RU79672U1 - Конвекционный днк термоциклер - Google Patents

Конвекционный днк термоциклер Download PDF

Info

Publication number
RU79672U1
RU79672U1 RU2008112872/22U RU2008112872U RU79672U1 RU 79672 U1 RU79672 U1 RU 79672U1 RU 2008112872/22 U RU2008112872/22 U RU 2008112872/22U RU 2008112872 U RU2008112872 U RU 2008112872U RU 79672 U1 RU79672 U1 RU 79672U1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
tubes
dna
temperature
convection
reaction
Prior art date
Application number
RU2008112872/22U
Other languages
English (en)
Inventor
Алексей Викторович Чемерис
Эдуард Гависович Магданов
Дмитрий Алексеевич Чемерис
Равиль Ринатович Гарафутдинов
Петр Александрович Шальков
Артур Радикович Гареев
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "НПФ "Ампликон"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "НПФ "Ампликон" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "НПФ "Ампликон"
Priority to RU2008112872/22U priority Critical patent/RU79672U1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU79672U1 publication Critical patent/RU79672U1/ru

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Конвекционный ДНК термоциклер относится к физико-химической биологии, биотехнологии и медицине и связан с анализом молекул нуклеиновых кислот путем амплификации их специфичных фрагментов. Термоциклер может быть использован при проведении ДНК-диагностики, в том числе в полевых условиях, медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.
Сущность полезной модели конвекционного ДНК термоциклера с наклонным градиентом температур заключается в том, что быстрая амплификация целевых продуктов ПЦР ведется в приборе специальной конструкции, оснащенном блоком электронного управления и особым реакционным термоблоком, обеспечивающем в реакционных сосудах, которыми служат стандартные пробирки, наклонный градиент температуры, ориентированный под углом к направлению действия силы тяжести.

Description

Полезная модель относится к физико-химической биологии, биотехнологии и медицине и связана с анализом молекул нуклеиновых кислот путем амплификации их специфичных фрагментов. Она может быть использована при проведении ДНК-диагностики, в том числе в полевых условиях, медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.
Современная ДНК-диагностика основана преимущественно на амплификации специфичных фрагментов ДНК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее модификаций. При этом ПЦР требует циклического изменения температур, поскольку для того, чтобы начался новый цикл, должна произойти денатурация ДНК (обычно при температуре около 95°С) после чего следует отжиг праймеров (чаще всего при температурах от 50 до 60°С) и их удлинение (наиболее часто используются
температуры 72-75°С). В настоящее время большинство ДНК термоциклеров имеют нагреваемый и охлаждаемый элементами Пельтье довольно массивный реакционный блок, изготовленный из металла, обладающего хорошей теплопроводностью. Скорость смены температур в таких приборах, как правило, варьирует в диапазоне от 2 до 6°С в секунду. Менее распространены устройства, в которых вместо реакционного блока имеется полая воздушная камера с расположенными в ней реакционными сосудами, нагрев и охлаждение воздушного пространства которой осуществляется соответственно инфракрасной лампой и вентилятором или попеременной подачей под давлением горячего и холодного газов и в этих случаях смена температур в реакционной смеси происходит со скоростью до 12-17°С/сек. Средняя продолжительность реакции в разных приборах этих типов составляет от 2 часов до 15 минут. При этом более удобные по ряду параметров приборы, основанные на элементах Пельтье, заметно уступают по скорости амплификации, являющейся одним из важных показателей. В то же время у приборов с полой воздушной камерой имеются свои недостатки. Так, ПЦР в них, как правило, ведется в специальных капиллярах, а не в стандартных полипропиленовых пробирках, которые заметно дешевле и удобнее в работе, тем более, что стеклянные капилляры не требуются при проведении большинства диагностических экспериментов, где не предполагается дальнейший анализ продуктов ПЦР с помощью высокоточного плавления ДНК.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является конвекционный ДНК термоциклер (Hwang H.J., Kim J.H., Jeong K. Method and apparatus for amplification of nucleic acid sequences by using thermal convection // US Patent Application Publication No 2004/0152122 A1. Aug. 5, 2004), представляющий собой аппарат с реакционным термоблоком, изготовленным из двух разделенных термоизолятором основных половинок, для которых поддерживается разная температура - для верхней части - температура отжига и для нижней части - температура денатурации. Реакционными сосудами служат открытые с верхней стороны толстостенные стеклянные трубки. Их высота составляет 55-60 мм, внутренний диаметр - 2 мм, внешний диаметр - 8 мм, запаянный нижний конец имеет толщину стенок также 3 мм. Открытое состояние пробирок необходимо для обеспечения внутри них повышенного давления азота (1,2 атм) для предотвращения начала процесса кипения и не нарушения, таким образом, возникающей температурной конвекции жидкости, происходящей по типу ячеек Бенара-Рэлея. Открытое состояние пробирок потенциально чревато перекрестным загрязнением их содержимого, что может приводить к ложно-позитивным результатам, но повышенное по сравнению с атмосферным давление, может до некоторой степени воспрепятствовать
этому, однако его создание заметно усложняет всю конструкцию и делает ее менее безопасной. Недостатком данной модели является использование пробирок особого типа, не относящихся к стандартным и массово применяемым в большинстве ДНК термоциклеров. Другим недостатком этой модели конвекционнного ДНК амплификатора можно считать довольно продолжительное время реакции, поскольку требуется около полутора часов, чтобы благодаря термоконвекции жидкости произошло должное количество циклов денатурации/отжига/элонгации и целевой продукт ПЦР стал виден после его разделения гель-электрофорезом.
Сущность полезной модели конвекционного ДНК термоциклера с наклонным градиентом температур заключается в том, что быстрая амплификация целевых продуктов ПЦР ведется в приборе специальной конструкции, оснащенном особым реакционным термоблоком, обеспечивающем в реакционных сосудах, которыми служат стандартные пробирки, наклонный градиент температуры, ориентированный под углом к направлению действия силы тяжести. Так, температура денатурации создается в определенной части реакционной смеси около дна пробирки после подведения к внешней поверхности последней сбоку внизу соответствующей температуры с использованием в качестве проводника тепла металлической пластины, в свою очередь нагреваемой элементом Пельтье. Вторая температура (температура отжига) создается в верхней части реакционной смеси после подведения с противоположного (по отношению к месту подвода температуры денатурации) бока пробирки на уровне границы жидкости (ниже мениска) другой металлической пластины, термостатированной при требуемой температуре, которая при амплификации различных образцов зависит от конкретных нуклеотидных последовательностей праймеров, характеризующихся присущими им температурами отжига. После приложения заданных температур к реакционным пробиркам в указанных местах внутри них в реакционной смеси очень быстро создается наклонный градиент температур, запускающий механизм конвекции, основанный на силе плавучести. Причем, благодаря наклонному градиенту температур возникает направленное движение слоев жидкости по эллипсоподобному пути, в массе своей не разбивающееся на многочисленные ячейки Бенара-Рэлея как это обычно происходит в случае приложения вертикального или горизонтального градиентов температур. В результате такой термоконвекции жидкость (водный раствор), проходя зону с высокой температурой (зона денатурации), затем зону средней температуры (нерабочая зона), попадая в зону низкой температуры (зона отжига), вновь оказываясь в зоне средней температуры (зона элонгации) и затем возвращаясь в зону высокой температуры,
совершает таким образом один полный оборот, которые повторяются до тех пор пока к пробирке (к ее внешней стороне) приложены в определенных местах соответствующие температуры. Таким образом, один цикл в конвекционной ПЦР в данной полезной модели занимает около 2-3-х секунд и за 1-2 минуты таких циклов происходит от 20 до 60. Ввиду короткого времени протекания реакции не требуется предотвращения испарения жидкости ни с помощью горячей крышки, ни наслаиванием минерального масла. Поскольку жидкость в средней части пробирки описывает несколько меньший эллипс, то молекулы ДНК, находящиеся в этом месте реакционной смеси, не оказываются в зоне высокой температуры, где могла бы произойти денатурация ампликонов и соответственно затем отжиг праймеров, сопровождающийся их удлинением. Однако, благодаря имеющей место диффузии и возникающим флуктуациям потоков, слои жидкости из центральной части смещаются в стороны и оказываются также вовлеченными в данный температурный круговорот. Аналогичные процессы происходят со слоями жидкости, прилегающими к стенкам пробирок и из-за трения имеющими меньшую скорость движения. При этом не имеет никакого значения, что не все ампликоны амплифицируются одновременно так как самое главное в подобной ПЦР, это чтобы успело размножиться столько молекул ДНК, сколько требуется для их регистрации по конечной точке электрофорезом или каким-то иным способом, либо в реальном времени по свечению соответствующего красителя(ей).
Касательно малого времени пребывания молекул ДНК в каждой из температурных зон, следует заметить, что скорость работы многих термостабильных ДНК полимераз весьма высока и за те мгновения (менее секунды), что ампликон с отожженым праймером находится в зоне, оптимальной для элонгации цепи ДНК, фермент вполне успевает построить 20 и более нуклеотидов. Время отжига праймеров и денатурации ДНК, выражающихся в образовании и разрушении водородных связей, по разным оценкам измеряемое от Милли - до пикосекунд, также не является лимитирующим. При этом главное предназначение подобной конвекционной ПЦР это не наработка протяженных фрагментов ДНК для их последующего клонирования или секвенирования, а она рассчитана на проведение массовых анализов, где размер ампликонов обычно не бывает большим, а нужна лишь большая пропускная способность метода при проведении диагностических тестов. Так, специфичность ПЦР вполне обеспечивается амплификацией фрагмента размером около 40 пар нуклеотидов с помощью праймеров, отжигающихся встык (на разных цепях) или даже с перекрытием в 1 нуклеотид, поскольку случайное нахождение таких участков нуклеотидной последовательности где-то еще в геноме или транскриптоме помимо детектируемых возможно с ничтожной вероятностью - 8×10-25.
Так как геномов и тем более транскриптомов с подобными размерами или набором молекул РНК не существует то, следовательно, такое событие можно считать практически невероятным.
Таким образом, решаемая задача и ожидаемый результат заключается в ускоренном за несколько минут проведении ПЦР с помощью термоконвекции в приборе особой конструкции, иллюстрируемой фигурами 1-3.
На фиг.1 изображено устройство, состоящее из блока электронного управления (1) и реакционного блока (2-10). Реакционный блок имеет две теплоизолированные прокладкой (3) (например, из фторопласта) нагревательных пластины - нижней (2) и верхней (4), изготовленных из материала с высокой теплопроводностью (например меди, алюминия), с установленными на них элементами Пельтье (6, 7). Нижняя нагревательная пластина (2) более детально показана на фиг.2 и представляет собой диск с радиально расположенными на ней лепестками, имеющий углубления, служащие для позиционирования пробирок (5) и обеспечивающие локальный нагрев боковых стенок пробирок около ее дна для осуществления в этой зоне денатурации ДНК. Верхняя нагревательная пластина (4), более детально представленная на фиг.3, имеет форму диска с радиально расположенными на ней лепестками, повторяющими конусную форму пробирок с целью обеспечения плотного контакта, и подведения нужной температуры к внешним стенкам пробирок с противоположной стороны от места подвода температуры денатурации для обеспечения внутри пробирок в верхней зоне реакционной смеси температуры отжига, характерного для тех или иных праймеров. Радиаторы (8, 9) осуществляют отвод тепла от элементов Пельтье (6, 7) соответственно. Прижимная крышка (10) является одновременно средством для прижима пробирок к нагревательным пластинам (2, 4) и дополнительным радиатором для верхнего элемента Пельтье. Блок электронного управления (1) осуществляет управление элементами Пельтье (6, 7) и контроль температур в реакционном блоке.
При приложении соответствующих температур внутри пробирки возникает наклонный по отношению к направлению действия силы тяжести градиент температуры, запускающий эллипсоподобный конвекционный поток жидкости. Этот поток влечет молекулы ДНК и остальные составляющие реакции через зону с высокой температурой (зона денатурации), через зону средней температуры (нерабочая зона), через зону низкой температуры (зона отжига), вновь через зону средней температуры (зона элонгации) и снова в зону высокой температуры. Таким образом, за несколько секунд совершается один полный цикл вращения конвекционного потока жидкости.

Claims (1)

  1. Устройство для проведения полимеразной цепной реакции, характеризующееся тем, что включает блок электронного управления, реакционный блок, состоящий из нижней пластины, изготовленной из материала с высокой теплопроводностью и представляющей собой диск с радиально расположенными лепестками, имеющими углубления для позиционирования пробирок и обеспечивающими локальный нагрев боковых стенок пробирок около дна для денатурации ДНК, верхней пластины, изготовленной из материала с высокой теплопроводностью и представляющей собой диск с радиально расположенными лепестками, повторяющими конусную форму пробирок для обеспечения плотного контакта и подведения нужной температуры к внешним стенкам пробирок с противоположной стороны от места подвода температуры денатурации для обеспечения в верхней зоне реакционной смеси в пробирках температуры отжига, характерной для праймеров, верхнего и нижнего элементов Пельтье, прокладки, обеспечивающей теплоизоляцию верхней и нижней пластин и фиксацию пробирок, расположенной между этими пластинами, верхнего и нижнего радиаторов и прижимной крышки, являющейся одновременно дополнительным радиатором для верхнего элемента Пельтье.
    Figure 00000001
RU2008112872/22U 2008-04-03 2008-04-03 Конвекционный днк термоциклер RU79672U1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008112872/22U RU79672U1 (ru) 2008-04-03 2008-04-03 Конвекционный днк термоциклер

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008112872/22U RU79672U1 (ru) 2008-04-03 2008-04-03 Конвекционный днк термоциклер

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU79672U1 true RU79672U1 (ru) 2009-01-10

Family

ID=40374743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008112872/22U RU79672U1 (ru) 2008-04-03 2008-04-03 Конвекционный днк термоциклер

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU79672U1 (ru)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200157607A1 (en) Nucleic acid amplification device, nucleic acid amplification method, and chip for nucleic acid amplification
US11634758B2 (en) Nucleic acid amplification and detection apparatus and method
AU660652B2 (en) Device and method for the automated cycling of solutions between two or more temperatures
US9170060B2 (en) Rapid microfluidic thermal cycler for nucleic acid amplification
US8163489B2 (en) Method for a continuous rapid thermal cycle system
Wheeler et al. Under-three minute PCR: probing the limits of fast amplification
KR100552706B1 (ko) 핵산 증폭 방법 및 장치
RU2385940C1 (ru) Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления
WO1998049340A1 (en) Temperature cycling device and method
WO2009111475A2 (en) Heat flow polymerase chain reaction systems and methods
WO2015069743A1 (en) Induction pcr
JP2018515140A (ja) 液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ
RU2413770C2 (ru) Способ проведения полимеразной цепной реакции с помощью конвекции
Li et al. Rapid detection of genetically modified organisms on a continuous-flow polymerase chain reaction microfluidics
RU79672U1 (ru) Конвекционный днк термоциклер
TWI445819B (zh) 熱對流聚合酶連鎖反應之方法及裝置
US20210053059A1 (en) High-speed polymerase chain reaction analysis plate
AU2003291144A1 (en) Sampling method and apparatus for amplification reaction analysis
RU144458U1 (ru) Устройство для проведения конвекционной полимеразной цепной реакции
Madadelahi et al. Designing a Polymerase Chain Reaction Device Working with Radiation and Convection Heat Transfer
Chen et al. A visual multiplex PCR microchip with easy sample loading
RU126704U1 (ru) Устройство для приготовления двойной эмульсии и амплификации во внутренней водной фазе с помощью цифровой пцр специфичных фрагментов нуклеиновых кислот
US20220323964A1 (en) Apparatus for polymerase chain reaction of nucleic acid
KR20180023545A (ko) 비정형 폐렴균 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 pcr 장치 및 비정형 폐렴균 검출 방법
CZ2016837A3 (cs) Zařízení pro amplifikaci DNA pomocí polymerázové řetězové reakce v miniaturním reaktoru

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Utility model has become invalid (non-payment of fees)

Effective date: 20130404