JP6447810B2 - 核酸検出方法 - Google Patents
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Description
本発明の方法で使用する核酸増幅反応容器は、反応液と、反応液と比重が異なり、相分離する液体と、を含む、密閉された容器を有し、反応液が液滴状であり、液体が、オイルと添加剤を含む核酸増幅反応容器である。
本実施形態では、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応容器として、チューブ型の核酸増幅反応用チューブ100を用いる。以下、PCRを核酸増幅反応の一例とし、核酸増幅反応用チューブ100に適した昇降式核酸増幅反応装置(以下、昇降式PCR装置とも記す)の一例について、詳細に述べる。
図4(A)及び図4(B)は、昇降式PCR装置1の、図2(A)のA−A線における断面を模式的に示す断面図である。図4(A)及び図4(B)は、昇降式PCR装置1に核酸増幅反応用チューブ100が装着された状態を示す。図4(A)は第1の配置、図4(B)は第2の配置を示す。以下では、核酸増幅反応用チューブ100を用いた場合の、実施形態に係る昇降式PCR装置1を用いた熱サイクル処理について説明する。
以下、本発明の熱サイクル方法を用いて、シャトルPCRにおいて、1つの核酸増幅反応液中で複数の核酸を検出する方法を説明する。ここでは、核酸増幅反応液140中の、第1及び第2の核酸を検出する例を説明する。核酸増幅反応装置として、(1)、(2)に記載の上記昇降式PCR装置を用い、熱サイクル処理は(3)に記載の例に準じる。なお、本方法を用いることで、3つ以上の核酸も独立に検出することができるが、その場合、以下の記載は、3つ以上の核酸のうちの2つについて説明したものとする。
上述の昇降式PCR装置を用いて、2種類のプライマー対及び1種類の蛍光色素を用いて、2つの遺伝子を1つの核酸増幅反応液で増幅させる実施例を示す。PCR法は、アニーリングと伸長反応を同一温度で行うシャトルPCRを選択した。以下、アニーリング温度とは、アニーリング及び伸長反応を行う温度を意味するものとする。
比較例のPCR装置として、StepOnePlus(Applied Biosystems)を用い、本発明の方法には上述の昇降式PCR装置を用いた。StepOnePlusは、昇降式PCR装置と異なり、核酸増幅反応液を入れたチューブをサーマルブロックに装填し、サーマルブロックの加熱冷却を繰り返すことで核酸増幅反応液の温度を上下させる従来型の装置である。
β-actin RNA2 Forwardプライマー: 5-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 (配列番号1)
β-actin RNA2 Reverseプライマー: 5-CTGGTGCCTGGGGCG-3 (配列番号2)
β-actin RNA2 プローブ: FAM-CCGCCGCCCGTCCACACCCGCC-TAMRA (配列番号3)
(2)G1−bに使用したプライマー対及びプローブ
COG1 Forwardプライマー: 5-CGYTGGATGCGNTTYCATGA-3 (配列番号4)
COG1 Reverseプライマー: 5-CTTAGACGCCATCATCATTYAC-3 (配列番号5)
RING1‐TP(b)プローブ: FAM-AGATCGCGGTCTCCTGTCCA-MGB (配列番号6)
上記2つの遺伝子の増幅と温度との関係を図5に示す。棒グラフの縦軸は増幅開始サイクル数を、横軸はアニーリング温度を表し、線グラフの縦軸は蛍光輝度を、横軸はサイクル数を表す。数値は、2回の試験の平均値を表す。StepOnePlus(従来法)においては、どちらの遺伝子も40〜70℃で増幅が確認された。つまり、StepOnePlusにおいては、各プライマー対のアニーリング可能温度領域は、どちらも40〜70℃だった。
昇降式PCR装置(本発明)及びStepOnePlus(従来法)を用いて、上記2つの遺伝子の増幅を、1つの反応液内で連続して行った(連続PCR)。反応液量は(1)と同じくそれぞれ1.6μl、10μlとし、104コピーの遺伝子を増幅した。連続PCRの条件は下記の通りである。
Claims (4)
- 核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液よりも比重が小さく、かつ、前記核酸増幅反応液とは混和しない液体とが充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、
前記核酸増幅反応容器の第1領域の温度を調整する第1の温度調整部と、
前記核酸増幅反応容器の第2領域の温度を調整する第2の温度調整部と、
前記第1領域が前記第2領域より重力の作用する方向に対し下になる第1の配置と前記第2領域が前記第1領域より重力の作用する方向に対し下になる第2の配置とを切換える駆動機構と、を含む核酸増幅反応装置を用いた核酸検出方法であって、
第1の核酸を増幅させるための第1のプライマー対及び第2の核酸を増幅させるための第2のプライマー対を含む前記核酸増幅反応液であって、前記第1のプライマー対の前記第1の核酸に対するアニーリング可能温度領域と、前記第2のプライマー対の前記第2の核酸に対するアニーリング可能温度領域の重なりが5℃以下である前記核酸増幅反応液に対し、
前記第1領域を第1の温度に設定し、前記第2領域を前記第1の温度より低い第2の温度に設定して第1の熱サイクルを行う工程と、
前記第1の熱サイクル後に、前記第1領域を第3の温度に設定し、前記第2領域を前記第3の温度より低く前記第2の温度とは異なる第4の温度に設定して第2の熱サイクルを行う工程を含む、核酸検出方法。 - 前記アニーリング可能温度領域の重なりがない、請求項1に記載の核酸検出方法。
- 前記第1の核酸と前記第1のプライマー対の最適アニーリング温度と、前記第2の核酸と前記第2のプライマー対の最適アニーリング温度とが、3℃以上離れている、請求項1又は2に記載の核酸検出方法。
- 前記核酸増幅反応装置が、更に蛍光検出部を含み、該蛍光検出部が、前記核酸増幅反応装置が前記第1の熱サイクル及び前記第2の熱サイクルを行っている間に、前記核酸増幅反応液から放射される蛍光をモニタリングする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸検出方法。
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