로 이동시켜 전처리를 실행했지만, 전처리의 실행 수법은 이것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 카트리지를 고정시키고, 피펫팁을 수평 방향 및 수직 방향으로 이동시켜 검체의 전처리를 실행해도 된다. 카트리지를 고정시킴으로써, 웰 내의 액체가 외부로 날아 나오지 않게 시스템을 설계하는 수고를 줄일 수 있어, 보다 간편한 측정 시스템의 제공이 가능해진다.
상기 실시양태 4 에서는, 중앙부에 기질액이 미리 수용된 수용부 (182a) 를 형성하고, 단부 (端部) 에 배양용의 히터 (153) 의 장착이 가능한 수용부를 형성한 카트리지 (180) 를 예시했지만, 카트리지에 있어서의 수용부의 배열 순서는 이것에 한정되지 않는다. 도 29 는, 개별 형태의 카트리지에 대해 개략적으로 나타낸 도면이다. 예를 들어, 도 29 에 나타내는 바와 같이, 카트리지가 마운트되는 측정 시스템 본체의 구성에 알맞게 적절하게 변경해도 된다. 도 29 에 도시한 형태에서는, 카트리지 (200) 의 중앙부에 히터 (153) 의 장착이 가능한 수용부 (202a) 를 형성하고, 단부에 기질액이 미리 수용된 수용부 (202b) 를 형성한다. 이와 같이 수용부의 배열 순서를 처리 내용을 감안하여 적절하게 변경함으로써 보다 효율적인 검체의 처리를 실시할 수 있다.
또, 상기 실시양태에서는, 자성 입자액을 수용부 (182) 에 미리 수용시켰지만, 자성 입자액을 미리 유지한 피펫팁을 사용하거나, 혹은, 검체 중의 협잡물을 흡착하는 담체를 구비한 피펫팁을 사용하여 검체의 전처리를 실행해도 된다. 이 경우, 이와 같은 피펫팁에 알맞게 카트리지의 수용부의 구성을 적절하게 변경할 필요가 있다.
또, 상기에서는, 제 1 부 (187) 와 제 2 부 (188) 가 일체 형성된 카트리지 (180) 를 예시했지만, 제 1 부 (187) 와 제 2 부 (188) 를 자유롭게 조합할 수 있도록 구성해도 된다. 제 1 부 (187) 와 제 2 부 (188) 를 자유롭게 조합할 수 있는 구성으로 함으로써, 검체에 대해, 협잡물의 제거 처리만을 실행하고자 하는 경우, 전처리 공정을 제외한 표지화 반응 공정에서 검출 공정까지만을 실행하고자 하는 경우, 혹은 전체 공정을 실행하고자 하는 경우에, 사용자는 각각의 경우에 따라 제 1 부, 제 2 부, 제 1 부와 제 2 부의 조합의 어느 것을 선택할 수 있어, 보다 편리성이 높은 측정 시스템을 제공할 수 있다.
상기 실시양태에서는 검출 대상의 항원으로서 CA19-9 를 사용한 것을 예시했지만, 검출 대상은 이것에 한정되지 않고, 예를 들어, 류머티즘 인자, 유리 사이록신 (F-T4), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 인슐린, α 태아성 단백 (AFP) 등의 단순 단백 또는 복합 단백, 스테로이드 호르몬, 펩티드 호르몬 등에 대한 적용도 가능하다.
6. 핵산 측정 시스템
본 발명의 다른 예로서, 본 발명을 핵산 검출 분야에 사용한 양태에 대해 이하에 설명한다. 검체로부터 핵산을 추출하고 이 추출된 핵산을 증폭시켜 측정하는 경우, 제 1 담체로서 표적 핵산에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 것을 사용하여 검체로부터 표적 핵산을 추출하고, 제 2 담체로서 표적 핵산의 검출용 시약을 고상화하여 이루어지는 것을 사용하여 표적 핵산을 측정할 수 있다. 이 측정 시스템에서는, 검체 중의 표적 핵산을 검출하는 공정 전에, 제 1 담체를 이용하여 핵산을 추출하는 공정이 실행된다. 또한, 본 발명의 시스템에서는, 생체 관련 물질과 친화성을 갖는, 및/또는 생체 관련 물질을 표지화하는 물질이 고정된 제 2 담체를 조제하는 공정을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서는, 이와 같은 제 1 담체를 이용한 핵산의 추출 공정 및 제 2 담체의 조제 공정을 포함하는 전처리를 1 개의 시스템으로 일관하여 실시하는 것이다. 이하, 본 발명을 이용하여 핵산을 검출하는 공정에 대해 설명한다.
도 30 은 검체로부터의 핵산의 추출에서 제 2 담체의 조제까지의 전처리 공정, 그리고 검출 공정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 30 에 나타내는 바와 같이, 표적 핵산의 측정 시스템에서는, (i) 표적 핵산에 대해 친화성을 갖는 물질이 고정된 담체 (제 1 담체) 를 사용하여 검체로부터 표적 핵산을 추출하는 공정, (ii) 생체 관련 물질과 친화성을 갖거나 혹은 생체 관련 물질을 표지화하는 적어도 어느 것의 기능을 갖는 담체 (제 2 담체) 를 조제하는 공정, (iii) 조제된 제 2 담체를 이용하여 표적 핵산을 표지화하여 검출하는 공정이 실시되고, 바람직하게는, 전처리 (i) ∼ (iii) 를 일관하여 실시하는 것이다. 검체는, 사용자에 의해 측정 시스템에 구비되어 웰 (250) 에 수용된다.
6-1. 검체로부터 표적 핵산을 추출하는 공정
표적 핵산을 취득하기 위해, 핵산 포착용의 프로브가 고정된 제 1 담체인 자성 입자 (이후, 핵산 포착용 자성 입자라고 한다) 가 구비된 피펫팁 (분주팁이라고도 한다) 이 노즐에 장착된다. 웰에 수용된 검체가 피펫팁에 빨아 올려져 핵산 포착용 자성 입자와 혼합된다. 혼합 후, 핵산 보충용 자성 입자에 고정된 프로브에 표적 핵산이 특이적으로 결합하여 핵산 포착용 자성 입자에 포착된다.
표적 핵산이 결합한 핵산 포착용 자성 입자가 피펫팁 내로 빨아 올려진 상태에서, 피펫팁에 자석이 가까워져 핵산 포착용 자성 입자가 피펫팁 내에 구속된다. 핵산 보충용 자성 입자가 자석에 의해 구속된 피펫팁이 웰로부터 떨어져 세정액을 수용한 웰로 이동하여 자석이 멀어짐으로써, 핵산 포착용 자성 입자가 세정액 내로 해방된다. 세정액에 의해 핵산 포착용 자성 입자를 세정한 후, 시약 등을 첨가하여 표적 핵산을 자성 입자로부터 분리시켜 표적 핵산을 취득할 수 있다.
6-2. 취득된 표적 핵산을 검출하기 위한 담체를 조제하는 공정
한편, 추출된 표적 핵산을 검출하기 위해서, 생체 관련 물질과 친화성을 갖고 또한 생체 관련 물질을 표지화하는 물질이 고정된 담체가 조제된다. 표적 핵산의 검출에서는 표적 핵산의 표지화 및 증폭이 실시되고, 표지화법 및 증폭법으로서는, PCR 법, PT-PCR 법, 리얼타임 PCR 법, LAMP 법, RT―LAMP 법, ICAN 법, SDA 법, RCA 법, NASBA 법 등 공지된 방법을 이용할 수 있다. 리얼타임 PCR 법은 여러가지 수법이 존재하지만, 예를 들어 인터카레이션법, 하이브리다이제이션법, LUX 법 등이 가능하다.
핵산의 표지화 및 증폭에는, 핵산의 표지화 및 증폭용의 프로브나 프라이머를 함유하는 고상화된 마스터믹스처 (MMX) 를 사용할 수 있다. 리얼타임 PCR 법을 이용하는 경우, 증폭 처리하는 핵산의 종류에 알맞게 핵산 증폭용의 프라이머나 프로브를 적절하게 선택하는 것이 바람직하다. 프로브, 프라이머로서는, 예를 들어, TaqMan (등록 상표) 프로브, FRET 프로브, LUX 프라이머 등 여러 가지의 것을 사용할 수 있다. 프로브는 표적 핵산을 표지화하기 위한 표지를 구비하고 있고, 이 표지를 구비한 프로브가 표적 핵산과 하이브리다이즈함으로써 표적 핵산이 표지화된다. 프라이머 및 프로브는 검출 대상의 핵산의 종류에 따라 적절하게 설계할 수 있다. 예를 들어, 리얼타임 PCR 법으로서 하이브리다이제이션법을 이용하는 경우, 표적 핵산은, 열변성, 어닐링, 및 신장 반응이 실시되어, 표적 핵산이 표지화된다.
본 발명에 있어서는, 표적 핵산의 검출을 실행하기 전에, 핵산의 증폭에 사용되는 시약을 미리 조제하고, 이것을 고상화하여 웰 내에 수용함으로써, 고상화된 시약 (이후, 고상화 시약이라고 한다) 을 고정시킨 웰 (제 2 담체) 이 제조된다. 핵산의 증폭시에는 이 고상화 시약에 완충액, 핵산 등을 주입함으로써 표적 핵산의 표지화 및 증폭이 개시된다. 대용량의 마스터믹스처를 사용함으로써, 측정 공정시, 측정용 샘플을 수용하기 위한 웰에 분주하는 것이 가능해져, 작업 효율을 향상시킬 수 있다. 시약을 고상화하는 방법에 대해서는 특별히 한정하지 않지만, 시약을 동결 건조시키면 편리성이 높아져, 작업 효율의 개선을 기대할 수 있다.
마스터믹스처의 시약을 동결 건조시키는 경우에는, 예를 들어, 표적 핵산을 증폭시키기 위한 프라이머 및 프로브, 및 그 보호 안정시키기 위한 사카라이드류나 폴리비닐피롤리돈 등의 보호 안정화제를 혼합시키고, 소정 온도에서 냉각시켜 감압함으로써 제조할 수 있다. 조정시의 압력, 냉각 온도, 및 냉각 시간은, 목적으로 하는 마스터믹스처의 성질에 알맞게 적절하게 변경해도 된다. 또, 본 발명에 있어서는, 동결 건조시켰을 때에 동결 건조품이 용기 내에 고상으로서 (제 2 담체로서) 고정화되도록, 수크로오스, 락토오스, 또는 트레할로오스 등을 혼합하는 것이 바람직하다. 이로써, 예를 들어 동결 건조된 시약을 용기 내벽에 막 형상으로 층설시켜 고정시킬 수 있다.
6-3. 표적 핵산을 검출하는 공정
표적 핵산의 검출은, 고상화 시약을 구비한 웰에 표적 핵산을 주입하여 실시된다. 표적 핵산의 주입 후, 표적 핵산이 고상화 시약에 함유되는 프로브와 하이브리다이즈하여 검출이 가능해지고, 예를 들어, 발광, 형광 등을 측정함으로써 표적 핵산을 검출할 수 있다. 검출 디바이스로서, 예를 들어, 이미지 센서를 탑재한 형광 레이저 현미경을 사용함으로써 표적 핵산의 화상 데이터를 취득할 수 있고, 이 화상 데이터를 적절하게 해석함으로써 형광 강도 등을 산출할 수 있다. 이와 같이 형광 강도를 산출함으로써 표적 핵산의 검출을 실시할 수 있다.
다음으로 상기 각 공정을 자동적으로 실행하는 시스템에 대해 설명한다. 상기 순서를 자동적으로 실행하는 측정 시스템은, 검체를 수용하여 표적 핵산을 취득하는 측정 샘플의 취득 장치, 취득된 측정 샘플을, PCR 법 등을 이용하여 증폭시켜 검출하는 검출 장치를 구비한다.
측정 샘플의 취득 장치는, 예를 들어, 검체를 수용하는 웰이나 시약을 수용하는 웰을 갖고, 검체를 수용하는 웰에는, 조직, 세포, 체액 등 사용자에 의해 취득된 검체가 수용된다. 또한, 검체가 조직이나 세포편인 경우에는, 미리 미세하게 해 두는 것이 바람직하다.
시약을 수용하는 웰은, 복수의 웰, 피펫팁, 검체를 용해시키기 위한 시약, 용해된 검체에 투입되어 표적 핵산과 특이적으로 결합하는 프로브가 고정된 자성 입자, 자성 입자를 피펫팁 내에 구속하기 위한 자석, 표적 핵산과 이 핵산과 프로브를 개재하여 특이적으로 결합한 자성 입자를 분리하여 용출하는 용출 시약 등을 구비하고, 검체를 수용하는 웰에 수용된 검체로부터, DNA 나 RNA 등의 표적 핵산을 추출한다.
또한, 시약을 수용하는 웰은, 검체로부터 추출된 표적 핵산을 표지화 및 증폭시키기 위한 고상화된 시약을 수용하는 웰을 구비하고, 웰 내에는, 예를 들어, 완충액, 프라이머, 프로브, 핵산 폴리멜라아제, 증류수, 세정액 등을 고상화하여 수용한다. 고상화된 시약은, 예를 들어, 각 시약을 일체로 혼합하고, 다시 동결 건조시킴으로써 제조할 수 있다 (동결 건조 마스터믹스처).
표적 핵산의 추출은, 검체를 용해시켜 이 용액과, 표적 핵산과 특이적으로 결합하는 프로브가 고정된 자성 입자를 혼합하고, 혼합 후에 자석을 사용하여 표적 핵산이 결합한 자성 입자를 피펫팁 내에 구속하여 분리하고, 이 분리된 자성 입자를 세정한 후에 표적 핵산을 용출함으로써 실행할 수 있다.
검출 장치는 검체로부터 추출된 표적 핵산을 증폭시켜 검출하는 동작을 실행한다. 핵산의 증폭 수법으로서는, 예를 들어 리얼타임 PCR 법을 들 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 시약을 수용하는 웰에 수용된 동결 건조 마스터믹스처를 사용하여 리얼타임 PCR 법에 따라 실행할 수 있다. 검출 장치는 핵산 증폭용의 반응 용기와 이 반응 용기의 온도를 조절하는 온도 조절부 등을 구비하여, 핵산의 열변성, 어닐링, 신장 반응의 각 공정을 반복하여 실행할 수 있다. 표적 핵산의 증폭 후, 표지화된 표적 핵산에, 예를 들어, 여기용의 전자파를 조사하는, 형광 반응용의 기질액을 첨가하고 나서 표적 핵산을 스캐너 등으로 스캔함으로써 표적 핵산을 검출할 수 있다.
상기 시스템을 보다 구체화한 것에 대해 이하에 설명한다. 도 31 은 표적 핵산의 추출에서 검출까지 실행하기 위한 웰을 상부로부터 나타낸 도면이다. 도 31 에 나타내는 바와 같이, 표적 핵산의 측정 시스템 (480) 은 처리 라인을 구비하고, 도 31 은 제 1 처리 라인 (500A) 에서 제 12 처리 라인 (500L) 까지의 12 열의 처리 라인을 예시한 도면이다. 각 처리 라인 (500A ∼ 500L) 에서는, 예를 들어, 검체를 수용하는 웰 (502), 용해액을 수용하는 웰 (504), 완충액을 수용하는 웰 (506), 자성 입자를 수용하는 웰 (508), 검체로부터 추출된 핵산을 세정하기 위한 세정액이나 피펫팁을 세정하기 위한 세정액이 수용된 웰 (510), 자성 입자와 표적 핵산을 분리하는 용출액을 수용한 웰 (512), 검체로부터 핵산을 추출하여 이루어지는 측정 샘플을 일시적으로 수용하는 웰 (514), 측정 샘플을 표지화하여 표적 핵산을 검출하기 위한 고상화된 마스터믹스처를 수용한 웰 (516) 이 배열되어 있다.
제 1 ∼ 제 12 처리 라인 (500A ∼ 500L) 의 상방에는, 각 처리 라인 (500A ∼ 500L) 에 대응하여 12 개의 노즐이 라인 방향 P (도시 생략) 으로 자유롭게 이동할 수 있도록 형성되고, 각 노즐에 피펫팁이 적절하게 장착된다. 측정 시스템 (480) 은, 예를 들어, 웰을 배치하는 스페이스를 외부로부터 격리하기 위한 차폐문을 구비하고, 이들 제 1 ∼ 제 12 처리 라인에 형성된 웰은, 이 격리문에 의해 외부로부터 차단할 수 있다. 상기에서는 12 열의 처리 라인을 구비한 장치를 예시했지만, 처리 라인의 개수는 이것에 한정되지 않고, 예를 들어, 1 개나 2 개이어도 되고, 또, 처리능을 더욱 높이기 위해서 20 개, 30 개로 해도 된다.
도 32 에 나타내는 바와 같이, 측정 시스템 (480) 은, 중앙 제어부 (532), 팁 위치 제어부 (534), 팁 마운트 제어부 (536), 자장 제어부 (538), PCR 유닛 (540), 펌핑 제어부 (542), 검출부 (545), RAM (548), ROM (550), 표시 패널 (552), 조작 인터페이스 (554), 계시부 등을 구비한다.
팁 위치 제어부 (534) 는 서로 직행한 XYZ 축을 구비하고, 스텝 모터나 서보 모터에 의해 노즐의 위치를 제어한다. XYZ 축은, 예를 들어, X 축이 처리 라인에 있어서의 웰의 배열 방향과 거의 평행을 이루고, Y 축이 X 축과 거의 수직을 이룸과 함께 각 열을 횡단하는 방향과 거의 평행을 이루고, Z 축은 X 축 및 Y 축이 이루는 면과 거의 수직을 이루고 있다. 검체의 처리가 개시되어 각 노즐이 이동하는 경우에는, 예를 들어, 이들 X 축 상에서의 이동과, Z 축 상에서의 이동의 2 단계에서 노즐이 구동됨으로써, 각 처리 라인 (500A ∼ 500L) 을 따른 처리가 실행된다.
팁 마운트 제어부 (536) 는 노즐에 대한 피펫팁의 장착, 및 노즐로부터의 피펫팁의 탈착을 실시한다. 팁 마운트 제어부 (536) 는 피펫팁을 파지하는 파지부와, 별도의 새로운 피펫팁을 준비하는 팁 준비부를 구비한다. 파지부가 피펫팁을 파지하면서 노즐이 Z 축을 따라 상승하면 노즐로부터 피펫팁이 탈착된다. 노출된 노즐이 X 축 및 Y 축 상에서 이동하여 새로운 피펫팁의 상방으로 이동한다. 팁 준비부에서는 새로운 피펫팁이 마운트부를 상측으로 선단부를 하측으로 한 상태에서 자세가 유지되어 있고, 노즐이 Z 축을 따라 하강함으로써 노즐에 새로운 피펫팁의 마운트부가 장착된다.
펌핑 제어부 (542) 는 펌프 (580) 및 압력 센서 (582) 를 구비하고, 노즐 및 이 노즐에 장착된 피펫팁을 개재하여 실시되는 액체의 흡입과 배출을 제어한다. 펌프 (580) 는 실린더 형상으로 형성된 하우징과 이 하우징으로 자유롭게 이동할 수 있도록 끼워맞추어진 피스톤, 이 피스톤을 구동시키는 모터를 구비하고, 하우징 내는 노즐의 개구와 연통되어 있다. 피스톤의 움직임은, 예를 들어 서보 모터에 의해 제어되고, 서보 모터의 구동은 펌핑 제어부 (542) 로부터의 구동 제어 신호에 의해 제어되어 있다. 피스톤이 작동하면 노즐의 개구를 통해 유체의 흡입 또는 배출이 가능해진다.
노즐의 개구 내에는 압력을 검지하는 압력 센서 (582) 가 형성되고, 압력 센서 (582) 는 펌핑 제어부 (542) 에 압력 신호를 송출한다. 펌핑 제어부 (542) 는 이 압력 센서 (582) 로부터의 압력 신호를 기초로 하여 압력을 모니터링하고 있다. 이와 같은 구성에 의해, 예를 들어, 피펫팁의 선단부가 웰 내의 유체에 침지되었을 때, 펌핑 제어부 (542) 에 의해 검지된 압력이 미리 정해진 임계값을 웃돌아, 이것에 따라 서보 모터에 구동 제어 신호가 송출된다. 유체의 흡입시 및 배출시에도 압력 센서 (582) 로부터는 상시, 펌핑 제어부 (542) 에 압력 신호가 송출되고, 이로써 펌핑 제어부 (542) 는 높은 정밀도로 서보 모터의 구동을 컨트롤할 수 있다. 이와 같은 구조에 의해 피펫팁이 장착된 노즐은 유체의 빨아 올림 및 토출을 실행할 수 있어, 유체의 교반을 실시할 수 있다.
ROM (550) 에는 각종 제어 프로그램이 저장되어 있다. 사용자가 조작 인터페이스 (554) 를 통해 선택한 모드에 따라 ROM (550) 으로부터 판독 출력된 제어 프로그램이 RAM (548) 에 전개되고, 중앙 제어부 (532) 는 이 RAM (548) 에 전개된 제어 프로그램을 기초로 하여 측정 시스템 (480) 의 각 부를 컨트롤하고 있다.
ROM (550) 에 기억하는 처리 프로그램으로서는, 예를 들어, (1) 세포나 바이러스로부터 RNA 를 추출하여 PCR 반응 후에 PCR 산물의 검출을 실행하는 제 1 프로그램, (2) 혈액 등의 생체 샘플로부터 DNA 를 추출하여 PCR 반응 후에 PCR 산물의 검출을 실행하는 제 2 프로그램, (3) 대장균 등의 세균으로부터 플라스미드 DNA 를 추출하는 제 3 프로그램 등이 있다.
표시 패널 (552) 은 사용자에 대해 제시할 필요가 있는 항목을 표시한다. 예를 들어, 핵산 추출시의 펌핑 횟수, 자성 입자 현탁 후의 정치 시간, 펌핑시의 유속의 완급, 흡입량 및 배출량, 피펫팁의 이동 속도의 완급 등은 표시 패널 (552) 에 표시할 수 있어, 사용자는 이 표시로 확인할 수 있다. 만약 각종 설정 내용을 변경하고자 하는 경우에는, 조작 인터페이스 (554) 의 조작을 통해 변경할 수 있다.
계시부 (545) 는 ROM (550) 으로부터 판독 출력된 프로그램에 따라 시간의 카운트를 실시한다. 시간의 카운트는, 예를 들어, 펌핑이나 PCR 반응에 있어서의 열변성, 어닐링, 신장 반응을 실시할 때 등에 실행되고, 이로써 각 공정의 실행 기간이 정확하게 관리된다.
자장 제어부 (538) 는 자석 (560) 의 배치를 관리하여 피펫팁에 부여하는 자장의 힘을 제어한다. 자장 제어부 (538) 는, 서로 직행한 XYZ 축을 구비하여, 스텝 모터나 서보 모터에 의해 자석 (560) 을 위치 결정한다. X 축 및 Y 축은 웰이 나열된 면과 거의 평행하게 서로 직행하고, Z 축은 이 면과 거의 수직을 이룬다. 자석 (560) 이 이동할 때에는, 예를 들어, X 축 상 및 Y 축 상에서의 이동과, Z 축 상에서의 이동의 2 단계에서 자석 (560) 의 위치 결정이 가능하게 되어 있다.
PCR 유닛 (540) 은 서멀 센서 (570), 온도 제어부 (572), 히터 (574) 를 구비한다. 온도 제어부 (572) 는 서멀 센서 (570) 로부터의 온도 신호에 기초하여 온도를 검지한다. 서멀 센서 (570) 는, 예를 들어 마스터믹스처를 수용한 웰 (516) 의 근방에 배치되어, 웰 내에 유체의 온도에 따라 온도 신호를 온도 제어부로 송출한다. 히터 (574) 는 웰 (516) 의 근방에 배치되고, 히터 (574) 의 통전은 온도 제어부 (572) 에 의해 제어되어 있다. 온도 제어부 (572) 는 서멀 센서 (570) 로부터의 온도 신호에 기초하여 히터 (574) 의 통전을 컨트롤함으로써 웰 (516) 내의 유체의 온도를 제어한다. 이로써, 적절한 온도 컨트롤이 요구되는 PCR 반응을 신속하게 실행할 수 있다. PCR 의 반응 사이클은 기본적으로, 열변성 단계, 어닐링 단계, 신장 반응 단계의 반복에 의해 구성되고, 온도 제어부 (572) 는 각 단계에서 유체가 최적인 온도가 되도록 히터 (574) 를 사용하여 온도를 컨트롤한다. PCR 반응에 있어서의 최적 온도, 반응 시간, 반응 사이클 수에 관한 데이터는 ROM 에 미리 저장되어 있고, 사용자에 의해 선택된 처리 모드에 대응하여 판독 출력되어 실행된다.
검출부 (545) 는, 트리거 광원 (590), 트리거 광원으로부터의 트리거광을 웰 내의 액체에 조사하는 도광부 (592), 도광부 (592) 로부터 조사된 광에 의해 형광된 핵산으로부터의 광을 수광하기 위한 수광부 (594), 검출 회로 (596) 등을 구비한다. 도광부 (592) 는 예를 들어 광파이버를 사용하여 구성할 수 있고, 트리거 광원으로부터의 트리거광을 광파이버 내에서 도광시킴으로써 웰 내의 액체에 트리거광을 조사할 수 있다. 수광부 (594) 에는 예를 들어 CCD 나 CMOS 등의 이미지 센서를 사용할 수 있어, 형광된 핵산으로부터의 광을 받아 수광 신호를 검출 회로 (596) 에 출력한다. 검출 회로 (596) 는 수광부 (594) 로부터의 수광 신호를 기초로 하여 핵산을 검출한다.
본 발명의 핵산 검출 시스템의 작용에 대해 도 33 의 플로우 차트를 사용하여 설명한다. 사용자에 의해 선택된 처리 프로그램이 ROM (550) 으로부터 판독 출력되고, 이 판독 출력된 처리 프로그램을 기초로 측정 시스템 (480) 의 각 부가 작동을 개시한다. 사용자는 각 처리 라인 (도 31 에서는 제 1 ∼ 제 12 처리 라인 (500A ∼ 500L)) 의 웰 (502) 에 취득한 검체를 수동으로 수용하여, 차폐문에 의해 제 1 ∼ 제 12 처리 라인 (500A ∼ 500L) 을 외부로부터 차폐한다. 제 1 ∼ 제 12 처리 라인 (500A ∼ 500L) 의 차폐가 검출되면 검체의 처리가 개시되고, 제 1 ∼ 제 12 처리 라인 (500A ∼ 500L) 에 대응하여 형성된 12 개의 노즐 및 피펫팁이 구동하여 검체와 용해액을 혼합한다. 이 혼합액의 교반 후, 자성 입자를 혼합액에 첨가하여 교반한다.
자성 입자가 첨가된 혼합액이 충분히 교반된 후, 자석을 사용하여 자성 입자를 피펫팁 내에 구속하여 불필요한 액을 피펫팁 외로 배출하여 표적 핵산이 접합한 자성 입자를 취득한다. 취득한 자성 입자는 세정액이 수용된 웰에 배출, 세정되고, 세정 후, 자성 입자와 표적 핵산의 결합을 절단하는 분리액에 혼합되어 교반 된다. 자성 입자가 첨가된 분리액이 충분히 교반된 후, 자성 입자는 피펫팁 내에 구속되어 표적 핵산이 분리된다. 취득된 표적 핵산을 함유하는 유체는 측정 공정에 제공되는 측정 샘플로서 웰 (514) 에 수용된다. 웰 (514) 에 수용된 측정 샘플은 마스터믹스처가 미리 수용된 웰 (516) 에 분주되어, PCR 반응이 실행된다. PCR 반응 공정에서는, 열변성 단계, 어닐링 단계, 신장 반응 단계가 소정 횟수만큼 반복되어 표적 핵산에 기초한 PCR 산물의 생성이 실행되고, 소정 횟수의 실행 후, 검출부 (545) 에 의해 PCR 산물의 검출이 실행된다.
이상과 같이, 제 1 ∼ 제 12 처리 라인 (500A ∼ 500L) 으로 대표되는 12 열의 처리 라인을 구비함으로써, 12 개의 검체를 동시에 처리할 수 있어, 검체의 처리 효율을 높일 수 있다. 또, 검체의 수용 웰 (502), 표적 핵산 추출용의 자성 입자를 수용한 웰, 세정용의 웰, 마스터믹스처를 수용한 웰을 라인 형상으로 나열함으로써, 노즐 및 피펫팁을 불필요하지 않게 구동시킬 수 있어, 처리 시간을 더욱 단기화할 수 있다. 또, 노즐 및 피펫팁이 직선 형상으로 구동하기 때문에, 다른 라인의 검체의 혼입을 방지할 수 있어, 콘터미네이션을 저감시킬 수 있다.
상기에서는 12 개의 처리 라인을 구비한 측정 시스템을 예시했지만, 처리 라인의 개수는 이것에 한정되지 않고, 이것보다 많아도 되고, 적어도 된다. 또한, 상기 실시형태에서는, 12 열의 처리 라인을 구비한 측정 시스템을 예시했지만, 라인 형상으로 처리하는 것 이외에도, 예를 들어, 검체의 수용 블록, 자성 입자와 검체의 반응 블록, 자성 입자 등을 세정하기 위한 세정액의 수용 블록, 제조된 측정 샘플의 수용 블록, PCR 반응 블록, 증폭된 표적 핵산의 측정 블록 등을, 예를 들어 고리 형상 혹은 십자 형상으로 배치해도 된다.
또, 시스템의 양태는 상기에 한정하지 않고 적절하게 변경해도 된다. 도 34 는, 카트리지를 이용하여 핵산을 전처리할 수 있는 측정 시스템의 개략을 나타낸 도면이다. 예를 들어, 도 34 에 나타내는 바와 같이, 검체 수용부와 시약 수용부를 일체화한 카트리지를 사용하여 표적 핵산을 검출할 수도 있다. 이하에, 검체 수용부 및 시약 수용부를 일체화한 카트리지를 사용하여 검체를 처리하는 시스템에 대해 설명한다.
측정 시스템 (260) 은 시스템 본체 (262) 와, 이 시스템 본체 (262) 에 장전되는 카트리지 (264) 를 구비한다. 시스템 본체 (262) 는, 카트리지 (264) 를 유지하는 락 (267), 락 (267) 을 시스템 본체 (262) 로부터 인출된 인출 위치와 시스템 본체에 수납한 수납 위치 사이에서 이동 제어하는 이동 제어 기구 (270), 핵산을 취득하기 위한 자성 입자를 구비한 피펫팁, 카트리지 (264) 에 대한 피펫팁의 배치를 제어하는 배치 제어 기구 (273), 피펫팁의 착탈 등을 실시하는 팁 착탈 제어부 (275), 증폭된 핵산을 스캔하여 검출하는 스캐너 (277) 등을 구비한다. 락 (267) 은 수납 위치에 위치하는 카트리지 (264) 를 외부로부터 차단하는 덮개 (280) 를 구비하고, 이로써 수납 위치에 위치하는 카트리지 (264) 등에 잡균이 부착되는 위험성을 저감시키고 있다.
카트리지 (264) 의 웰의 배치 형태는, DNA 를 추출하여 증폭시키는지 RNA 를 추출하여 증폭시키는지에 따라 개수, 순서, 사이즈 등이 상이하다. 도 35 는, 상기 측정 시스템에서 사용되는 카트리지에 대해 나타낸 도면으로, 마스터믹스처를 수용한 웰을 카트리지의 길이 방향을 따라 일부 절단한 사시 단면도이다. 예를 들어, DNA 를 추출하여 PCR 법을 이용하여 증폭시키는 경우, 도 35 에 나타내는 바와 같이, 카트리지 (264) 에는, 검체를 수용하는 웰 (300), 검체로부터 DNA 를 추출하기 위한 추출 시약이 미리 수용된 웰 (302), 버퍼가 수용된 웰 (304), 추출된 DNA 를 세정하기 위한 세정액이 수용된 웰 (306, 308), 표적 핵산 추출용의 자성 입자를 DNA 와 분리시켜 DNA 를 취득하기 위한 용출액 (310), 피펫팁 (330) 을 세정하기 위한 세정액이 수용된 웰 (312), 동결 건조된 마스터믹스처가 수용된 웰 (314), 표지화된 DNA 를 형광 검출시키는 경우에 사용되는 기질액이 수용된 웰 (316) 등이 일체화되어 있다. 각 웰의 개구는 알루미늄 시일 (도시 생략) 에 의해 밀봉되어, 사용 전에 잡균이 웰 내에 침입하지 않게 되어 있다. 웰 (314) 내에는 동결 건조된 마스터믹스처 (318) 가 용기 내벽에 막 형상으로 형성되어 있다. 동결 건조된 마스터믹스처 (318) 를 웰 (314) 내에 막 형상으로 형성하는 수법으로서는, 예를 들어, 웰 (314) 내에 동결 건조 전의 마스터믹스처를 수용한 후, 소정 동결 건조 조건 하에서 동결 건조를 실행함으로써 웰 (314) 내에 동결 건조된 마스터믹스처 (318) 를 막 형상으로 형성할 수 있다.
카트리지 (264) 가 락 (267) 에 장전되어 핵산의 자동 검출이 개시된 후, 락 (267) 이 시스템 본체 (262) 에 수납되어, 카트리지 (264) 가 외부로부터 격절된다. 카트리지 (264) 가 락 (267) 에 의해 수납 위치에 배치된 후, 알루미늄 시일이 박리되어, 검체로부터의 DNA 의 추출이 실행된다. 카트리지 (264) 에는 동결 건조된 마스터믹스처를 구비한 웰 (314) 이 미리 형성되어 있고, 이로써 DNA 추출 후에 신속하게 전처리를 완료할 수 있어, 다음의 측정 공정으로 이행할 수 있다.
이와 같이, 카트리지를 (264) 사용하여 전처리를 자동적으로 일관하여 실행할 수 있기 때문에, 본 발명에 있어서는 간편하고 편리성이 높은 시스템을 제공할 수 있다. 또, 자성 입자를 사용하여 검체로부터 표적 핵산을 추출하기 때문에 불요물을 핵산 증폭 전에 미리 저감시켜, 보다 신뢰성이 높은 DNA 검출을 실행할 수 있다.
또, 상기에서는, 검체로부터의 표적 핵산의 추출로부터 핵산을 추출하여 측정 샘플을 제조하고, 제조된 측정 샘플을 기초로 하여 표적 핵산을 검출하는 공정까지를 일관하여 실시했지만, 측정 샘플을 제조할 때까지의 공정과, 측정 샘플로부터 표적 핵산을 측정하는 측정 공정을 다른 장치로 실행해도 된다. 이와 같은 시스템의 일례로서는, 예를 들어, 검체를 수용하여 표적 핵산을 추출하여 측정 샘플을 취득하는 샘플 제조 장치와, 취득된 측정 샘플을, 핵산 증폭법을 이용하여 증폭시켜 검출하는 검출 장치를 구비하는 측정 시스템을 들 수 있다. 이와 같은 시스템을 이용하는 경우, 도 36 에 나타내는 바와 같이, 웰 카트리지 (600) 로부터, 측정 샘플을 수용하는 웰 (610) 과 마스터믹스처를 수용한 웰 (612) 이 일체화되어 분리 유닛 (615) 을, 카트리지 본체 (608) 로부터 예를 들어 할단 라인 (L) 을 따라 할단하여 분리할 수 있도록 하고, 분리 유닛 (615) 을 검출 장치에 장전함으로써 표적 핵산의 검출을 실행할 수 있다.
검체를 취득하여 웰 카트리지 (600) 에 수용하여 샘플 제조 장치에 장전하면 검체의 처리가 개시되어, 측정 샘플을 수용하기 위한 웰 (610) 에 측정 샘플이 수용된다. 분리 유닛 (615) 이 카트리지 본체 (608) 로부터 분리되어 검출 장치에 장전되면, 웰 (610) 내에 수용된 측정 샘플이 마스터믹스처를 수용한 4 련 웰 (612) 에 주입된다. 측정 샘플이 마스터믹스처와 혼합된 후, PCR 법에 따라 표적 핵산을 증폭시켜 검출된다.
이와 같이, 측정 샘플을 수용하는 웰 (610) 과 마스터믹스처를 수용한 웰 (612) 이 일체화된 분리 유닛 (615) 을 카트리지 본체 (608) 로부터 분리할 수 있게 함으로써, 측정 샘플을 취득할 때까지의 공정과, 취득된 측정 샘플로부터 표적 핵산을 검출하는 공정을 다른 장치에서 실행할 수 있다.
이로써, 샘플 제조 장치의 구동 스케줄이 검출 장치의 구동 스케줄로부터 독립하여, 제 1 측정 샘플의 제조 후에 제 2 측정 샘플의 제조로 곧 바로 이행할 수 있어, 표적 핵산의 검출을 기다리지 않고 측정 샘플을 보다 자유롭게 제조할 수 있다. 또, 측정 샘플의 일시 보존 등도 가능해진다.
또, 상기에서는 1 개의 검체에 대해 1 열의 웰군을 대응시켰지만, 1 개의 검체에 대해 복수열의 웰군을 대응시켜도 된다. 예를 들어, 도 37 에 나타내는 바와 같이, 1 개의 검체에 대해 2 열의 웰을 대응시킬 수도 있다. 측정 시스템 (620) 은, 핵산의 추출시에 사용되는 웰군을 구비한 핵산 추출부 (625), 고상화된 핵산 증폭용 시약이 수용된 웰군을 구비한 고상화 시약 수용부 (630), 서멀 사이클러에 조합되는 온도 조정부 (635), 트리거광을 조사하여 핵산의 검출을 실시하는 검출부 (640), 노즐 유닛 (645) 등을 구비한다. 노즐 유닛 (645) 은 워크 에어리어 (645) 내에서 구동하여 검체의 흡입이나 토출을 실시한다. 이와 같이 웰의 배치를 이용하여 핵산을 측정해도 된다.
또, 본 발명의 바람직한 양태로서, 상기에 설명한 측정 시스템을 이용하여, 각종 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 (H1N1, H3N2, H5N1, H7N7 등) 를 검출할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 검출은, 채취된 검체 (비강 내 체액 등) 로부터의 인플루엔자 바이러스의 추출, 및 마스터믹스처의 제조, 리얼타임 RT-PCR 의 실행, 그리고 검출의 순서로 실시된다.
[인플루엔자 바이러스 A (H1N1) 의 검출에 있어서의 프로브 및 프라이머]
사용되는 프로브 및 프라이머로서는
포워드 프라이머 (InfA, SW InfA, SW H1, RnaseP)
리버스 프라이머 (InfA, SW InfA, SW H1, RnaseP)
Taq Man 프로브 (InfA, SW InfA, SW H1, RnaseP)
등을 사용한다.
따라서, 프라이머 및 프로브의 조합으로서는
InfA : 인플루엔자 A 형 프라이머 세트 및 Taq Man 프로브
SW InfA : SW InfA 형 프라이머 세트 및 Taq Man 프로브
SW H1 : SW H1 형 프라이머 세트 및 Taq Man 프로브
RnaseP : 휴먼 RNaseP 유전자 (내부 포지티브 컨트롤) 프라이머 세트 및 Taq Man 프로브를 사용한다.
상기 4 종류의 프라이머 및 프로브의 조합을 함유하는 마스터믹스처를 각각 조제하여, 예를 들어, 도 35 에 나타낸 카트리지 (264) 의 4 련의 웰 (314) 에 미리 수용하여 알루미늄 시일로 밀봉해 둠으로써 간편한 조작으로 인플루엔자 바이러스 A (H1N1) 를 검출할 수 있는 시스템, 및 이 시스템을 위한 카트리지를 제공할 수 있다.
또한, 상기에 나타낸 카트리지 (264) 는, 1 개의 검체에 대해 핵산의 추출에서 검출하기 전까지 실시하는 것에 대해 나타냈지만, 복수의 카트리지 (264) 를 병렬시켜 복수의 검체를 동시 처리할 수 있도록 해도 된다. 복수의 검체를 동시 처리함으로써 처리 능력이 향상되어, 더욱 편리성이 높은 시스템을 제공할 수 있다.
상기 도 31 ∼ 37 에서는, 표적 핵산과 PCR 반응용 시약의 혼합 용액의 온도를 상승/하강시켜 핵산 증폭을 실시하는 PCR 법을 이용한 양태에 대해 예시했지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 등온으로 핵산을 증폭시키는 등온 증폭법을 이용해도 된다.
본 발명의 핵산 승복 장치는,
(a) 검체를 수용하는 검체 수용부와,
(b) 검체로부터 표적 핵산을 보충하는 포착 입자를 수용하는 제 1 수용부와,
(c) 표적 핵산의 검출용 시약을 수용하는 제 2 수용부와,
(d) 상기 검체를 검체 수용부에 분주하는 분주 기구, 상기 검체와 보충 입자를 혼합하여 검체로부터 표적 핵산을 추출하는 기구, 및 상기 추출된 표적 핵산과 검출용 시약을 혼합하는 기구와,
(e) 상기 제 2 수용부에 표적 핵산과 검출용 시약의 혼합 유체보다 비중이 작은 소수성 유체를 주입하는 기구, 상기 각 수용부를 덮는 덮개를 탈착시키는 기구, 표적 핵산을 형광시키기 위한 조사광을 투사하는 기구 및 그 조사광을 받은 표적 핵산으로부터의 광을 받아 표적 핵산을 검출하는 기구, 그리고 이들 기구를 조합한 기구로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 기구를 구비하는 것을 특징으로 하고 있고, 상기 (a) ∼ (e) 의 구성의 조합을 바꿈으로써 여러가지 장치를 실현할 수 있다.
이하에, 표적 핵산을 등온 증폭시키는 기구를 구비한 장치에 대해 설명한다. 또한, 상기에 나타낸 PCR 법을 이용하여 표적 핵산을 증폭시키는 장치와 동일한 지점에 대해서는 개략적인 설명을 기재하고 그 상세한 설명에 대해서는 생략한다.
도 38 은 표적 핵산의 추출에서 검출까지 실행하기 위한 복수의 웰 및 노즐을 나타낸 사시도이다. 도 38 에 나타내는 바와 같이, 일체적으로 카트리지화된 각 처리 라인 (700A ∼ 700F) 에서는, 예를 들어, 검체를 수용하는 웰 (702), 용해액을 수용하는 웰 (704), 완충액을 수용하는 웰 (706), 포착 입자인 자성 입자를 수용하는 웰 (708), 검체로부터 추출된 핵산을 세정하기 위한 세정액이나 피펫팁을 세정하기 위한 세정액이 수용된 웰 (710), 자성 입자와 표적 핵산을 분리하기 위한 시약을 함유하는 용출액을 수용한 웰 (712), 검체로부터 핵산을 추출하여 이루어지는 표적 핵산 함유 용액을 일시적으로 수용하는 웰 (714), 표적 핵산을 증폭시키기 위한 건조 (예를 들어, 동결 건조된 시약) 된 시약 (검출용 시약) 을 함유하는 웰 (716), 표적 핵산 함유 용액 중의 표적 핵산을 증폭시킴으로써 취득된 증폭 산물을 검출하기 위한 검출용 웰 (718) 이 배열되어 있다.
제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (700A ∼ 700F) 의 상방에는, 각 처리 라인 (700A ∼ 700F) 에 대응하여 6 개의 노즐 유닛 (720) 이 라인 방향 (P) 으로 자유롭게 이동할 수 있도록 형성되고, 각 노즐 유닛 (720) 에 피펫팁 (730) 이 장착 가능하게 되어 있다. 또한, 처리 라인의 개수는 6 개에 한정하지 않고 적절하게 변경해도 된다.
도 39 에 노즐 유닛 (720) 의 선단부를 나타낸 부분 사시도를 나타낸다. 도 39(a) 에 나타내는 바와 같이, 노즐 유닛 (720) 은, 예를 들어, 검체나 표적 핵산을 함유한 용액 등의 유체를 흡인/배출하는 펌핑 개구 (730), 표적 핵산의 증폭 산물에 형광 반응용의 트리거광을 조사하는 플라스틱 광파이버 (이후, POF 라고 한다) (732), 표적 핵산으로부터의 광을 수광하는 렌즈 (734) 등을 구비한다. 렌즈 (734) 는 펌핑 개구 (730) 내에 배치되고, 펌핑 개구 (730) 의 주위에는 서로 등간격을 간격을 두고 예를 들어 8 개의 POF (732) 가 배치되어 있다. 또한, 노즐 유닛의 형상은 상기에 한정하지 않고, 예를 들어 도 39(b) 나 도 39(c) 에 나타내는 바와 같은 것이어도 된다. 도 39(b) 에 나타내는 바와 같이, 노즐 유닛 (760) 의 선단의 중앙부에는, 유체를 흡인/배출하는 펌핑 개구 (762) 와 렌즈 (764) 가 구비되고, 그 주변부에는 4 개의 트리거광 조사용의 POF (767) 를 구비하고 있다. 또, 도 39(c) 에 나타내는 바와 같이, 노즐 유닛 (770) 의 선단부의 중앙부에 펌핑 개구 (772) 와 트리거광 조사용의 POF (774) 를 구비하는 구성으로 해도 된다.
도 40 은 노즐 유닛 (720) 을 펌핑 개구 (730) 의 연신 방향과 평행한 평면에서 절단한 단면도이다. 도 40 에 나타내는 바와 같이, 펌핑 개구 (730) 의 주위에는, 예를 들어 8 개의 POF 가 배치되고, 펌핑 개구 (730) 내의 중앙에는 렌즈 (734) 및 광학 이미지 전달용의 POF (740) 가 배치되어 있다. 렌즈 (734) 는, 검출용 웰 (748) 내에 수용된 증폭 산물 함유 용액과 대면하여, POF (740) 측에 증폭 산물 용액의 광학 이미지를 결상한다. 렌즈 (734) 에 의해 결상된 광학 이미지는 POF (740) 가운데에 전해져, 후술하는 재결상 광학계 (도 41 참조) 에 입력된다. 렌즈 (734) 의 주위에, 트리거광을 조사하는 POF (732) 를 배치한 것에 의해, 화상의 주변부가 어두워지는 쉐이딩이 억제되어, 퀄리티가 높은 증폭 산물의 화상의 취득이 가능해진다. 또, 노즐 유닛 전체 단부의 구조는 상기에 한정하지 않고, 도 40(b) 에 나타내는 것과 같은 구조로 해도 된다. 도 40(b) 에 나타내는 바와 같이, 노즐 유닛 (780) 은 펌핑 개구 (782) 와 트리거광 조사용의 POF (784) 를 구비한다. 이와 같이, 펌핑 개구, 트리거광 조사용의 광파이버, 및/또는 이미지 센서에 검체용 웰 내의 광학 이미지를 전달하는 광파이버를 일체화한 노즐 유닛과, 직선 형상으로 배열된 처리 라인에 의해, 검체 등의 펌핑과 표적 핵산의 증폭 산물의 검출을 겸하는 노즐 유닛을 처리 라인을 따라 직선 형상으로 이동시키는 것만으로 검체로부터의 표적 핵산의 추출에서 증폭 산물의 검출까지를 실행할 수 있어, 장치의 컴팩트화를 기대할 수 있다. 특히, 노즐 유닛은 펌핑 개구와 광파이버에 의해 세경화할 수 있고, 이로써 이웃하는 노즐 유닛 사이의 간격 및 처리 라인간의 간격을 좁힐 수 있어, 핵산 검출 장치를 더욱 컴팩트화할 수 있다.
도 41 은 표적 핵산 검출 장치의 기능 블록도이다. 도 41 에 나타내는 바와 같이, 측정 시스템 (680) 은 중앙 제어부 (832), 노즐 위치 제어부 (834), 팁 마운트 제어부 (836), 자장 제어부 (838), 등온 제어 유닛 (840), 펌핑 제어부 (842), 계시부 (843), 검출부 (845), RAM (848), ROM (850), 표시 패널 (852), 조작 인터페이스 (854), 재결상 광학계 (856) 등을 구비한다.
노즐 위치 제어부 (834) 는 서로 직행한 XZ 축 (2 축) 을 구비하고, 제 1, 제 2 모터 (861, 862) 의 2 개의 모터에 의해 노즐 유닛 (720) 의 위치를 제어한다. XZ 축은 예를 들어, P 방향을 향한 X 축은 각 처리 라인 (700A ∼ 700F) 에 있어서의 웰의 배열 방향과 거의 평행한 방향을 이루고, Z 축은 X 축과 거의 수직을 이루면서 웰의 근위치와 원위치 사이를 연결하는 방향과 거의 평행한 방향을 향하고 있다. 검체의 처리가 개시되어 각 노즐 유닛 (720) 이 이동할 때, 예를 들어, X 축 상에서의 이동과, Z 축 상에서의 이동의 2 단계에서 노즐 (720) 이 구동됨으로써, 각 처리 라인간을 횡단하지 않고 각 처리 라인 (700A ∼ 700F) 을 따라 처리를 실행할 수 있다. 이때, 각 노즐 유닛 (720) 이 동시에 작동함으로써, 각 처리 라인 (700A ∼ 700F) 간의 검출 환경을 보다 일정하게 하는 것이 가능해져, 보다 정확한 증폭 산물의 검출이나 그 후의 분석을 실행하는 것이 가능해진다.
ROM (850) 에 기억하는 처리 프로그램으로서는, 예를 들어, (1) 세포나 바이러스로부터 RNA 를 추출하고 증폭시켜 증폭 산물의 검출을 실행하는 제 1 프로그램, (2) 혈액 등의 생체 샘플로부터 DNA 를 추출하고 증폭시켜 증폭 산물의 검출을 실행하는 제 2 프로그램, (3) 세균 등으로부터 플라스미드 DNA 를 추출하는 제 3 프로그램 등이 있고, 목적에 따라 ROM 에 기억시키는 프로그램은 적절하게 변경하면 된다.
계시부 (843) 는 ROM (850) 으로부터 판독 출력된 프로그램에 따라 시간의 카운트를 실시한다. 시간의 카운트는, 예를 들어, 타이밍 클록에 기초하여 표적 핵산의 등온 증폭을 실시할 때 등에 실행되고, 이로써 각 공정의 실행 기간을 정확하게 관리할 수 있다.
등온 제어 유닛 (840) 은 서멀 센서 (870), 온도 제어부 (872), 히터 (874) 를 구비한다. 온도 제어부 (872) 는 서멀 센서 (870) 로부터의 온도 신호에 기초하여 온도를 검지하고, 서멀 센서 (870) 는 예를 들어 동결 건조된 핵산 증폭용 시약을 수용한 웰 (716) 의 근방에 배치되어, 웰 (716) 내에 수용된 표적 핵산 함유 용액의 온도에 따라 온도 신호를 온도 제어부 (872) 로 송출한다. 온도 제어부 (872) 는 서멀 센서 (870) 로부터의 온도 신호에 기초하여 히터 (874) 의 통전을 컨트롤함으로써 웰 (716) 내의 유체의 온도를 소정 온도로 제어한다. 이로써, 일정 온도가 요구되는 등온 증폭 또는 온도를 변화시키는 PCR 를 실행할 수 있다.
검출부 (845) 는 트리거 광원 (890), POF (740) 로부터의 광을 수광하기 위한 이미지 센서 (894), 검출 회로 (896) 등을 구비한다. 트리거 광원 (890) 으로부터의 트리거광을 POF (732) 내에서 도광시킴으로써 검출용 웰 (718) 내에 트리거광을 조사할 수 있다. 이미지 센서 (894) 에는 예를 들어 CCD 나 CMOS 등의 이미지 센서를 사용할 수 있고, 재결상 광학계 (856) 로부터의 광을 받아 화상 신호를 검출 회로 (896) 에 출력한다. 검출 회로 (896) 는 이미지 센서 (894) 로부터의 수광 신호를 기초로 화상 처리하여 핵산의 검출 판정을 실시한다.
다음으로 본 발명의 핵산 검출 시스템의 작용에 대해 설명한다.
사용자에 의해 선택된 처리 프로그램이 ROM (850) 로부터 판독 출력되고, 이 판독 출력된 처리 프로그램을 기초로 핵산 검출 시스템 (680) 의 각 부가 작동한다. 사용자는 각 처리 라인 라인 (700A ∼ 700F) 의 웰 (702) 에 취득한 검체를 수동으로 수용하여, 도시되지 않은 차폐문 등에 의해 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (700A ∼ 700F) 을 외부로부터 차폐한다. 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (700A ∼ 700F) 은, 예를 들어, 2 열을 검체로부터 표적 핵산을 추출하여 증폭 후에 검출하기 위한 라인으로서 사용하고, 2 열을 네거티브/포지티브 컨트롤용으로서 사용하며, 나머지 2 열을 검량선 작성용으로 사용하는 등 적절하게 바꾸면 된다. 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (700A ∼ 700F) 의 차폐가 검출되면 검체의 처리가 개시되어, 노즐 유닛 (720) 이 구동하여 검체와 용해액을 혼합한다. 이 혼합액의 교반 후, 자성 입자를 혼합액에 추가하여 교반한다.
자성 입자가 첨가된 혼합액의 교반 후, 자성 입자를 구속하여 표적 핵산이 접합한 자성 입자를 취득한다. 취득한 자성 입자는 자성 입자와 표적 핵산의 결합을 절단하는 분리액에 혼합되고, 혼합 후, 표적 핵산과 자성 입자가 분리되어 표적 핵산이 취득된다. 취득된 표적 핵산 함유 용액은 증폭 공정에 제공하기 위해 일시적으로 714 에 수용된다. 웰 (714) 에 수용된 표적 핵산 함유 용액은 핵산 증폭용 시약이 미리 수용된 웰 (716) 에 분주되고, 다시 미네랄 오일이 분주되어 등온 증폭 반응이 실행된다.
여기서, 등온 증폭 반응으로서는, 예를 들어 LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) 법이 이용된다. 주지하는 바와 같이 LAMP 법에서는 사슬 치환 활성 효소와 2 쌍의 프라이머 (이너 프라이머 및 아우터 프라이머) 를 사용하여 증폭 산물을 취득한다. LAMP 법은 주형 핵산의 2 개 사슬로부터 1 개 사슬에 대한 열변성의 필요가 없어, 증폭에 이러한 공정을 등온도로 실행할 수 있다. 또한, PCR 법을 이용한 경우에는 약 5 분의 증폭 사이클을 적어도 25 ∼ 30 회 정도 반복하여, LAMP 법을 비롯한 등온 핵산 증폭법에서는, 30 분 정도로 검출에 충분한 증폭 산물을 취득할 수 있다. 프라이머 설계에 관한 기본 사항은 WO2000/28082호나 WO2002/24902호 등에 기재되어 있다.
또한, 등온 증폭 반응 공정으로서는 상기 LAMP 법 이외에도 예를 들어,
키메라프라이머를 사용하는 ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acid) 법 ;
오픈 써클 프로브 (Open Circle Probes : OCP) 와 DNA 리가아제와 프라이머쌍과 사슬 치환형 DNA 폴리멜라아제를 사용하여 증폭 산물을 취득하는 RCA (Rolling Cycle Amplification) 법 ;
2 쌍의 프라이머와 제한 효소와 사슬 치환 활성 효소와 S 화 아날로그 기질을 사용하여 증폭 산물을 얻는 SDA (Strand Displacement Amplification) 법 ;
IVT (In Vitro Transcription) 법 ;
역전 사진 효소 등을 사용하여 RNA 를 트리밍하여 RNA 를 증폭 산물로서 취득하는 TRC (Transcription Reverse transcription Concerted amplification) 법 ;
역전 사진 효소나 RNA 폴리멜라아제 등의 3 종류의 효소와 주형 특이적 프라이머쌍을 사용하여 RNA 를 증폭시키는 NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) 법,
RNA 와 DNA 의 키메라 구조를 갖는 프라이머를 사용하여 증폭 산물을 취득하는 SPIA 법 등, 일정한 온도에서 표적 핵산을 증폭시키는 수법이면 어떠한 방법이어도 된다.
이와 같이 PCR 법 대신 등온 증폭 반응 공정을 이용하면, 표적 핵산의 증폭을 위해서 핵산 용액을, 실온으로부터 94 도, 72 도, 55 도 등의 온도로 승온 혹은 강온시킬 필요가 없고, 이 때문에 서멀 사이클러와 같은 온도를 비교적 고온으로 승온시키는 장치도 불필요해지는 점에서 바람직하다. 또, 등온 증폭법은, 검출하는 데에 충분한 양의 증폭 산물을 취득하기까지 걸리는 시간이 수십 분 정도이기 때문에, 표적 핵산의 추출에서 검출까지 걸리는 시간의 단기화를 충분히 기대할 수 있다.
동결 건조된 핵산 증폭용 시약에 추출된 표적 핵산 함유 용액을 혼합한 후, 웰 (716) 에는 노즐 유닛 (720) 에 의해 소수성 유체가 주입된다. 소수성 유체로서는, 예를 들어, CnH2n +2 (n 은 3 ∼ 20 의 정수를 나타낸다) 로 나타나는 사슬형 포화 탄화수소, 이른바 미네랄 오일을 들 수 있고, 바람직하게는 CnH2n +2 (n 은 16 ∼ 20 의 정수를 나타낸다) 의 유동 파라핀을 들 수 있고, 이와 같은 소수성 유체가 웰 (716) 에 주입된다. 이 미네랄 오일에 의해 외부로부터 핵산 증폭용의 웰 (716) 내에 협잡물이 침입하는 것을 방지할 수 있음과 함께, 표적 핵산 함유 용액과 등온 증폭용 시약의 혼합 용액의 증산을 방지할 수 있다. 또한, 미네랄 오일을 대신하여 또는 미네랄 오일과 병용하여, 웰 (716) 의 개구를 막는 고체 형성된 시란트를, 노즐 유닛 (720) 을 사용하여 웰 (716) 의 개구에 장착해도 된다.
표적 핵산의 증폭 후, 증폭 산물 용액이 노즐 유닛 (720) 에 의해 검출용의 웰 (718) 에 이송되어, 증폭 산물의 검출이 실시된다.
이상과 같이, 검체의 수용 웰 (702), 표적 핵산 추출용의 자성 입자를 수용한 웰, 세정용 웰, 등온 증폭용 동결 건조 시약을 수용한 웰을 순서대로 라인 형상으로 나열함으로써, 노즐 유닛 (720) 을 불필요하지 않게 구동시킬 수 있어, 처리 시간의 더 나은 단기화를 기대할 수 있다. 또, 노즐 유닛 (720) 및 피펫팁 (730) 이 직선 형상으로 구동하기 때문에 다른 처리 라인의 검체의 혼입을 방지할 수 있어, 콘터미네이션을 저감시킬 수 있다. 또, 6 열의 처리 라인으로 동시에 할 수 있다.
또, 표적 핵산의 검출 장치의 양태는 상기에 한정하지 않고 여러가지 변경이 가능하다. 예를 들어, 상기 도 38 에서는 6 열의 처리 라인 (700A ∼ 700F) 과 그들 처리 라인 (700A ∼ 700F) 에 대응하는 6 개의 노즐 유닛 (720) 을 구비하는데, 노즐 유닛의 개수는 1 개이어도 된다. 도 42 는, 1 개의 노즐 유닛을 구비한 표적 핵산의 검출 장치의 개략을 나타낸 사시도이다. 도 42 에 나타내는 바와 같이, 핵산 검출 장치 (900) 는, 1 개의 노즐 유닛 (902) 을 구비한다. 노즐 유닛 (902) 은, 제 1 가이드 레일 (904) 에 의해 웰의 배열 방향을 따라 이동할 수 있고, 제 2 가이드 레일 (906) 을 따라 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (700A ∼ 700F) 을 횡단하는 방향을 따라 이동할 수 있다. 이와 같은 장치 구성으로 함으로써 노즐 유닛의 개수를 줄여 저비용인 장치로 해도 된다.
또, 상기 실시형태에서는, 이미지 센서 (894) 와 트리거 광원 (890) 을 형성하는데, 이미지 센서 대신 광 전자 증배관을 일체화한 핵산 검출 장치로 해도 된다.
또, 분주용의 노즐과 표적 핵산의 검출기를 별개로 해도 된다. 도 43 에 나타내는 바와 같이, 핵산 검출 장치 (918) 는, 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (920A ∼ 920F) 에 대응한 6 개의 분주 노즐 (922) 과, 1 기의 핵산 검출기 (924) 를 구비한다. 각 분주 노즐 (922) 은 웰 (926) 의 배열 방향으로 이동 제어되고, 검출기 (924) 는 검출용의 웰 (927) 상에서, 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (920A ∼ 920F) 을 횡단하는 방향 (S) 으로 이동 가능하게 형성되어 있다. 이와 같은 장치 구성으로 함으로써 효율적인 처리가 기대된다.
또, 핵산 검출기는 1 개뿐만 아니라, 도 44 에 나타내는 바와 같이 각 처리 라인에 대응하여 형성할 수도 있다. 도 44 에 나타내는 바와 같이, 제 1 ∼ 제 6 처리 라인 (930A ∼ 930F) 에 대응하여 핵산 검출기 (932) 를 구비한다. 이와 같은 장치 구성으로 함으로써, 검출기 (932) 의 구동 기구가 불필요해짐과 함께, 처리 효율의 추가적인 향상을 기대할 수 있다.
또, 복수의 처리 라인을 구비한 핵산 증폭 장치에 있어서 표적 핵산의 증폭 공정에 등온 증폭법을 이용하는 경우, 각 라인의 핵산의 증폭률이 상이한 경우가 있어, 이 경우에는, 온도 제어부에 의해 반응 온도를 보정해도 된다. 증폭 반응의 온도를 보정함으로써 각 처리 라인의 증폭률의 조화를 기대할 수 있어, 표적 핵산의 보다 정확한 정량을 기대할 수 있다.
또, 상기에서는 노즐 유닛 (720) 에 펌핑 개구 (730) 와 증폭 산물의 광학 이미지를 이미지 센서 (894) 에 전달하는 플라스틱 광파이버 (740) 를 설치했지만, 이 펌핑 개구의 외부에 증폭 산물의 광학 이미지를 이미지 센서에 전달하는 광파이버를 설치해도 된다. 도 45 는 펌핑 개구의 외부에 검출용 웰 내의 광학 이미지를 이미지 센서에 전달하는 광파이버를 배치한 유닛을 광파이버의 연신 방향과 거의 평행한 평면에서 절단한 단면도이다. 일체화 유닛 (1000) 은, 노즐부 (1010) 와 광파이버부 (1020) 를 갖고, 광파이버 (1020) 는 노즐부 (1010) 의 외부에 배치되어 있다. 이와 같이 노즐부 (1010) 의 외부에 광파이버를 배치한 유닛으로 해도 된다.
또, 도 46 에 나타내는 바와 같이, 복수의 검출용 웰을 구비한 핵산 검출 장치에 있어서, 각각의 검출용 웰 내의 증폭 산물을 검출할 수 있도록 각각의 검출용 웰에 광파이버를 배치 형성하고 이들 복수의 광파이버를 선택적으로 사용하여, 단일한 검출기로 표적 핵산을 검출하도록 해도 된다. 핵산 검출 장치 (1050) 는 단일한 이미지 센서 (1052), 이 이미지 센서 (1052) 에 검출용 웰 (1054) 내의 광학 이미지를 선택적으로 전달하는 전환 장치 (1060), 분주용의 노즐 (1062), 표적 핵산의 추출에서 증폭까지를 실행하기 위한 복수의 웰을 배열한 처리 라인 (1065) 등을 구비한다. 전환 장치를 전환하여 각 검출용 웰 (1054) 로부터 증폭 산물을 검출할 수 있어, 이와 같은 장치 구성으로 해도 된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
AFP 함유 검체의 처리
[목적]
HAMA 와 인간 류머티즘 인자 (Human Rheumatoid Factor) (IgM) 를 Protein G 자성 입자, 또는 anti-Human IgM 자성 입자를 사용하여 협잡물을 제거 처리하고, 이 처리가 AFP (α-fetoprotein) 의 값에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다.
[사용한 시료 및 기구]
Anti-AFP HYb-2051 고정된 ELISA 플레이트 (F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE (442404, Nunc.))
혈청 컨트롤 (Liquichek Immunoassay Plus Control Level 2, Bio-Rad)
HAMA (Human Anti Mouse Antibody) 1 ㎎/㎖
Dynabeads Protein G (Dynal, Invitrogen) (자성 입자)
BioMag anti-Human IgM (Bangs Laboratories, Inc.) (자성 입자)
AFP 항원 (Original conc. 4 ㎎/㎖)
AFP-HRP 표지 항체 (Original conc. 0.13 ㎎/㎖)
블록 에이스 분말 (1 포 : 4 g 100 ㎖ 분 Cat.No.UK-B80 제조원 : 유키지루시 유업 주식회사)
10x PBS
8 련 피펫
디스포저블 플레이트
SPECTRAMAX 190 (Molecular Devices) & SoftMax Pro 4.8
Nunc-Immuno Wash 8
TMB Peroxidase Substrate & Peroxidase Solution B(H2O2) (KPL : Kirkegaard & Perry Laboratories)
ELISA 반응 정지액 (1.0 N H2SO4)
Sucker
킴타올
[실험 내용]
하기의 샘플 No.1 ∼ No.6 에 나타내는 검체를 조제하여, AFP 값의 측정을 실시하였다.
[자성 입자의 결합능의 산출]
각 검체의 AFP 값을 취득하는 데에 있어서, 미리 자성 입자의 결합능를 계산하였다.
혈청 중의 각 이뮤노글로블린 함유량은, 하기의 표 1 과 같다.
Figure 112011055889584-pct00001
혈청 5 ㎕ 중에는 대략 0.04 ∼ 0.10 ㎎ 의 IgG 가 존재하고, Dynabeads protein G 에 흡착시키기 위해서는 100 ∼ 250 ㎕ beads 가 필요하다.
또, 혈청 5 ㎕ 중에는 대략 7.5 ㎍ 의 IgM 가 존재하고, BioMag anti-Human IgM 에 흡착시키기 위해서는 50 ㎕ beads 가 필요하다.
[세정액의 제조]
블록 에이스 분말을 대략 90 ㎖ 의 밀리 Q 수에 용해시켰다. 용해 확인 후, 100 ㎖ 메스 실린더에서 100 ㎖ 로 필 업 (fill up) 하였다. 10x PBS 를 100 ㎖ 측정하여, 1 ℓ 메스 실린더에 넣고, 블록 에이스 분말도 첨가하고, 밀리 Q 수를 첨가하여 1000 ㎖ 로 필 업 (fill up) 하였다.
[각종 검체에 있어서의 흡광도의 측정]
본 실험에서는, 6 종류의 검체 (샘플 No.1 ∼ 6) 에 대해 흡광도를 측정하였다. ELISA 플레이트의 반응 검체는 50 ㎕ 로 하고, 혈청에는 Liquichek Immunoassay Plus Control Level 2 를 사용하고, 표지 항체 AFP-HRP 는 1/800, n = 3 으로 하였다.
[샘플 No.1]
컨트롤로서 PBS (Phosphate buffered salinel) 완충액을 사용하고, 이 용액을, Dynabeads protein G 로 처리한 검체, BioMag anti-Human IgM 으로 처리한 검체, 및 처리하지 않은 검체에 대해 각각 흡광도를 측정하였다.
[샘플 No.2]
혈청 컨트롤로서 혈청 5 ㎕ 를 함유하는 용액을 사용하고, 이 용액을, Dynabeads protein G 로 처리한 검체, BioMag anti-Human IgM 으로 처리한 검체, 및 처리하지 않은 검체에 대해 각각 흡광도를 측정하였다.
[샘플 No.3]
혈청 5 ㎕ 와 HAMA 10 ％ 를 함유하는 용액을 조제하여 사용하고, 이 용액을, Dynabeads protein G 로 처리한 검체와 처리하지 않은 검체에 대해 각각 흡광도를 측정하였다.
[샘플 No.4]
혈청 5 ㎕ 와 류머티즘 인자 10 ％ 를 함유하는 용액을 조제하여 사용하고, 이 용액을, BioMag anti-Human IgM 으로 처리한 검체와 처리하지 않은 검체에 대해 각각 흡광도를 측정하였다.
[샘플 No.5]
혈청 5 ㎕ 와 HAMA 10 ％ 와 AFP 80 ng/㎖ 를 함유하는 용액을 조제하여 사용하고, 이 용액을, Dynabeads Protein G 로 처리한 검체와 처리하지 않은 검체에 대해 각각 흡광도를 측정하였다.
[샘플 No.6]
혈청 5 ㎕ 와 류머티즘 인자 10 ％ 와 AFP 80 ng/㎖ 를 함유하는 용액을 조제하여 사용하고, 이 용액을, BioMag anti-Human IgM 으로 처리한 검체와 처리하지 않은 검체에 대해 각각 흡광도를 측정하였다.
[결과]
이하의 표 2 에 나타내는 측정 결과를 취득하였다.
Figure 112011055889584-pct00002
[AFP 값의 산출]
상기 표 2 의 Abs 450 TMB 값에 기초하여 AFP 값을 산출하였다. AFP 값의 산출에 있어서 도 47, 48 로부터 요구되는 수 식
y = 0.0065x + 0.2088 식 (1)
y = 0.0068x + 0.0554 식 (2)
중, 식 (1) 을 이용하여 산출하였다.
산출된 AFP 값을 하기의 표 3 에 나타낸다.
Figure 112011055889584-pct00003
[실험 결과에 대한 고찰]
샘플 No.3 의 무처리 (「No beads」처리) 인 경우의 AFP 값이 나타내는 바와 같이, HAMA 가 존재함으로써 AFP 값이 상승하기 때문에 HAMA 가 위양성의 인자일 가능성을 생각할 수 있다.
이 것을 증명하기 위해서, HAMA 를 Dynabeads protein G 로 처리한 결과, 샘플 No.3 의 Dynabeads Protein G 로 처리된 경우의 AFP 값은 7.00 이 되고, AFP 값은 샘플 No.2 에 나타난 AFP 값과 동등한 레벨까지 내려갔다.
이로써, HAMA 가 위양성을 일으키는 인자인 것이 뒷받침된다.
또한, 샘플 No.4 의 AFP 값에 대해서는, Bio Mag 로 처리되었을 때의 AFP 값과, 무처리 (「No beads」처리) 인 경우의 AFP 값으로 거의 변함없었다.
[결론]
Protein G Dynabeads 를 사용하여 검체에 함유되는 협잡물을 제거 처리함으로써, 위양성의 원인이라고 생각되는 IgM 을 검체로부터 제거할 수 있다. 이로써 검체 중의 AFP 의 존재량을 보다 정확하게 측정하는 것이 가능해진다.
10 피펫팁
12 웰
20 칼럼 함유 피펫팁
30 멤브레인 함유 피펫팁
40 겔 함유 피펫팁
50 피펫팁 (통 형상 팁)
70 항원 분별 고정 튜브
72 스페이서 비즈
100 측정 시스템
102 중앙 제어부
106 팁 마운트 제어부
108 자장 제어부
112 펌핑 제어부
130 자석
140 펌프
146 압력 센서
150 측정 시스템
151 자석
152 분주 장치
153 히트 블록
154 검출 장치
162 노즐
164 피펫팁
170 PMT
171 광원
180 카트리지
181 베이스 패널
182 수용부
260 측정 시스템
262 시스템 본체
264 카트리지

Claims (45)

  1. 생체 관련 물질 측정 장치로서,
    (a) 검체를 수용하는 검체 수용부와,
    (b) 검체로부터 생체 관련 물질을 포착하는 포착 입자를 수용하는 제 1 수용부와,
    (c) 상기 생체 관련 물질의 검출용 시약을 수용하는 제 2 수용부와,
    (d) 상기 검체 또는 상기 생체 관련 물질을 분주하는 분주 기구와,
    (e) 상기 생체 관련 물질을 형광시키기 위한 조사광을 조사하는 광 조사 기구 및 상기 생체 관련 물질로부터의 상기 형광을 받아 상기 생체 관련 물질을 검출하는 검출 기구를 구비하고,
    상기 광 조사 기구는, 상기 조사광을 상기 분주 기구의 노즐 유닛으로부터 하방(下方)으로 조사하는 광 조사용 광파이버를 함유하고, 상기 광 조사용 광파이버는, 상기 분주 기구의 상기 노즐 유닛의 내부를, 상기 노즐 유닛을 따라 연장되어 있는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 광 조사용 광파이버는 상기 노즐 유닛과 일체화되는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 노즐 유닛은 펌핑 개구를 구비하고, 상기 광 조사용 광파이버는 상기 펌핑 개구의 외측에 설치되는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 검출 기구는 상기 형광을 수광하는 수광용 광파이버를 구비하고, 상기 수광용 광파이버는 상기 노즐 유닛을 따라 연장되어 있는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 수광용 광파이버는, 상기 노즐 유닛의 외측에 설치되는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 검출 기구는, 상기 형광을 수광하여 상기 수광용 광파이버로 유도하는 렌즈를 구비하는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 렌즈는 검출용 웰과 대면하는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 포착 입자는 자성 입자인, 생체 관련 물질 측정 장치.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 자성 입자는, 상기 노즐 유닛의 분주팁 내에 수용되는 생체 관련 물질 측정 장치.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 검체 수용부, 제 1 수용부, 및 제 2 수용부는, 직선 형상으로 배열되는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 생체 관련 물질은 핵산이고, 상기 검출용 시약은 PCR 법 또는 등온 증폭법에 의한 핵산 증폭용 시약 및 증폭 산물의 검출용 시약을 함유하는, 생체 관련 물질 측정 장치.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 검출용 시약은 미리 동결 건조된 검출용 시약인, 생체 관련 물질 측정 장치.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 수용부가 카트리지화된, 생체 관련 물질 측정 장치.
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