TWI445819B - 熱對流聚合酶連鎖反應之方法及裝置 - Google Patents

熱對流聚合酶連鎖反應之方法及裝置 Download PDF

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熱對流聚合酶連鎖反應之方法及裝置
本發明係屬以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增核酸序列之領域。更特定而言，本發明係關於熱對流PCR之方法及其裝置。
以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增特定核酸序列已為成熟技術，且為醫學及生物學研究之有力工具。此生化反應過程需要三個主要步驟：「變性反應」、「煉合反應」及「延伸反應」，其各需不同之反應溫度。現今商業化之PCR擴增技術所需樣本包含欲擴增之模板DNA、與模板DNA各股上特定序列互補之寡核苷酸引子對、熱安定性DNA聚合酶、以及去氧核苷三磷酸(dNTP)。隨後藉由反覆加熱與冷卻樣本，使樣本在三種不同溫度間循環，藉以擴增模板DNA核酸序列之特定部分。
PCR之第一步驟為變性反應，其係將樣本加熱至高溫，俾使雙股之模板DNA分離成為單股DNA。第二步驟為煉合反應，其係將樣本冷卻至較低溫度，俾使引子與第一步驟所形成之單股DNA結合，形成DNA與引子之複合物。最後步驟為聚合(延伸)反應，其係將樣本維持於適當溫度，藉由DNA聚合酶之作用，使DNA與引子之複合物中之引子得以延伸，從而產生與模板DNA各股互補之新單股DNA。每一次由上述三步驟組成之循環可複製兩份引子結合位置間之DNA序列。典型地，將包含變性反應、煉合反應及延伸反應等三個溫度各異之步驟的PCR循環重複約20至40次，可生產出數百萬個標的核酸序列之複製物。
變性反應之溫度典型地係介於90至94℃之範圍。煉合反應之溫度係依據所用引子之解鏈溫度(melting temperature；T m )而選擇，典型地係介於35至65℃之範圍。聚合反應之典型溫度為72℃，這是由於最常用之DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶(一種萃取自Thermus aquaticus 之熱安定性DNA聚合酶)，在該溫度下活性最佳。由於Taq DNA聚合酶具有廣泛之溫度範圍，因此其亦可使用僅有兩個步驟之溫度循環，其中聚合溫度與煉合溫度幾乎相同。
在傳統之市售PCR儀器(亦即熱循環儀器)中，樣本之溫度係以熱傳導方式控制。簡言之，令含有PCR樣本之反應容器與具有高導熱性之固體金屬塊接觸。該金屬塊與加熱及冷卻裝置相連，使其可改變溫度，以達到所需溫度。採用該方法之傳統PCR儀器通常使用具極高導熱性之鍍金銀塊及/或珀耳帖(Peltier)冷卻方法，以達成迅速之溫度改變。然而，傳統之熱循環PCR並非有效率之程序，因其尚需花費額外的時間及能源去加熱及冷卻PCR樣本本身以外的物質。此外，由於機器本身精密的特性，因此熱循環儀器通常十分昂貴。
熱對流PCR方法係於具有兩個溫度控制元件之裝置上進行PCR(Krishnan,M.等人，2002，Science 298:793)。Benett等人在美國專利第6,586,233號(2003年7月1日核准)中揭示了熱對流PCR(CPCR)之方法及裝置，其中由熱對流驅動之樣本溶液在一側加熱之封閉O形槽內循環流動。Hwang等人在美國專利申請案第10/801,342號(2004年3月15日公開，公開號2004/0152122)中揭示了熱對流PCR之方法及裝置，其使用複數個熱源，以在樣本溶液中維持不同溫度之區域，使得當樣本在各區域間循環時，PCR的三個步驟可依序並重複地發生。
雖然已經提供一些熱循環PCR之方法，但其所需之裝置包含複雜的結構且十分昂貴，因而阻礙其在商業上的應用。目前仍需更方便且實用之熱對流PCR(CPCR)方法及裝置。
本發明提供可方便、有效率且經濟地進行熱對流PCR(CPCR)之新穎方法及裝置。
因此，在第一方面，本發明提供一種以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增標的核酸序列之方法，包含步驟：
(1)提供管狀容器；
(2)將PCR樣本置於該管狀容器內，其中該PCR樣本包含具有欲擴增之標的核酸序列的模板DNA、去氧核糖核酸(DNA)聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧胞苷三磷酸(dCTP)、去氧鳥苷三磷酸(dGTP)、去氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二種具有互補於標的核酸序列之3’端的序列之寡核苷酸引子，其中該等引子係經設計為具有介於40℃至約90℃間之解鏈溫度(T m )；
(3)將該容器之底部埋置於熱源中，然後加熱該PCR樣本，使引子解鏈，並於穩定維持PCR樣本表面溫度(T S )低於引子之解鏈溫度(T m )至少約2℃，因而造成由PCR樣本底部至頂部漸減之溫度梯度，該梯度誘發熱對流並致使下列事件依序並重複地在樣本之不同區域中發生：(i)變性反應，其中雙股之模板DNA分離成為兩條單股DNA，(ii)煉合反應，其中引子與單股DNA雜交形成DNA與引子之複合物，及(iii)聚合(延伸)反應，其中DNA與引子之複合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。
在第二方面，本發明提供一種藉由本發明方法以聚合酶連鎖反應(PCR)進行核酸序列擴增之裝置，包含：(i)單一熱源；(ii)在其中進行PCR之一或多個管狀容器；及(iii)支持物，其具有使累積於多個容器間之熱量均勻化之構件。
本發明提供進行熱對流PCR之新穎方法及裝置。
本發明之具體實例為一種以PCR擴增標的核酸序列之方法，包含步驟：
(1)提供管狀容器；
(2)將PCR樣本置於該管狀容器內，其中該PCR樣本包含具有欲擴增之標的核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧胞苷三磷酸(dCTP)、去氧鳥苷三磷酸(dGTP)、去氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二種互補於標的核酸序列之3’端之序列的寡核苷酸引子，其中該等引子係經設計為具有介於40℃至約90℃間之解鏈溫度(T m )；
(3)將該容器之底部埋置於熱源中，然後加熱該PCR樣本，使引子解鏈，並穩定維持PCR樣本表面溫度(T S )低於引子之解鏈溫度(T m )至少約2℃，因而造成由PCR樣本底部至頂部漸減之溫度梯度，該梯度誘發熱對流並使下列事件依序並重複地在樣本之不同區域發生：(i)變性反應，其中雙股之模板DNA分離成為兩條單股DNA，(ii)煉合反應，其中引子與單股DNA雜交形成DNA與引子之複合物，及(iii)聚合(延伸)反應，其中DNA與引子之複合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。
欲實施本發明之熱對流PCR(CPCR)，需將PCR樣本中隨機且混亂之自然熱對流轉變為穩定之單一熱對流循環，俾使模板DNA在各個不同事件所需之不同溫度間循環而逐步擴增。如圖1A及1B所示，PCR包含三個事件的發生：(i)藉由加熱達到高溫之變性反應，(ii)煉合反應，及(iii)於低於變性溫度之溫度下的延伸(聚合)反應。特定而言，在熱對流PCR中，應使低溫維持足夠時間，以進行PCR樣本之煉合。
在本發明中意外發現，當PCR樣本表面溫度(T S )穩定地維持低於引子之解鏈溫度(T m )至少約2℃時，造成由PCR樣本底部至頂部漸減之溫度梯度，此溫度梯度會誘發熱對流並使事件依序並重複地在PCR樣本的不同區域發生，如實例2所示。
在本發明之方法中，該管狀容器可以油封閉，以避免樣本在反應過程中蒸發。在本發明之具體實例中，該油可為礦物油。依據本發明，可於PCR樣本上面添加一滴礦物油，使樣本表面為油所覆蓋。
欲實施本發明之熱對流PCR，必須維持由PCR樣本底部至頂部漸減之溫度梯度。該溫度梯度可藉由加熱管狀容器之底部，同時維持PCR樣本表面溫度低於引子解鏈溫度(T m )至少約2℃之穩定溫度(T S )達成。上述目標可藉由設計具有特定解鏈溫度之適當引子及控制PCR之各個參數達成。
為達成單一循環之熱對流，進行了本發明CPCR之電腦模擬，以得知各個PCR參數間之關聯性，該等參數包括：PCR樣本之總體積(V ，單位為μl)、PCR溶液之黏度(μ，單位為Ns/m2 )，容器之內直徑(d ，單位為mm)，以及PCR樣本之表面溫度(T S ，單位為℃)，此單一循環之熱對流的達成可由下列公式決定：
V =(A×T s +B-500μ+0.7)×e (1.86+100μ) d
其中A值介於-0.019與-0.016之間，且B值介於1.85與2.27之間。在本發明之較佳具體實例中，A值為-0.01812而B值為2.1。
在本發明之具體實例中，T S 係介於約40℃與約80℃之間；μ係介於0.001Ns/m2 與0.0018Ns/m2 之間；且d 係介於0.6mm與5.0mm之間。在較佳具體實例中，T S 係介於約55℃與約70℃之間；μ係介於0.001Ns/m2 與0.0016Ns/m2 之間；且d 係介於0.8mm與4.0mm之間。在最佳具體實例中，T S 係介於約65℃與約68℃之間；μ係介於0.001Ns/m2 與0.0014Ns/m2 之間；且d 係介於0.8mm與2.5mm之間。
欲增加PCR樣本之黏度，可於樣本添加非反應性液態物質。適當之物質為任何非反應性之有機或無機物質，包括但不限於甘油、NP-40、Tween 20、EDTA、DMSO、甲醯胺、甜菜鹼及明膠。較佳之物質為甘油、NP-40、Tween 20及EDTA。最佳之物質為甘油。增加黏度物質之添加量應為任何可達成所需黏度之量。在本發明之具體實例中，PCR樣本中添加4%至8% v/v之甘油。
本發明提供一種以聚合酶連鎖反應(PCR)藉由本發明之方法進行核酸序列擴增之裝置，包含：(i)單一熱源；(ii)在其中進行PCR之一或多個管狀容器；及(iii)支持物，其具有使累積於多個容器間之熱量均勻化之構件。
本發明中所使用之熱源可為具有控溫構件之簡單加熱裝置。適當熱源包括但不限於乾浴加熱器、水浴加熱器及油浴加熱器。在本發明之具體實例中，熱源為沸騰中之水。
本發明之管狀容器可以任何材料製成，只要該材料為生物可相容性且具有至少120℃之抗熱性即可。適當之材料包括聚合物材料如聚丙烯(PP)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚碸(PSF)及聚醚碸(PES)，以及玻璃。
在本發明之具體實例中，採用累積於多個容器之熱量均勻化的構件為均熱器，其可為金屬板製成，俾使複數試驗之PCR中多個容器之表面溫度均勻化。本文中所用之「均熱器」乙詞係指通常由鋁或銅製成之外殼，其係設計用以覆蓋電子裝置並散熱，通常用於電腦之CPU(中央處理器)。例如，用於進行複數試驗CPCR之裝置可包含具有均熱器之配備之支持物。在依據本發明之裝置中，均熱器係用於驅散累積於複數試驗CPCR容器之間隙的熱量。在本發明之具體實例中，支持物係設計用於支持排列成長方矩陣之多個容器。在本發明之較佳具體實例中，該支持物係設計為可支持排列成8：12之長方矩陣之96個容器。
本發明之裝置亦可包含測量PCR樣本表面溫度之構件。該構件之實例為溫度計。
本發明進一步以下列實例闡明。該等實例係供例示之目的，在任何方面均不應視為限制本發明範疇。
實例
在以下實例中，下列縮寫具有下列意義：℃=攝氏度數；hr=小時；min=分鐘；sec=秒；M=莫耳濃度；mM=毫莫耳濃度；μM=微莫耳濃度；L或l=升；ml=毫升；μl=微升；G或g=克；mg=毫克；μg=微克；pg=毫微克。未定義之縮寫具有一般所接受之意義。
實例1 1.材料與方法 1.1樣本
PCR樣本包含下列反應試劑：3.32pg之模板DNA(pHBV-48，GenBank編號NC003977，其插入於-3Z載體(Promega Corporation,Madison,WI)中)、1.5pmol之F118引子(5’-CCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCG-3’)、1.5pmol之R145引子(5’-TCCAGTTGGCAGCACAGCCTAGCAG C-3’)、7.5μl之FastStart DNA Master HybProbe熱起始反應混合物(Rosche Applied Science,Indianapolis,IN)及5% v/v之甘油。
進行模擬本發明CPCR抽象模型之電腦模擬，獲得如下式之參數公式：
V =(A×T s +B-500μ+0.7)× e (1.86+100μ) d
其中A=-0.01812，B=2.1，Ts=68℃，μ=0.0012Ns/m2 ，且d=2.2mm。
基於以上公式，可算出PCR樣本之總體基為75.44μl。
1.2裝置
用於進行本發明熱對流PCR之裝置係由下列元件構成：具控溫功能之加熱槽、用作反應容器之複數個玻璃毛細管(內直徑為2.2mm)、及具均熱器之支持物，如圖4所示。
1.3流程
在整個實驗中，加熱槽中之矽油溫度均維持於95℃。將PCR樣本及一負對照組(與樣本之成分相同，但以相同體積，即30λ之ddH2 O取代模板DNA)分別注入玻璃毛細管中，並以10μl之礦物油密封。然後將該等毛細管置於加熱槽之站架上，使各毛細管之下半部埋置於加熱之矽油中，達25分鐘。
在整個反應過程中，周圍環境溫度係維持於室溫。時間到時，由站架取出毛細管並取各毛細管中2μl之所得混合物，進行電泳分析。
2.結果
於2%洋菜膠上分析所得PCR反應產物，結果示於圖2。如圖2所示，第1道及第2道中之明亮條帶顯示本發明之熱對流PCR方法在少於半小時內即正確地擴增了122bp之標的序列。當使用傳統式熱循環機台時，整個反應需花費超過一個半小時，且造成之產品複製數仍然較少(數據未顯示)。因此，本發明之方法在效率及經濟層面均較傳統之PCR方法優異。
實例2
設計如下表1所示之七對引子對，解鏈溫度(T m )介於58℃至80℃，其中各引子之T m 係使用Lightcycler Probe Design2.0(Roche,Germany)程式計算。
使用表1所示各對引子，依據實例1所述方法及程序分別進行CPCR，PCR樣本之Ts 溫度為68℃。CPCR之結果示於圖3，使用T m 為70或高於70之引子之組別產生122bp條帶。
鑒於上述發現，結論為當Ts 值少於T m 值至少約2℃時可成功進行CPCR。
實例3
分別使用具有或不具有支持物(含均熱器)之裝置進行CPCR。支持物係經設計為可支持96個容器，容器排列方式為8(欄A-H)：12(列1-12)的長方矩陣，參見圖4。選擇此矩陣中10個不同位置的樣本，如圖5A所示予以編號。圖5B(無均熱器)及5C(有均熱器)顯示CPCR結果。如圖5B及5C所示，使用無均熱器之裝置時，位於矩陣中心附近的位置3、4及5均無結果；然而，使用有均熱器的裝置時，所有位置的CPCR結果均十分良好。
圖6顯示具有或不具有均熱器之裝置的進一步比較結果。測量並記錄編號1-10之各PCR樣本在加熱後30分鐘內之表面溫度，圖6顯示各樣本在30分鐘期間內之表面溫度(Ts )變化，其中曲線A代表使用無均熱器之裝置之組別的變化，曲線B代表使用有均熱器之裝置之組別的變化。結果顯示，使用有均熱器之裝置之組別的Ts 值變化在1℃以內，但使用無均熱器之裝置之組別的變化則在2~3℃內。這表示具有均熱器之裝置可為實驗中之各位置提供穩定的表面溫度，以及CPCR所需的穩定熱量條件。
熟習本技藝者應瞭解，可針對上述具體實例加以改變而不背離其廣泛之發明概念。因此，應瞭解本發明並不限於所揭示之特定具體實例，而是要涵蓋下附申請專利範圍所定義之本發明精神及範疇內的修飾。
41．．．溫度計
42．．．管狀容器
43．．．支持物(含均熱器)
圖1為根據本發明之CPCR的理想單一循環熱對流圖解，其中X軸代表時間尺度，Y軸代表溫度尺度，10、20及30表示PCR中所發生的三個事件(分別為變性、煉合及延伸)之溫度範圍；圖1A顯示根據本發明之CPCR的PCR樣本之溫度變化，圖1B顯示傳統PCR的PCR樣本之溫度變化，以供比較。
圖2為顯示實例1之PCR結果之影像，其中第1道及第2道代表使用相同樣本及程序的兩次重複實驗結果，而第3道則代表負對照組之結果。
圖3為顯示實例2之PCR結果之影像，其中標示為「CPCR」之各道為依據本發明方法之PCR樣本之結果，所使用引子對之解鏈溫度(T m )如各道上端標示之數字，PCR樣本之表面溫度則為68℃；而標示為「傳統PCR」之各道則為相同樣本但使用傳統PCR方法之結果，以供比較。
圖4為依據本發明之裝置(具有均熱器)之具體實例的圖像。
圖5顯示實例3之CPCR結果，使用本發明之CPCR方法及具有或不具有均熱器之裝置；其中圖5A顯示樣本位置之編號；圖5B顯示無均熱器之裝置的CPCR結果；圖5C顯示有均熱器之裝置的CPCR結果。
圖6顯示實施依據本發明之CPCR方法的PCR樣本之表面溫度(Ts )變化，樣本位置如圖5A中位置編號1-8所示，分為二組，分別為使用具有或不具有均熱器之裝置；其中曲線A(-◆-)代表使用無均熱器之裝置之組別的變化，曲線B(-■-)代表使用有均熱器之裝置之組別的變化。

Claims (26)

  1. 一種以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增標的核酸序列之方法，包含步驟：(1)提供管狀容器；(2)將PCR樣本置於該管狀容器內，其中該PCR樣本包含具有欲擴增之標的核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧胞苷三磷酸(dCTP)、去氧鳥苷三磷酸(dGTP)、去氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二種具有互補於標的核酸序列之3’端之序列的寡核苷酸引子，其中該等引子係經設計為具有介於40℃至約90℃間之解鏈溫度(T m )；及(3)將該容器之下半部埋置於單一熱源中，然後加熱該PCR樣本，使引子解鏈，並於容器中之PCR樣本的上表面維持穩定的表面溫度(T S )，其中該表面溫度低於該引子之解鏈溫度(T m )至少約2℃，因而造成由PCR樣本底部至頂部漸減之溫度梯度，藉此誘發熱對流並使下列事件在PCR樣本之不同區域依序並重複地發生：(i)變性反應，其中雙股之模板DNA分離成為兩條單股DNA，(ii)煉合反應，其中引子與單股DNA雜交形成DNA與引子之複合物，及(iii)聚合反應，其中DNA與引子之複合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步於步驟(2)之後包含將油加入容器中之樣本上方以密封樣本之步驟，其後為步驟(3)。
  3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中PCR之各參數：PCR樣本之總體積(V ，單位為μl)、PCR樣本之黏度(μ ，單位為Ns/m2 )，容器之內直徑(d ，單位為mm)，以及容器中之PCR樣本之表面溫度(T S ，單位為℃)，其係由下列公式決定：V =(A×T s +B-500μ +0.7)×e (1.86+100μ )d 其中A值介於-0.019與-0.016之間，且B值介於1.85與2.27之間。
  4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中A值為-0.01812而B值為2.1。
  5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中PCR樣本之表面溫度係介於約40℃與約80℃之間。
  6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中PCR樣本之表面溫度係介於約55℃與約70℃之間。
  7. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中PCR樣本之表面溫度係介於約65℃與約68℃之間。
  8. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該熱源為乾浴加熱器。
  9. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該熱源為水浴加熱器。
  10. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該熱源為油浴加熱器。
  11. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該熱源為沸騰中之水。
  12. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該PCR樣本進一步包含用於增加黏度之非反應性液態物質。
  13. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該非反應性液態物質係選自由下列組成之群：甘油、NP-40、Tween 20、EDTA、DMSO、甲醯胺、甜菜鹼及明膠。
  14. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該非反應性液態物質為甘油。
  15. 一種藉由申請專利範圍第1項之方法以聚合酶連鎖反應(PCR)進行核酸序列擴增之裝置，包含：(i)單一熱源；(ii)用於盛裝PCR溶液之一或多個管狀容器；及(iii)支持物，其 具有使累積於多個試驗容器之熱量均一化之構件。
  16. 根據申請專利範圍第15項之裝置，其中該使累積於多個容器之熱量均一化之構件為均熱器(heat homogenizer)。
  17. 根據申請專利範圍第16項之裝置，其中該均熱器為鋁或銅所製。
  18. 根據申請專利範圍第15項之裝置，其包含具有均熱器之支持物。
  19. 根據申請專利範圍第18項之裝置，其中該支持物係設計為可支持排列成長方矩陣之多個容器。
  20. 根據申請專利範圍第18項之裝置，其中該支持物係設計為可支持排列成8：12之長方矩陣之96個容器。
  21. 根據申請專利範圍第15項之裝置，其中該熱源為乾浴加熱器。
  22. 根據申請專利範圍第15項之裝置，其中該熱源為水浴加熱器。
  23. 根據申請專利範圍第15項之裝置，其中該熱源為油浴加熱器。
  24. 根據申請專利範圍第15項之裝置，其中該熱源為沸騰中之水。
  25. 根據申請專利範圍第15項之裝置，進一步包含(iv)測量PCR樣本表面溫度之構件。
  26. 根據申請專利範圍第25項之裝置，其中該測量PCR樣本表面溫度之構件為溫度計。
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