JP6562552B2 - 合成装置及び合成方法 - Google Patents

Description

本発明は、生化学合成のための装置に、厳密にはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び同種の分子の合成、また更には対応する方法に、関する。

ＤＮＡの増幅は、発酵層の中で細菌の培養物が増幅対象のＤＮＡを増殖させるといった様な細胞ベースのプロセスの使用を通じて実施されることがある。出発テンプレートからのＤＮＡ増幅のための無細胞酵素プロセスについてもポリメラーゼ連鎖反応及び鎖置換反応を含め記載がある。国際公開第２０１０／０８６６２６号及び国際公開第２０１２／０１７２１０号は、ＤＮＡポリメラーゼ及びプロテロメラーゼの使用による閉直鎖ＤＮＡ形成のための生体外無細胞プロセスを記載している。

過去には、試験規模でのＤＮＡの増幅が、マイクロタイタープレートと必要に応じて反応成分を添加するようにロボット制御されるピペットとをベースにした装置を使用して遂行されてきた。その様な装置は、試験目的での少量のＤＮＡ分子の製造向けには適しているが、他の目的には十分な量を提供しない。特定のタンパク質の大規模な増幅及び製造は細胞ベースのプロセスを通じて実施されることが殆どであった。その様な方法は、極めて大量の生成物作製にとっては有効であるが、セットアップに費用が掛かる。

更に、ＤＮＡ試料を増幅させるのに熱循環方法を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をもたらすように特に適合されている装置は利用可能なものが多くある。これらの装置は当該反応にとっては理想的にも適しているが、融通が利かず、他の反応を遂行するように適合させるのは無理である。その様な装置の一例が米国特許第８，１６３，４８９号に開示されている。

国際公開第２０１０／０８６６２６号 国際公開第２０１２／０１７２１０号 米国特許第８，１６３，４８９号

従って、様々な生化学反応を大きい規模で実施するのに使用することのできる適合可能な装置が必要とされている。

本発明によれば、
反応容器と、
反応容器の温度を制御するための温度制御器と、
反応成分を保持するための複数の貯留部と、
貯留部に保持されている反応成分の制御量を反応容器へ所望される時々に供給するように、及び材料を反応容器から引き出すように、貯留部及び反応容器へ選択的に接続可能な供給／引き出し手段と、
反応容器の内容物を撹拌及び／混合するために、前記供給／引き出し手段を制御して反応容器の内容物の一部を引き出させ及び戻させるための制御手段と、を備えている合成装置が提供されている。

本発明によれば、
複数の反応成分を反応容器へ添加して反応混合物を形成させる段階と、
反応混合物を撹拌しその混合を確かにするために、反応混合物の一部を反応容器から引き出し及び当該引き出し分を反応容器へ戻す段階と、
反応終了時に反応生成物を反応容器から引き出す段階と、を備えている合成の方法が提供されている。

以下では本発明を例示としての実施形態及び添付図面を参照しながら更に説明してゆく。

様々な図面中、同様の部分は同様の符号で指し示されている。

本発明の或る実施形態による合成装置の斜視図である。 図１の装置の配線図である。 本発明の或る実施形態の反応容器の断面図である。 本発明を使用している一例としてのプロセスでの圧力差対時間のグラフである。

本発明の実施形態による合成装置は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の様な、生化学分子に関わる所望の反応を自動的に実施する能力がある。反応は、様々な反応成分を所望の（単数又は複数の）反応がもたらされるように所望量例えば所望体積で所望スケジュールに沿って送達できるようになっている温度制御式反応容器の中で遂行される。

或る実施形態では、反応容器の温度は、反応成分の添加及び／又は材料の引き出しと同期して所望の温度プロファイルをなぞるように正確に制御されている。

或る実施形態では、反応容器は、その内容物を所望に応じて撹拌及び／混合させることを可能にする手段と一体に配列され提供されている。実施形態では、反応容器は、反応混合物の制御量の引き出し及び戻しが反応混合物を十分に混合する働きをするように適切な形状をしている。

或る実施形態では、反応容器は、入口／出口支持部が設けられているその最下点に向かって先細になるように配列されているのが望ましい。例えば、反応容器の断面積が反応容器の最下点に向かって単調に小さくなっていっている。或る実施形態では、反応容器にはその高さ全体を通して一定した断面積を有する主部が提供されている。或る実施形態では、反応容器の水平方向断面はその高さ全体を通して実質的に円形である。

或る実施形態では、反応容器のアスペクト比、即ち反応容器の高さ対反応容器の幅の比は、５：１から８：１の範囲にあり、６：１から７：１の範囲にあるのが好ましい。水平方向断面が円形ではない反応容器の場合には、アスペクト比は最も広い水平方向の寸法を基準に確定される。ここでの使用に際し「水平方向」及び「垂直方向」という用語は、その通常の使用向きでの装置を参照している。

或る実施形態では、反応成分は、制御された温度に貯蔵され及び／又は制御された温度で反応容器へ送達される。本発明の或る実施形態では、装置は、反応成分のための複数の温度制御式貯留部を有している。或る実施形態では、温度制御式貯留部には、貯留部の内容物にとっての所望の温度を設定するために温度制御器が提供されている。或る実施形態では、温度制御器は、ペルチェ加熱／冷却素子及び／又は抵抗加熱器を備えている。

本発明の或る実施形態では、反応成分の供給と反応生成物及び／又は試料の引き出しは、１つ又はそれ以上の往復シリンジポンプによって行われている。本発明の或る実施形態では、当該又は各往復シリンジポンプを反応容器の入口／出口ポート及び／又は貯留部へ選択的に接続するのに１つ又はそれ以上の多方向弁が提供されている。

或る実施形態では、反応の終了時に、又は所望により例えばサンプリング目的で反応中に、反応混合物を反応容器から引き出すことができる。

或る実施形態では、装置は、一括モード又は連続処理モードで動作させることができる。

或る実施形態では、装置は、汚染物質の入り込みを防ぐように閉鎖されたシステムである。

或る実施形態では、少なくとも１つの貯留部は、取り外し可能なシリンジ、例えばポリプロピレンシリンジ、を備えている。或る実施形態では、往復シリンジポンプの少なくとも１つは、取り外し可能なシリンジ、例えばガラスシリンジ又はポリプロピレンシリンジ、を備えている。或る実施形態では、ガラスシリンジは、ＤＮＡ材料がシリンジに粘着するのを防ぐようにシラン処理されている。

図１は、本発明の或る実施形態による合成装置１の斜視図である。理解し易くするため、及び主要構成要素をより見え易くするために、一部の特定の構成要素及び接続導管はこの図には省略されている。図２は同じ装置の配線図である。

合成装置１は、内蔵型シャーシ１１上に構築されており、主要構成要素へのアクセスを可能にさせる開閉式前カバー１２を提供されている。前カバー１２は、透明な材料で作られているのが望ましいが、反応成分を過度な光源レベルから保護するように薄い色が付けられていてもよい。それは汚染物質の入り込みを制限する働きもする。装置には、外側からアクセスできるパワースイッチ及びパワー入力１３が例えば装置の側面に提供されている。加えて、装置が、例えば米国テキサス州のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社によって供給されているＬａｂｖｉｅｗ（商標）の様な実験室自動化ソフトウェアを実行する汎用コンピュータと通信できるようにするための、及び／又は当該汎用コンピュータによって装置を制御できるようにするための、入力／出力ポート１４が設けられている。動作表示灯１５が装置の正面から見える位置に提供されていて、装置が動作中であるか否かを指し示す。

合成装置の中心的構成要素は、３０ｍｌより大きい体積を有するジャケット付き反応容器２である。或る実施形態では、反応容器の体積は５０ｍｌより大きい。或る実施形態では、反応容器の体積は約７５ｍｌ又は約１２０ｍｌである。或る実施形態では、反応容器の体積は３００ｍｌより小さい。或る実施形態では、反応容器の体積は２００ｍｌより小さい。或る実施形態では、反応容器の体積は１５０ｍｌより小さい。反応容器の体積は、装置の意図される使用及び生成物の意図される一括製造量又は連続プロセスでの作製速度に従って選択されればよい。反応容器のサイズで一括作製でき得る生成物量の上限が決まるのは明白である。

或る実施形態では、反応容器のアスペクト比は８：１以下である。或る実施形態では、アスペクト比は７：１以下である。反応容器があまりに背高であれば、反応混合物の引き出し及び戻しによる内容物の完全混合をもたらすのはより困難になる。或る実施形態では、アスペクト比は５：１以上である。或る実施形態では、アスペクト比は６：１以上である。反応容器があまりに幅広であれば、全体を通して一様な温度を確保するのはより難しくなり、反応器体積がより小さい場合は特にそうである。混合物の撹拌は、混合物全体を通して所望の温度を得るのを支援することができ、反応混合物が９５℃へ加熱される場合は特にそうである。上記制限内のアスペクト比を有する反応容器は、反応成分の異なる諸量に適合可能である。

本発明の或る実施形態で使用できる反応容器２が図３に断面図で示されている。反応容器２は、ジャケット２５によって取り囲まれた内側容器２３を備えている。内側容器２３の内容物の温度を制御するために、温度制御流体が内側容器２３とジャケット２５の間の空間２６を通って循環されている。下側ポート２７と上側ポート２８が内側容器を選択弁３２ｂ、３２ａへそれぞれ接続するように提供されている。

本発明の或る実施形態では、内側容器２３は、例えば２０ｍｍから５０ｍｍ、好適には２５ｍｍから３５ｍｍ、の範囲の直径Ｄ１の円筒の形を有している主部と、円筒部を下側ポート２７へ接続している先細部２４と、を有している。内側容器の全高Ｈ１は、或る実施形態では、１５０ｍｍから３００ｍｍ、望ましくは２００ｍｍから２５０ｍｍ、の範囲にある。先細部２４の高さは、或る実施形態では、５ｍｍから２０ｍｍ、好適には１０ｍｍから１５ｍｍ、の範囲にある。先細部の側壁の角度は、内側容器の軸に対して３０°から６０°の範囲にあり、約４５°が好適である。下側ポート２７の直径Ｄ２は５ｍｍから１０ｍｍの範囲にある。

本発明の或る実施形態では、反応容器は一定でない断面を有しており、例えばその高さ全体を通して下に向かって先細になっている、即ち中心が膨出している。

反応容器の温度は、反応容器に対し外側のジャケットを通る温度制御流体の流れによって制御される。温度制御流体は、入口２ａによって供給され、出口２ｂから再循環温度制御器２２によって取り出される。再循環温度制御器は、流体を加熱及び／又は冷却することによって温度制御流体の温度を制御する。反応容器は、例えば吸熱反応又は発熱反応の発現にもかかわらず、一定した温度に維持される又は所望の温度プロファイルをなぞるよう制御される。温度制御流体は水又は油であってもよい。或る実施形態では、温度制御流体は装置のシャーシ上に提供されているポート１６を介して供給される。適する再循環温度制御器は、米国ペンシルベニア州のＪｕｌａｂｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．社によって製造されているＰｒｅｓｔｏ Ａ３０温度制御システムである。本発明の或る実施形態では、再循環温度制御器２２は、オーム加熱器及び／又はペルチェ素子を備えている。或る実施形態では、反応容器の温度は、４℃から９５℃までの範囲の温度へ０．０１℃の精度で制御可能である。

本発明のこの実施形態は、反応成分を合成反応に使用させるための温度制御式貯留部４ａ−４ｃを提供されている。反応成分は、温度制御器４１ａ−４１ｃに装着されているシリンジ４２ａ−４２ｃ、例えば使い捨てのポリプロピレンシリンジ、内に保持されている。この実施形態の温度制御器は、シリンジ４２ａ−４２ｃを密接に受け入れる孔を有している伝導性材料、例えばアルミニウム、のブロックを備えている。ブロックとシリンジの間の熱伝導性を増加させることが所望される場合には熱伝導性ペーストが提供されてもよい。熱伝導性ブロックの温度、ひいては貯留部４２ａ−４２ｃに貯蔵されている反応成分の温度を制御するために、加熱／冷却器、例えばオーム加熱器及び／又はペルチェ素子が、熱伝導性ブロックへ取り付けられている。

温度制御器４１ａ−４１ｃは、貯蔵されている反応成分を加熱するか又は冷却するのに使用することができる。幾つかの反応成分は、それらの分解を防ぐために、低温、例えば約４℃、に保持されるのが望ましい。プライマーは、ぼやけてしまうのを防止又は低減されるように、高い温度に貯蔵することができる。貯留部は、更に、反応容器への添加に先立つテンプレート及びプライマーの変性及びアニーリングのために加熱されてもよい。反応容器の主要温度制御と同様、温度制御式貯留部は、一定した温度に維持されてもよいし、又は、例えば反応容器への添加の直前に反応成分を加熱するように、所望の温度プロファイルをなぞることもできる。或る実施形態では、温度制御式貯留部の温度は、４℃から９５℃の範囲内で０．０１℃の精度で独立に制御可能である。

或る実施形態では、プライマーの様な反応成分の温度を反応容器への添加の前に例えば９５℃へ上昇させるために、１つ又はそれ以上のインライン加熱器（図示せず）が提供されている。当該加熱器又は加熱器が複数ある場合にはそのうちの１つは、貯留部４ａ−４ｃ、５ａ−５ｇと選択弁３２ｃの間及び／又は選択弁３２ａと反応容器２の間の導管上に提供されている。

この実施形態では、温度制御式貯留部の１つ４ｃは、単一の温度制御ブロック４１ｃと熱的接触にある２つの貯留部シリンジ４２ｃ及び４２ｃ´を備えている。これは、２つの反応成分が同じ温度に維持されることが必要である場合又は所望の反応のために単一反応成分のより大きい体積が要求される場合に有用である。

装置は、更に、温度制御器の提供されていない複数の更なる貯留部５ａ−５ｇを備えている。この実施形態では、その様な貯留部は７つあり、他の実施形態ではより多い又はより少ない貯留部が提供されている。更なる貯留部５ａ−５ｇも、空になったら取り外して廃棄できるシリンジ、例えばガラスシリンジ又はポリプロピレンシリンジ、を備えていてもよい。シリンジの使用は、貯留部の体積を自動的に減少させながら反応成分が引き出されてゆくので好都合である。折り畳み式の袋又は管でも同様の効果を得ることができる。剛性の容器が使用されている場合は、汚染物質の入り込みを防ぐために、大気へ至る何らかの通気口にはフィルターが提供されているのが望ましい。

貯留部５を搭載するための回転スタンド５１が提供されているのが好都合である。反応成分が多量に要求されている場合、装置には外部貯留部ヘ接続するポートが提供されていてもよい。装置は、貯留部を選択弁へ接続するのに要する導管の長さが最小限になるようにレイアウトされているのが望ましい。或る実施形態では、導管は貯留部から脱着可能であり、そうしてすすぎのために洗浄液又は水の供給部へ接続されているマニホールドへ取り付けることができる。このやり方では、装置全体を、解体することなく、その場で流し洗いできる。

或る実施形態では、貯留部４ａ−４ｃ及び５ａ−５ｇは、３ｍｌから１０ｍｌの容量、例えば約５ｍｌの容量、を有している。１つ又はそれ以上のより大きい貯留部、例えば緩衝溶液用の貯留部には、１０ｍｌから５００ｍｌの容量、例えば約２５０ｍｌの容量、が提供されていてもよい。

反応成分の反応容器への供給は往復シリンジポンプ３ａによって行われる。このポンプは供給ポンプと呼称されている。これは、例えばガラスシリンジ又はポリプロピレンシリンジであるシリンジ３１ａであってソレノイド３３ａによって駆動されていてシリンジ３１ａを貯留部の各々へ及び反応容器へ選択的に接続するための制御式選択弁３２ａへ接続されているシリンジ３１ａ、を備えている。反応成分の制御量を反応容器へ添加する場合、先ず選択弁３２ａを使用してポンプシリンジを関連貯留部へ接続し、次いでソレノイドを作動させて反応成分の関連体積をシリンジの中へ引き入れる。次に、選択弁３２ａを使用してシリンジ３１ａを反応容器２へ接続し、ソレノイドを逆転させてシリンジ内容物を反応容器の中へ吐き出させる。この配列を用いれば、複数のシリンジポンプ及び反応容器への複数の入口を必要とすることなく、所望反応成分の諸量を順次式に反応容器へ素早く添加することが可能である。しかしながら、複数の反応成分を反応容器へ同時に添加することが望ましい場合は、複数の供給ポンプ３ａを設けることも可能である。これは、一部の特定の反応成分をそれらの反応容器への添加前に確実に分離させておくことが必要である場合にも望ましいであろう。

この実施形態では、反応容器の内容物を撹拌するため、更には反応混合物又は反応生成物を反応終了時か又はサンプリング目的で反応プロセス中に取り出すために、第２往復シリンジポンプ３ｂが使用されている。このポンプは、引き出しポンプと呼称されており、ソレノイド３３ｂによって駆動されるシリンジ３１ｂを備えている。第２シリンジポンプ３ｂは反応容器の底の出口へ第２選択弁３２ｂを介して接続されている。反応容器の内容物を撹拌する場合、第２選択弁３２ｂを使用してシリンジ３１ｂを反応容器へ接続しておいて、その間に反応混合物の或る量を反応容器から引き出し、次いで反応容器へ戻す。もたらされる撹拌の程度を制御するためには、引き出される反応混合物の量及びそれが戻される速度を制御すればよい。その様な撹拌は、反応の過程を通して継続的に、周期的に、又は反応成分の添加に関係する特定の時期に、行うことができる。

或る実施形態では、第２往復シリンジポンプ３ｂは、更に、貯留部４ａへ接続されていて、当該貯留部に貯蔵されている反応成分を反応容器２へ供給するのに使用することができる。

反応容器２と選択弁３２ｂの間又は選択弁３２ｂと引き出しポンプ３ｂの間の導管へ接続されている短いスパー上に圧力センサ８２が提供されている。反応容器２からの材料の引き出し中及び反応容器２への材料の戻し中、センサ８２によって測定される圧力は移されてゆく混合物の粘度を指し示しており、圧力が高いほど粘度が高い。具体的に、材料の循環的引き出し及び戻し中の圧力変化の振幅は反応混合物の粘度を指し示している。圧力と粘度の厳密な関係性は、材料の引き出し又は戻しの速度、使用されている導管の直径、及び反応容器の幾何学形状を含む様々な要因に依存する。この関係性は理論的に又は較正によって確定することができる。或る実施形態では、精密な関係性は必須ではなく、圧力センサ８２からの信号を使用するだけで、反応混合物の精密な粘度を知らなくても反応混合物の変化を検知することができる。生成物形成に因り粘度が増加する反応では、圧力センサからの信号を使用して反応を制御することができる。ポンプを起動して、１つ又はそれ以上の適切な試薬を貯留部の１つ又はそれ以上から圧力信号に基づく適切な速度又は適切な量で送達させることによって、生成物歩留りを増加させることが可能である。他の事例では、圧力信号は反応又は反応段の完了を指し示すことができ、よって信号を使用して生成物の採収又は次段のための成分添加をトリガさせることもできる。

本発明の或る実施形態では、圧力センサ８２からの信号を使用し、混合物の反応容器に対する引き出し及び／又は戻しの速度を制御して、確実に、混合物中のＤＮＡ材料がせん断力によって損傷されることのないようにしている。或る実施形態では、混合物の引き出し及び／又は戻しの速度は、確実に、圧力限界を超過してしまうことのないように制御される。圧力限界は粘度依存であってもよい。

本発明者は、反応混合物の取り出し及び戻しによる撹拌は、上述のサイズ、形状、及びアスペクト比の反応容器と共に使用された場合に特に効果が高いことを見極めた。この撹拌方法は、更に、反応混合物の広範な体積について有効である。このセットアップは、更に、洗浄するのが難しいこともある反応容器内部のバッフルの様な構成要素が一切不要であることに利点を有する。

本発明の或る実施形態では、反応混合物を撹拌するための代わりの手段、例えば反応容器内の磁気式掻き混ぜ器及び／又は反応容器全体を揺動するための攪拌器、が提供されている。

材料、例えば反応生成物、を反応容器から取り出す場合、引き出しポンプ３ｂを先ず反応容器へ第２選択弁３２ｂにより接続し、ソレノイドを動作させてシリンジのピストンを後退させ、材料が反応容器２から引き出されるようにする。引き出しポンプを次いで出口ポート７へ第２選択ポンプにより接続し、ソレノイド３３ｂを起動させて収集された材料を出口ポート７を通して排出させる。

出口ポート７は、例えば、反応生成物用収容器、試料収容器、測定器、又は何か他の装置ヘ接続されている。測定目的で取り出した試料を測定後に反応容器へ戻すことも可能である。

本発明の或る実施形態では、引き出しポンプ３ｂは、例えば反応容器全体を一回のポンピング動作で空にすることができるように、供給ポンプ３ａより大きい容量を有している。引き出しポンプ３ｂとしてのその様な大きい容量は、大量の洗浄溶液及び／又は脱イオン水をシステム全体を通して流すことによって装置の洗浄を支援するうえでも望ましい。これを果たすために、装置には、洗浄溶液及び脱イオン水の十分量を保持するための追加の大貯留部が提供されていてもよい。

本発明の或る実施形態では、反応成分を供給するため、反応混合物を撹拌するため、及び反応混合物及び／又は生成物を引き出すために、単一のポンプが使用されている。

本発明の或る実施形態では、供給ポンプ３ａ及び／又は引き出しポンプ３ｂは、別の形態のポンプ、例えば蠕動ポンプ、を備えている。

装置は、更に、廃物容器６を備えており、廃物容器６は通気口６２を介して大気へ接続されており、通気口６２には一方向弁が提供されていてもよい。廃物容器６は、容器のための通気口を提供し反応容器２内の圧力の蓄積を防ぐように、反応容器２の上側部分へ接続されている。反応容器からの生成物の投棄及び何らかの未使用及び不所望反応成分の投棄を可能にさせるために廃物容器６を選択弁３２ａ及び３２ｂへ接続するべく更に導管が提供されている。廃物容器は、現場での洗浄及びすすぎ中の洗浄液及びすすぎ液を受けたり、反応容器への所望量の厳密送達が可能になるように導管の呼び水入れ段階からの少量の反応成分を受けたりするのにも使用できる。

或る実施形態では、廃物容器６は省略されている。この場合、反応容器２に対し安全弁を提供すること及び選択弁３２ａ、３２ｂから外部排水管への接続を提供することが望ましい。

装置の動作は、温度制御器４１ａ−４１ｃへ、選択シリンジ３２ａ−３２ｂへ、ソレノイド３３ａ−３３ｂへ、温度制御器２２へ、及び圧力センサ８２へ、装置のそれら構成要素を制御するように、電気的に接続されている制御部８によって制御される。制御部８は、更に、実行されるべきプロセスの全体制御のために外部コンピュータ９への接続を可能にさせるインターフェース８１を備えている。

或る実施形態では、制御部８は、呼び水入れ、サンプリング、採収、すすぎ及び洗浄の様な、特定の一般的に使用されているルーチンを遂行するように予めプログラムされている。或る実施形態では、制御部８は単に外部コンピュータ９からのコマンドを装置の異なる構成要素へ受け渡すだけである。言及されているルーチンは、外部コンピュータの制御下に遂行されていてもよいし、又は手動で遂行されていてもよい。

或る実施形態では、装置の呼び水入れは、反応成分を貯留部の各々から引いて貯留部と選択弁の間の導管がそれぞれの反応成分で満たされるようにすることを備えている。これは、反応容器へ送達される反応成分の量の正確性を高め汚染の可能性を低減するうえで望ましい。或る実施形態では、反応混合物のサンプリングは、反応の過程中に反応成分の既定量を外部容器又はセンサへ取り出すことを備えている。反応容器への試料の戻しが場合によってはあり得る。或る実施形態では、採収は、一括プロセスの終了時又は連続プロセスでの適切な時期に反応生成物の一部又は全部を引き出すことを備えている。或る実施形態では、すすぎは、使用された導管及び貯留部を純水ですすぐことを備えている。或る実施形態では、装置洗浄は、導管及び貯留部を洗浄溶液ですすぐことを備えている。

本発明の或る方法では、複数の反応成分が反応容器へ添加されて反応混合物を形成する。反応混合物を撹拌しその混合を確かにするために、反応混合物の一部が反応容器から引き出され反応容器へ戻される。反応終了時、反応生成物が反応容器から引き出される。或る実施形態では、反応混合物は、反応容器の下側部分に、好適には反応容器の最下点に、提供されているポートから引き出される。或る実施形態では、反応混合物の取り出し分は、反応混合物全体の５０％又はそれ以下、望ましくは４０％又はそれ以下、好適には３０％又はそれ以下に及ぶ。或る実施形態では、反応混合物の取り出し分は、反応混合物全体の５％又はそれ以上、望ましくは１０％又はそれ以上、好適には２０％又はそれ以上に及ぶ。

本発明の或る実施形態による装置を使用したＤＮＡ合成の方法の実施例をこれより説明してゆく。

最初に装置を洗浄し浄化した。管を１０個の試薬貯留部（４２ａ、４２ｂ、４２ｃ´、４２ｃ、５ａ−５ｇ）から接続解除し、ルアー継手を介して、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液の入った１２０ｍｌ貯留部から送給を受ける１０位置マニホールドへ接続し直した。同様に、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液の６０ｍｌ貯留部を出口ポート７へ選択弁３２ｂから取り付けた。選択弁３２ａ及び３２ｂの位置と５ｍｌガラスシリンジ３１ａ及び３１ｂへのソレノイド３３ａ及び３３ｂの作用をそれぞれ制御することによって、反応容器２そのものを含むシステム全体を空所無しに完全に次亜塩素酸ナトリウム溶液で満たした。５ｍｌという溶液最小量を各管を通して引いた。反応容器（１２０ｍｌ容量）をサーモサーキュラー２２への制御作用によって５０℃へ加熱し、システムを３０分の期間に亘ってこの状態に維持した。この手続きにより、確実に全ての送給管及び反応容器自体の内のあらゆる汚染ＤＮＡが完全に破壊されるようにした。

同様に、以上に説明されている様に適切なプログラムを使用して選択弁及びソレノイドを制御することによって、次亜塩素酸ナトリウム溶液を廃物容器６の中へ分注することによりシステム全体から次亜塩素酸ナトリウム溶液を空けた。貯留部の次亜塩素酸ナトリウム溶液を脱イオン水に置き換えた後に上記プロセスを５回繰り返すことで、残っている次亜塩素酸ナトリウムのシステム全体からの完全除去を確かにし、システムをいつでも使える状態にした。

次いで、管をマニホールドから接続解除し、ルアロック継ぎ手を有する滅菌使い捨てポリプロピレンシリンジを備える１０個の試薬貯留部（５ｍｌ乃至２０ｍｌ容量）へ接続し直した。以下に指示されている場合、これらのシリンジは個々の反応成分を最小体積２ｍｌで収容した。それ以外の場合、それらはプランジャーを一杯まで押して空にしておかれた。貯留部５ｄは、並列する６０ｍｌのシリンジ２つから成り、合計１２０ｍｌの脱イオン水容量を与えた。試薬の入ったシリンジでは、充填後に、手でプランジャーを液体がシリンジ出口からちょうど漏れ出るまで押すことによって各シリンジバレル内の空気を追い出した。この手続き中、バレル内の空気全ての追い出しが可能になるようにシリンジ出口を垂直方向にシリンジプランジャーより上に保った。

貯留部４２ｃ及び４２ｃ´中の酵素試薬であるＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ及びピロホスファターゼは、それぞれ、温度制御器４１ｃによって４℃の安定した条件下に維持された。全ての他の試薬は室温に維持された。

試薬の反応容器２内への正確な分注を実現するために、試薬貯留部と選択弁３２ａ及び３２ｂの間の管には、連続して極少量の試薬を引き出しそして廃物容器６へ分注することによって、呼び水入れを施した。

ＤＮＡテンプレートを変性させ、オリゴヌクレオチドプライマーを結合させるために、貯留部５ａ、５ｂ、及５ｃからの試薬を、選択弁３２ａを介して（シリンジ３１ａへのソレノイド３３ａの作用により）、閉じている空の５ｍｌシリンジ（貯留部４２ｂ）の中へ分注した。この貯留部の温度は、温度制御器４１ｂによって制御された。４１ｂへの制御作用を使用してその温度を３分の間９５℃へ上昇させ、次いで３０℃へ冷却した。貯留部４２ｂ中の化合された反応成分を次いで反応容器２の中へ選択弁３２ａを介して分注した。残り５つの反応成分を、反応容器２の最終体積が４０ｍｌになるようにして、表１に示されている順に選択弁３２ａを介して順次分注した。反応容器２の温度は、サーモサーキュラー２２への制御作用によって３０℃に設定された。反応成分は、設定点より２℃を超えて高い表面温度に曝されることはなかった。

反応成分の混合は、ソレノイド３３ｂへの制御作用及びそれに続く混合シリンジ３１ｂの運動への制御作用によって実現させた。シリンジの作用は、反応成分５ｍｌを反応容器２から引き出し反応容器２へ戻すように制御された。混合は、シリンジを大凡２時間の間隔で１０分間に亘って７０ｍｌ／ｍｉｎの引き出し／分注速度で起動させるという具合に非連続であった。

反応容器２とシリンジ３１ｂの間の管材内の圧力変化を、真空及び圧力センサ８２（日本、東京、ＳＭＣコーポレイション社、型番ＺＳＥ３０−０１−２６）によって測定した。このセンサは、−１０１ｋＰａから＋１０１ｋＰａまで（−１０００ｍｂａｌから＋１０００ｍｂａｒ）の圧力差を測定するものであり、１／８インチ（３．１７５ミリメートル）直径のＰＴＦＥ管材の短尺部分を使用するＴピースを介して接続した。センサからの出力信号（０−５Ｖ）は、Ｐｉｃｏ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ ＵＳＢ ＴＣ−Ｏ８データロガー（イギリス、ケンブリッジ、Ｐｉｃｏ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ社）を使用して監視した。センサからのｍＶ出力を４００ミリ秒間隔で記録するようにデータロガーをプログラムし、反応の過程中リアルタイムで出力をプロットした。

混合シリンジの往復作用は、高圧及び低圧のピークを示すグラフ出力を生じさせた。シリンジの速さ、管材の材料と内径と長さ、及び選択弁のサイズと幾何学形状の様な、全ての他の変数が固定された状態で、ピーク高さに何らかの変化があればそれは反応成分の粘度の変化に因る以外にはあり得ない。極めて小さい圧力変化なら環境の温度及び圧力変動が原因ということもあり圧力差計算では補償しなかった。

プロセス中、環状ＤＮＡテンプレート、ＤＢ−Ｃａｌ０９２へのΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの作用は、テンプレートの７０キロベース又はそれ以上にも伸び得る長い直線状の鎖状体反復を現出させ、反応は反応成分の１つ又はそれ以上が使い尽されると終わった。長い一本鎖ＤＮＡを先ず作製し、ついでそれらにポリメラーゼのテンプレートの役目をさせて相補鎖を作製した。反応終了時の生成物組成は、一本鎖と二本鎖の両方の鎖状体ＤＮＡを含んでおり、それが粘度を増加させることになる。

この粘度変化の測定は、ｍｂａｒ単位の圧力差Ｐ対時間単位の時間Ｔをプロットしている図４に示される、センサによって記録された圧力差の増加に反映されている。約１４時間の過程を経て圧力差Ｐが約２２５ｍｂａｒから約２９０ｍｂａｒへ増加したことが見て取れる。増加は単調だがあまり直線的ではなく、増加率は平均を中心に変動した。

反応の経過中に観測された圧力差の増加は、ＤＮＡの作製に因る溶液粘度の増加によって説明がつく。この増加の確証を取り出した試料の目視検査によって確認したところ、これらは反応の進行につれた自らの閉じ込め気泡保留能力の漸増を示した。

本発明を単に例示としての実施形態を参照しながら説明してきたが、本発明はそれらの実施形態に限定されると解釈されてはならず、付随の特許請求の範囲の範囲内に収まる変更及び修正を包含する。

１ 合成装置
２ 反応容器
２ａ 入口
２ｂ 出口
３ａ 供給ポンプ
３ｂ 引き出しポンプ
４ａ、４ｂ、４ｃ 貯留部
５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅ、５ｆ、５ｇ 貯留部
６ 廃物容器
７ 出口ポート
８ 制御部
９ 外部コンピュータ
１１ シャーシ
１２ 前カバー
１３ パワースイッチ及びパワー入力
１４ 入力／出力ポート
１５ 動作表示灯
１６ ポート
２２ 再循環温度制御器
２３ 内側容器
２４ 先細部
２５ ジャケット
２６ 空間
２７ 下側ポート
２８ 上側ポート
３１ａ、３１ｂ シリンジ
３２ｂ、３２ａ 選択弁
３３ｂ、３３ｂ ソレノイド
４１ａ、４１ｂ、４１ｃ 温度制御器
４２ａ、４２ｂ、４２ｃ、４２ｃ´ シリンジ
５１ 回転スタンド
６２ 通気口
８１ インターフェース
８２ 圧力センサ
Ｄ１ 内側容器の主部の直径
Ｄ２ 内側容器の下側ポートの直径
Ｈ１ 内側容器の全体高さ

Claims (14)

1. 第１の下側ポート及び第２の上側ポートを有する反応容器と、
   前記反応容器の温度を制御するための温度制御器と、
   反応成分を保持するための複数の貯留部と、
   複数の導管であって、当該複数の導管の各々が前記反応容器の前記第２の上側ポートを前記複数の貯留部のそれぞれ１つと接続している、複数の導管と、
   前記第１の下側ポート及び／又は前記反応容器の内容物の圧力を測定するための少なくとも１つの圧力センサと、
   前記複数の貯留部に保持されている反応成分の制御量を前記反応容器へ所望される時々に選択的に供給するための供給手段と、
   前記反応容器からその前記第１の下側ポートを通して内容物の或る量を選択的に引き出し、当該引き出された内容物を前記反応容器へその前記第１の下側ポートを通して選択的に戻すための撹拌手段と、
   前記供給手段及び前記撹拌手段を制御するための制御手段と、を備えている合成装置において、
   前記制御手段は、前記少なくとも１つの圧力センサによる測定圧力に基づいて反応の終了または反応の段階を検出して前記供給手段を制御し、および／または前記制御手段は、前記少なくとも１つの圧力センサによる測定圧力に基づいて核酸材料が損傷しないように前記撹拌手段を制御する、核酸の合成装置。
2. 前記反応容器は、その最下点に向かって先細になってゆき入口／出口ポートを前記最下点に有するように配列されている、請求項１に記載の装置。
3. 前記反応容器のアスペクト比は、５：１から８：１の範囲にあり、好適には６：１から７：１の範囲にある、請求項１又は２に記載の装置。
4. 前記温度制御器は、反応成分の添加及び／又は材料の引き出しと同期して、前記反応容器の温度を制御して所望の温度プロファイルをなぞらせるように配列されている、請求項１から３の何れか一項に記載の装置。
5. 前記貯留部の少なくとも１つに保持されている反応成分の温度を制御するように配列されている貯留部温度制御器を更に備えている請求項１から４の何れか一項に記載の装置。
6. 前記温度制御器は、サーモサーキュラー、ペルチェ加熱／冷却素子、及び／又は抵抗加熱器を備えている、請求項１から５の何れか一項に記載の装置。
7. 前記供給手段及び前記撹拌手段は、往復シリンジポンプを備えている、請求項１から６の何れか一項に記載の装置。
8. 前記供給手段及び／又は前記撹拌手段は、当該供給手段及び／又は当該撹拌手段を前記反応容器の前記第１の下側ポート又は第２の上側ポート及び／又は貯留部へ選択的に接続するように配列されている多方向弁を備えている、請求項１から７の何れか一項に記載の装置。
9. 少なくとも１つの貯留部は、取り外し可能なシリンジ、例えばガラスシリンジ又はポリプロピレンシリンジ、を備えている、請求項１から８の何れか一項に記載の装置。
10. 反応容器における上側ポートを通して複数の反応成分を前記反応容器へ添加して反応混合物を形成させる段階と、
    前記反応混合物を撹拌しその混合を確かにするために、当該反応混合物の一部を前記反応容器の下側ポートを通して前記反応容器から引き出し及び当該引き出し分を前記反応容器の前記下側ポートを通して前記反応容器へ戻す段階と、
    少なくとも１つの圧力センサによって前記反応容器の外から前記反応混合物の圧力を測定し、前記測定された圧力に基づいて反応の終了または反応の段階を検出して前記複数の反応成分の前記反応容器への添加を制御する、及び／又は前記測定された圧力に基づいて核酸材料が損傷しないように前記反応容器から引き出し及び前記反応容器へ戻す速度を制御する段階と、
    前記反応の終了時に反応生成物を前記反応容器から引き出す段階と、を備えている核酸の合成の方法。
11. 前記反応容器の前記下側ポートは、前記反応容器の下側部分に、好適には前記反応容器の最下点に設けられている、請求項１０に記載の方法。
12. 前記反応混合物の前記引き出し分は、前記反応混合物全体の５０％又はそれ以下、望ましくは４０％又はそれ以下、好適には３０％又はそれ以下に及ぶ、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記反応混合物の前記引き出し分は、前記反応混合物全体の５％又はそれ以上、望ましくは１０％又はそれ以上、好適には２０％又はそれ以上に及ぶ、請求項１０、１１又は１２に記載の方法。
14. 前記反応の終了に先立って前記反応混合物の試料を引き出す段階、を更に備えている請求項１０から１３の何れか一項に記載の方法。

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