CN103103118A - 一种核酸扩增与检测反应管 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核酸扩增与检测反应管，包括相互配合管体和管盖，所述管体包括位于上方的储液区以及位于下方的核酸扩增区，在核酸扩增区完成反应及荧光信号采集等实时检测手段；所述管盖内部设有中空凹槽，且所述核酸扩增区的容积分别小于或等于所述储液区的容积和中空凹槽的容积。在核酸扩增区结束反应后，可将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区的产物进入管盖的中空凹槽，开盖后直接取出少量样本去进行电泳或层析或其他方式的检测，省去一次换管的操作步骤以减少污染的机会。

Description

一种核酸扩增与检测反应管

技术领域

本发明涉及一种实验器材，特别是涉及一种核酸扩增与检测反应管。

背景技术

聚合酶链反应技术(以下简称PCR技术)，是一种体外快速扩增DNA的技术。每个循环包括变性、退火和延伸三个过程，每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍。经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近10⁹倍。PCR是体外大量获得目的DNA片段的有效方法，便于对核酸分子做进一步的分析和检验。目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，在基础研究中可用于克隆基因，并在此基础上对基因组DNA进行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中，则可以用于传染病的诊断、遗传疾病的检测及产前诊断、法医研究等。美国专利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188对PCR技术做出了描述。

DNA的扩增在体内是由细胞内有关因子的参与下，双螺旋的DNA分子被解链成2条单链，在引物酶的作用下合成DNA引物。引物与单链DNA碱基互补配对，形成引物单链DNA复合物；在DNA聚合酶作用下，沿着5’-3’方向，按碱基互补配对原则，在引物3’端开始，逐一将互补的三磷酸脱氧核苷酸接上，最终形成一条新的双链DNA分子。

而DNA分子在体外的PCR扩增模拟了体内的三个步骤：首先，在大约95°C的高温下加热双链DNA样品，双链间的氢键会断裂，使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子，这一过程称为高温解链反应。然后，温度迅速降到大约50-65°C的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应。退火反应结束后，温度要迅速升高到72°C左右进行延伸反应，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，增加了一倍。反复进行高温解链-低温退火-中温延伸三个过程，就可以获得数量更多的复制双链，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板。

通过这样一种扩增方法，经过30-40个循环，目的核酸分子数目可由1个增加到原来的近10⁹倍。但PCR的高灵敏度始终伴随的弊端就是易污染。仅仅1个拷贝的污染就可能会使检测结果发生错误，因此，如何在PCR的全过程中避免污染也是现今核酸检测的一个重要研究方向。荧光PCR的出现使得对核酸产物的检测避免了开管取样的步骤，大大减少了核酸产物污染的机会。另外，UNG酶的使用也避免了PCR过程中核酸扩增产物的污染。除此之外，如何在试剂配制与加样等操作过程中避免污染，也需得到足够的重视。

目前，主流的PCR扩增技术的反应装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，通过金属块的加热、冷却，达到平衡温度后将热量通过反应管传递至PCR反应液。但是这种装置具有如下缺陷：

(1)耗时长，常规PCR完成30个循环一般需要2-3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热量通过反应管传递至PCR反应液；

(2)仪器结构复杂、成本昂贵且耗能较高；

(3)程序设置复杂，需经过培训的专业人员进行操作。

因此，PCR难以满足快速诊断、高效、高通量、野外检测、家庭自检等客观需求。

21世纪初，出现了一种新型的PCR扩增方法——利用自然对流(即雷诺-本纳德对流)原理进行PCR扩增的方法。该技术是将PCR反应液置于一个封闭的柱形反应腔内，反应腔的上下表面分别进行恒温控制，通常上端温度为60°C，下端温度为97°C。通过上下表面的温差驱动液体经过不同的温区，实现PCR扩增。这种方法不需要改变器件的温度，也不需要外加驱动来实现样品的流动，只需要一个反应腔，并控制其上下两端的温度为恒温，就可以实现PCR扩增。

传统PCR反应是要将试管静置于金属槽中并均匀加热，其试管因形状、材质、壁厚等因素，不能应用于上述的新型PCR方法。上述新型PCR方法中，反应管的形状是在管内建立稳定环流并成功扩增的关键因素。其中，热对流的发生依赖于流体中浮力与黏滞力的相对大小，能否形成环流，可根据雷利数——Ra(Rayleigh Number)来判定，其公式见下(1)：

$\mathrm{Ra}=\frac{\mathrm{g\β}(\mathrm{Th}-\mathrm{Tl})h^3}{\mathrm{\α\υ}}---\left(1\right)$

其中g：重力加速度，β：体积膨胀系数，Th：底部温度，Tl：顶部温度，h：流体所流经的上下界面高度差，υ：运动黏滞系数，α：热扩散系数。对于位于容器内的液体而言，当雷利数Ra大于临界值范围时，流体会形成类似于沸水的无规则湍流；当雷利数Ra小于临界值范围时，将无法形成流体，而仅仅存在热传递；只有当雷利数Ra处于临界值范围内时，浮力克服重力与黏滞力，促使流体自下而上的有规则流动，才能形成对流，热对流PCR的原理即基于第三种情况。但目前的现有技术中，尚没有能够适合于应用上述新型PCR方法的试管或反应器结构。

发明内容

本发明的目的是提出一种成本较低、结构简单、效果显著的核酸扩增与检测反应管。

为实现上述目的，本发明提供了一种核酸扩增与检测反应管，包括相互配合的管体和管盖，所述管体包括位于上方的储液区以及位于下方的核酸扩增区，在核酸扩增区完成反应及荧光信号采集等实时检测手段；所述管盖内部设有中空凹槽，且所述核酸扩增区的容积分别小于或等于所述储液区的容积和中空凹槽的容积。在核酸扩增区结束反应后，可将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区的产物进入管盖的中空凹槽，开盖后直接取出少量样本去进行电泳或层析或其他方式的检测，省去一次换管的操作步骤以减少污染的机会。

优选地，所述核酸扩增区的高度/内径比值为3～12。

更优选地，所述核酸扩增区的高度/内径比值为6～9，所述核酸扩增区的最大内径小于等于10mm，且所述核酸扩增区的内径小于所述储液区的内径。

进一步，所述核酸扩增区的最大内径小于等于5mm。

优选地，所述管体核酸扩增区的内腔为横截面上宽下窄的锥状中空结构或多层梯形中空结构。

优选地，所述核酸扩增区的内腔为上下内径相等的柱状中空结构。

优选地，所述核酸扩增区上设有可见的体积刻度标识。

优选地，所述储液区的外壁上设有防滑沟槽。

优选地，所述管体的上部开口处设有一个突出于管体外表面的环状结构。

优选地，所述核酸扩增区与储液区的连接处内部为圆滑导角结构。

优选地，所述管盖的外壁上设有防滑槽。

优选地，所述管体与管盖之间通过旋转螺纹结构，或环状卡口结构，或凸点锁扣结构相互密闭连接。

优选地，所述管体与管盖由耐热材料制成。更优选地，所述耐热材料包括：玻璃、或聚丙烯、或聚醚砜、或丙烯、或聚丙酸酯、或聚砜。

优选地，所述管体和管盖的内壁经过钝化处理。

基于上述技术方案，本发明的优点是：

核酸扩增试剂注入本实用核酸扩增与检测反应管，并以较高的温度加热反应管的底部周围时，受热的试剂开始上浮并变性打开双螺旋结构形成单链模板。在上浮到反应管中试剂顶部的过程中，因为周围环境带走热量，会在反应管内形成一个自下而上的、连续的温度梯度；当反应试剂经过适合引物退火与延伸的温度区域时，会在此区域以进行引物配对和延伸；此时试剂也因为冷却而下沉，到达反应管底部后又受到加热二次上浮，如此会依序且重复地进行PCR三个过程，变性、退火与延伸，从而完成扩增过程。

本发明不仅可应用于DNA的核酸扩增，而且也可应用于以RNA为范本的核酸扩增。即将核酸扩增试剂注入本实用核酸扩增与检测反应管，并以合适的温度加热反应管底部周围。在反应管内会形成自下而上的连续的温度梯度并驱动试剂流动，当试剂流经适合的温度区域时可发生转录。转录完成后，仅需要调整加热反应管底部周围的温度，便可建立新的适合于DNA扩增的连续温度梯度，开始以DNA为范本的扩增。此外，本发明还具有制造成本较低、使用方面、效果显著等有益效果。

在核酸扩增区结束反应后，可将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区的产物进入管盖的中空凹槽，开盖后直接取出少量样本去进行电泳或层析或其他方式的检测，省去一次换管的操作步骤以减少污染的机会。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A所示为本发明核酸扩增与检测反应管的结构示意图；

图1B所示为本发明核酸扩增与检测反应管的整体示意图；

图2所示为管体核酸扩增区内腔为上下直径相等的中空结构；

图3所示为管体核酸扩增区内腔为上宽下窄的锥状中空结构；

图4A和图4B是管体核酸扩增区内腔为两种形式的上宽下窄的多层梯形中空结构；

图5所示为在管内加有反应试剂的对流PCR反应状态图；

图6所示为在扩增结束后将反应试剂从扩增区通过离心、振动或其他方式转移至管盖内的状态图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

参见图1A、1B～图6，其中示出了本发明一种核酸扩增与检测反应管的优选实施例，包括相互配合的管体1和管盖2，所述管体1包括位于上方的储液区4以及位于下方的核酸扩增区3；在实际操作时，可通过离心、振动或其他方式使上方储液区4中的反应试剂进入下方的核酸扩增区3，在核酸扩增区3完成反应及荧光信号采集等实时检测手段；管盖2与管体1可以相互密闭连接，所述管盖2内部设有中空凹槽10，且所述核酸扩增区3的容积分别小于或等于所述储液区4的容积和中空凹槽10的容积；应用时，在核酸扩增区3结束反应后，可将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区的产物进入管盖2的中空凹槽10，开盖后直接取出少量样本去进行电泳或层析或其他方式的检测，由此便省去了一次换管的操作步骤并且减少了污染的机会。

优选地，所述核酸扩增区3的内径小于等于10mm，且所述核酸扩增区3的内径小于所述储液区4的内径。进一步优选地，所述核酸扩增区3的高度/内径比值为3～12，更优选地，核酸扩增区3的高度/内径比值为6～9。本发明的此种尺寸以及比例结构，能够有效地保障和促进反应管的管内液体自发地形成连续而稳定的对流，并极大地提高了PCR扩增的效果。在本发明中，管体1上方内径较大的区域作为储液区4，因为核酸扩增区3的内径相对较小，不能将移液枪尖插入底部，也无法让液体自流至底部，所以反应试剂可先暂贮存于储液区4中，然后再通过离心、振动或其他方式使上方储液区4的反应试剂进入下方的核酸扩增区3。且储液区4相对于核酸扩增区3具有较大的直径，更容易握、拿，因此，本发明上述的结构特征为操作者在配液的过程中提供了极大的便利性。

同时，为了进一步提高操作的便利性，本发明优选地，所述核酸扩增区3上设有可见的体积刻度标识5，例如刻度线，便于检视是否存在加样量错误；另外，本发明还在所述储液区4的外壁上设有防滑沟槽6，在所述管盖2的外壁上设有防滑槽9，如图1A和1B所示。

进一步，所述管体核酸扩增区3的内腔为横截面上宽下窄的锥状中空结构或多层梯形中空结构，核酸的扩增、RNA的转录、实时检测信号的采集均位于此区域。本发明核酸扩增区3内腔上宽下窄的内径设计优点为：当试剂因建立的上下温度梯度而发生对流时，反应管上方较宽内径的区域会增加试剂在该温度区域的路径，即相当于增加PCR反应中“延伸”步骤的时间，有利于长片段的扩增。

当然，为了制造方便，所述核酸扩增区3的内腔也可以为上下内径相等的柱状中空结构。

优选地，所述管体1的上部开口处设有一个突出于管体外表面的环状结构7。在储液区4的外部设计上述有一定宽度的环状结构7可以作为防污装置。在操作时，操作者的手指会被该环状结构7的防污装置阻挡，所以，操作者只会接触到在管体1的下方，由此便可以避免污染物或是其他干扰扩增的物质在操作时因操作者的手指碰触管口而被带入反应试剂中，进一步地减少了污染的可能性。

此外，本发明所述核酸扩增区3与储液区4的连接处内部为圆滑导角结构，此种结构避免了在通过离心、振动或其他方式使上方储液区4的反应试剂进入下方的核酸扩增区3时，在这两个区的连接处出现的卡液现象。

所述管体1与管盖2之间通过旋转螺纹结构，或环状卡口结构，或凸点锁扣结构相互密闭连接，当然也可以采用现有技术中其它的密闭连接方式。

本发明管盖2的内部为中空凹槽结构，在扩增时，管盖2发挥其密闭作用；在扩增结束后，管盖2的中空凹槽10为扩增产物容器。扩增结束后可将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区的产物进入管盖2的中空凹槽10中。开盖后直接取出少量样本去进行电泳或层析或其他方式的检测，省去一次换管的操作步骤以减少污染的机会。

优选地，所述管体1与管盖2由耐热材料制成。所述耐热材料包括：玻璃(glass)、或聚丙烯(PE)、或聚醚砜(PES)、或丙烯(PP)、或聚丙酸酯(PC)、或聚砜(PSF)，当然也可以采用现有技术中其他耐热可加工材料制成。

此外，优选地，所述管体2的内壁可通过牛血清白蛋白(BSA)或硅烷化试剂等做钝化处理，从而降低对核酸及反应试剂中某些成分的吸附。

实施例1、核酸扩增与检测反应管

如图1A所示，本发明的核酸扩增与检测反应管，包括管体1和管盖2，管体1包括核酸扩增区3与储液区4。核酸扩增区3上有可见的体积刻度标识5，例如刻度线。储液区4外壁有防滑沟槽6，储液区4外壁还有一个突出于外表面的环状结构7，所述环状结构7具有防污作用。核酸扩增区3与储液区4连接处内部设有圆滑导角结构8。管盖2上有防滑槽9，管盖2内部为一中空凹槽10。使用时，将反应试剂加入管体1的储液区4中，然后再通过离心、振动或其他方式使上方储液区4的反应试剂进入下方的核酸扩增区3。在核酸扩增区3中完成反应后，可倒置反应管，通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区3中的扩增产物通过离心、振动或其他方式进入管盖2的中空凹槽10中，再进行电泳或层析或其他方式的检测。

在上述实施例中，核酸扩增区3的内径可以是小于等于5mm的任一长度，核酸扩增区3的高度/内径比值为8，其内腔形状可以是3种形式：(1)图2所示的是上下内径相等的柱状中空结构；(2)图3所示的是上宽下窄的锥状中空结构；(3)图4所示的是两种形式的上宽下窄的多层梯形中空结构。管体1与管盖2，其密闭方式有旋转螺纹或环状卡口或凸点锁扣等所有可密闭的结构。管体1与管盖2的材质可以是玻璃(glass)、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)、聚砜(PSF)等所有耐热的可加工材料。

实施例2、应用核酸扩增与检测反应管进行以DNA为模板的扩增

1、实验材料

化学试剂：LightCycler FastStart DNA Master HybridizationMixture(Roche，Germany)，二价镁离子，超纯水、石蜡油

仪器耗材：自制核酸扩增仪、本实用核酸扩增与检测反应管、凝胶成像仪(美国UVI公司)

引物：169F：(5′-GCA CGG GAC CAT GCA GAA CCT GCA CGA T-3′)

      169R：(5′-GCA AGC CAG GAG AAA CGG ACT GAG GCC CAC T-3)

核酸范本：HBV全长质粒，浓度为10⁶copies/ml。

2、实验方法：

(1)扩增试剂的配置：1pmol169F，1pmol169R，4μl LightCyclerFastStart DNA Master Hybridization Mixture，4mM二价镁离子，20μl HBV全长质粒范本，总体积40μl，剩余体积用超纯水补足。

(2)核酸扩增：a.将配置好的扩增试剂注入本实用核酸扩增与检测反应管的储液区4，滴加10μl石蜡油，盖上管盖2并通过离心、振动或其他方式，使扩增试剂从储液区4流至扩增区3的底部(如图5所示)；b.设置自制核酸扩增仪底部温度为95℃，待温度平衡后将装有核酸扩增试剂的反应管插入仪器中，静置半小时后取出反应管。

(3)扩增结果电泳检测：a.将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式，使核酸扩增区3的产物进入管盖2的中空凹槽10(如图6所示)；b.使用3％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

实施例3、应用核酸扩增与检测反应管进行以DNA为模板的扩增

1、实验材料

化学试剂：Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(Roche，Germany)，二价镁离子，超纯水、石蜡油、

仪器耗材：自制核酸扩增仪、本实用核酸扩增与检测反应管、凝胶成像仪(美国UVI公司)

引物：CJ1F：(5’-GGCAATCCACCTTGCTGGGTCAGTTGTGCGGG-3’)

      CJ1R：(5′-CCTTGGGCAAAGGGCCTCCTGGCGGTGTATA-3′)、

核酸范本：从EV71病人血清中提取的RNA。

2、实验方法

(1)扩增试剂的配置：8μl5*Reaction Buffer，1pmol CJ1F，1pmol CJ1R，0.8μl Transcriptor Enzyme Mix，2μl病人血清中提取的RNA范本，总体积40μl，剩余体积用超纯水补足。

(2)RNA转录：a.将配置好的扩增试剂注入本实用核酸扩增与检测反应管的储液区4，滴加10μl石蜡油，盖上管盖2并通过离心、振动或其他方式使扩增试剂从储液区4流至扩增区3的底部(如图5所示)；b.设置自制核酸扩增仪底部温度为60℃，待温度平衡后将装有核酸扩增试剂的反应管插入仪器中，静置20分钟。

(3)核酸扩增：将自制核酸扩增仪底部温度调至95℃，静置半小时后取出反应管。

(4)扩增结果电泳检测：a.将反应管倒置并通过离心、振动或其他方式使核酸扩增区3的产物进入管盖2的中空凹槽10(如图6所示)；b.使用3％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

显而易见，本领域的普通技术人员，可以用本发明的一种核酸扩增与检测反应管，构成各种类型的实验器材。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (15)

1.一种核酸扩增与检测反应管，包括相互配合的管体(1)和管盖(2)，其特征在于：所述管体(1)包括位于上方的储液区(4)以及位于下方的核酸扩增区(3)，所述管盖(2)内部设有中空凹槽(10)，且所述核酸扩增区(3)的容积分别小于或等于所述储液区(4)的容积和中空凹槽(10)的容积。

2.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述核酸扩增区(3)的高度/内径比值为3～12。

3.根据权利要求2所述的反应管，其特征在于：所述核酸扩增区(3)的高度/内径比值为6～9，所述核酸扩增区(3)的最大内径小于等于10mm，且所述核酸扩增区(3)的内径小于所述储液区(4)的内径。

4.根据权利要求3所述的反应管，其特征在于：所述核酸扩增区(3)的最大内径小于等于5mm。

5.根据权利要求1或2或3所述的反应管，其特征在于：所述管体核酸扩增区(3)的内腔为横截面上宽下窄的锥状中空结构或多层梯形中空结构。

6.根据权利要求1或2或3所述的反应管，其特征在于：所述核酸扩增区(3)的内腔为上下内径相等的柱状中空结构。

7.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述核酸扩增区(3)上设有可见的体积刻度标识(5)。

8.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述储液区(4)的外壁上设有防滑沟槽(6)。

9.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述管体(1)的上部开口处设有一个突出于管体外表面的环状结构(7)。

10.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述核酸扩增区(3)与储液区(4)的连接处内部为圆滑导角结构。

11.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述管盖(2)的外壁上设有防滑槽(9)。

12.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述管体(1)与管盖(2)之间通过旋转螺纹结构，或环状卡口结构，或凸点锁扣结构相互密闭连接。

13.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述管体(1)与管盖(2)由耐热材料制成。

14.根据权利要求13所述的反应管，其特征在于：所述耐热材料包括：玻璃、或聚丙烯、或聚醚砜、或丙烯、或聚丙酸酯、或聚砜。

15.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述管体(1)和管盖(2)的内壁经过钝化处理。

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