JP2016214203A - 核酸増幅装置、核酸増幅用カートリッジおよび核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、サイクルタイムを短縮させても増幅効率が低減することを抑制させることを目的とする。【解決手段】 本発明では、標的核酸の変性温度に加熱される容器10の第1領域36Aに液滴20を移動させて留める変性段階、および、当該第1領域36Aとは異なる容器10の第2領域36Bに液滴20を移動させて留める合成段階を経るサイクルが複数回繰り返される。液滴20には蛍光標識プローブが含有され、当該蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含む。【選択図】 図7
Description
本発明は増幅核酸装置、増幅核酸用カートリッジおよび増幅核酸方法に関する。
PCR(polymerase chain reaction)法は、核酸における鎖長の違いなどを要因としてその核酸の変性やアニーリングの違いが生じることを利用し、当該核酸に対する温度変化を複数サイクル繰り返して核酸を増幅させる手法である。この手法によって、サイクル数だけ2を累乗したPCR産物が得られる。
このようなPCR法を用いた核酸増幅装置として、下記特許文献1のPCR装置が本出願人により提案されている。下記特許文献1のPCR装置に装着されるバイオチップには、標的核酸などが含まれる反応液が移動する流路が形成され、その流路には反応液が収容されるとともに、当該反応液よりも比重が小さく反応液とは混和しない液体が充填されている。
下記特許文献1のPCR装置には、バイオチップが装着される装着部にそのバイオチップを装着した場合において、当該バイオチップに形成される流路の第1領域を加熱する加熱部と、当該第1領域と異なる温度で第2領域を加熱する加熱部が備えられる。また、下記特許文献1のPCR装置には、装着部および加熱部の配置を、第1の配置と第2の配置との間で切換える駆動機構が備えられる。この駆動機構によって、装着部に装着されるバイオチップの反応液は、互いに異なる温度に加熱される第1の領域と第2の領域との相互に移動される。このような下記特許文献1のPCR装置によれば、バイオチップ全体の温度を互いに異なる温度に切り替える場合に比べると、増幅反応期間を短縮できるというものである。
ところで、上述のPCR装置におけるPCR産物の生成時間をより一段と早めるべき要請がある。しかしながら、PCR産物を得るために各サイクルタイムを短くし過ぎると増幅効率が低減することが懸念される。
そこで本発明は、サイクルタイムを短縮させても増幅効率が低減することを抑制させることを目的とする。
上記増幅効率が低減する要因の1つとして、鋳型核酸にプライマーが結合してもプローブが結合できていないことが考えられる。そこで本発明者は核酸の合成反応期間を短縮させてもプローブの結合を強める観点で鋭意検討した結果、本発明の増幅核酸装置、増幅核酸用カートリッジおよび増幅核酸方法に至った。
本発明の核酸増幅装置は、鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴と、前記液滴の比重とは異なり相分離するオイルとが収容される容器を装着する装着部と、前記装着部に装着される前記容器の第1領域を前記標的核酸の変性温度に設定する第1ヒーターと、前記第1領域とは異なる前記容器の第2領域を前記標的核酸の合成温度に設定する第2ヒーターと、前記第1領域から前記第2領域に前記液滴を移動させ、および前記第2領域から前記第1領域に前記液滴を移動させる移動機構と、前記第1領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第2領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、を備え、前記試薬には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有され、前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする。
また本発明は、鋳型核酸を含む溶液の液滴が導入され、前記液滴が移動する流路を有する容器と、前記容器に収容され、前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬と、を備える核酸増幅用カートリッジであって、前記試薬には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有され、前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする。
さらに本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴が収容される容器の第1領域を前記標的核酸の変性温度に設定するとともに、前記第1領域とは異なる第2領域を前記標的核酸の合成温度に設定する温度調整ステップと、前記第1領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第2領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、を備え、前記試薬には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有され、前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする。
以下、本発明を実施するための形態を添付図面を用いて例示する。以下に例示する実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができる。
(1)実施形態
実施形態として、核酸を増幅させる核酸増幅装置に装着されるカートリッジを説明した後に、当該核酸増幅装置を説明する。
実施形態として、核酸を増幅させる核酸増幅装置に装着されるカートリッジを説明した後に、当該核酸増幅装置を説明する。
===カートリッジ===
図1は、カートリッジ1の断面を示す図である。図1に示すように、カートリッジ1は、試薬11とオイル12とが収容される容器10を備える。本実施形態では容器10の側壁部10Aは円筒状とされ、当該容器10の底壁部10Bは中空半球状とされる。
図1は、カートリッジ1の断面を示す図である。図1に示すように、カートリッジ1は、試薬11とオイル12とが収容される容器10を備える。本実施形態では容器10の側壁部10Aは円筒状とされ、当該容器10の底壁部10Bは中空半球状とされる。
容器10の底壁部10Bに対向する端部は開口しており、当該開口にはキャップ10Cが取り付けられる。キャップ10Cは容器10の開口を塞ぐ蓋部材であり、本実施形態では容器10に対して着脱自在とされる。また、本実施形態では容器10内に収容されるキャップ10Cのシール部位SPは円柱状とされる。
このような容器10内には鋳型核酸溶液が導入される。容器10内に鋳型核酸溶液を導入するときにはキャップ10Cが容器10から取り外され、当該導入後にキャップ10Cが再び容器10に取り付けられる。
なお、容器10内に導入される鋳型核酸溶液は、例えば次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によってヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルス粒子などの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて鋳型核酸が検体から抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液(鋳型核酸を含有する溶液)が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液の組成は、例えば水(蒸留水、滅菌水)やTris-EDTA溶液(TE)とされる。
試薬11は、標的核酸の増幅反応に使用される試薬であり、凍結乾燥状態で容器10に収容される。本実施形態に使用される試薬11は、凍結乾燥によって容器10の底壁部10Bに固定される。この試薬11には、少なくとも、DNA(deoxyribonucleic acid)ポリメラーゼ、プライマー、dNTP(deoxyribonucleotide triphosphate)、蛍光標識プローブおよび緩衝液が含有される。なお、試薬11が凍結乾燥された場合、当該試薬11における水分が消失するため、緩衝液に含有されるマグネシウムやカリウムなどのイオンが容器10の底壁部10Bに固定される。
標的核酸は、容器10内に導入される鋳型核酸溶液中の鋳型核酸において増幅させるべき全部または一部の核酸であり、例えばDNA断片、cDNA(complementary DNA)断片又はPNA(peptide nucleic acid)である。
蛍光標識プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識物質である。本実施形態の蛍光標識プローブは、図2に示すように、プローブP1と、当該プローブP1の5´末端側に付加されたレポーター蛍光色素P2と、当該プローブP1の3´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素P3と、そのクエンチャー蛍光色素P3に付加されたマイナーグルーブバインダー(MGB:minor groove binder)分子P4とでなる。
なお、鋳型核酸がRNA(ribonucleic acid)の場合、そのRNAのcDNAを得るため、逆転写酵素や逆転写酵素用プライマーなども、標的核酸の増幅反応に使用される試薬11として含有される。
オイル12は、容器10内に導入される鋳型核酸溶液の比重よりも比重が小さく、当該鋳型核酸溶液とは相分離するものであり、例えば2CSシリコーンオイルあるいはミネラルオイルなどとされる。
図3はカートリッジの容器内に鋳型核酸溶液が導入される様子を示す図であり、図4は鋳型核酸溶液によって凍結乾燥状態の試薬が元の状態に戻った場合の様子を示す図である。
図3に示すように、カートリッジ1の容器10内に鋳型核酸溶液が導入された場合、当該鋳型核酸溶液には界面の表面積を小さくする作用が働くことで、鋳型核酸溶液は容器10内のオイル12と相分離し、液滴20となる。この液滴20の比重はオイル12の比重よりも大きいため、当該液滴20が移動する流路である容器10の側壁部10Aに沿って沈降する。なお、液滴20の体積は0.2μL以上2μL以下であることが好ましい。
図4に示すように、液滴20が容器10の底壁部10Bにまで沈降した場合、当該液滴20の水分によって凍結乾燥した試薬11が元の状態になり、その元の状態になった試薬11が液滴20内に取り込まれる。
凍結乾燥状態から元の状態になった試薬11が液滴20内に取り込まれた場合、当該液滴20には鋳型核酸およびその鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬11を含むこととなり、当該液滴20が核酸の増幅反応を進行させる場となる。
なお、容器10における側壁部10Aの内壁は、液滴20が付着しない程度の撥水性を有することが好ましい。
===核酸増幅装置===
図5は、核酸増幅装置のブロック図である。図5に示すように、核酸増幅装置50は、回転機構60、蛍光測定器70および制御部80を有する。
図5は、核酸増幅装置のブロック図である。図5に示すように、核酸増幅装置50は、回転機構60、蛍光測定器70および制御部80を有する。
<回転機構>
図6は、回転機構の様子を示す図である。図6は回転機構60の側面図である。以下の核酸増幅装置50の説明では、図6に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、核酸増幅装置50のベース51を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、カートリッジ1の回転軸AXの軸方向を「左右方向」とし、上下方向及び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。
図6は、回転機構の様子を示す図である。図6は回転機構60の側面図である。以下の核酸増幅装置50の説明では、図6に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、核酸増幅装置50のベース51を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、カートリッジ1の回転軸AXの軸方向を「左右方向」とし、上下方向及び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。
図6に示すように、回転機構60は、回転体61およびその回転体61を回転させる回転用モーター66(図5)を有する。回転体61には、カートリッジ1を着脱可能な挿入穴64を有するヒーター部65が設けられる。回転体61は、ヒーター部65とそのヒーター部65の挿入穴64に装着されるカートリッジ1との相対位置を変えずに、ベース51に固定された支持台52に支持される回転軸AXを中心として回転する。
なお、本実施形態におけるヒーター部65の挿入穴64は、カートリッジ1を出し入れ可能な穴と、当該穴に入れられたカートリッジ1を装着する装着部を兼ねているが、当該穴と装着部とが別々に核酸増幅装置50に設けられていてもよい。また、装着部が装着可能なカートリッジ1の数は、1つに限られず、複数でもよい。
回転用モーター66(図5)は、制御部80からの指示にしたがって、ヒーター部65の挿入穴64に装着されたカートリッジ1が上下反転するように、回転体61を回転させる。
図7は、カートリッジが装着された様子を示す図である。図7に示すように、ヒーター部65は、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱するための第1ヒーター部65Bと、標的核酸の合成反応(アニーリング反応および伸長反応)が進行する温度に加熱するための第2ヒーター部65Cとを有する。
ヒーター部65の挿入穴64にカートリッジ1が装着された場合、そのカートリッジ1の容器10において液滴20の流路である側壁部10Aの一端側にあたる第1領域36Aが第1ヒーター部65Bに囲まれる。第1ヒーター部65Bは、第1領域36Aを例えば95〜100℃に加熱する。
また、ヒーター部65の挿入穴64にカートリッジ1が装着された場合、そのカートリッジ1の容器10において液滴20の流路である側壁部10Aの他端側にあたる第2領域36Bが第2ヒーター部65Cに囲まれる。第2ヒーター部65Cは、第2領域36Bを例えば50〜75℃に加熱する。
このようにカートリッジ1における容器10の第1領域36Aが標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱され、当該容器10の第2領域36Bが標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱される。
なお、第1ヒーター部65Bと第2ヒーター部65Cとの間には、第1ヒーター部65Bと第2ヒーター部65Cとの間の熱伝導を抑制するスペーサー65Dが配置されている。このスペーサー65Dには、第1ヒーター部65Bおよび第2ヒーター部65Cの挿入穴64の長手方向に沿った位置に貫通孔が形成され、挿入穴64に対してカートリッジ1の容器10の挿入を妨げることが防止される。
<蛍光測定器>
蛍光測定器70は、カートリッジ1における容器10に収容される液滴20の蛍光強度を測定する測定器であり、図6に示すように、ヒーター部65の挿入穴64に装着されるカートリッジ1の末端に対して所定距離を隔てて対向する状態で配置される。
蛍光測定器70は、カートリッジ1における容器10に収容される液滴20の蛍光強度を測定する測定器であり、図6に示すように、ヒーター部65の挿入穴64に装着されるカートリッジ1の末端に対して所定距離を隔てて対向する状態で配置される。
蛍光測定器70は、制御部80からの測定指示に応じて液滴20に含有される蛍光色素に対応する励起光を照射し、当該液滴20で発光する蛍光強度を測定する。また蛍光測定器70は、測定結果として得られる蛍光強度を示すデータを制御部80に与える。なお、蛍光測定器70は、1つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであっても、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであってもよい。
<制御部>
制御部80は、図5に示すように、記憶部91を有し、当該制御部80には入力部92および表示部93などが接続される。記憶部91には、プログラムを格納する領域と、入力部92から入力される設定データおよび核酸増幅処理によって得られるデータなどの各種のデータを格納する領域と、当該プログラムやデータを展開する領域とが含まれる。
制御部80は、図5に示すように、記憶部91を有し、当該制御部80には入力部92および表示部93などが接続される。記憶部91には、プログラムを格納する領域と、入力部92から入力される設定データおよび核酸増幅処理によって得られるデータなどの各種のデータを格納する領域と、当該プログラムやデータを展開する領域とが含まれる。
制御部80は、記憶部91に格納されるプログラムおよび設定データに基づいて回転機構60および蛍光測定器70を適宜制御し、熱サイクル処理または増幅解析処理を適宜実行する。
≪熱サイクル処理≫
図8は、熱サイクル処理の様子を示す図である。具体的に図7の(A)および(B)は標的核酸の合成段階の様子を示し、図8の(C)および(D)は標的核酸の変性段階の様子を示す図である。
図8は、熱サイクル処理の様子を示す図である。具体的に図7の(A)および(B)は標的核酸の合成段階の様子を示し、図8の(C)および(D)は標的核酸の変性段階の様子を示す図である。
すなわち、制御部80は、例えば熱サイクル処理すべき命令を入力部92から受けると、回転体61に設けられた第1ヒーター部65Bを駆動し、カートリッジ1における容器10の第1領域36Aを、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱する。また、制御部80は、回転体61に設けられた第2ヒーター部65Cを駆動し、カートリッジ1における容器10の第2領域36Bを、標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱する。これによりカートリッジ1の容器10に充填されるオイル12には温度勾配が形成される。
第1ヒーター部65Bおよび第2ヒーター部65Cが駆動されてから、第1領域36Aにおけるオイル12が例えば98℃に達し、第2領域36Bにおけるオイル12が例えば54℃に達するまでには所定の期間を要する。この期間に標的核酸の増幅反応は適切に進行しないため、制御部80は当該期間を待機期間として待機する。
このとき、図8の(A)に示すように、ヒーター部65の挿入穴64に装着された容器10におけるキャップ10C側が上側に配置され、当該容器10における底壁部10B側が下側に配置される基準位置に回転体61が位置している。回転体61が基準位置に位置している場合、図8の(B)に示すように、液滴20は自重により沈降して第2領域36Bに留まる。したがって、液滴20に含有する標的核酸が1回目の変性段階に移行することはない。
制御部80は、上述の待機期間を経過した場合、回転体61を180度回転させる。この場合、図8の(C)に示すように、ヒーター部65の挿入穴64に装着された容器10におけるキャップ10C側が下側に配置され、当該容器10における底壁部10B側が上側に配置される反転位置に回転体61が位置することになる。回転体61が反転位置に位置している場合、図8の(D)に示すように、液滴20は自重により沈降して第1領域36Aに移動する。したがって、液滴20に含有する標的核酸は変性段階に移行することになる。
また制御部80は、回転体61を180度回転し終えた時点(回転体61を停止した)から標的核酸の変性段階の期間として設定された変性反応期間だけ、回転体61を停止させる。これにより液滴20に含有する標的核酸の変性反応が進行する。なお、変性反応期間は、少なくとも、容器10において液滴20の流路となる側壁部10Aの一端側にあたる第1領域36Aと、当該側壁部10Aの他端側にあたる第2領域36Bとの間を液滴20が移動する期間以上の期間とされる。本実施形態の場合、変性反応期間は、2秒以上5秒未満とされ、一般的な変性反応期間として採用される5秒以上30秒未満よりも短くされる。
次いで制御部80は、変性反応期間を経過すると、回転体61を180度回転させて、当該回転体61を反転位置から基準位置に切り替え、図8の(B)に示すように、第2領域36Bに液滴20を移動させる。これにより液滴20に含有する標的核酸は合成段階に移行することになる。
また制御部80は、回転体61を180度回転し終えた時点(回転体61を停止した)時点から標的核酸の合成段階の期間として設定された合成反応期間だけ、回転体61を停止させる。これにより液滴20に含有する標的核酸のアニーリング反応および伸長反応が進行する。なお、合成反応期間は、上述の変性反応期間と同様に、少なくとも第1領域36Aと第2領域36Bとの間を液滴20が移動する期間以上の期間とされる。本実施形態の場合、合成反応期間は、3秒以上20秒未満とされ、一般的な変性反応期間として採用される20秒以上60秒未満よりも短くされる。
このように制御部80は、上述の反転位置と基準位置とを交互に切り替えて、第1領域36Aに液滴20を移動させて留める変性段階および第2領域36Bに液滴20を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す。繰り返すべきサイクル数は制御部80に設定され、例えば50回とされる。
≪増幅解析処理≫
増幅解析処理は、熱サイクル処理と同時期に並行して実行される。すなわち、制御部80は、蛍光測定器70に対して合成反応期間ごとに測定指示を与え、当該測定指示結果として蛍光測定器70から与えられる蛍光強度を示すデータを記憶部91に記憶する。
増幅解析処理は、熱サイクル処理と同時期に並行して実行される。すなわち、制御部80は、蛍光測定器70に対して合成反応期間ごとに測定指示を与え、当該測定指示結果として蛍光測定器70から与えられる蛍光強度を示すデータを記憶部91に記憶する。
なお、図8の(A)および(B)に示したように、合成反応期間では回転体61が基準位置にあるため、容器10内の液滴20は底壁部10Bに向かって沈降していく。しかしながら、回転体61が基準位置になった直後では、液滴20が底壁部10Bに到達していない場合がある。したがって、制御部80が蛍光測定器70に対して測定指示を与える時期は、回転体61を反転位置から基準位置にまで回転し終えた時点から所定時間経過した後であることが望ましい。特に、基準位置から反転位置に回転させる直前であることが望ましい。
また制御部80は、入力部92から入力される命令に応じて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を示すデータを記憶部91から読み出し、当該データに基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成する。制御部80は、増幅曲線を生成した場合、その増幅曲線に基づいて基準の増幅効率に対する良否を判定し、当該判定結果と増幅曲線との双方またはいずれか一方を適宜表示部93に表示させる。
<熱サイクル処理手順>
図9は、熱サイクル処理手順を示すフローチャートである。図9に示すように、制御部80は、核酸溶出処理を実行した以降にステップSP1に進んで、核酸増幅用カートリッジ1における容器10の第1領域36Aを、標的核酸の変性反応が進行する温度として設定される変性温度に加熱する。また制御部80は、容器10の第2領域36Bを、標的核酸の合成反応が進行する温度として設定される合成温度に加熱し、ステップSP2に進む。
図9は、熱サイクル処理手順を示すフローチャートである。図9に示すように、制御部80は、核酸溶出処理を実行した以降にステップSP1に進んで、核酸増幅用カートリッジ1における容器10の第1領域36Aを、標的核酸の変性反応が進行する温度として設定される変性温度に加熱する。また制御部80は、容器10の第2領域36Bを、標的核酸の合成反応が進行する温度として設定される合成温度に加熱し、ステップSP2に進む。
制御部80は、ステップSP2では、加熱し始めた時点から加熱対象が目的の温度に達するとして設定される待機期間を経過するまで待機し、当該待機期間を経過した場合にはステップSP3に進む。
制御部80は、ステップSP3では、回転体61を基準位置から反転位置にまで回転させて容器10の変性温度領域(第1領域36A)に液滴20を移動させる。次いで制御部80は、回転体61を反転位置に位置させた時点から変性反応期間を経過するまで、回転体61を停止させ続けて容器10の変性温度領域に液滴20を留める。制御部80は、変性反応期間を経過した場合にはステップSP4に進む。
制御部80は、ステップSP4では、回転体61を反転位置から基準位置にまで回転させて容器10の合成温度領域(第2領域36B)に液滴20を移動させる。次いで制御部80は、回転体61を基準位置に位置させた時点から合成反応期間を経過するまで、回転体61を停止させ続けて容器10の合成温度領域に液滴20を留める。制御部80は、合成反応期間を経過した場合にはステップSP5に進む。
制御部80は、ステップSP5では、繰り返すべきサイクル数として設定される繰返数にサイクル終了数が達したかを認識する。ここで、サイクル終了数が繰返数に至っていない場合、制御部80は、サイクル終了数を1回分だけ増加させた後、ステップSP3に戻って上述の処理を繰り返す。一方、サイクル終了数が繰返数に至った場合、制御部80は、ステップSP6に進む。
制御部80は、ステップSP6では、容器10における第1領域36Aおよび第2領域36Bの加熱を停止した後、熱サイクル処理を終了する。
<小括>
以上のとおり、本実施形態におけるカートリッジ1の場合、鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬11が凍結乾燥された状態で容器10に収容される。この試薬11は、容器10に導入される鋳型核酸溶液(鋳型核酸を含む溶液)の液滴20によって元に戻されその液滴20に取り込まれる。このため、容器10に導入される液滴20に対して、試薬11をユーザに調整させることなく添加でき、この結果、試薬11の調整時間分を短縮することができるとともに、当該調整不良に起因する増幅効率の低減を回避することができる。
以上のとおり、本実施形態におけるカートリッジ1の場合、鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬11が凍結乾燥された状態で容器10に収容される。この試薬11は、容器10に導入される鋳型核酸溶液(鋳型核酸を含む溶液)の液滴20によって元に戻されその液滴20に取り込まれる。このため、容器10に導入される液滴20に対して、試薬11をユーザに調整させることなく添加でき、この結果、試薬11の調整時間分を短縮することができるとともに、当該調整不良に起因する増幅効率の低減を回避することができる。
この液滴20は、核酸増幅装置50によって移動される。具体的には、容器10の流路である側壁部10Aに沿って、変性温度に加熱に加熱される第1領域36Aと、合成温度に加熱される第2領域36Bとに交互に液滴20が移動される。このため、一定の場所で温度を変性温度と合成温度とに切り替える一般的な場合に比べると、増幅反応期間(サイクルタイム)を短縮することができる。特に、液滴20の体積が0.2μL以上2μL以下である場合、容器10の第1領域36Aと第2領域36Bとの間を速やかに液滴20が移動するため、より一段と増幅反応期間(サイクルタイム)を短縮することができる。その一方、合成反応時間が短縮されると増幅効率が低減することが懸念される。
これに対し本実施形態における試薬11には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有される。この蛍光標識プローブは、図2に示したように、プローブと、プローブの5´末端側に付加されたレポーター蛍光色素と、プローブの3´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素に付加されたMGB分子とでなる。
このようにMGB分子が付加された蛍光標識プローブが用いられた場合、一般的に採用される合成反応期間である20秒よりもその合成反応期間が短縮されても、増幅効率が向上することが見出された。このことは下記の実施例を一例として述べる。
MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブは、プローブ長を短くしても特異度が維持されることが知られている。これは、MGB分子P4は鋳型核酸の対応するマイナーグルーブにアプローチし、当該マイナーグルーブにおける塩基配列とMGB分子P4に付加されたプローブP1とが特異的に相補鎖を形成することでプローブP1の結合効率又は結合力が高まるからと考えられる。
すなわち、低温度でも特異性を維持させることが可能な因子としてMGB分子P4が知られていた。これに対し、合成反応期間を短くしても特異性を維持させることが可能な因子としてMGB分子P4が該当することが明らかにされた。したがって、ある一定の増幅効率を得るための調整要素が増えるのみならずプローブの設計幅が広がり、標的核酸に対する感度および特異度の双方をより向上させることが可能となる。
(2)変形例
上記実施形態では、プローブP1と、当該プローブP1の5´末端側に付加されたレポーター蛍光色素P2と、当該プローブP1の3´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素P3と、そのクエンチャー蛍光色素P3に付加されたマイナーグルーブバインダー分子P4とでなる蛍光標識プローブが用いられた。しかしながら、マイナーグルーブバインダー分子P4は、プローブP1またはレポーター蛍光色素P2に付加されていてもよい。
また、上記実施形態の蛍光標識プローブに代えて、インターカレーター用の蛍光色素の蛍光標識プローブが用いられてもよい。あるいは、上記実施形態の蛍光標識プローブに代えて、サイクリングプローブといった蛍光色素が結合される蛍光標識プローブが用いられてもよい。この蛍光標識プローブが用いられる場合、例えば蛍光色素にマイナーグルーブバインダー分子P4が付加されればよい。
要するに、マイナーグルーブバインダー分子P4が含まれる蛍光標識プローブであればよい。
上記実施形態では、プローブP1と、当該プローブP1の5´末端側に付加されたレポーター蛍光色素P2と、当該プローブP1の3´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素P3と、そのクエンチャー蛍光色素P3に付加されたマイナーグルーブバインダー分子P4とでなる蛍光標識プローブが用いられた。しかしながら、マイナーグルーブバインダー分子P4は、プローブP1またはレポーター蛍光色素P2に付加されていてもよい。
また、上記実施形態の蛍光標識プローブに代えて、インターカレーター用の蛍光色素の蛍光標識プローブが用いられてもよい。あるいは、上記実施形態の蛍光標識プローブに代えて、サイクリングプローブといった蛍光色素が結合される蛍光標識プローブが用いられてもよい。この蛍光標識プローブが用いられる場合、例えば蛍光色素にマイナーグルーブバインダー分子P4が付加されればよい。
要するに、マイナーグルーブバインダー分子P4が含まれる蛍光標識プローブであればよい。
また上記実施形態では、容器10の側壁部10Aは円筒状とされ、当該容器10の底壁部10Bは中空半球状とされた。しかしながら、容器10の形状は種々の形状とすることができる。
また上記実施形態では、容器10に対してキャップ10Cが着脱自在とされ、当該容器10からキャップ10Cが取り外された状態で鋳型核酸溶液が導入された。しかしながら、容器10に対してキャップ10Cが固定され、当該キャップ10Cに貫通される針を介して鋳型核酸溶液が導入されてもよい。なお、キャップ10Cは容器10と一体に形成されていてもよい。
また上記実施形態では、キャップ10Cのシール部位SPが円柱状とされた。しかしながら、シール部位SPにおいて容器10の底壁部10Bに対向する部分に半球状や円錐状の窪みが形成されていてもよい。この窪みが、容器10の側壁部10Aから離れるほど先細りとなる場合、液滴20を定位置に静止させることができるため、より同じ条件で液滴20を加熱させることが可能となる。なお、容器10の底壁部10Bが、当該容器10の側壁部10Aから離れるほど先細りとなっていてもよい。
また上記実施形態では、液滴20の比重がオイル12の比重よりも大きくされた。しかしながら、液滴20の比重がオイル12の比重よりも小さくされていてもよい。このようにしても上記実施形態と同様の効果を奏する。
また上記実施形態では、変性反応期間および合成反応期間の始期が回転体61を180度回転し終えた(回転体61を停止した)時点とされたが、当該回転体61を180度回転し始める時点とされてもよい。
また上記実施形態では、カートリッジ1における容器10内の液滴20を第1領域36Aと第2領域36Bとに交互に移動させる機構として回転機構60が採用された。しかしながら、容器10において標的核酸の変性温度にされる第1領域36Aと、その第1領域36Aとは異なる領域であって標的核酸の合成温度にされる第2領域36Bとに液滴20を交互に移動させる機構であれば、上記回転機構60以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
また上記実施形態では、容器10内で液滴20を移動させるべき領域として、標的核酸の変性温度にされる第1領域36Aと、その第1領域36Aとは異なる領域であって標的核酸の合成温度にされる第2領域36Bとが配置された。しかしながら、例えば特願2014−107844号に記載されているように3つの領域が配置されていてもよい。すなわち、第1領域36Aとして、標的核酸の変性温度にされる領域が配置される。また、第2領域36Bとして、互いに異なる2つ領域が配置され、一方の領域は標的核酸の合成反応におけるアニーリング反応が進行する温度として設定されるアニーリング温度にされ、他方の領域は標的核酸の伸長反応が進行する温度として設定される伸長温度にされる。このように、サイクルにおける温度変化が変性段階および合成段階の2段階とされる上記実施形態の場合に限らず、変性段階、アニーリング段階および伸長段階の3段階とされる場合であっても、容器内で液滴20を移動させることができる。なお、サイクルにおける温度変化が3段階とされる場合であっても、回転機構以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
上記実施形態では、第1ヒーター部65Bおよび第2ヒーター部65Cを備えた核酸増幅装置50が適用された。しかしながら、容器10の内部に温度勾配を形成できるのであれば、上記実施形態の核酸増幅装置50以外の核酸増幅装置が適用されてもよい。例えば、高温側ヒーターのみが備えられていてもよく、第2ヒーター部65Cが冷却器に変更されてもよい。あるいは、回転体61の外部に高温側ヒーターおよび低温側ヒーターが備えられていてもよい。あるいは、第1ヒーター部65Bを設ける部位と、第2ヒーター部65Cを設ける部位とが逆にされてもよい。
(実施例1)
まず、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬11と、ポジティブコントロール(陽性対照)を試験管に投入した後、蒸留水を加えて10μLの鋳型核酸溶液を調整した。
まず、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬11と、ポジティブコントロール(陽性対照)を試験管に投入した後、蒸留水を加えて10μLの鋳型核酸溶液を調整した。
鋳型核酸は、Vircell社製における肺炎マイコプラズマのゲノムDNA(MBC035)250コピーとし、0.625μLだけ試験管に投入した。
ポジティブコントロールは、タカラバイオ社製における大腸菌のゲノムDNA(9060(750fg/μL))とし、0.625μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるDNAポリメラーゼは、Life Technologies社製のPlatinumTaqとし、0.4μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるdNTPは、Roche社製のものを使用し、0.5μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用意した。マイコプラズマ用フォワードプライマーおよびマイコプラズマ用リバースプライマーは、それぞれ、0.8μLだけ試験管に投入した。また、大腸菌用フォワードプライマーおよび大腸菌用リバースプライマーは、それぞれ、0.8μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有される蛍光標識プローブは、MGB分子P4が付加されたマイコプラズマ用蛍光標識プローブであり、Life Technologies社製ものを使用し、0.6μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有される緩衝液は、MgCl2が25mM、Tris-HCl(PH9.0)が250mM、KClが125mMの組成のものとし、2.0μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるマイコプラズマ用蛍光標識プローブは、0.6μLだけ試験管に投入した。
ポジティブコントロールは、タカラバイオ社製における大腸菌のゲノムDNA(9060(750fg/μL))とし、0.625μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるDNAポリメラーゼは、Life Technologies社製のPlatinumTaqとし、0.4μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるdNTPは、Roche社製のものを使用し、0.5μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用意した。マイコプラズマ用フォワードプライマーおよびマイコプラズマ用リバースプライマーは、それぞれ、0.8μLだけ試験管に投入した。また、大腸菌用フォワードプライマーおよび大腸菌用リバースプライマーは、それぞれ、0.8μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有される蛍光標識プローブは、MGB分子P4が付加されたマイコプラズマ用蛍光標識プローブであり、Life Technologies社製ものを使用し、0.6μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有される緩衝液は、MgCl2が25mM、Tris-HCl(PH9.0)が250mM、KClが125mMの組成のものとし、2.0μLだけ試験管に投入した。
試薬11に含有されるマイコプラズマ用蛍光標識プローブは、0.6μLだけ試験管に投入した。
マイコプラズマ・大腸菌用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと、マイコプラズマ用蛍光標識プローブとの配列は、下記の表1に示すものとされる。
上記表1における“FAM”は、フルオレセインアミノヘキシル(fluorescein aminohexyl)の略語であり、レポーター蛍光色素の1つである。また、上記表1における“NFQ” は、非蛍光クエンチャー(Non-Fluorescent Quencher)の略語であり、クエンチャー蛍光色素の1つである。
次いで、鋳型核酸溶液を容器10に導入して容器10内に液滴20を形成させた後、上記核酸増幅装置50におけるヒーター部65の挿入穴64に容器10を装着し、熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
熱サイクル処理におけるサイクル数は50回とし、変性反応期間は4秒とし、合成反応期間は6秒とし、第1ヒーター部65Bの温度は100℃とし、第2ヒーター部65Cの温度は64℃とした。
(比較例1)
実施例1の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例1と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例1の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例1と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
比較例1の蛍光標識プローブは、MGB分子P4が付加されていないマイコプラズマ用蛍光標識プローブである。このマイコプラズマ用蛍光標識プローブの配列は、下記の表2に示すものとされる。
上記表2における“BHQ”は、ブラックホールクエンチャー(Black Hole Quencher)の略語であり、クエンチャー蛍光色素の1つである。
次いで、鋳型核酸溶液を容器10に導入して容器10内に液滴20を形成させた後、上記核酸増幅装置50におけるヒーター部65の挿入穴64に容器10を装着し、実施例1と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
(実施例1と比較例1との対比)
上述の実施例1および比較例1における増幅曲線を図10に示す。図10に示されるように、MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。また、増幅曲線の立ち上がりが数サイクル早まるという相乗効果を有することも分かった。すなわち、プローブの検出感度および特異度の双方を向上させることができるなお、このような効果は、図10に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
上述の実施例1および比較例1における増幅曲線を図10に示す。図10に示されるように、MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。また、増幅曲線の立ち上がりが数サイクル早まるという相乗効果を有することも分かった。すなわち、プローブの検出感度および特異度の双方を向上させることができるなお、このような効果は、図10に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
(実施例2)
実施例1の鋳型核酸、プライマーおよびプローブとは異なる鋳型核酸、プライマーおよびプローブを用い、当該鋳型核酸、プライマーおよびプローブ以外の条件が実施例1と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例1の鋳型核酸、プライマーおよびプローブとは異なる鋳型核酸、プライマーおよびプローブを用い、当該鋳型核酸、プライマーおよびプローブ以外の条件が実施例1と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例2の鋳型核酸は、Vircell社製における百日咳のゲノムDNA(MBC008)200コピーとした。
百日咳用プライマーおよび百日咳用蛍光標識プローブの配列は、下記の表3に示すものとされる。
次いで、鋳型核酸溶液を容器10に導入して容器10内に液滴20を形成させた後、上記核酸増幅装置50におけるヒーター部65の挿入穴64に容器10を装着し、実施例1と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
(比較例2)
実施例2の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例2と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例2の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例2と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
比較例2の蛍光標識プローブは、MGB分子P4が付加されていない百日咳用蛍光標識プローブである。この百日咳用蛍光標識プローブの配列は、下記の表4に示すものとされる。
次いで、鋳型核酸溶液を容器10に導入して容器10内に液滴20を形成させた後、上記核酸増幅装置50におけるヒーター部65の挿入穴64に容器10を装着し、実施例2と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
(実施例2と比較例2との対比)
上述の実施例2および比較例2における増幅曲線を図11に示す。図11に示されるように、MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。なお、このような効果は、図11に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
上述の実施例2および比較例2における増幅曲線を図11に示す。図11に示されるように、MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。なお、このような効果は、図11に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
(実施例3)
実施例1の鋳型核酸、ポジティブコントロール、プライマーおよびプローブとは異なる鋳型核酸、プライマーおよびプローブを用い、当該鋳型核酸、プライマーおよびプローブ以外の条件が実施例1と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例1の鋳型核酸、ポジティブコントロール、プライマーおよびプローブとは異なる鋳型核酸、プライマーおよびプローブを用い、当該鋳型核酸、プライマーおよびプローブ以外の条件が実施例1と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例3の鋳型核酸は、Vircell社製におけるアデノウイルスのゲノムDNA(MBC001)100コピーとした。また、実施例3のポジティブコントロールは、培養由来枯草菌のゲノムDNAとした。
アデノウイルス・枯草菌用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと、アデノウイルス用蛍光標識プローブとの配列は、下記の表5に示すものとされる。
次いで、鋳型核酸溶液を容器10に導入して容器10内に液滴20を形成させた後、上記核酸増幅装置50におけるヒーター部65の挿入穴64に容器10を装着し、熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
熱サイクル処理におけるサイクル数は50回とし、変性反応期間は4秒とし、合成反応期間は6秒とし、第1ヒーター部65Bの温度は100℃とし、第2ヒーター部65Cの温度は58℃とした。
(比較例3)
実施例3の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例3と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
実施例3の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例3と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
比較例3の蛍光標識プローブは、MGB分子P4が付加されていないアデノウイルス用蛍光標識プローブである。このアデノウイルス用蛍光標識プローブの配列は、下記の表6に示すものとされる。
次いで、鋳型核酸溶液を容器10に導入して容器10内に液滴20を形成させた後、上記核酸増幅装置50におけるヒーター部65の挿入穴64に容器10を装着し、実施例3と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
(実施例3と比較例3との対比)
上述の実施例3および比較例3における増幅曲線を図12に示す。図12に示されるように、MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。また、増幅曲線の立ち上がりが数サイクル早まるという相乗効果を有することも分かった。すなわち、プローブの検出感度および特異度の双方を向上させることができるなお、このような効果は、図12に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
上述の実施例3および比較例3における増幅曲線を図12に示す。図12に示されるように、MGB分子P4が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。また、増幅曲線の立ち上がりが数サイクル早まるという相乗効果を有することも分かった。すなわち、プローブの検出感度および特異度の双方を向上させることができるなお、このような効果は、図12に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
1・・・カートリッジ、10・・・容器、10A・・・側壁部、10B・・・底壁部、10C・・・キャップ、11・・・試薬、12・・・オイル、20・・・液滴、50・・・核酸増幅装置。
本発明は核酸増幅装置、核酸増幅用カートリッジおよび核酸増幅方法に関する。
上記増幅効率が低減する要因の1つとして、鋳型核酸にプライマーが結合してもプローブが結合できていないことが考えられる。そこで本発明者は核酸の合成反応期間を短縮させてもプローブの結合を強める観点で鋭意検討した結果、本発明の核酸増幅装置、核酸増幅用カートリッジおよび核酸増幅方法に至った。
Claims (13)
- 鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴と、前記液滴の比重とは異なり相分離するオイルとが収容される容器を装着する装着部と、
前記装着部に装着される前記容器の第1領域を前記標的核酸の変性温度に設定する第1ヒーターと、前記第1領域とは異なる前記容器の第2領域を前記標的核酸の合成温度に設定する第2ヒーターと、
前記第1領域から前記第2領域に前記液滴を移動させ、および前記第2領域から前記第1領域に前記液滴を移動させる移動機構と、
前記第1領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第2領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、
を備え、
前記試薬には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅装置。 - 前記第2領域に前記液滴が留められる合成段階の期間は20秒未満とされる、請求項1に記載の核酸増幅装置。
- 前記第2領域に前記液滴が留められる合成段階の期間は6秒以下とされる、請求項1に記載の核酸増幅装置。
- 鋳型核酸を含む溶液の液滴が導入され、前記液滴が移動する流路を有する容器と、
前記容器に収容され、前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬と、
を備える核酸増幅用カートリッジであって、
前記試薬には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅用カートリッジ。 - 前記液滴の体積は、0.2μL以上2μL以下である、請求項4に記載の核酸増幅用カートリッジ。
- 前記試薬は凍結乾燥され、前記容器内壁に固定される、請求項4または5に記載の核酸増幅用カートリッジ。
- 前記容器に収容され、前記反応液とは比重が異なり、相分離するオイルを有する、請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
- 前記標的核酸における合成反応期間は20秒未満とされる、請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
- 前記標的核酸における合成反応期間は6秒以下とされる、請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
- 前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-CGGGACGGAAAGACC-NFQ-MGB 3’
でなる、請求項4ないし9のいずれか1項に記載の核酸増幅用カートリッジ。 - 前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-AATGGCAAGGCCGAACGCTTCA-NFQ-MGB 3’
でなる、請求項4ないし9のいずれか1項に記載の核酸増幅用カートリッジ。 - 前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA 3’
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA 3’
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-GAGTGCACCAGCCACACCGC-NFQ-MGB 3’
でなる、請求項4ないし9のいずれか1項に記載の核酸増幅用カートリッジ。 - 鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴が収容される容器の第1領域を前記標的核酸の変性温度に設定するとともに、前記第1領域とは異なる第2領域を前記標的核酸の合成温度に設定する温度調整ステップと、
前記第1領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第2領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、
を備え、
前記試薬には、DNAポリメラーゼ、プライマー、dNTPおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅方法。
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