JP2018515140A - 液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ - Google Patents
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Abstract
液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、反応チューブを含む核酸増幅用の反応器具、及び反応チューブを使用するステップを含む核酸を増幅するための方法を開示する。また、反応チューブを含むキット、及びキットの調整における反応チューブの使用も開示する。
Description
本発明は分子生物学の分野、特に核酸増幅の分野におけるものである。特に、本発明は核酸増幅用の反応チューブ、より詳細には液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブに関する。さらに本発明は、本発明の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブを使用するステップを含む、核酸を増幅するための方法にも関する。さらに本発明は反応チューブを含む核酸増幅用の反応器具にも関する。さらに本発明は、反応チューブを含むキット及びキットの調整における反応チューブの使用にも関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡを急速に増幅するための技術であり、各サイクルは３つのステップ：変性、アニーリング、及び伸長を含む。まず、二本鎖ＤＮＡの試料は約９５℃の高温に加熱され、ＤＮＡが２本の相補的な一本鎖ＤＮＡ分子に分けられるように二本鎖間の水素結合が破壊され、このプロセスは高温融解反応と呼ばれる。次いで、相補的塩基対形成の原理に従って一本鎖ＤＮＡがプライマーに結合する約５０〜６５℃まで温度は急速に下げられ、これは低温アニーリング反応と呼ばれる。アニーリング反応の後、伸長反応を可能にするために温度は約７２℃まで急速に上げられ、適切な濃度のマグネシウムイオンでＤＮＡポリメラーゼによって１つのヌクレオチドがプライマーの３’端から順に添加され、新しいＤＮＡを形成する。そのようなプロセスの後、１つの元々の二本鎖ＤＮＡ分子は２つの新しいＤＮＡ分子になり、ＤＮＡ分子の数は２倍になる。各サイクルの後、標的核酸分子の数は２倍になり、これらの新しく形成された二本鎖分子は次のサイクルのための鋳型として使用できる。３０〜４０サイクル後、標的核酸分子の数はほぼ１０９倍まで増加できる。ＰＣＲは、さらなる分析及び検出のための大量の標的ＤＮＡセグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏで得るための方法である。
現時点では、ＰＣＲのための反応装置は主に、プラスチック製のＰＣＲ反応チューブを加熱するための温度制御された金属ブロックを用い、平衡温度まで金属ブロックを加熱及び冷却することにより、熱が反応チューブからＰＣＲ反応溶液へと伝えられる。この装置の欠点は、反応体積が大きく、すなわち装置が通常大きな体積及び熱容量を有することである。通常、３０サイクルの従来のＰＣＲを完了するためには２〜３時間かかり、ほとんどの時間は加熱及び冷却プロセス、すなわち金属ブロックを平衡温度に到達させ、反応チューブからＰＣＲ反応溶液へと熱を伝えることに費やされ、そのため、速く効率的なＰＣＲを達成することが難しい。
２００２年に、Ｍａｄｈａｖｉ Ｋｒｉｓｈｎａｎらは、底部から最上部まで温度勾配のある閉鎖反応腔を確立するために、上部及び下部領域それぞれに配置された２つの一定温度の熱源を使用し、それにより、ＰＣＲ試薬の対流運動が自然発生的に生じ、ＰＣＲ試薬を異なる温度領域に繰り返し流して増幅を完了する、熱伝導及び熱対流の原理に基づくレイリーベナールＰＣＲ（ＲＢ−ＰＣＲ）と名付けられた方法を報告した。この方法の増幅速度は速く、機器は従来のＰＣＲ機器よりもずっとシンプルであるが、増幅試薬が閉鎖腔全体を満たさなければならず、試料をロードすることが困難となり、漏れ及びコンタミネーションなどの問題が生じる。
台湾大学のＣｈｏｕらは、閉鎖反応腔を特定仕様の開放反応チューブへと変更すること、及びチューブ内の試薬の自然発生的な循環を駆動するためにチューブの底部を加熱し、一定温度の１つの単一熱源を用いて増幅を完了することにより、ＲＢ−ＰＣＲ技術に基づいて改良を行った。この方法はＲＢ−ＰＣＲの漏れ及びコンタミネーションの問題を解決する。
しかし、対流ＰＣＲに基づく現在の増幅方法には共通の欠点、すなわちチューブ内の液体の流路が複雑であるという欠点が存在する。チューブ内の流路は、ほぼ同中心の楕円形態の多層流路である（図１ａ）。この複雑な多層流路は増幅において以下の問題を有する。
１．低い増幅効率：
（ａ）変性効率：図１ａに示すように、鋳型又はアンプリコンの有効な変性は、鋳型又はアンプリコンが鋳型又はアンプリコンに必要とされる変性温度よりも温度が低くない領域Ｄ１を通過する時に起こり得るが、一方、鋳型又はアンプリコンが領域Ｄ１よりも高く位置する領域Ｄ２を通過する時には、有効な変性反応が起こり得ず、全体的に低い変性効率となる。
（ｂ）アニーリング効率：図１ａに示すように、有効なアニーリング反応は、一本鎖鋳型及びプライマーが、鋳型及びプライマーに必要とされるアニーリング温度よりも温度が高くない領域Ａ１を通過する時に起こり得るが、一方、一本鎖鋳型及びプライマーが、領域Ａ１よりも低く位置する領域Ａ２を通過する時には、有効なアニーリング反応が起こり得ず、全体的に低いアニーリング効率となる。
２．増幅の低い特異性：
対流ＰＣＲでは、一定温度でのアニーリングのための場所及び時間がないため、温度場及び流動場を制御することによって、反応チューブの上端の温度が通常プライマーのアニーリング温度よりも低くなるように制御され、プライマーの十分なアニーリングを確実にする。しかし、一本鎖鋳型及び（又は）プライマーが、循環において温度が低すぎる領域を通過する時、アニーリング反応の特異性は低下し、１つのプライマー内若しくは２つのプライマー間、又はプライマーと鋳型（若しくはアンプリコン）の間の非特異的対形成が容易に形成され得、伸長反応が開始すると非特異的増幅産物が形成される。
３．それぞれのチューブにおいて平行する増幅反応間の差が存在し得る：
（ａ）反応の終点における定性的検出に関して、結果は主に増幅効率及び産物構成における差を示す。変性後、上述の２点目に記載したように非特異的増幅産物は、次の回の非特異的増幅において鋳型となり、非特異的増幅は継続的に拡大し、プライマー、酵素、ｄＮＴＰ、及び他の反応成分の利用を正しい増幅と競合するようになり、正しい増幅の阻害及び反応効率の低下をもたらす。しかし、この非特異的反応が起こるかどうか又はいつ起こるかは分からず、この反応の発生率は制御されず、すなわちそのような非特異的増幅が起こる反応チューブ間での増幅効率に関して不一致を引き起こす一定のランダム性がある。非特異的増幅が早い時点で起こる又は発生率が高い反応チューブでは、非特異的増幅が遅い時点で起こる又は発生率が低い反応チューブよりも反応効率が低い。上述の２つの反応チューブでは、非特異的増幅が起きていない反応チューブよりも反応効率が両方とも低い。同様に、非特異的増幅が早い時点で起こる又は発生率が高い反応チューブでは非特異的産物の割合が高く、非特異的増幅が遅い時点で起こる又は発生率が低い反応チューブでは非特異的産物の割合が低いが、一方、非特異的増幅が起きていない反応チューブでは、チューブ内の産物は全て正しい増幅産物である。
（ｂ）リアルタイム定量検出に関して、結果は主に単位時間当たりの増幅効率における差を示す。すなわち、リアルタイム定量検出を行うことができない。１点目及び２点目に上述したように、対流ＰＣＲ反応が開始する時、二本鎖鋳型が変性に有効な領域を通過できるか、又は一本鎖鋳型及びプライマーがアニーリングに有効な領域を通過できるか、及びアニーリング反応の間に非特異的反応が起こるかは分からない。したがって、反応の開始時に、産物構成における差が異なるチューブ間で生じ得る。これらの差は上記３（ａ）に記載した問題をもたらし得るだけでなく、単位時間当たりの異なる反応チューブにおける産物（鋳型）の量の差ももたらし、さらに増幅の対数期に入る時点での差をもたらし、したがって鋳型の定量は従来のリアルタイムモニタリング法によって行うことができない。
１．低い増幅効率：
（ａ）変性効率：図１ａに示すように、鋳型又はアンプリコンの有効な変性は、鋳型又はアンプリコンが鋳型又はアンプリコンに必要とされる変性温度よりも温度が低くない領域Ｄ１を通過する時に起こり得るが、一方、鋳型又はアンプリコンが領域Ｄ１よりも高く位置する領域Ｄ２を通過する時には、有効な変性反応が起こり得ず、全体的に低い変性効率となる。
（ｂ）アニーリング効率：図１ａに示すように、有効なアニーリング反応は、一本鎖鋳型及びプライマーが、鋳型及びプライマーに必要とされるアニーリング温度よりも温度が高くない領域Ａ１を通過する時に起こり得るが、一方、一本鎖鋳型及びプライマーが、領域Ａ１よりも低く位置する領域Ａ２を通過する時には、有効なアニーリング反応が起こり得ず、全体的に低いアニーリング効率となる。
２．増幅の低い特異性：
対流ＰＣＲでは、一定温度でのアニーリングのための場所及び時間がないため、温度場及び流動場を制御することによって、反応チューブの上端の温度が通常プライマーのアニーリング温度よりも低くなるように制御され、プライマーの十分なアニーリングを確実にする。しかし、一本鎖鋳型及び（又は）プライマーが、循環において温度が低すぎる領域を通過する時、アニーリング反応の特異性は低下し、１つのプライマー内若しくは２つのプライマー間、又はプライマーと鋳型（若しくはアンプリコン）の間の非特異的対形成が容易に形成され得、伸長反応が開始すると非特異的増幅産物が形成される。
３．それぞれのチューブにおいて平行する増幅反応間の差が存在し得る：
（ａ）反応の終点における定性的検出に関して、結果は主に増幅効率及び産物構成における差を示す。変性後、上述の２点目に記載したように非特異的増幅産物は、次の回の非特異的増幅において鋳型となり、非特異的増幅は継続的に拡大し、プライマー、酵素、ｄＮＴＰ、及び他の反応成分の利用を正しい増幅と競合するようになり、正しい増幅の阻害及び反応効率の低下をもたらす。しかし、この非特異的反応が起こるかどうか又はいつ起こるかは分からず、この反応の発生率は制御されず、すなわちそのような非特異的増幅が起こる反応チューブ間での増幅効率に関して不一致を引き起こす一定のランダム性がある。非特異的増幅が早い時点で起こる又は発生率が高い反応チューブでは、非特異的増幅が遅い時点で起こる又は発生率が低い反応チューブよりも反応効率が低い。上述の２つの反応チューブでは、非特異的増幅が起きていない反応チューブよりも反応効率が両方とも低い。同様に、非特異的増幅が早い時点で起こる又は発生率が高い反応チューブでは非特異的産物の割合が高く、非特異的増幅が遅い時点で起こる又は発生率が低い反応チューブでは非特異的産物の割合が低いが、一方、非特異的増幅が起きていない反応チューブでは、チューブ内の産物は全て正しい増幅産物である。
（ｂ）リアルタイム定量検出に関して、結果は主に単位時間当たりの増幅効率における差を示す。すなわち、リアルタイム定量検出を行うことができない。１点目及び２点目に上述したように、対流ＰＣＲ反応が開始する時、二本鎖鋳型が変性に有効な領域を通過できるか、又は一本鎖鋳型及びプライマーがアニーリングに有効な領域を通過できるか、及びアニーリング反応の間に非特異的反応が起こるかは分からない。したがって、反応の開始時に、産物構成における差が異なるチューブ間で生じ得る。これらの差は上記３（ａ）に記載した問題をもたらし得るだけでなく、単位時間当たりの異なる反応チューブにおける産物（鋳型）の量の差ももたらし、さらに増幅の対数期に入る時点での差をもたらし、したがって鋳型の定量は従来のリアルタイムモニタリング法によって行うことができない。
本発明の目的は、核酸増幅用の新規な反応チューブ、並びに低い増幅効率、低い特異性、反応チューブ間の大きな差、及び不正確な定量など、現在の対流ＰＣＲにおける問題を解決する核酸増幅方法を提供することである。
本発明の第一の態様は、一端が閉じたチューブ本体を含む核酸増幅用の反応チューブを提供し、前記チューブ本体は貯留領域及び貯留領域の下に位置する核酸増幅領域を含み、ここではインサートが、インサートの上に上部空間を残し、インサートの下に下部空間を残して前記核酸増幅領域に配置される。試薬が反応チューブに注入されると、インサートの物理的障壁効果により、試薬は内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる。
好ましくはインサートはチューブ本体の中心軸に沿って提供され、インサートの両側は核酸増幅領域の内壁に接続されている。インサートは、チューブ本体の中心軸に沿って核酸増幅領域を第一領域と第二領域に分け、第一領域及び第二領域は核酸増幅領域の上部領域及び下部領域を介して接続されている。
好ましくはインサートの下端とチューブ本体の底部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域の高さの１／２より小さい。より好ましくはインサートの下端とチューブ本体の底部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域の高さの１／３より小さい。さらに好ましくはインサートの下端とチューブ本体の底部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、４ｍｍ以下である。
好ましくはインサートの上端と核酸増幅領域の最上部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域の高さの１／２より小さい。より好ましくはインサートの上端と核酸増幅領域の最上部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅ゾーンの高さの１／３より小さい。さらに好ましくはインサートの上端と核酸増幅領域の最上部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、３ｍｍ以下である。
好ましくはチューブ本体の底部はチューブ本体と組み合う底栓によって閉じられる。好ましくはチューブ本体及び底栓は、回転可能なねじ構造、リング状のバヨネット構造、バンプラッチ構造、又は当技術分野で公知の他の密閉接続によって互いに密閉して接続されている。
好ましくはチューブ本体はそれと組み合うチューブカバーをさらに含む。好ましくはチューブ本体及びチューブカバーは、回転可能なねじ構造、リング状のバヨネット構造、バンプラッチ構造、又は当技術分野で公知の他の密閉接続によって互いに密閉して接続されている。
好ましくは核酸増幅領域は３〜１２の高さ／内径比を有する。より好ましくは核酸増幅領域は６〜９の高さ／内径比を有する。
好ましくは核酸増幅領域は３０〜２００μｌの容積を有する。より好ましくは核酸増幅領域は４０〜１５０μｌの容積を有する。
好ましくはチューブ本体及びインサートは耐熱材料製である。例えば耐熱材料は、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、及びポリスルホンから選択される。
さらに、チューブ本体の内壁は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はシリル化剤等によって不動態化することができ、それにより試薬中の核酸及び特定の成分の吸収を減らすことが好ましい。
好ましい実施形態では、核酸増幅領域の内腔は、等しい上部及び下部内径を有する柱状中空構造、又は広い最上部及び狭い底部の断面を有する先細の中空構造若しくは多層台形の中空構造である。核酸の増幅、ＲＮＡ転写、及びリアルタイム検出でのシグナルの獲得は全てこの領域で行われる。
別の好ましい実施形態では、核酸増幅領域は可視的な容積スケールマーキングを備えていてもよい。
本発明の別の態様は、本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブ、及び熱を供給又は除去することができる１つ以上の温度制御装置を含む、核酸増幅用の反応器具を提供し、前記温度制御装置は反応チューブの外側又は内側に配置される。
本発明のさらに別の態様は、本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブを含むキットを提供する。
本発明のさらに別の態様は、本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブを使用するステップ、又は本発明のいずれか１つに記載の核酸増幅用の反応器具を含む、試料中の標的核酸を増幅するための方法を提供する。
好ましくは核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。
好ましくは増幅はＰＣＲ反応又は逆転写反応である。
好ましくは方法は：
１）核酸増幅反応のための試薬を本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブに注入するステップ、
２）振動、遠心分離、又は他の方法によって、試薬を核酸増幅領域に充填し、任意選択により、試薬の表面を不揮発性物質（例えばパラフィン油又は低融点ワックス）によって覆う又はチューブカバーで反応チューブを閉じるステップ、
３）温度制御装置によって反応チューブの特定の部位において熱を供給又は除去し、ＲＮＡ逆転写及び／又はＤＮＡ増幅反応を完了するステップ、
４）任意選択により、核酸増幅の間又は後に増幅産物を検出するステップ
を含む。
１）核酸増幅反応のための試薬を本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブに注入するステップ、
２）振動、遠心分離、又は他の方法によって、試薬を核酸増幅領域に充填し、任意選択により、試薬の表面を不揮発性物質（例えばパラフィン油又は低融点ワックス）によって覆う又はチューブカバーで反応チューブを閉じるステップ、
３）温度制御装置によって反応チューブの特定の部位において熱を供給又は除去し、ＲＮＡ逆転写及び／又はＤＮＡ増幅反応を完了するステップ、
４）任意選択により、核酸増幅の間又は後に増幅産物を検出するステップ
を含む。
本発明は、核酸増幅における本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブ、又は本発明のいずれか１つに記載の核酸増幅用の反応器具の使用も提供する。
本発明は、キットの調整における本発明の第一の態様のいずれか１つに記載の反応チューブの使用も提供し、キットは核酸増幅のために使用される。
本発明では、インサートの物理的障壁効果により、チューブ内の試薬は、外力又は内力によって駆動される動きでインサートの下及び上のみを通過することができ、反応チューブの外側又は内側に配置された１つ以上の温度制御装置を通って、反応チューブ内の特定の領域が加熱され得る。この方法により、変性反応は、循環中の試薬がインサートの下の特定の領域を通過する時に起こることができ、アニーリング反応は、循環中の試薬がインサートの上の領域を通過する時に起こることができる。このような循環路及び温度制御モードは以下の利点を達成することができる：
１．増幅効率の改善：（ａ）変性効率の改善：図１ｂに示すように、インサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの下端へ移動する時、インサート２の下の領域Ｄ１のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は変性反応に必要な温度よりも高い温度に維持することができる。したがって、有効な変性反応は、循環中の試薬が反応チューブのインサート２の下の領域Ｄ１を通過する時に起こり得る；（ｂ）アニーリング効率の改善：図１ｂに示すように、インサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、インサート２の上の領域Ａ１のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は特異的プライマーのアニーリングに望ましい温度に維持することができる。したがって、有効なアニーリング反応は、循環中の試薬が反応チューブのインサート２の上を通過する時に起こり得る。
２．増幅の特異性の保証：図１ｂに示すように、インサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、インサート２の上の領域Ａ１のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は特異的プライマーのアニーリング温度をはるかに下回ることなく、特異的プライマーのアニーリングに望ましい温度に維持することができる。したがって、循環中の試薬がその領域を通過する時、１つのプライマー内若しくは２つのプライマー間、又はプライマーと鋳型（若しくはアンプリコン）の間の非特異的対形成が起こることができず、非特異的増幅をもたらさない。
３．異なるチューブにおける増幅間での一貫性の改善：
（ａ）特異性を増すことによる異なるチューブにおける増幅間の一貫性の改善：上述の２点目に記載したように、プライマー、酵素、ｄＮＴＰ、及び他の反応成分を正しい増幅と競合する非特異的産物のランダムな形成が起こらないため、正しい増幅の効率は非特異的増幅によって影響されず、したがって、単位時間当たりの異なるチューブにおける増幅間の一貫性を改善することができる；（ｂ）増幅効率を上げることによる異なるチューブにおける増幅間の一貫性の改善：対流ＰＣＲが開始すると、反応チューブ内のインサート２の物理的障壁効果及び温度制御装置による制御機能により、チューブ内の全ての二本鎖鋳型が有効な変性のための領域を通過することができ、変性反応を受ける；循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、全ての一本鎖鋳型及びプライマーがアニーリングのための領域を通過することができ、アニーリング反応を受ける。したがって、縦に並んだ循環路による無効なサイクル（すなわち、循環中の試薬が下部位置へ移動する時、変性に望ましい温度の領域を通過せず、及び（／又は）循環中の試薬が上部位置へ移動する時、アニーリングに望ましい温度の領域を通過しない）が起こらず、単位時間当たりの異なるチューブにおける増幅間の一貫性が改善する。（ｃ）増幅間で改善した一貫性により、平行する反応の間の終点での増幅産物の一貫性を改善することができ、したがって平行する反応における単位時間当たりの増幅間の一貫性も改善することができる。したがって、対流ＰＣＲ増幅における最初の鋳型の定量は、リアルタイム蛍光検出によって実現できる。
１．増幅効率の改善：（ａ）変性効率の改善：図１ｂに示すように、インサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの下端へ移動する時、インサート２の下の領域Ｄ１のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は変性反応に必要な温度よりも高い温度に維持することができる。したがって、有効な変性反応は、循環中の試薬が反応チューブのインサート２の下の領域Ｄ１を通過する時に起こり得る；（ｂ）アニーリング効率の改善：図１ｂに示すように、インサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、インサート２の上の領域Ａ１のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は特異的プライマーのアニーリングに望ましい温度に維持することができる。したがって、有効なアニーリング反応は、循環中の試薬が反応チューブのインサート２の上を通過する時に起こり得る。
２．増幅の特異性の保証：図１ｂに示すように、インサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、インサート２の上の領域Ａ１のみを通過することができ、温度制御装置により、その領域は特異的プライマーのアニーリング温度をはるかに下回ることなく、特異的プライマーのアニーリングに望ましい温度に維持することができる。したがって、循環中の試薬がその領域を通過する時、１つのプライマー内若しくは２つのプライマー間、又はプライマーと鋳型（若しくはアンプリコン）の間の非特異的対形成が起こることができず、非特異的増幅をもたらさない。
３．異なるチューブにおける増幅間での一貫性の改善：
（ａ）特異性を増すことによる異なるチューブにおける増幅間の一貫性の改善：上述の２点目に記載したように、プライマー、酵素、ｄＮＴＰ、及び他の反応成分を正しい増幅と競合する非特異的産物のランダムな形成が起こらないため、正しい増幅の効率は非特異的増幅によって影響されず、したがって、単位時間当たりの異なるチューブにおける増幅間の一貫性を改善することができる；（ｂ）増幅効率を上げることによる異なるチューブにおける増幅間の一貫性の改善：対流ＰＣＲが開始すると、反応チューブ内のインサート２の物理的障壁効果及び温度制御装置による制御機能により、チューブ内の全ての二本鎖鋳型が有効な変性のための領域を通過することができ、変性反応を受ける；循環中の試薬が反応チューブの上端へ移動する時、全ての一本鎖鋳型及びプライマーがアニーリングのための領域を通過することができ、アニーリング反応を受ける。したがって、縦に並んだ循環路による無効なサイクル（すなわち、循環中の試薬が下部位置へ移動する時、変性に望ましい温度の領域を通過せず、及び（／又は）循環中の試薬が上部位置へ移動する時、アニーリングに望ましい温度の領域を通過しない）が起こらず、単位時間当たりの異なるチューブにおける増幅間の一貫性が改善する。（ｃ）増幅間で改善した一貫性により、平行する反応の間の終点での増幅産物の一貫性を改善することができ、したがって平行する反応における単位時間当たりの増幅間の一貫性も改善することができる。したがって、対流ＰＣＲ増幅における最初の鋳型の定量は、リアルタイム蛍光検出によって実現できる。
本発明の実施形態を、添付の図面及び実施例を参照して詳細に記載する。しかし、以下の図面及び実施例は本発明の例示のみを意図し、本発明の範囲を制限することを意図しないことは当業者によって理解されるであろう。本発明の様々な目的及び有利な態様は、以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な説明によって当業者に明らかである。
本発明において、本明細書で使用する科学及び技術用語は、特に指定しない限り当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。また、本明細書で使用する分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験手順は、該当する分野で広く使用される日常的な手順である。一方、本発明のより良い理解のため、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。
本明細書で使用する場合、用語「増幅」は、限定はされないが、ＰＣＲ反応、逆転写反応、及びそれらの様々なバリエーション（例えばリアルタイムＰＣＲ反応）を含む、ＲＮＡ又はＤＮＡからＤＮＡを調製する任意のプロセスを含む、広範な意味で理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。
図１ａは、自然な対流状態の反応チューブ内の循環の動作軌道を示す。反応チューブ内の特定の部分で温度差が発生した場合に対流が起こることができる。したがって、反応チューブの空間において、循環軌道は単一ではなく、多層及び多方向の特徴を示す。次いで、この多層循環において、（１）温度が変性に必要な温度よりも低くない領域Ｄ１を通過する時、鋳型又はアンプリコンは有効な変性反応を受けることができるが、一方、領域Ｄ１の上に位置する領域Ｄ２を通過する時、鋳型又はアンプリコンは有効な変性反応を受けることができず、全体的に低い変性効率をもたらす；（２）温度がアニーリングに必要な温度よりも高くない領域Ａ１を通過する時、一本鎖鋳型及びプライマーは有効なアニーリング反応を受けることができるが、一方、領域Ａ１の下に位置する領域Ａ２を通過する時、一本鎖鋳型及びアンプリコンは有効なアニーリング反応を受けることができず、全体的に低いアニーリング効率をもたらす；（３）一本鎖鋳型及び（又は）プライマーが循環において温度が過度に低い領域を通過する時、アニーリングの特異性が低下し、１つのプライマー内若しくは２つのプライマー間、又はプライマーと鋳型（若しくはアンプリコン）の間の非特異的対形成が容易に形成され、伸長反応が開始すると非特異的増幅産物が形成される；（４）変性後、非特異的増幅産物は、次の回の非特異的増幅の鋳型となり、非特異的増幅は継続的に拡大し、プライマー、酵素、ｄＮＴＰ、及び他の反応成分の利用を正しい増幅と競合するようになり、正しい増幅の阻害及び反応効率の低下をもたらす。しかし、この非特異的反応が起こるかどうか又はいつ起こるかは分からず、この反応の発生率は制御されず、すなわち、そのような非特異的増幅が起こる反応チューブ間での増幅効率の不一致を引き起こす一定のランダム性がある；（５）増幅の前記不一致は、リアルタイム定量検出における単位時間当たりの有効な増幅効率の差として現れ、標準曲線を用いる従来の蛍光定量ＰＣＲ法を使用して核酸の鋳型が定量できなくなる。
図１ｂは、一方向性の、比較的集中した循環路、及び自然の対流に基づいて物理的障壁の制御下で形成された規則的な循環軌道を示す。液体循環路を制御することができる反応チューブでは、反応チューブ内のインサート２の物理的障壁効果によって、循環中の試薬が反応チューブの下部領域へ移動する時、インサート２の下の空間のみを通過することができる。温度制御装置により、前記領域は変性反応に必要な温度よりも高い温度に維持することができる。したがって、循環中の試薬が反応チューブのインサート２の下を通過する時に、有効な変性反応が起こり得る。また、反応チューブ内のインサート２の物理的障壁効果により、循環中の試薬が反応チューブの上部領域へ移動する時、インサート２の上の空間のみを通過することができ、温度制御装置により、前記領域は特異的プライマーのアニーリングに必要な温度に維持することができる。したがって、循環中の試薬が反応チューブ内のインサート２の上を通過する時に、有効なアニーリング反応が起こり得る。
上述の方法の実行に関して図２ａ、２ｂ、２ｃ、及び２ｄを参照して、本発明はまず、一端が閉じたチューブ本体１を含む、液体循環路を制御することができる核酸増幅のための実行可能な反応チューブの好ましい実施形態を提供し、前記チューブ本体１は貯留領域４及び貯留領域の下に位置する核酸増幅領域３を含み、インサート２が、インサートの上に上部空間を残し、インサートの下に下部空間を残して前記核酸増幅領域３に配置される。試薬が反応チューブに注入されると、インサートの物理的障壁効果により、試薬は内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる。
好ましくはインサート２はチューブ本体１の中心軸に沿って提供され、インサートの両側ａ及びｂは核酸増幅領域の内壁に接続されている。さらに好ましくはインサートのａ及びｂ側は核酸増幅領域３の内壁に密閉して接続されている。インサート２は、チューブ本体１の中心軸に沿って核酸増幅領域３を第一領域３−１と第二領域３−２に分け、第一領域３−１及び第二領域３−２は核酸増幅領域３の上部領域３−Ａ及び下部領域３−Ｂを介して接続されている。
好ましくはインサート２の下端ｄとチューブ本体１の底部の間の距離（すなわち核酸増幅領域３の下部領域３−Ｂの高さ）は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域３の高さの１／２より小さい。より好ましくはインサート２の下端ｄとチューブ本体１の底部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域３の高さの１／３より小さい。さらに好ましくはインサート２の下端ｄとチューブ本体１の底部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、４ｍｍ以下である。
好ましくはインサート２の上端ｃと核酸増幅領域３の最上部の間の距離（すなわち核酸増幅領域３の上部領域３−Ａの高さ）は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域３の高さの１／２より小さい。より好ましくはインサート２の上端ｃと核酸増幅領域３の最上部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域３の高さの１／３より小さい。さらに好ましくはインサート２の上端ｃと核酸増幅領域３の最上部の間の距離は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、３ｍｍ以下である。
好ましくはチューブ本体１の底部はチューブ本体１と組み合う底栓１−１によって閉じられる。例えばチューブ本体及び底栓は、回転可能なねじ構造、リング状のバヨネット構造、バンプラッチ構造、又は当技術分野で公知の他の密閉接続によって互いに密閉して接続されている。
好ましくはチューブ本体１はそれと組み合うチューブカバーをさらに含む。チューブ本体１及びチューブカバーは、回転可能なねじ構造、リング状のバヨネット構造、バンプラッチ構造、又は当技術分野で公知の他の密閉接続によって互いに接続されている。
好ましくは核酸増幅領域３は３〜１２の高さ／内径比を有する。より好ましくは核酸増幅領域３は６〜９、例えば７〜８の高さ／直径比を有する。核酸増幅領域３は、内径が１０ｍｍ以下、例えば５ｍｍ以下であり、また内径が貯留領域４の内径より小さいことがさらに好ましい。本発明の前記寸法及び比を有する構造は、反応チューブにおける液体の継続的で安定な対流の自然発生的な形成を効率的に確実に及び促進することができる。本発明では、チューブ本体１の上部部分において大きな内径を有する領域は、貯留領域４として機能することができる。核酸増幅領域３の内径は比較的小さいため、ピペットの先端を底部へと容易に挿入することができず、液体も自然発生的に底部に流れることができない。したがって、反応試薬は貯留領域４に一時的に保存され、次いで貯留領域４内の反応試薬は遠心分離、振動、又は他の方法によって核酸増幅領域３へと導入することができ、増幅反応又は蛍光シグナルの獲得が完了する。さらに、貯留領域４は核酸増幅領域３と比較して大きな直径を有し、したがって、チューブをつかんで持つことが容易であり、オペレーターにとって液体の調整に非常に便利である。
好ましくは核酸増幅領域３は３０〜２００μｌの容積を有する。より好ましくは核酸増幅領域３は４０〜１５０μｌの容積を有する。
さらに、核酸増幅領域３の内腔は、広い最上部及び狭い底部の断面を有する先細の中空構造若しくは多層台形の中空構造を有することができ、核酸の増幅、ＲＮＡ転写、リアルタイム検出でのシグナルの獲得は全てこの領域で行われる。核酸増幅領域３の広い最上部及び狭い底部を有する内腔の利点は、以下の通りである：反応チューブ内の最上部から底部への温度勾配によって試薬の対流が起こる時、試薬は反応チューブの上部部分において広い内径を有する領域に延長された経路を有することができ、すなわちＰＣＲ反応の「伸長」ステップの時間を増やすことができ、長い断片の伸長を促進することができる。もちろん、製造を容易にするため、核酸増幅領域３の内腔は等しい上部及び下部内径を有する柱状中空構造であってもよい。
好ましくはチューブ本体１及びインサート２は耐熱材料製である。例えば、耐熱材料は、ガラス、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、及びポリスルホン（ＰＳＦ）から選択される。
さらに、チューブ本体１の内壁は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、シリル化剤等によって不動態化することができ、それにより反応試薬中の核酸又は特定の成分の吸収を減らすことが好ましい。
上述の反応チューブは、試験する核酸の試料、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、反応バッファー、２価のマグネシウムイオン、非主要成分としてのＰＣＲ添加剤（例えば、ベタイン、ウシ血清アルブミン、ＤＭＳＯ等）、及び試験する核酸配列に特異的に相補的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、並びに任意選択により、蛍光色素又は二本鎖ＤＮＡに結合することができる特異的な蛍光プローブを含有できる。その後、蒸発を防ぐため、低密度の不揮発性物質（例えば、パラフィン油又は様々な低融点ワックス）を使用して試薬の表面を覆う又はチューブカバーを使用して反応チューブを閉じる。
一方、本発明はまた、本発明のいずれか１つに記載の反応チューブ、及び熱を供給又は除去することができる１つ以上の温度制御装置を含む、核酸増幅用の反応器具も提供し、前記温度制御装置は反応チューブの内側又は外側に提供される。温度制御装置は以下の機能を有する：（１）反応チューブ内の反応試薬の自然発生的な循環を駆動するようにレイリーベナール原理に基づいて反応チューブ内の試薬の温度勾配及び密度勾配を確立すること；（２）チューブ内の特定の部位において反応チューブ及び試薬の温度を制御すること；（３）試薬の自然発生的な循環及び温度制御によってポリメラーゼ連鎖反応及び他の核酸増幅反応を完了すること。反応チューブ内の試薬の温度勾配及び密度勾配を確立することができる温度制御装置は当技術分野において周知であり、例えば、発明特許ＣＮ１０３１７３４３４Ａ、ＣＮ１５７１８４９Ａ、及びＣＮ１０１９８３２３６Ａにおいて見出すことができる。
本発明の温度制御装置の好ましい実施形態を図３に示し、好ましくは温度制御装置は、反応チューブの底部及び上部部分に熱を供給又は除去するための上部加熱モジュール４及び下部加熱モジュール５をそれぞれ含み、そのような温度制御により、試薬がインサートの下を流れ、有効な変性反応を確実に受けられるように、変性に好適な温度が液体循環路を制御することができる反応チューブの底部に提供され、有効なＰＣＲ増幅を実現し、アニーリングに好適な温度もまた反応チューブの上部部分に提供され、インサートの上を流れる試薬が有効なアニーリング反応を確実に受けられるようにする。さらに、低い熱伝達係数を有するモジュール６は、上部加熱モジュールと下部加熱モジュールの間に配置され、反応チューブの非直接加熱領域を包む。そうして、領域の外気への曝露によって起こる干渉を避けることができ、多チャンネルモジュールの中心位置と端位置の間の放熱能の差によって起こる異なる反応チューブ間の温度場の分布の差も避けることができる。
好ましくは器具は蛍光シグナルのリアルタイム検出のためのモジュールをさらに含む。モジュールは、励起光源７、フィルター８、及び光検出器９を含み、ミリ秒単位の時間で複数の試料の高速平衡走査法を行うことができる。
本発明は、図２及び３に記載の反応チューブ及び検出装置に限定されず、加熱モード及び反応チューブの形状における変更は全て本発明の範囲内である。
図４は、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブを使用してＤＮＡ鋳型から得た増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。適用において、反応チューブは：試験するＤＮＡ鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、反応バッファー、２価のマグネシウムイオン、非主要成分としてのＰＣＲ添加剤（例えば、ベタイン、ウシ血清アルブミン、ＤＭＳＯ等）、及び試験する核酸配列に特異的に相補的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する。その後、蒸発を防ぐため、低密度の不揮発性物質（例えば、パラフィン油又は様々な低融点ワックス）を使用して試薬の表面を覆う又はチューブカバーを使用して反応チューブを閉じる。増幅の間、反応チューブを加熱装置に置き、反応チューブの底部の外側に位置する加熱モジュールを９５℃に設定し、反応チューブの上部部分の外側に位置する加熱モジュールを６０℃に設定し、反応時間は３０分間に設定する。反応チューブ内の試薬は、温度差の駆動下で継続的に流れ、反応チューブ内のインサートの物理的障壁効果により、インサートの上及び下のみを通過する。試薬はインサートの下を流れる時に変性反応を受け、インサートの上を流れる時にアニーリング反応を受け、次いで、ポリメラーゼ活性のための温度範囲で伸長反応を受けることができる。増幅後、産物５μｌをチューブから取り、アガロースゲル電気泳動にかける。レーン１及びレーン２は、陽性試料の増幅の結果を示し、レーン３及びレーン４は陰性対照（ＤＥＰＣ水）の増幅の結果を示す。結果から分かるように、本発明の反応チューブはＤＮＡ鋳型の増幅を可能にする。
図５は、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブを使用してＲＮＡ鋳型から得た増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ＤＮＡ増幅とは違い、反応チューブは、ＤＮＡ増幅のために必要な上述の作用剤に加えて、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡの合成のための逆転写酵素も含有する。さらに、ＲＮＡ増幅のための加熱モジュールの温度設定も異なる：反応チューブの底部の外側に位置する加熱モジュールの温度をまず６０℃に設定し、２０分間維持し、次いで３０分間９５℃に上げる；反応チューブの上部の外側に位置する加熱モジュールの温度を５０分間６０℃の一定温度に設定する。同様に、増幅後、産物５μｌをチューブから取り、アガロースゲル電気泳動にかける。レーン１及びレーン２は、陽性試料の結果であり、レーン３及びレーン４は陰性対照（ＤＥＰＣ水）の結果である。電気泳動図から分かるように、本発明の反応チューブはＲＮＡ鋳型の増幅も可能にする。
図６は、先の対流ＰＣＲ法と比較して、チューブ間での増幅の一貫性及び特異性が、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブを使用して改善され得ることを示す。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陽性試料（ＣＭＶ ＤＮＡ濃度は１０３コピー／チューブ）から抽出した４つの同一の鋳型試料、並びにＣＭＶ陰性及びＨＢＶ陽性試料（ＨＢＶ ＤＮＡ濃度は１０６コピー／チューブ）から抽出した４つの同一の鋳型試料で、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブ、又は循環制御の機能がない反応チューブを、同じ加熱装置でそれぞれ使用して増幅を行う。本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブにおける増幅の結果を図６ａに示し、循環制御の機能がない反応チューブにおける増幅の結果を図６ｂに示す。レーン１〜４は、ＣＭＶ核酸が陽性の４つの同一の試料の増幅結果を示し、レーン５〜８は対照としてＣＭＶ核酸が陰性でＨＢＶ核酸が陽性の試料の増幅結果である。結果は、平行する本発明の反応チューブにおいて増幅した４つの陽性試料の終点で検出した結果の間の一貫性（図６ａ、レーン１〜４）を示し、循環制御の機能がない反応チューブにおいて増幅した試料の結果の間の一貫性（図６ｂ、レーン１〜４）より著しく優れており、チューブ間の増幅の一貫性が、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブを使用して改善され得ることを示している。さらに、終点で検出される結果は、循環制御の機能がない反応チューブにおいて増幅した試料（図６ｂ、レーン５〜８）と比較して、平行する本発明の反応チューブにおいて増幅した４つの陰性試料における非特異的増幅（図６ａ、レーン５〜８）の著しい減少も示し、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブは増幅の特異性を改善し得ることを示している。
図７は、先の対流ＰＣＲ法と比較して、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブを使用して、増幅率が改善され得ることを示す。増幅はそれぞれ１５分間、２０分間、及び２５分間の３つの群で行う。各群について、１０３コピー／ｍｌの濃度を有するＣＭＶ ＤＮＡの４つの同一の試料及び陰性対照としてＤＥＰＣ水の試料を、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブ、又は循環制御の機能がない反応チューブを同じ加熱装置でそれぞれ使用して平行して増幅する。本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブによって得た増幅結果を図７ａに示し、循環制御の機能がない反応チューブによって得た増幅結果を図７ｂに示す。結果は、本発明の反応チューブで増幅が行われる場合、増幅の２０分後、陽性試料において弱いバンドを観察することができ、２５分後、陽性試料において強いバンドを観察することができるが、一方、循環制御の機能がない反応チューブで増幅が行われる場合、増幅反応の開始後２５分まで陽性試料において弱いバンドを観察することができる。このことは、先の対流ＰＣＲ法と比較して、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブによって増幅効率が改善され得ることを実証する。
図８は、先の対流ＰＣＲ法と比較して、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブによって改善され得る定量検出の正確性を示す。１０６コピー／チューブの濃度を有するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡの陽性試料、１０５コピー／チューブの濃度を有するＣＭＶ ＤＮＡの陽性試料、及びＤＥＰＣ水の陰性試料で、本発明による液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブ、又は循環制御の機能がない反応チューブを同じ加熱装置でそれぞれ使用して増幅を行う。増幅のリアルタイム検出を、ｔａｑｍａｎ加水分解プローブを用いて行う。結果は、本発明の反応チューブによって得た同じ濃度の試料からの結果の再現性が、循環制御の機能がない反応チューブによって得られた再現性よりも明らかに高いことを示す。
ここで、本発明を以下の実施例を参照して記載する（これは例示の目的のためにのみ使用し、本発明を限定することを意図しない）。
特に指定しない限り、本発明において使用する分子生物学実験方法及び免疫測定法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、１９８９年、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年に記載の方法に実質的に従って行い、酵素は製品の製造業者によって推奨される条件下で使用する。実施例は本発明を例示するために使用されるが、請求項のように本発明の範囲を限定することを意図しないことは当業者によって理解される。
特に指定しない限り、本発明において使用する分子生物学実験方法及び免疫測定法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、１９８９年、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年に記載の方法に実質的に従って行い、酵素は製品の製造業者によって推奨される条件下で使用する。実施例は本発明を例示するために使用されるが、請求項のように本発明の範囲を限定することを意図しないことは当業者によって理解される。
（例１）
液体の自然発生的な循環路を制御する反応チューブ
図２ａ、２ｂ、２ｃ、及び２ｄに示すように、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブは、一端が閉じたチューブ本体１を含み、チューブ本体１は貯留領域４及び貯留領域の下に提供される核酸増幅領域３を含み、インサート２が、インサートの上に上部空間を残し、インサート２の下に下部空間を残して核酸増幅領域３に配置される。試薬が反応チューブに注入されると、インサート２の物理的障壁効果により、試薬は内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる。
液体の自然発生的な循環路を制御する反応チューブ
図２ａ、２ｂ、２ｃ、及び２ｄに示すように、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブは、一端が閉じたチューブ本体１を含み、チューブ本体１は貯留領域４及び貯留領域の下に提供される核酸増幅領域３を含み、インサート２が、インサートの上に上部空間を残し、インサート２の下に下部空間を残して核酸増幅領域３に配置される。試薬が反応チューブに注入されると、インサート２の物理的障壁効果により、試薬は内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる。
好ましくはインサート２はチューブ本体１の中心軸に沿って提供され、インサートの両側ａ及びｂは核酸増幅領域３の内壁に接続されている。インサート２は、チューブ本体１の中心軸に沿って核酸増幅領域３を第一領域３−１と第二領域３−２に分け、第一領域３−１及び第二領域３−２は核酸増幅領域３の上部領域３−Ａ及び下部領域３−Ｂを介して接続されている。
好ましくはインサート２の下端ｄとチューブ本体１の底部の間の距離（すなわち核酸増幅領域３の下部部分３−Ｂの高さ）は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域３の高さの１／２より小さく、例えば、核酸増幅領域の高さの１／３より小さく、例えば、４ｍｍ以下である。
好ましくはインサート２の上端ｃと核酸増幅領域３の最上部の間の距離（すなわち核酸増幅領域３の上部領域３−Ａの高さ）は０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域３の高さの１／２より小さく、例えば、核酸増幅領域の高さの１／３より小さく、例えば、３ｍｍ以下である。
好ましくはチューブ本体１の底部はチューブ本体１と組み合う底栓１−１によって閉じられる。好ましくはチューブ本体及び底栓は、回転可能なねじ構造、リング状のバヨネット構造、バンプラッチ構造、又は当技術分野で公知の他の密閉接続によって互いに密閉して接続されている。
好ましくは核酸増幅領域３は３〜１２の高さ／内径比を有する。より好ましくは核酸増幅領域３は６〜９の高さ／内径比を有する。
好ましくは核酸増幅領域３は３０〜２００μｌの容積を有する。より好ましくは核酸増幅領域３は４０〜１５０μｌの容積を有する。
好ましくは核酸増幅領域３の内腔は、広い最上部及び狭い底部の断面を有する先細の中空構造若しくは多層台形の中空構造、又は等しい上部及び下部内径を有する柱状中空構造であってよい。核酸の増幅、ＲＮＡ転写、リアルタイム検出でのシグナルの獲得は全てこの領域で行われる。
チューブ本体１及びインサート２は耐熱材料製である。例えば、耐熱材料は、ガラス、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、及びポリスルホン（ＰＳＦ）から選択される。
さらに、チューブ本体１の内壁は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、シリル化剤等によって不動態化することができ、それにより反応試薬中の核酸又は特定の成分の吸収を減らすことが好ましい。
上述の反応チューブは、試験する核酸の試料、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、反応バッファー、２価のマグネシウムイオン、非主要成分としてのＰＣＲ添加剤（例えば、ベタイン、ウシ血清アルブミン、ＤＭＳＯ等）、及び試験する核酸配列に特異的に相補的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、並びに任意選択により、蛍光色素又は二本鎖ＤＮＡに結合することができる特異的な蛍光プローブを含有できる。その後、蒸発を防ぐため、低密度の不揮発性物質（例えば、パラフィン油又は様々な低融点ワックス）を使用して試薬の表面を覆う又はチューブカバーを使用して反応チューブを閉じる。
（例２）
例１の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブにおけるＤＮＡ鋳型の増幅及び検出
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含む）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器（出願ＣＮ２０１１１０４５６８１１．９を参照）；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルスのＤＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
例１の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブにおけるＤＮＡ鋳型の増幅及び検出
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含む）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器（出願ＣＮ２０１１１０４５６８１１．９を参照）；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルスのＤＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
２．実験方法
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μＬ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μＬにする。
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μＬ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μＬにする。
（２）核酸の増幅：ａ．（１）で調製した増幅試薬を、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブに注入し、パラフィン油１０μｌを滴下添加し、核酸増幅のための領域が、遠心分離、振動、又は他の手段によって増幅試薬で充填されるようにする；ｂ．核酸増幅のための自作機器の底部温度を９５℃に設定し、上部温度を６０℃に設定し、増幅時間を３０分間に設定する。増幅試薬を含有する反応チューブを核酸増幅のための機器に入れ、増幅手順を開始し、手順が完了した後に反応チューブを取り出す。
（３）増幅産物の電気泳動検出：増幅産物５μｌを反応チューブから取り、ローディングバッファー１μｌと混合し、次いで検出のため、３％アガロースゲル電気泳動にかける。
３．実験結果：図４に示すように、レーン１及びレーン２は陽性試料の増幅結果を示し、レーン３及びレーン４は陰性対照（ＤＥＰＣ水）の増幅結果を示す。結果から分かるように、本発明の反応チューブはＤＮＡ鋳型の増幅を可能にすることができ、陰性対照では観察されるバンドがなく、非特異的増幅が起こらないことを示している。
（例３）
例１の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブにおけるＲＮＡ鋳型の増幅及び検出
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含む）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器（出願ＣＮ２０１１１０４５６８１１．９を参照）；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：
ＣＡ１６−ＷＪ−Ｆ６−１：ＣＡＡＧＴＡＹＴＡＣＣＹＡＣＲＧＣＴＧＣＣＡＡ（配列番号３）
ＣＡ１６−ＷＪ−Ｒ６−１：ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＹＣＴＭＧＴＣＴＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号４）
試験鋳型１：コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６ウイルス）のＲＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
例１の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブにおけるＲＮＡ鋳型の増幅及び検出
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含む）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器（出願ＣＮ２０１１１０４５６８１１．９を参照）；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：
ＣＡ１６−ＷＪ−Ｆ６−１：ＣＡＡＧＴＡＹＴＡＣＣＹＡＣＲＧＣＴＧＣＣＡＡ（配列番号３）
ＣＡ１６−ＷＪ−Ｒ６−１：ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＹＣＴＭＧＴＣＴＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号４）
試験鋳型１：コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６ウイルス）のＲＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
２．実験方法
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４Ｕ ＭＭＬＶ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４Ｕ ＭＭＬＶ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（２）核酸の増幅：ａ．（１）で調製した増幅試薬を、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブに注入し、パラフィン油１０μｌを滴下添加し、核酸増幅のための領域が、遠心分離、振動、又は他の手段によって増幅試薬で充填されるようにする；ｂ．機器の底部の加熱モジュールの温度を２０分間６０℃に設定し、次いで３０分間９５℃に設定し、機器の最上部の加熱モジュールの温度を５０分間６０℃の一定温度に設定する。増幅試薬を含有する反応チューブを機器に入れ、増幅手順を開始し、手順が完了した後に反応チューブを取り出す。
（３）増幅産物の電気泳動検出：増幅産物５μｌを反応チューブから取り、ローディングバッファー１μｌと混合し、次いで検出のため、３％アガロースゲル電気泳動にかける。
３．実験結果：図５に示すように、レーン１及びレーン２は陽性試料の増幅結果を示し、レーン３及びレーン４は陰性対照（ＤＥＰＣ水）の増幅結果を示す。結果から分かるように、本発明の反応チューブはＲＮＡ鋳型の増幅を可能にすることができ、陰性対照では観察されるバンドがなく、非特異的増幅が起こらないことを示している。
（例４）
循環制御の機能がある及び機能がない反応チューブにおける増幅間での一貫性及び特異性の比較
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含有する）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ（出願番号２０１１１０３６０３５０．５を参照）、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：
ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルスのＤＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
循環制御の機能がある及び機能がない反応チューブにおける増幅間での一貫性及び特異性の比較
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含有する）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ（出願番号２０１１１０３６０３５０．５を参照）、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：
ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルスのＤＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
２．実験方法
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（２）核酸の増幅：ａ．（１）で調製した増幅試薬を、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブ、又は循環制御の機能がない反応チューブそれぞれに注入する。パラフィン油１０μｌを滴下添加し、核酸増幅のための領域が、遠心分離、振動、又は他の手段によって増幅試薬で充填されるようにする；ｂ．核酸増幅のための自作機器の底部温度を９５℃に設定し、上部温度を６０℃に設定し、増幅時間を３０分間に設定する。増幅試薬を含有する反応チューブを機器に入れ、増幅手順を開始し、手順が完了した後に反応チューブを取り出す。
（３）増幅産物の電気泳動検出：増幅産物５μｌを反応チューブから取り、ローディングバッファー１μｌと混合し、次いで検出のため、３％アガロースゲル電気泳動にかける。
３．実験結果：図６のレーン１〜４は陽性試料の増幅結果を示し、本発明の液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブで増幅した試料からのバンド（図６ａ）は、循環路を制御する機能がない反応チューブで増幅した試料からのバンド（図６ｂ）よりも著しく強い強度を有する。図６のレーン５〜８は、陰性試料の増幅結果を示し、図６ａのレーン５〜８は鮮明な背景にバンドがなく、本発明の液体循環路を制御することができる反応チューブで増幅した試料では、プライマーダイマーが製造されるなどの非特異的増幅がないことを示しているが、一方、循環制御の機能がない反応チューブで増幅した試料ではプライマーダイマーの形成がはっきりと観察される（図６ｂ）。上記の結果は、本発明の液体の自然発生的な循環路を制御することができる反応チューブが、異なるチューブでの増幅の一貫性及び特異性を改善する機能を有することを実証する。
（例５）
循環制御の機能がある及び機能がない反応チューブの増幅効率の比較
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含有する）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ（出願番号２０１１１０３６０３５０．５を参照）、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：
ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルスのＤＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
循環制御の機能がある及び機能がない反応チューブの増幅効率の比較
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油、６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを含有する）
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ（出願番号２０１１１０３６０３５０．５を参照）、ゲル電気泳動機器、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
プライマー：
ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルスのＤＮＡ抽出物、濃度は１０３コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＤＥＰＣ水
２．実験方法
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（２）核酸の増幅：ａ．（１）で調製した増幅試薬を、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブ、及び循環制御の機能がない反応チューブそれぞれに注入する。パラフィン油１０μｌを滴下添加し、核酸増幅のための領域が、遠心分離、振動、又は他の手段によって増幅試薬で充填されるようにする；ｂ．核酸増幅のための自作機器の底部温度を９５℃に設定し、上部温度を６０℃に設定し、増幅時間を１５分間、２０分間、又は２５分間に設定する。増幅試薬を含有する反応チューブを機器に入れ、手順を開始し、手順が完了した後に反応チューブを取り出す。
（３）増幅産物の電気泳動検出：増幅産物５μｌを反応チューブから取り、ローディングバッファー１μｌと混合し、次いで検出のため、３％アガロースゲル電気泳動にかける。
３．実験結果：本発明の液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブで得た増幅結果を図７ａに示し、循環制御の機能がない反応チューブで得た増幅結果を図７ｂに示す。結果は、本発明の反応チューブで増幅を行う場合、増幅の２０分後に陽性試料で弱いバンドを観察することができ、２５分後に陽性試料で強いバンドを観察することができるが、一方、循環制御の機能がない反応チューブで増幅を行う場合、増幅の開始後２５分まで陽性試料で弱いバンドを観察することができる。これは、本発明の反応チューブが、先の対流ＰＣＲ法と比較して増幅の効率を改善できることを実証する。
（例６）
循環制御の機能がある又は機能がない反応チューブでの増幅のリアルタイム蛍光検出の結果の比較
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器及びリアルタイム蛍光検出（出願番号ＣＮ２０１１１０４５６８１１．９を参照）；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ（出願番号２０１１１０３６０３５０．５を参照）
プライマー：
ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
プローブ：ＪｘｂＵＬ５４Ｐ１：ＦＡＭ−ＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧ−ＢＨＱ−１（配列番号５）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルス由来のＤＮＡ抽出物の鋳型、濃度は１０６コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＣＭＶウイルス由来のＤＮＡ抽出物の鋳型、濃度は１０５コピー／ｍＬ
試験鋳型３：ＤＥＰＣ水
循環制御の機能がある又は機能がない反応チューブでの増幅のリアルタイム蛍光検出の結果の比較
１．実験材料
化学試薬：ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、１０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）、ＤＥＰＣ水、パラフィン油
機器及び材料：核酸増幅のための自作機器及びリアルタイム蛍光検出（出願番号ＣＮ２０１１１０４５６８１１．９を参照）；例１の液体の循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ、循環制御の機能がない反応チューブ（出願番号２０１１１０３６０３５０．５を参照）
プライマー：
ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１：ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１）
ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１：ＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号２）
プローブ：ＪｘｂＵＬ５４Ｐ１：ＦＡＭ−ＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧ−ＢＨＱ−１（配列番号５）
試験鋳型１：ＣＭＶウイルス由来のＤＮＡ抽出物の鋳型、濃度は１０６コピー／ｍＬ
試験鋳型２：ＣＭＶウイルス由来のＤＮＡ抽出物の鋳型、濃度は１０５コピー／ｍＬ
試験鋳型３：ＤＥＰＣ水
２．実験方法
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、０．２μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｐ１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（１）増幅試薬の調整：３．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬ １０×Ｆａｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ）、１Ｕ ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｆ１、０．４μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｒ１１、０．２μＬ １０μＭ ＪｘｂＵＬ５４Ｐ１、５μｌ試験鋳型；及びＤＥＰＣ水を使用して総容積を４０μｌにする。
（２）核酸の増幅：ａ．（１）で調製した増幅試薬を、液体の循環路を制御することができる本発明の核酸増幅用の反応チューブ、及び循環制御の機能がない反応チューブそれぞれに注入する。パラフィン油１０μｌを滴下添加し、核酸増幅のための領域が、遠心分離、振動、又は他の手段によって増幅試薬で充填されるようにする；ｂ．核酸増幅のための自作機器の底部温度を９５℃に設定し、上部温度を６０℃に設定し、増幅時間を３０分間に設定する。増幅試薬を含有する反応チューブを、核酸増幅及びリアルタイム蛍光検出のための自作機器に入れ、手順を開始し、手順が完了した後に反応チューブを取り出し、データを分析する。
３．実験結果：本発明の液体の自然発生的な循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブで得た増幅結果を図８ａに示し、循環制御の機能がない反応チューブで得た増幅結果を図８ｂに示す。結果は、本発明の反応チューブで増幅を行う場合、同じ濃度を有する試料の増幅曲線の再現性が、循環制御機能がない反応チューブより明らかに優れていることを実証し、本発明の液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブが、核酸試料における定量検出を可能にすることができることを示している。
本発明の特定の実施形態を詳細に記載するが、当業者は、開示される全ての教示に従って、様々な改変及び置換がこれらの詳細になされ、これらは本発明の範囲内であることを理解する。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの任意の均等物によって得られる。
Claims (16)
- 一端が閉じたチューブ本体（１）を含む核酸増幅用の反応チューブであって、前記チューブ本体（１）が、貯留領域（４）及び貯留領域の下に位置する核酸増幅領域（３）を含み、インサート（２）が、インサート（２）の上に残される上部空間とインサート（２）の下に残される下部空間とを備える前記核酸増幅領域（３）に配置される、反応チューブ。
- 試薬が反応チューブに注入されると、インサート（２）の物理的障壁効果により、試薬が内力又は外力下で反応チューブ内の上部空間及び下部空間を通る循環路に沿って動くことができる、請求項１に記載の反応チューブ。
- インサート（２）がチューブ本体（１）の中心軸に沿って提供され、インサートの両側（ａ、ｂ）が核酸増幅領域（３）の内壁に接続され、
好ましくはインサート（２）が、チューブ本体（１）の中心軸に沿って核酸増幅領域を第一領域（３−１）と第二領域（３−２）に分け、第一領域（３−１）及び第二領域（３−２）が核酸増幅領域の上部領域（３−Ａ）及び下部領域（３−Ｂ）を介して接続されている、
請求項１に記載の反応チューブ。 - 請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応チューブであって、インサート（２）の下端（ｄ）とチューブ本体の底部の間の距離が０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域（３）の高さの１／２より小さく、
好ましくはインサート（２）の下端（ｄ）とチューブ本体の底部の間の距離が０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域（３）の高さの１／３より小さく、
さらに好ましくはインサート（２）の下端（ｄ）とチューブ本体の底部の間の距離が０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、４ｍｍ以下である、
反応チューブ。 - 請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応チューブであって、インサート（２）の上端（ｃ）と核酸増幅領域（３）の最上部の間の距離が０ｍｍよりも大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域（３）の高さの１／２より小さく、
好ましくはインサート（２）の上端（ｃ）と核酸増幅領域（３）の最上部の間の距離が０ｍｍより大きく（例えば１ｍｍ以上）、核酸増幅領域（３）の高さの１／３より小さく、
さらに好ましくはインサート（２）の上端（ｃ）と核酸増幅領域（３）の最上部の間の距離が０ｍｍより大きく（例えば１ｍｍ以上）、３ｍｍ以下である、
反応チューブ。 - チューブ本体（１）の底部がチューブ本体（１）と組み合う底栓（１−１）によって閉じられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応チューブ。
- チューブ本体（１）がそれと組み合うチューブカバーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応チューブ。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応チューブであって、核酸増幅領域（３）が３〜１２の高さ／内径比を有し、
好ましくは核酸増幅領域（３）が６〜９の高さ／内径比を有する、
反応チューブ。 - 請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応チューブであって、核酸増幅領域（３）が３０〜２００μｌの容積を有し、
好ましくは核酸増幅領域が４０〜１５０μｌの容積を有する、
反応チューブ。 - チューブ本体（１）及びインサート（２）が耐熱材料製であり、例えば、耐熱材料が、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、及びポリスルホンから選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の反応チューブ。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応チューブ、及び熱を供給又は除去することができる１つ以上の温度制御装置を含み、前記温度制御装置が反応チューブの外側又は内側に配置される、核酸増幅用の反応器具。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応チューブを含むキット。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応チューブ又は請求項１１に記載の反応器具を使用するステップを含む、試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、
好ましくは核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであり、
好ましくは増幅がＰＣＲ反応又は逆転写反応である、
方法。 - １）核酸増幅反応のための試薬を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応チューブに注入するステップ、
２）振動、遠心分離、又は他の方法によって、試薬を核酸増幅領域（３）に充填し、任意選択により、試薬の表面を不揮発性物質（例えばパラフィン油又は低融点ワックス）によって覆う又はチューブカバーで反応チューブを閉じるステップ、
３）ＲＮＡ逆転写及び／又はＤＮＡ増幅反応を行うために温度制御装置により反応チューブの特定の部位において熱を供給又は除去するステップ、並びに
４）任意選択により、核酸増幅の間又は後に増幅産物を検出するステップ
を含む、請求項１３に記載の方法。 - 核酸増幅における請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応チューブ又は請求項９に記載の反応器具の使用。
- 核酸増幅のために使用されるキットの調整における請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応チューブの使用。
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