JP2016168018A - 核酸増幅反応装置及び核酸増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸増幅反応装置を提供する。
【解決手段】核酸増幅反応液と、当該反応液とは比重が異なり混和しない液体とが充填された容器の第１、第２領域の温度を其々調整する第１、第２の温度調整部と、重力の作用方向に対し、第１領域が第２領域より下の第１配置と第２領域が第１領域より下の第２配置とを切換える駆動部とを含み、反応液は標的核酸増幅用第１プライマー対及びその増幅産物増幅用第２プライマー対を含み、核酸に対する第１プライマー対のアニーリング可能温度領域と増幅産物に対する第２プライマー対のアニーリング可能温度領域の重なりが１０℃以下で、第１、第２の温度調整部と駆動部が、第１、第２領域の温度を其々第１の温度、第１温度より低い第２温度にし、第１と第２配置とを切換えた後、第１、第２領域の温度を其々第３温度、第３温度より低く第２温度と１０℃以上異なる第４温度にし、第１と第２配置とを切換える、核酸増幅反応装置とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅反応装置及び核酸増幅方法に関する。

ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による核酸増幅反応は、しばしば、非特異的産物が問題になる。また、鋳型となる核酸が少量であると、増幅産物が十分量得られないこともある。そこで、標的遺伝子以外の遺伝子が多く存在する検体から、微量な標的遺伝子だけを検出する方法として、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲが採用されている。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法は、検出したい標的遺伝子の量が微量である場合、1対のプライマーの内側にもう1対のプライマーを設定し２回核酸増幅を行うことで、ＰＣＲの感度と特異度を上げる方法である。しかし、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、２種類のプライマー対を用いるために、通常、１つのプライマー対を用いた1回目のＰＣＲ終了後に、反応液の希釈、別の反応容器への移し替え、もう一方のプライマー等の試薬追加などを行うために、コンタミネーションのリスクがあり、且つ操作が煩雑なものだった。

特許文献１には、相異なるＴｍ値を有する複数のプライマー対を用いて、一つの反応容器で逆転写反応及びｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行う技術が開示されている。しかしこの技術は、１回目のＰＣＲから２回目のＰＣＲへ移行する際等に、反応容器を開けて反応試薬を容器に加える必要があり、反応液中のプライマー量も細かく調整する必要があるなど、依然としてコンタミネーションのリスクと操作の煩雑さがあった。

よって、よりコンタミネーションのリスクが低く、操作も簡便なｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを可能とする核酸増幅反応装置や核酸増幅方法が求められていた。

特開平４−２２２１８４号公報

本発明は、コンタミネーションのリスクを低減し、短時間で簡便に微量の核酸を増幅できる核酸増幅装置及び核酸増幅方法を提供することである。

本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することができる。

本発明の一実施形態は、核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液と比重が異なり、核酸増幅反応液とは混和しない液体とが充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、核酸増幅反応容器の第１領域の温度を調整する第１の温度調整部と、核酸増幅反応容器の第２領域の温度を調整する第２の温度調整部と、第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置とを切換える駆動部と、第１の温度調整部、第２の温度調整部、及び駆動部を制御する制御部と、を含む核酸増幅反応装置であって、核酸増幅反応液は、標的核酸を増幅させるための第１のプライマー対、及び第１のプライマー対を用いた核酸増幅反応の増幅産物を増幅させるための第２のプライマー対、を含み、第１のプライマー対の核酸に対するアニーリング可能温度領域と、第２のプライマー対の増幅産物に対するアニーリング可能温度領域との重なりが１０℃以下であり、制御部は、第１の温度調整部を制御して第１の領域の温度を第１の温度に調整し、第２の温度調整部を制御して第２の領域の温度を第１の温度より低い第２の温度に調整し、駆動部を制御して第１の配置と第２の配置とを切換えて第１の熱サイクルを行った後、
第１の温度調整部を制御して前記第１の領域の温度を第３の温度に調整し、第２の温度調整部を制御して前記第２の領域の温度を前記第３の温度より低く前記２の温度とは１０℃以上異なる第４の温度に調整し、前記駆動部を制御して前記第１の配置と前記第２の配置とを切換えて第２の熱サイクルを行う、核酸増幅反応装置である。

第２の温度が前記第４の温度より高くてもよい。また、第２の温度と、前記第１のプライマー対と前記標的核酸との最適アニーリング温度との温度差が５℃以内、又は１℃以内であってもよい。

第４の温度と、前記第２のプライマー対と前記増幅産物との最適アニーリング温度との温度差が５℃以内、又は１℃以内であってもよい。

第１の熱サイクルが、第１の温度と第２の温度の２段階の温度変化を繰り返す熱サイクルであって、第２の温度では、前記第１のプライマー対を用いた核酸増幅が起こり、第２のプライマー対を用いた核酸増幅が起こらなくてもよく、第２の熱サイクルが、第３の温度と第４の温度の２段階の温度変化を繰り返す熱サイクルであって、第４の温度では、第２のプライマー対を用いた核酸増幅が起こり、前記第１のプライマー対を用いた核酸増幅が起こらなくてもよい。

本発明の他の実施態様は、標的核酸を増幅させるための第１のプライマー対、及び第１のプライマー対を用いた核酸増幅反応の増幅産物を増幅させるための第２のプライマー対、を含む核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液と比重が異なり前記核酸増幅反応液とは混和しない液体、を核酸増幅反応容器に充填し、核酸増幅反応容器の第１の領域の温度を第１の温度に調整し、核酸増幅反応容器の第２の領域の温度を前記第１の温度より低い第２の温度に調整し、第１領域が第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と、第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置と、を切換えて第１の熱サイクルを行った後、第１の領域の温度を第３の温度に調整し、第２の領域の温度を第３の温度より低く第２の温度とは１０℃以上異なる第４の温度に調整し、第１の配置と第２の配置とを切り替えて第２の熱サイクルを行う、核酸増幅方法であって、第１のプライマー対の核酸に対するアニーリング可能温度領域と、第２のプライマー対の前記増幅産物に対するアニーリング可能温度領域との重なりが１０℃以下である、核酸増幅方法である。

アニーリング可能温度領域の重なりが５℃以下である、又は重なりがなくてもよい。

標的核酸と前記第１のプライマー対の最適アニーリング温度と、前記増幅産物と前記第２のプライマー対の最適アニーリング温度とが、３℃以上離れていてもよい。

第１の熱サイクル及び第２の熱サイクルを行っている間に、前記核酸増幅反応液から放射される蛍光をモニタリングしてもよい。

本発明によって、コンタミネーションのリスクを低減し、短時間で簡便に微量の核酸を増幅できる核酸増幅装置及び核酸増幅方法を提供することができるようになった。

本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応容器の断面図である。ｇは重力の方向を表す。 本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置の斜視図である。（Ａ）は蓋を閉じた状態、（Ｂ）は蓋を開けた状態を示す。 本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の分解斜視図である。 本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。（Ａ）は第１の配置、（Ｂ）は第２の配置を示す。 本発明の一実施形態に係るプライマー対のアニーリング可能温度領域を示す図である。 本発明の一実施形態に係るプライマー対のアニーリング可能温度領域を示す図である。 本発明の一実施形態に係る、それぞれアニーリング温度が異なる２回の核酸増幅反応の結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲの結果を示す図である。

以下、実施例を挙げながら、本発明の実施形態を詳細に述べる。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

（１）核酸増幅反応容器
本発明の方法で使用する核酸増幅反応容器は、反応液と、反応液と比重が異なり、反応液と混和しない液体と、を含む、密閉された容器を有し、反応液が液滴状であり、液体が、オイルと添加剤を含む核酸増幅反応容器である。

図１は、核酸増幅反応容器１００の断面図である。図１は、核酸増幅反応容器に反応液を入れた状態を表す。

本発明に使用する核酸増幅反応容器１００は、容器１５０及び封止部１２０を含んで構成されている。核酸増幅反応容器１００の大きさや形状は、特に限定されないが、例えば、反応液１４０と混和しない液体１３０の量、熱伝導率、容器１５０及び封止部１２０の形状、あるいは取り扱いの容易さの少なくとも１つを考慮して設計されてもよい。

核酸増幅反応容器１００の容器１５０は透明な材質から形成することができる。それによって、核酸増幅反応容器１００の外部から、容器１５０内の反応液１４０の移動を観察したり、リアルタイムＰＣＲ等の、容器１５０の外部から測定等を行うような用途に使用したりすることができる。なお、本明細書において「透明」という場合には、容器１５０の外部から容器１５０内の反応液１４０を観察できる程度の視認性が確保できるものとし、この条件が満たされる限り、必ずしも核酸増幅反応容器１００の全体が透明でなくても良いものとする。

核酸増幅反応容器１００の用途は特に限定されないが、例えばリアルタイムＰＣＲのような、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、容器１５０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。容器１５０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。また、容器１５０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等による酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。これらの条件を満たす材質としては特に限定されず、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥＸ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよいが、ポリプロピレンが好ましい。

図１に示す核酸増幅反応容器１００では、容器１５０は円筒状に形成されており、中心軸方向（図１における上下方向）が長手方向となっている。ここで用いる容器１５０は、チューブであることが好ましく、小型遠心用チューブや、ＰＣＲ用に設計されたチューブであってもよいが、長手方向を有する、即ち細長い形状であることにより、例えば、後述する昇降式の核酸増幅反応装置を用いて、容器１５０内の液体１３０に温度の異なる領域が形成されるように核酸増幅反応容器１００を温度制御する場合に、異なる温度の領域の間の距離を長くしやすくなる。これにより、容器１５０内の領域毎に、液体１３０を異なる温度に制御することが容易となるので、ＰＣＲに適した熱サイクルを実現できる。なお、昇降式の核酸増幅反応装置とは、容器１５０を満たした液体１３０中に少なくとも２つの温度領域を形成し、液体１３０と混和しない反応液１４０をこれらの温度領域間で往復移動させることによって熱サイクルを実現する装置である。この装置を用いた核酸増幅反応を、以下、昇降式ＰＣＲとも称する。

容器１５０の形状は、長手方向を有する限り、特に限定されないが、昇降式ＰＣＲに用いる場合には、略円筒形状で内径Ｄと長手方向の長さＬとの比が１：５〜１．５：２０の範囲であることが好ましい。さらには、内径Ｄが１．５〜２ｍｍ、長さＬが１０〜２０ｍｍであることがより好ましい。

容器１５０は、開口部及び開口部を封止する封止部１２０を有し、容器１５０中は反応液１４０と、反応液１４０と比重が異なり、反応液１４０と混和しない液体１３０を含む。開口部を封止部１２０により封止した場合に、容器１５０内に空気が残らないことが好ましい。容器１５０内に気泡が残ると、反応液１４０の移動が妨げられることがあるからである。封止部１２０は、容器１５０と同様の材質から形成することができる。封止部１２０の構造は、容器１５０を密閉できる構造であればよく、例えば、ねじ蓋、栓、はめ込み等の構造とすることができる。図１においては、封止部１２０はねじ蓋の構造である。

反応液１４０（以下、核酸増幅反応液１４０とも記す）は、核酸増幅反応用試薬、及び増幅対象の標的核酸を含んでもよい。標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液、組織などの検体から調製されたＤＮＡ、又は、それらの検体から調製されたＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡなどが挙げられる。核酸増幅反応用試薬は、標的核酸を増幅するためのプライマー対、バッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２及び、標的核酸の増幅産物を検出するための蛍光標識などを含んでいてもよい。核酸増幅反応容器１００中でＲＴ−ＰＣＲを行う場合は、逆転写酵素や逆転写用プライマーなどを含んでいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ^２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ⁻を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。標的核酸の増幅産物を検出するための蛍光標識は、特に限定されず、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの蛍光プローブや、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）などのインターカレーターなど、目的に応じて入試可能なものから任意に選択されてよい。

反応液１４０はまた、界面活性剤を含んでよい。界面活性剤は特に限定されないが、NP40、Triton-X100、Tween20などが例示できる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、核酸増幅反応を阻害しない濃度が好ましく、０．００１％〜０．１％以下であってもよく、０．００２％〜０．０２％であることが好ましく、０．００５％〜０．０１％であることが最も好ましい。界面活性剤は、上述の酵素のストック溶液からの持ち込みであってもよいが、それとは独立に界面活性剤溶液を反応液１４０に添加してもよい。

液体１３０は、反応液１４０とは混和しないものを用いることにより、容器１５０に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０と液体１３０とが混和しないため、液体１３０中において反応液１４０を液滴状にすることができる。こうして、反応液１４０が液体１３０中に液滴状で保持されている。

液体１３０は、反応液１４０よりも比重が小さいものが好ましい。この場合、液体１３０中に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が大きいので、重力の作用によって重力の作用する方向に移動する。また、液体１３０は、反応液１４０よりも比重が大きい液体であってもよい。この場合には、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が小さいので、重力の作用によって重力の作用する方向とは反対方向に移動する。

液体１３０はオイルを含むことが好ましく、例えば、シリコーンオイル又はミネラルオイルを使用することができる。ここで、シリコーンとは、主骨格としてシロキサン結合を有するオリゴマーまたはポリマーを意味する。本明細書においては、シリコーンのうち熱サイクル処理に使用する温度帯において液体の状態であるものを特にシリコーンオイルと称する。また、本明細書においては、石油から精製され、熱サイクル処理に使用する温度帯において液体であるものをミネラルオイルと称する。これらのオイルは熱に対する安定性が高く、例えば粘度が５×１０^３Ｎｓｍ^−２以下の製品も入手しやすいので、昇降式のＰＣＲに好適である。

シリコーンオイルとしては、信越シリコーン社製のＫＦ−９６Ｌ−０．６５ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−１ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−５ｃｓ、東レ・ダウコーニング社製のＳＨ２００ Ｃ ＦＬＵＩＤ ５ ＣＳ、あるいはモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製のＴＳＦ４５１−５Ａ、ＴＳＦ４５１−１０等のジメチルシリコーンオイルが例示される。ミネラルオイルとしては、主成分として炭素数１４から２０程度のアルカンを含有するものが例示される。すなわち、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペンタデカン、ｎ−ヘキサデカン、ｎ−ヘプタデカン、ｎ−オクタデカン、ｎ−ノナデカン、ｎ−テトラコサンが例示される。

液体１３０は、添加剤を含んでよい。添加剤としては、例えば、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、 KF-6017 、KF-8005（以上、信越シリコーン社）などの変性シリコーンオイル、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370（以上、Momentive社）などのシリコーンレジン、XS66-C1191（Momentive社）などのフルオロ変性シリコーンレジン、などのほか、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）などの変性シリコーンオイルを使用することができる。添加剤の濃度は、特に限定されないが、容器の構造、材質、形状などを考慮して決定することができる。例えば、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下であることが好ましく、２％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ）以下であることがより好ましく、５％（ｖ/ｖ）であることがさらに好ましい。

（２）昇降式核酸増幅反応装置の装置構成
本実施形態では、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応容器１００として、チューブ型の核酸増幅反応用チューブ１００を用いる。以下、ＰＣＲを核酸増幅反応の一例とし、核酸増幅反応用チューブ１００に適した昇降式核酸増幅反応装置（以下、昇降式ＰＣＲ装置とも記す）の一例について、詳細に述べる。

図２は、昇降式ＰＣＲ装置１の一例を示す。（Ａ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を閉じた状態、（Ｂ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を開けた状態であり、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を表す。図３は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の分解斜視図である。図４は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。

この昇降式ＰＣＲ装置１は、図２（Ａ）に示すように、本体１０及び駆動部２０を含む。図３に示すように、本体１０は、装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３を含む。第１温度調整部１２と第２温度調整部１３との間にはスペーサー１４が設けられている。本実施形態の本体１０においては、第１温度調整部１２が底板１７の側、第２温度調整部１３が蓋５０の側に配置されている。本実施形態の本体１０においては、第１温度調整部１２、第２温度調整部１３、及びスペーサー１４はフランジ１６、底板１７及び固定板１９に固定されている。

装着部１１は、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を装着する構造である。図２（Ｂ）および図２に示すように、本実施形態の装着部１１は、核酸増幅反応用チューブ１００を差し込んで装着するスロット構造であり、第１温度調整部１２の第１ヒートブロック１２ｂ、スペーサー１４、及び第２温度調整部１３の第２ヒートブロック１３ｂを貫通する穴に核酸増幅反応用チューブ１００を差し込む構造となっている。装着部１１の数は複数であってもよく、図２（Ｂ）の例では、２０個の装着部１１が本体１０に設けられている。

この昇降式ＰＣＲ装置１は、核酸増幅反応用チューブ１００を第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３に対して所定の位置に保持する構造を含む。より具体的には、図４に示すように、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１の温度を第１温度調整部１２によって、第２領域１１２の温度を第２温度調整部１３によって、調整できる。本実施形態においては核酸増幅反応用チューブ１００の位置を定める構造は底板１７であり、図４（Ａ）に示すように、核酸増幅反応用チューブ１００を底板１７に接触する位置まで差し込むことで、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３に対して核酸増幅反応用チューブ１００を所定の位置に保持できる。

第１温度調整部１２は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、後述する核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１の温度を第１の温度に調整する。図４（Ａ）に示す例では、第１温度調整部１２は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。

第１温度調整部１２は、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材とを含んでもよい。図３に示す例では、第１温度調整部１２は第１ヒーター１２ａ及び第１ヒートブロック１２ｂを含む。本実施形態においては、第１ヒーター１２ａはカートリッジヒーターであり、導線１５によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター１２ａは第１ヒートブロック１２ｂに挿入されており、第１ヒーター１２ａが発熱することで第１ヒートブロック１２ｂが加熱される。第１ヒートブロック１２ｂは、第１ヒーター１２ａから発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材である。本実施形態においてはアルミニウム製のブロックである。

第２温度調整部１３は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、核酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２の温度を、第１の温度とは異なる第２の温度に調整する。図４（Ａ）に示す例では、第２温度調整部１３は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。図３に示すように、第２温度調整部１３は、第２ヒーター１３ａ及び第２ヒートブロック１３ｂを含む。第２温度調整部１３は、加熱する核酸増幅反応用チューブ１００の領域及び加熱する温度が第１温度調整部１２と異なる以外は、第１温度調整部１２と同様である。

本実施形態においては、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３の温度は、図示しない温度センサー及び後述する制御部によって制御される。第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３の温度は、核酸増幅反応用チューブ１００の第１及び第２領域の温度が所望の温度に調整されるように設定されることが好ましい。本実施形態においては、第１温度調整部１２を第１の温度に、第２温度調整部１３を第２の温度に制御することで、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の温度に、第２領域１１２を第２の温度に加熱できる。本実施形態における温度センサーは熱電対である。

駆動部２０は、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３を制御する機構であり、それにより第１領域と第２領域の配置を制御する。本実施形態においては、駆動部２０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１６とが接続されている。本実施形態における駆動軸は、装着部１１の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体１０が回転する。

本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、図示しない制御部を含む。制御部は、後述する第１の温度、第２の温度、第１の時間、第２の時間、及び熱サイクルのサイクル数のうち、少なくとも１つを制御する。制御部が第１の時間または第２の時間を制御する場合には、制御部は駆動部２０の動作を制御することによって、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３が所定の配置に保持される時間を制御する。制御部は、制御する項目ごとに異なる機構を設けても、全項目を一括して制御するものであってもよいが、本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１における制御部は電子制御であり、上記項目を全て制御する。本実施形態の制御部は図示しないＣＰＵ等のプロセッサー、及び、ＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置を含む。記憶装置には上記各項目を制御するための各種プログラム、データ等が記憶されている。また、記憶装置は各種処理の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有する。

本実施形態の本体１０は、図３及び図４（Ａ）の例に示すように、第１温度調整部１２と第２温度調整部１３との間にスペーサー１４が設けられている。本実施形態のスペーサー１４は、第１温度調整部１２または第２温度調整部１３を保持する部材である。本実施形態においては、スペーサー１４は断熱材であり、図４（Ａ）の例においては、装着部１１はスペーサー１４を貫通している。

本実施形態の本体１０は、固定板１９を含む。固定板１９は、装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３を保持する部材である。図２（Ｂ）及び図３に示す例においては、２枚の固定板１９がフランジ１６に嵌め合わされており、第１温度調整部１２、第２温度調整部１３及び底板１７が固定されている。

本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、蓋５０を含む。図２（Ａ）及び図４（Ａ）の例では、装着部１１は蓋５０によって覆われている。蓋５０は、固定部５１によって本体１０に固定されてもよい。本実施形態においては、固定部５１は磁石である。図２（Ｂ）及び図３の例に示すように、本体１０の蓋５０の接触する面には磁石が設けられている。図２（Ｂ）及び図３には示されていないが、蓋５０にも、本体１０の磁石が接触する位置に磁石が設けられており、蓋５０で装着部１１を覆うと、磁力によって蓋５０が本体１０に固定される。

なお、固定板１９、底板１７、蓋５０、フランジ１６は断熱材を用いて形成されることが好ましい。

（３）昇降式ＰＣＲ装置を用いた熱サイクル処理
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１に核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を示す。図４（Ａ）は第１の配置、図４（Ｂ）は第２の配置を示す。以下では、核酸増幅反応用チューブ１００を用いた場合の、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理について説明する。

図１の例に示すように、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００は流路１１０及び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しないオイル１３０とが充填され、封止部１２０によって封止されている。

流路１１０は、対向する内壁に近接して反応液１４０が移動するように形成されている。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域を意味する。「近接」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距離が近いことを意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する場合を含む。したがって、「対向する内壁に近接して反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０が移動する」こと、すなわち、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動することを意味する。

図１の例では、核酸増幅反応用チューブ１００の外形は円柱状であり、中心軸方向（図１における上下方向）に流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形の筒状である。したがって、本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、流路１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の直径を構成する流路１１０の壁面上の２点を含む領域であり、対向する内壁に沿って反応液１４０が流路１１０の長手方向に移動する。

核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１は、第１温度調整部１２によって第１の温度に調整される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２温度調整部１３によって第２の温度に調整される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域である。本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、第１領域１１１は、流路１１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の長手方向における他方の端部を含む領域である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、流路１１０の封止部１２０側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２であり、封止部１２０から遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１である。

図１に示すように、流路１１０は、オイル１３０と、反応液１４０の液滴とを含む。オイル１３０と反応液１４０は、（１）核酸増幅反応容器の記載に従って準備される。

以下、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照しながら、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理を説明する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）においては、矢印ｇの方向（図における下方向）が重力の作用する方向である。本実施形態においては、熱サイクル処理の例としてシャトルＰＣＲ（２段階温度ＰＣＲ）を行う場合を説明する。なお、以下に説明する各工程は熱サイクル処理の一例を示すものである。必要に応じて工程の順序を入れ替えたり、２以上の工程を連続的にあるいは並行して行ったり、工程を追加したりしてもよい。

シャトルＰＣＲは、高温と低温の２段階の温度処理を繰り返し反応液に施すことにより、反応液中の核酸を増幅させる手法である。高温の処理においては２本鎖ＤＮＡの解離が、低温の処理においてはアニーリング（プライマーが１本鎖ＤＮＡに結合する反応）及び伸長反応（プライマーを始点としてＤＮＡの相補鎖が合成される反応）が起こる。

一般に、シャトルＰＣＲにおける高温は８０℃から１００℃の間の温度、低温は５０℃から７０℃の間の温度である。各温度における処理は所定時間行われ、高温に保持する時間は低温に保持する時間よりも短いことが一般的である。例えば、高温が１秒から１０秒程度、低温が４秒から６０秒程度としてもよく、反応の条件によってはこれよりも長い又は短い時間であってもよい。

なお、使用する試薬の種類や量によって、適切な時間、温度およびサイクル数（高温と低温を繰り返す回数）は異なるので、試薬の種類や反応液１４０の量を考慮して適切なプロトコールを決定した上で反応を行うことが好ましい。

まず、核酸増幅反応用チューブ１００を、装着部１１に装着する。本実施形態では、オイル１３０が充填された流路１１０に反応液１４０を導入後、封止部１２０によって封止された核酸増幅反応用チューブ１００を装着部１１に装着する。反応液１４０の導入は、マイクロピペットやインクジェット方式の分注装置等を用いて行うことができる。装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した状態においては、第１温度調整部１２は第１領域１１１を、第２温度調整部１３は第２領域１１２を、それぞれ含む位置において核酸増幅反応用チューブ１００に接している。

ここで、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３、の配置は第１の配置である。図４（Ａ）に示すように、第１の配置は、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置させる。第１の配置においては、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に第１領域１１１が位置するので、オイル１３０よりも比重の大きい反応液１４０は、第１領域１１１に位置する。本実施形態においては、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着したら、蓋５０によって装着部１１を覆い、昇降式ＰＣＲ装置１を作動させる。

次に、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３により核酸増幅反応用チューブ１００を加熱する。第１温度調整部１２と第２温度調整部１３とは、核酸増幅反応用チューブ１００の異なる領域の温度を異なる温度に調整する。すなわち、第１温度調整部１２は第１領域１１１の温度を第１の温度に調整し、第２温度調整部１３は第２領域１１２の温度を第２の温度に調整する。これにより、流路１１０の第１領域１１１と第２領域１１２との間には、第１の温度と第２の温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、第１領域１１１から第２領域１１２へ向けて温度が低くなる温度勾配が形成される。本実施形態の熱サイクル処理はシャトルＰＣＲであるので、第１の温度は２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度はアニーリング及び伸長反応に適した温度とする。

装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３の配置は第１の配置であるので、核酸増幅反応用チューブ１００を加熱すると、反応液１４０は第１の温度に加熱される。第１の時間が経過したら、駆動部２０によって本体１０を駆動し、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３の配置を第１の配置から第２の配置へ切換える。第２の配置は、第２領域１１２を重力の作用する方向において流路１１０の最下部に位置させる配置である。換言すると、第２領域１１２は、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３が、第１の配置とは異なる所定の配置にある場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する領域である。本実施形態の熱サイクル装置１においては、制御部の制御によって駆動部２０が本体１０を回転駆動する。駆動軸を回転の軸として、モーターによってフランジ１６を回転駆動すると、フランジ１６に固定されている装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３が回転する。駆動軸は装着部１１の長手方向に対して垂直な方向の軸であるので、モーターの動作によって駆動軸が回転すると、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３が回転する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、本体１０を１８０°回転させる。これにより、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。

ここで、第１領域１１１と第２領域１１２との重力の作用する方向における位置関係が第１の配置とは逆になるので、反応液１４０は重力の作用によって第１領域１１１から第２領域１１２へと移動する。装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３の配置が第２の配置に達した場合に、駆動部２０の動作が停止すると、装着部１１、第１温度調整部１２並びに第２温度調整部１３の配置が第２の配置に保持される。第２の配置において、第２の時間が経過したら、再度回転し、所定の回数が来るまで、このようにして第１の位置と第２の位置を入れ替えながら回転することにより、核酸増幅反応が行われる。第１の位置と第２の位置を一回入れ替えることを、１サイクルとする。

核酸増幅反応液１４０が、第１領域から第２領域へ移動する時間は任意に設定できるが、より短い方が好ましい。例えば、その時間は５秒以内であってもよいが、２秒以内であることがより好ましく、１秒以内であることが最も好ましい。

上述の核酸増幅反応容器及び昇降式ＰＣＲ装置を用いてこの熱サイクル処理を行うことで、微小な液滴である反応液の温度を、従来のＰＣＲ装置に比べて素早く変えることできる。例えばシャトルＰＣＲにおいて、反応液の温度が、高温からアニーリング及び伸長反応に適した設定温度へ下降する時間、またはその逆が非常に短いために、アニーリング可能な温度以外の温度である時間も非常に短い。よって核酸増幅反応液中に、アニーリング可能温度領域の相異なる複数のプライマー対が存在していても、非特異的増幅が抑えられ、目的の増幅を効率的に行うことができる。

（４）本発明の核酸増幅方法
本発明に係る核酸増幅方法として、シャトルＰＣＲ法による、上述の熱サイクル方法を用いたｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を説明する。

ここでは、核酸増幅反応液１４０に含まれる標的核酸を第１のプライマー対を用いて第１の核酸増幅反応を行い、次いで第１のプライマー対より内側にアニーリングする、すなわち第１のプライマー対を用いて得た増幅産物にアニーリングするよう設計された第２のプライマー対を用いて第２の核酸増幅反応を行う例を説明する。本発明の核酸増幅反応装置として、（１）、（２）に記載の昇降式ＰＣＲ装置を用い、熱サイクル処理は（３）に記載の例に準じる。なお、本方法を用いることで、３種以上のプライマー対を用いて３つ以上の核酸増幅反応を行うことができるが、その場合、以下の記載は、そのうちの２つの核酸増幅反応について説明したものとする。

核酸増幅反応液１４０は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２、核酸、核酸を増幅させるための第１及び第２のプライマー対、並びに核酸増幅の指標である蛍光標識を含み、必要に応じて界面活性剤等を含んでもよい。蛍光標識は、１種類でも２種類でもよい。本方法では、この核酸増幅反応液１４０に対し、第１の温度と第２の温度で第１の熱サイクルを行った後で、第３の温度と第４の温度で、第２の熱サイクルを行う。第１及び第３の温度は、核酸変性に適した（３）の第１の温度、第２及び第４の温度は、アニーリング及び伸長反応に適した（３）の第２の温度に相当する。なお、第１及び第２のプライマー対は、以下のような特性を満たすように設計する。

まず、第１のプライマー対と第２のプライマー対は、それぞれ核酸に対するアニーリング可能温度領域が重なっていてもよいが、重なっていないことが最も好ましい。アニーリング可能温度領域が重なる場合、１０℃以下であることが好ましく、７℃以下であることがより好ましく、５℃以下であることがより好ましく、３℃以下であることがより好ましく、１℃以下であることがさらに好ましい。ここで、アニーリング可能温度領域とは、所定の条件で各プライマー対を単独で用いて核酸を増幅させた場合、核酸の増幅が認められる温度領域のことをいう。

また、核酸と第１のプライマー対の最適アニーリング温度と、核酸と第２のプライマー対の最適アニーリング温度とは、異なっていることが好ましく。１℃以上離れていることが好ましく、３℃以上離れていることがより好ましく、５℃以上離れていることがより好ましい。ここで、最適アニーリング温度とは、所定の条件で各プライマー対を単独で用いて核酸を増幅させた場合に、核酸が最も多量に増幅される温度のことをいう。

第１の核酸増幅反応におけるアニーリング温度と、第２の核酸増幅反応におけるアニーリング温度との差は、各プライマー対のアニーリング可能温度領域に応じて任意に決定すればよいが、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃以上、更に好ましくは１５℃以上離れた値に設定する。

アニーリング可能温度領域や最適アニーリング温度を調べる場合、ＰＣＲ装置、例えば上述の昇降式ＰＣＲ装置を用いた熱サイクル処理によって、決定することができるが、核酸を増幅させるのに用いるのと同じＰＣＲ装置で、かつ同じ条件で決定することが好ましい。なお、増幅反応の有無及び増幅反応産物量は、例えば、蛍光標識の呈する蛍光輝度を測定することによって調べることができる。

このようなプライマー対を含んだ核酸増幅反応液１４０に対し、第１の熱サイクル処理によって、まず第１の温度と第２の温度で第１の核酸増幅反応を行う。具体的には、以下の通りである。まず、第１温度調整部及び第２温度調整部を、それぞれ第１の温度及び第２の温度に設定し、装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３の配置を、第１の配置とする。このとき、核酸増幅反応液１４０は第１領域１１１に存在し、第１温度調整部によって、核酸変性反応に適した第１の温度に加熱される。任意に設定された第１の時間経過後、装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３を、回転によって第２の配置にすると、核酸増幅反応液１４０は第２領域１１２に移動する。第２の配置において、第２温度調整部によって、第２領域１１２を、第１のプライマー対と核酸とのアニーリング反応に適した第２の温度にし、アニーリング反応及び核酸伸長反応を行う。任意に設定された第２の時間経過後、再度回転し第１の位置に戻す。任意に設定された回数、第１と第２の配置を入れ替えながら回転させ、第１の核酸増幅反応を行う。第１のプライマー対と第２のプライマー対の、核酸とのアニーリング可能温度領域が重なっていない場合、実質的に第１の核酸増幅反応のみが進行する。

続いて、第２の熱サイクル処理によって第３の温度と第４の温度で第２の核酸増幅反応を行うために、第１温度調整部及び第２温度調整部を、それぞれ第３の温度及び第４の温度に設定する。第１の熱サイクル処理と同様、まず、第１の配置において、第１温度調整部によって、第１領域１１１に存在する核酸増幅反応液１４０を、核酸変性反応に適した、第３の温度にする。任意に設定された第１の時間経過後、装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３を、回転によって第２の配置にし、核酸増幅反応液１４０を第２領域１１２に移動させ、第２領域１１２の温度を、第２のプライマー対のアニーリング反応に適した第４の温度にする。任意に設定された第２の時間経過後、装着部１１、第１温度調整部１２及び第２温度調整部１３を、再度回転によって第１の配置にする。任意に設定された回数、第１と第２の配置を入れ替えながら回転させ、第２の核酸増幅反応を行う。第１のプライマー対と第２のプライマー対の、核酸とのアニーリング可能温度領域が重なっていない場合、実質的に第２の核酸増幅反応のみが進行する。このように、本発明の方法では、第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応を、核酸増幅反応容器への溶液添加や容器開閉等を行わずに、連続して行う。以下、このことを連続ＰＣＲと称する。

ここで、第２の温度と第４の温度は、それぞれ第１のプライマー対と第２のプライマー対の最適アニーリング温度との差が所定の温度以内になるように設定する。例えば、その温度差は５℃以内であってもよく、３℃以内であることが好ましく、１℃以内であることがより好ましいが、第２の温度及び第４の温度は、それぞれ第１のプライマー対と第２のプライマー対の最適アニーリング温度であることが最も好ましい。第２の温度及び第４の温度は、どちらが高くても構わないが、第２の温度の方が第４の温度より高い方が好ましい。

第１の温度と第３の温度は、それぞれ核酸と第１のプライマー及び核酸と第２のプライマーが十分変性できる温度である限り特に限定されず、また同じであっても異なっていてもよい。例えば、それぞれ独立に、９０℃以上であってもよく、９３℃以上であってもよく、９５℃以上であってもよい。

第１の核酸増幅反応から第２の核酸増幅反応に移行する際に、第１温度調整部による加熱温度を第１の温度から第３の温度へと変更し、第２温度調整部による加熱温度を第２の温度から第４の温度へと変更する場合、その時の第１温度調整部及び第２温度調整部の温度変更速度は任意に設定できるが、より速い方が好ましい。例えば、その速度は１℃／秒であってもよいが、２℃／秒であることがより好ましく、５℃／秒であることがさらに好ましく、１０℃／秒であることが最も好ましい。

核酸増幅反応液１４０が、第１領域から第２領域へ移動する時間は任意に設定できるが、より短い方が好ましい。例えば、その時間は５秒以内であってもよいが、２秒以内であることがより好ましく、１秒以内であることが最も好ましい。

好ましくは、上述の連続ＰＣＲ中、蛍光検出部によって核酸増幅反応液１４０に含まれる蛍光標識の蛍光輝度をモニタリングする。なお、第１の核酸増幅反応または第２の核酸増幅反応において、検出される蛍光輝度が上昇した場合、それぞれ核酸の増幅が起こったと判断できる。また、所定のサイクル数、例えば４０サイクル後でも蛍光輝度が上昇しない場合、核酸の増幅反応は起こらなかったと判断できる。

第２の核酸増幅反応を開始するタイミングは任意に設定できる。例えば、第１の核酸増幅反応を所定の回数のサイクル数行った時点で、第２の核酸増幅反応に切り替えるとあらかじめ決めておいてもよいが、第１の核酸増幅反応において核酸の増幅反応が起こったと判断された時点で第２の核酸増幅反応を開始してもよい。

また、本実施の形態では、ＰＣＲ法としてシャトルＰＣＲを用いたが、熱変性、アニーリング、及び伸長反応で温度を変えるＰＣＲ法（３段階温度ＰＣＲ）でもよい。この場合、第１及び第２アニーリング温度に加えて伸長反応温度を設定し、核酸増幅反応液をアニーリング温度に維持した後、所定時間、伸長反応温度に維持すればよい。

なお、ＲＴ-ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行う場合は、上述の熱サイクル処理の前に、第２温度調整部１３によって第２領域１１２を加熱し、第２領域１１２に存在する反応液１４０を約４２〜５５℃で処理することにより、逆転写反応を行えばよい。具体的には、例えば、第１温度調整部１２によって核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１の温度を９５℃に、第２温度調整部１３によって第２領域１１２の温度を４２℃に調整し、一定期間、第２の配置とする。このとき、反応液１４０は第２領域１１２にあるので、４２℃に加熱され、一定の期間ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写が行われ、その後第１の配置とし、９５℃の第１領域１１１に反応液１４０を移動させ、逆転写酵素を失活させる。その後、得られたｃＤＮＡを鋳型に、上述の熱サイクル処理を行えばよい。逆転写反応の温度及び逆転写酵素の失活温度は特に限定されないが、一般的には、逆転写反応の温度は３５〜６５℃程度、逆転写酵素の失活温度はＤＮＡポリメラーゼを失活させない温度、具体的には７０〜１０５℃程度の範囲から、任意に選択できる。

以上説明した本発明の方法を用いれば、第１の核酸増幅反応から第２の核酸増幅反応に移行する際、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行う場合は逆転写反応から第１の核酸増幅反応、第１の核酸増幅反応から第２の核酸増幅反応に移行する際、核酸増幅反応容器への試薬の添加や容器の開閉などの必要がないため、コンタミネーションのリスクや操作の煩雑さを低減できる。また、昇降式ＰＣＲ装置を用いると、核酸増幅反応液の温度変化が素早いために核酸増幅反応に要する時間が短いので、微量な核酸を短時間で増幅することが可能である。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。

＜実施例１＞
まず、２種類のプライマー対を用いて核酸増幅反応のアニーリング可能温度領域を上述の昇降式ＰＣＲ装置を用いて調べた。ＰＣＲ法は、アニーリングと伸長反応を同一温度で行うシャトルＰＣＲを選択した。以下、アニーリング温度とは、アニーリング及び伸長反応を行う温度を意味するものとする。

（１）アニーリング可能温度領域とアニーリング温度の決定
昇降式ＰＣＲ装置を用いた核酸増幅反応のためのアニーリング可能温度領域及びアニーリング温度を決定するため、まず、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、標的核酸としてのＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の一部（配列番号１）をｐＣＲ２．１ベクターに挿入したＢＣＲ−ＡＢＬプラスミドを作製した。そして、ＢＣＲ−ＡＢＬプラスミド１０^３コピー、２つの異なる領域（第一領域及び第二領域とする）をそれぞれ増幅するためのプライマー対、及びその他核酸増幅反応に必要な試薬を含む核酸増幅反応液を調製し、下記の条件で、増幅反応をそれぞれ個別に行った。

ＰＣＲ条件は以下の通りである。

第一領域の増幅のための核酸増幅反応液の組成は下記の通りである。調製した１０μｌから、１．６μｌ（１０^３コピー）を核酸増幅反応に使用した。

Platinum（登録商標）Taq DNA Polymerase ０．２μｌ
５xbuffer（※） ２．０μｌ
dNTP(2.5 ｍＭ) １．０μｌ
step2-BCRプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
step2-ABLプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
蛍光標識プローブ (10μＭ) ０．２μｌ
BCR-ABL plasmid（10⁴コピー/μｌ） ０．６２５μｌ
水 ５．１７５μｌ
計１０．０μｌ
（※５xbufferの組成 ＭｇＣｌ_２：２５ｍＭ、ＫＣｌ：１２５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：１２５ｍＭ）

使用したプライマー対及び蛍光標識プローブの配列は下記のとおりである。
step2-BCRプライマー： GTGAAACTCCAGACTGTCCACAGCA （配列番号２）
step2-ABLプライマー： TCCACTGGCCACAAAATCATACAGT （配列番号３）
ENP541プローブ： FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-TAMRA （配列番号４）

第二領域の増幅のための核酸増幅反応液の組成は下記の通りである。調製した１０μｌから、１．６μｌ（１０^３コピー）を核酸増幅反応に使用した。
Platinum（登録商標）Taq DNA Polymerase ０．２μｌ
５xbuffer（※） ２．０μｌ
dNTP(2.5 ｍＭ) １．０μｌ
2nd-BCRプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
2nd-ABLプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
蛍光標識プローブ (10μＭ) ０．２μｌ
BCR-ABL plasmid（10⁴コピー/μｌ） ０．６２５μｌ
水 ５．１７５μｌ
計１０．０μｌ
（※５xbufferの組成 ＭｇＣｌ_２：２５ｍＭ、ＫＣｌ：１２５ｍＭ、Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：１２５ｍＭ）

使用したプライマー対及び蛍光標識プローブの配列は下記のとおりである。
2nd-BCRプライマー： CACTGGATTTAAGCAGA （配列番号５）
2nd-ABLプライマー： TTCACTCAGACCCTGAG （配列番号６）
ENP541プローブ： FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-TAMRA （配列番号４）
上記２つの遺伝子の増幅と温度との関係を図５及び６に示す。図中、「1st primer」は第１のプライマー対を用いた結果、「2nd primer」は第２のプライマーを用いた結果を表し、棒グラフの縦軸はＣｔ値を、横軸はアニーリング温度を表し、線グラフの縦軸は蛍光輝度を、横軸はサイクル数を表す。数値は、２回の試験の平均値を表す。本発明の方法で用いる昇降式ＰＣＲ装置において、最もアニーリング及び伸長の効率の良い温度（最適アニーリング温度）は、第一領域が６２．５℃、第二領域が５０℃であった。

＜実施例２＞
本実施例では、１つのチューブの中でｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行ったとき、連続して各プライマー対を用いた核酸増幅（連続ＰＣＲ）を行っても、それらが独立して起こることを確認した。ここでは、アニーリング温度及び伸長温度が同一である、シャトルＰＣＲ法を採用し、核酸増幅反応装置及び熱サイクル方法は、上述のものを用いた。

ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおいて、第一領域を増幅する第１の核酸増幅反応で用いるプライマー対を第１のプライマー対、第二領域を増幅する第２の核酸増幅反応で用いるプライマー対を第２のプライマー対と命名した。

両プライマー対、標的核酸としてのＢＣＲ−ＡＢＬプラスミド、及びその他反応に必要な試薬を含む核酸増幅反応液１．６μｌを用いて、アニーリング及び伸長温度を６５℃とし第１の核酸増幅反応を行った。また、アニーリング及び伸長温度を５０℃として第２の核酸増幅反応を行った。プローブは、上述の、ＦＡＭで蛍光標識しＴＡＭＲＡで修飾したＥＮＰ５４１（配列番号３）を用いた。

また、ＰＣＲ条件は以下の通りである。

核酸増幅反応液の組成は下記の通りである。調製した１０μｌから、１．６μｌ（１０^３コピー）を核酸増幅反応に使用した。

Platinum（登録商標）Taq DNA Polymerase ０．２μｌ
５xbuffer（※） ２．０μｌ
dNTP(2.5 ｍＭ) １．０μｌ
第１のプライマー対 step2-BCRプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
step2-ABLプライマー(20μＭ) ０．４μｌ
第２のプライマー対 2nd-BCRプライマー(20μＭ) ０．４μｌ
2nd-ABLプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
蛍光標識プローブ (10μＭ) ０．２μｌ
BCR-ABL plasmid（10⁴コピー/μｌ） ０．６２５μｌ
水 ４．３７５μｌ
計１０．０μｌ
（※５xbufferの組成 ＭｇＣｌ_２：２５ｍＭ、ＫＣｌ：１２５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：１２５ｍＭ）
第１又は第２のプライマー対と、アニーリング及び伸長温度との関係を、図７に示す。縦軸はプローブ由来の蛍光輝度を表し、数値が高いほど増幅産物が生成したことを示す。横軸はサイクル数を表す。

図７に示すように、アニーリング及び伸長温度を６５℃とした第１の核酸増幅反応では、第１のプライマー対による増幅、つまり第１のプライマー対のアニーリング及び伸長のみが起こったことが確認でき、第２のプライマー対による増幅は確認できなかった。一方で、アニーリング及び伸長温度を５０℃とした第２の核酸増幅反応では、第２のプライマー対による増幅、つまり第２のプライマー対のアニーリング及び伸長のみが起こったことが確認でき、第１のプライマー対による増幅は確認できなかった。つまり、あらかじめ第１及び第２のプライマー対を含んだ核酸増幅反応液を用いても、反応液の温度を素早く変化させることができる昇降式ＰＣＲ装置を用いて核酸増幅反応を行うので、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおいて各核酸増幅反応を独立して行うことができる。

＜実施例３＞
本実施例では、昇降式ＰＣＲ装置を用いてＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとは、逆転写反応後、連続してｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことを意味する。

ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を持つヒトのＫ５６２細胞株から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ、及び、ネガティブコントロールとして健常人の末梢血から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用意した。実施例１で使用した、第１のプライマー対及び第２のプライマー対を含む核酸増幅反応液１．６μｌにヒトのＫ５６２細胞株から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを１．０ｎｇまたは０．１ｎｇ混合した反応液と、健常人の末梢血から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを１．０ｎｇ混合した核酸増幅反応液とをそれぞれ調製し、各反応液に対しＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。核酸の増幅は、プローブの蛍光をリアルタイムで検出することで確認した。

ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ条件は下記の通りである。

核酸増幅反応液の組成は下記の通りである。調製した１０μｌから、１．６μｌ（１ｎｇまたは０．１ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を核酸増幅反応に使用した。

SuperScript（登録商標）III RT/Platinum（登録商標）TaqMix ０．２μｌ
Platinum（登録商標）Taq DNA Polymerase ０．２μｌ
5xbuffer（※） ２．０μｌ
dNTP(2.5 ｍＭ) １．０μｌ
第１のプライマー対 step2-BCRプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
step2-ABLプライマー(20μＭ) ０．４μｌ
第２のプライマー対 2nd-BCRプライマー(20μＭ) ０．４μｌ
2nd-ABLプライマー (20μＭ) ０．４μｌ
蛍光標識プローブ (10μＭ) ０．２μｌ
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（５ｎｇ/μL又は０．５ｎｇ/μL） １．２５μｌ
水 ３．５５μｌ
計１０．０μｌ
（※５xbufferの組成 ＭｇＣｌ_２：２５ｍＭ、ＫＣｌ：１２５ｍＭ、Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：１２５ｍＭ）
検出結果を図８に示す。図中、ＮＣはネガティブコントロールを表し、縦軸はプローブ由来の蛍光輝度を表し、横軸はサイクル数を表す。

図８に示すように、ネガティブコントロールではプローブ由来の蛍光輝度の上昇がみられず、増幅は確認されなかった。一方でＫ５６２細胞由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡにおいては、１ｎｇの場合も０．１ｎｇの場合も、プローブ由来の蛍光輝度の上昇が確認された。

以上に示すように、本発明の方法は、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおいて、逆転写反応、第１の核酸増幅反応、第２の核酸増幅反応を、１つの容器で、１回の試薬調製で連続して行うことができた。これは、反応開始から終了までコンタミネーションのリスクがなく、且つ操作が簡便であることを意味する。さらに、本発明に係る核酸増幅反応装置を使用するため、標的核酸の増幅産物の検出までを３０分以内という短時間で行うことができる。また、蛍光標識を用いた場合、輝度変化により標的核酸の増幅有無を判断できるため、融解アッセイや電気泳動などのさらなるステップが必要なく、短時間での判断が可能となる。

１…昇降式ＰＣＲ装置、１０…本体、１１…装着部、１２…第１温度調整部、１２ａ…第１ヒーター、１２ｂ…第１ヒートブロック、１３…第２温度調整部、１３ａ…第２ヒーター、１３ｂ…第２ヒートブロック、１４…スペーサー、１５…導線、１６…フランジ、１７…底板、１９…固定板、２０…駆動部、５０…蓋、５１…固定部、１００…核酸増幅反応容器又は核酸増幅反応用チューブ、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、１２０…封止部、１３０…液体、１４０…核酸増幅反応液、１５０…容器

Claims (13)

1. 核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液と比重が異なり、前記核酸増幅反応液とは混和しない液体とが充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、
   前記核酸増幅反応容器の第１領域の温度を調整する第１の温度調整部と、
   前記核酸増幅反応容器の第２領域の温度を調整する第２の温度調整部と、
   前記第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と前記第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置とを切換える駆動部と、
   前記第１の温度調整部、前記第２の温度調整部、及び前記駆動部を制御する制御部と、を含む核酸増幅反応装置であって、
   前記核酸増幅反応液は、標的核酸を増幅させるための第１のプライマー対、及び前記第１のプライマー対を用いた核酸増幅反応の増幅産物を増幅させるための第２のプライマー対、を含み、前記第１のプライマー対の前記標的核酸に対するアニーリング可能温度領域と、前記第２のプライマー対の前記増幅産物に対するアニーリング可能温度領域との重なりが１０℃以下であり、
   前記制御部は、第１の温度調整部を制御して前記第１領域の温度を第１の温度に調整し、第２の温度調整部を制御して前記第２領域の温度を前記第１の温度より低い第２の温度に調整し、前記駆動部を制御して前記第１の配置と前記第２の配置とを切換えて第１の熱サイクルを行った後、
   第１の温度調整部を制御して前記第１領域の温度を第３の温度に調整し、第２の温度調整部を制御して前記第２領域の温度を前記第３の温度より低く前記２の温度とは１０℃以上異なる第４の温度に調整し、前記駆動部を制御して前記第１の配置と前記第２の配置とを切換えて第２の熱サイクルを行う、核酸増幅反応装置。
2. 前記第２の温度が前記第４の温度より高い、請求項１に記載の核酸増幅反応装置。
3. 前記第２の温度と、前記第１のプライマー対と前記標的核酸との最適アニーリング温度との温度差が５℃以内である、請求項１または２に記載の核酸増幅反応装置。
4. 前記第２の温度と、前記第１のプライマー対と前記標的核酸との最適アニーリング温度との温度差が１℃以内である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅反応装置。
5. 前記第４の温度と、前記第２のプライマー対と前記増幅産物との最適アニーリング温度との温度差が５℃以内である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸増幅反応装置。
6. 前記第４の温度と、前記第２のプライマー対と前記増幅産物との最適アニーリング温度との温度差が１℃以内である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸増幅反応装置。
7. 前記第１の熱サイクルが、前記第１の温度と前記第２の温度の２段階の温度変化を繰り返す熱サイクルであって、
   前記第２の温度では、前記第１のプライマー対を用いた核酸増幅が起こり、前記第２のプライマー対を用いた核酸増幅が起こらない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸増幅反応装置。
8. 前記第２の熱サイクルが、前記第３の温度と前記第４の温度の２段階の温度変化を繰り返す熱サイクルであって、
   前記第４の温度では、前記第２のプライマー対を用いた核酸増幅が起こり、前記第１のプライマー対を用いた核酸増幅が起こらない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸増幅反応装置。
9. 標的核酸を増幅させるための第１のプライマー対、及び前記第１のプライマー対を用いた核酸増幅反応の増幅産物を増幅させるための第２のプライマー対、を含む核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液と比重が異なり前記核酸増幅反応液とは混和しない液体、を核酸増幅反応容器に充填し、
   前記核酸増幅反応容器の前記第１の領域の温度を第１の温度に調整し、前記核酸増幅反応容器の第２の領域の温度を前記第１の温度より低い第２の温度に調整し、前記第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と、前記第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置と、を切換えて第１の熱サイクルを行った後、前記第１の領域の温度を第３の温度に調整し、前記第２の領域の温度を前記第３の温度より低く前記第２の温度とは１０℃以上異なる第４の温度に調整し、前記第１の配置と前記第２の配置とを切り替えて第２の熱サイクルを行う、核酸増幅方法であって、
   前記第１のプライマー対の前記核酸に対するアニーリング可能温度領域と、前記第２のプライマー対の前記増幅産物に対するアニーリング可能温度領域との重なりが１０℃以下である、核酸増幅方法。
10. 前記アニーリング可能温度領域の重なりが５℃以下である、請求項９に記載の核酸増幅方法。
11. 前記アニーリング可能温度領域の重なりがない、請求項９又は１０に記載の核酸増幅方法。
12. 前記標的核酸と前記第１のプライマー対の最適アニーリング温度と、前記増幅産物と前記第２のプライマー対の最適アニーリング温度とが、３℃以上離れている、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
13. 前記第１の熱サイクル及び前記第２の熱サイクルを行っている間に、前記核酸増幅反応液から放射される蛍光をモニタリングする、請求項９〜１２に記載の核酸増幅方法。