KR102389800B1 - 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭 반응 튜브 - Google Patents

액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭 반응 튜브 Download PDF

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Abstract

액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭 반응 튜브, 및 상기 반응 튜브의 핵산 증폭 반응 장치, 및 상기 반응 튜브를 사용하는 핵산의 증폭 방법을 개시한다. 또한, 상기 반응 튜브를 포함하는 시약 용기, 및 상기 시약 용기의 제조를 위한 상기 반응 튜브의 용도를 개시한다.

Description

액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭 반응 튜브
본 발명은 분자 생물학 분야, 특히 핵산 증폭 분야에 있다. 특히, 본 발명은 핵산 증폭용 반응 튜브, 및 보다 특히 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 본 발명의 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브의 사용을 포함하는 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 상기 반응 튜브를 포함하는 핵산 증폭용 반응 장치에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 상기 반응 튜브를 포함하는 키트, 및 키트의 제조에서 상기 반응 튜브의 용도에 관한 것이다.
폴리머라제 쇄 반응(PCR)은 DNA를 시험관내에서 신속하게 증폭시키는 기술이며, 각 주기는 변성, 어닐링 및 연장의 3 단계를 포함한다. 먼저, 이중가닥 DNA의 샘플을 약 95 ℃의 고온에서 가열하고, 상기 이중가닥 사이의 수소 결합을, DNA가 2개의 상보성 단일가닥 DNA 분자로 분리되도록 파괴하고(상기 과정을 고온 용융 반응이라 칭한다); 이어서 상기 온도를 약 50 내지 65 ℃(여기에서 상기 단일가닥 DNA는 상보성 염기 짝짓기의 원리에 따라 프라이머에 결합한다)로 신속하게 낮추고(이를 저온 어닐링 반응이라 칭한다); 상기 어닐링 반응 후에, 상기 온도를 약 72 ℃로 신속하게 상승시켜 연장 반응을 허용하고, 여기에서 단일 뉴클레오티드가 적합한 마그네슘 이온 농도에서 DNA 폴리머라제에 의해 상기 프라이머의 3' 단부로부터 순차적으로 첨가되어 새로운 DNA를 형성한다. 상기와 같은 과정 후에, 하나의 원래 이중가닥 DNA 분자는 2개의 새로운 DNA 분자로 되며, DNA 분자의 수는 2배가 된다. 각 주기 후에, 표적 핵산 분자의 수는 2배가 되며, 이들 새로 형성된 이중가닥 분자는 다음 주기에 대한 주형으로서 사용될 수 있다. 30 내지 40주기 후에, 표적 핵산 분자의 수는 거의 109 배까지 증가할 수 있다. PCR은 추가적인 분석 및 검출을 위해, 시험관내에서 다수의 표적 DNA 분절을 획득하는 방법이다.
현재, PCR용 반응 장치들은 주로 온도-조절된 금속 블록을 사용하여 플라스틱으로 제조된 PCR 반응 튜브를 가열하며, 상기 금속 블록을 평형 온도로 가열 및 냉각시킴으로써 열이 상기 반응 튜브로부터 PCR 반응 용액으로 이동한다. 상기 장치의 단점은 반응 부피가 크다는 것이다, 즉 상기 장치는 대개 큰 부피 및 열용량을 갖는다. 전형적으로 통상적인 PCR을 30주기로 완료시키는데 2 내지 3시간이 걸리며, 상기 시간의 대부분은 가열 및 냉각 공정에 의해 소비된다, 즉 상기 금속 블록이 평형 온도에 도달되게 하고 열이 상기 반응 튜브로부터 상기 PCR 반응 용액으로 이동하는데 소비된다, 따라서 빠르고 효율적인 PCR을 성취하기가 어렵다.
2002년에, 마다비 크리슈난(Madhavi Krishnan) 등은 열 전도 및 열 대류의 원리를 토대로, 각각 상부 및 하부 영역에 배치된 2개의 항온 열원을 사용하여 기부에서부터 상부로의 온도 구배를 갖는 폐쇄된 반응 공동을 확립시키고, 따라서 PCR 시약의 대류 이동이 자발적으로 발생하며 상기 PCR 시약이 상이한 온도를 갖는 영역들을 통해 반복적으로 흐르게 하여 증폭을 완성시키는 레일리-베나르(Rayleigh-Benard) PCR(RB-PCR)이라 칭하는 방법을 보고하였다. 상기 방법의 증폭 속도는 빠르며, 상기 장비는 전통적인 PCR 장비보다 훨씬 더 간단하지만, 증폭 시약이 상기 전체 폐쇄된 공동을 채워야 하고, 이는 샘플 로딩을 어렵게 하며, 누출 및 오염과 같은 문제를 생성시킨다.
타이완 대학의 쵸우(Chou) 등은 상기 RB-PCR 기술을 토대로, 상기 폐쇄된 반응 공동을 특정한 시방서를 갖는 개방 반응 튜브로 바꾸고 하나의 단일 항온 열원을 사용하여 상기 튜브의 기부를 가열하여 상기 튜브내 시약들의 자발적인 순환을 구동시켜 증폭을 완료시킴으로써 개선을 이루었다. 상기 방법은 RB-PCR의 누출 및 오염 문제를 해결한다.
그러나, 대류성 PCR에 기반한 현행 증폭 방법에 공통적인 결함이 존재한다, 즉 상기 튜브 중 액체의 흐름 경로가 복잡하다. 상기 튜브 중의 흐름 경로는 거의 동심원상 타원 형태의 다층 흐름 경로이다(도 1a). 이러한 복잡한 다층 흐름 경로는 증폭에 있어서 하기의 문제들을 갖는다:
1. 낮은 증폭 효율:
(a) 변성 효율: 도 1a에 나타낸 바와 같이, 주형 또는 증폭절이, 온도가 상기 주형 또는 증폭절에 의해 요구되는 변성 온도 이상인 영역(D1)을 통과할때 상기 주형 또는 증폭절의 유효 변성이 발생할 수 있지만; 상기 주형 또는 증폭절이 영역 (D1)보다 더 높게 위치한 영역(D21)를 통과할때는 유효 변성 반응이 발생할 수 없어서, 낮은 전체 변성 효율을 생성시킨다;
(b) 어닐링 효율: 도 1a에 나타낸 바와 같이, 단일가닥 주형 및 프라이머가, 온도가 상기 주형 및 프라이머에 의해 요구되는 어닐링 온도 이하인 영역(A1)을 통과할때 유효 어닐링 반응이 발생할 수 있지만; 상기 단일가닥 주형 및 프라이머가 영역(A1)보다 더 낮게 위치한 영역(A2)을 통과할때는 유효 어닐링 반응이 발생할 수 없어서, 낮은 전체 어닐링 효율을 생성시킨다.
2. 불충분한 증폭 특이성:
대류 PCR에서, 항온으로 어닐링하기 위한 면적 및 기간의 부족으로 인해, 반응 튜브의 상단부의 온도를 일반적으로는, 온도장 및 유동장을 조절함으로써 상기 프라이머의 어닐링 온도보다 낮게 조절하여 프라이머의 충분한 어닐링을 보장한다. 그러나, 상기 단일가닥 주형 및(또는) 프라이머가, 순환 중 온도가 너무 낮은 영역을 통과할 때 어닐링 반응의 특이성이 감소하고, 하나의 프라이머내 또는 2개의 프라이머 사이 또는 프라이머와 주형(또는 증폭절) 사이의 비특이적인 짝짓기가 쉽게 형성될 수 있으며, 연장 반응이 시작함에 따라 비특이적인 증폭산물이 형성된다.
3. 각 튜브 중에서 병행 증폭 반응들간에 차이가 존재할 수 있다:
(a) 반응의 종점에서 정성적인 검출에 관하여, 결과는 주로 증폭 효율 및 생성물 구성의 차이를 나타낸다: 변성 후에, 상기에서 언급한 2항에 개시된 바와 같은 비특이적인 증폭산물은 다음 라운드의 비특이적인 증폭에서 주형으로 될 것이며, 따라서 비특이적인 증폭이 연속적으로 확대되고, 프라이머, 효소, dNTP 및 다른 반응 성분들의 유용성에 대해 정확한 증폭과 경쟁하여, 상기 정확한 증폭을 억제하고 반응 효율을 감소시킬 것이다. 그러나, 상기 비특이적인 반응이 발생하는 지의 여부 또는 발생하는 때를 알지 못하며, 상기 반응의 발생비율을 조절하지 못한다, 즉 어느 정도의 무질서도가 존재하며, 이는 상기와 같은 비특이적인 증폭이 발생하는 반응 튜브들간의 증폭 효율에 대한 불일치를 야기할 것이다. 상기 비특이적인 증폭이 보다 이른 시점에서 발생하거나 또는 보다 높은 발생비율을 갖는 반응 튜브에서, 반응 효율은 상기 비특이적인 증폭이 보다 나중의 시점에서 발생하거나 보다 낮은 발생비율을 갖는 반응 튜브에서보다 더 낮을 것이다. 또, 상기에서 언급한 2개의 반응 튜브에서, 반응 효율들은 둘 다 상기 비특이적인 증폭이 발생하지 않은 반응 튜브에서보다 더 낮다. 유사하게, 상기 비특이적인 증폭이 보다 이른 시점에서 발생하거나 또는 보다 높은 발생비율을 갖는 반응 튜브에서 높은 비율의 비특이적인 생성물이 존재하고, 상기 비특이적인 증폭이 보다 나중의 시점에서 발생하거나 보다 낮은 발생비율을 갖는 반응 튜브에서는 낮은 비율의 비특이적인 생성물이 존재하며, 비특이적인 증폭이 발생하지 않은 반응 튜브에서 상기 튜브 중 생성물은 전부 정확한 증폭산물이다.
(b) 실시간 정량적인 검출에 관하여, 결과는 주로 단위시간당 증폭 효율의 차이를 나타낸다: 즉, 실시간 정량적인 검출을 수행할 수 없다. 상기 1 및 2항에 기재된 바와 같이, 대류 PCR 반응을 시작할 때, 이중가닥 주형이 변성에 유효한 영역을 통과할 수 있는지, 또는 단일가닥 주형 및 프라이머가 어닐링에 유효한 영역을 통과할 수 있는지, 및 비특이적인 반응이 상기 어닐링 반응 동안 발생하는지를 알지 못한다. 따라서, 상기 반응의 시작시, 상이한 튜브들간에 생성물 구성의 차이가 발생할 수 있다. 이러한 차이는 상기 3(a)에 기재된 문제를 도출할 수 있을 뿐만 아니라, 단위시간당 상이한 반응 튜브 중의 생성물(주형)의 양의 차이를 도출할 수 있고, 추가로 지수 증폭기에 진입하는 시점의 차이를 발생시키고, 따라서 주형의 정량분석을 전통적인 실시간 모니터링 방법에 의해 수행할 수 없다.
본 발명의 목적은 현행 대류 PCR의 문제, 예를 들어 낮은 증폭 효율, 적은 특이성, 반응 튜브들간의 큰 차이 및 부정확한 정량분석을 해결하기 위해서, 신규의 핵산 증폭용 반응 튜브 및 핵산 증폭 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 태양은, 한쪽 단부가 폐쇄된 튜브 바디를 포함하고 상기 튜브 바디가 수용조 영역 및 상기 수용조 영역 아래에 위치한 핵산 증폭 영역을 포함하는 핵산 증폭용 반응 튜브를 제공하며, 여기에서 인서트가 상기 핵산 증폭 영역에 배치되고, 이때 상기 인서트의 위에 상부 공간이 남아있고 상기 인서트의 아래에 하부 공간이 남아있다. 시약이 상기 반응 튜브내에 주입될 때, 상기 시약은 상기 인서트의 물리적 장벽 효과로 인해 내력 또는 외력하에서 상기 반응 튜브 중의 상부 공간 및 하부 공간을 관통하여 순환 경로를 따라 이동할 수 있다.
바람직하게, 상기 인서트는 상기 튜브 바디의 중심축을 따라 제공되며, 상기 인서트의 양쪽 측면은 핵산 증폭 영역의 내벽에 연결된다. 상기 인서트는 상기 핵산 증폭 영역을 상기 튜브 바디의 중심축을 따라 제1 영역 및 제2 영역으로 분할하며, 상기 제1 영역 및 제2 영역은 상기 핵산 증폭 영역의 상부 영역 및 하부 영역을 통해 연결된다.
바람직하게, 상기 인서트의 하단부와 상기 튜브 바디의 기부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역 높이의 1/2 미만이다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트의 하단부와 상기 튜브 바디의 기부 사이의 거리는 (예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역 높이의 1/3 미만이다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트의 하단부와 상기 튜브 바디의 기부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 4 ㎜ 이하이다.
바람직하게, 상기 인서트의 상단부와 상기 핵산 증폭 영역의 상부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역 높이의 1/2 미만이다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트의 상단부와 상기 핵산 증폭 영역의 상부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 대역 높이의 1/3 미만이다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트의 상단부와 상기 핵산 증폭 영역의 상부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 3 ㎜ 이하이다.
바람직하게, 상기 튜브 바디의 기부는 상기 튜브 바디와 협력하는 기부 플러그에 의해 폐쇄된다. 바람직하게, 상기 튜브 바디 및 기부 플러그는 서로, 회전식 나삿니 구조, 또는 고리형 소켓쇠 구조, 또는 범프 걸쇠 구조에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 밀폐식 연결에 의해 밀폐 연결된다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역은 3 내지 12의 높이/내부 직경비를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역은 6 내지 9의 높이/내부 직경비를 갖는다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역은 30 내지 200 ㎕의 부피를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역은 40 내지 150 ㎕의 부피를 갖는다.
바람직하게, 상기 튜브 바디 및 인서트는 내열성 물질로 제조된다. 예를 들어, 상기 내열성 물질은 유리, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에테르설폰 및 폴리설폰 중에서 선택된다.
추가로, 바람직하게는 상기 튜브 바디의 내벽을 소 혈청 알부민(BSA) 또는 실릴화제 등에 의해 패시베이션시켜, 시약 중 핵산 및 몇몇 성분의 흡착을 감소시킬 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 핵산 증폭 영역의 내부 공동은 동일한 상부 및 하부 내부 직경을 갖는 원주모양 중공 구조를 갖거나, 또는 넓은 상부 및 좁은 기부의 횡단면을 갖는, 점점 가늘어지는 중공 구조 또는 다층 사다리꼴 중공 구조를 갖는다. 핵산의 증폭, RNA 전사, 및 실시간 검출에서 신호의 포착은 모두 상기 영역에서 수행된다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산 증폭 영역에 가시적인 부피 눈금 표시를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 첫 번째 태양 중 어느 하나에 따른 반응 튜브 및 열을 제공하거나 제거할 수 있는 하나 이상의 온도 조절기를 포함하고, 상기 온도 조절기가 상기 반응 튜브의 외부 또는 내부에 배열되는 핵산 증폭용 반응 장치를 제공한다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양은 본 발명의 첫 번째 태양 중 어느 하나에 따른 반응 튜브를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양은 샘플 중의 표적 핵산을 증폭시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 첫 번째 태양 중 어느 하나에 따른 반응 튜브 또는 본 발명 중 어느 하나에 따른 핵산 증폭용 반응 장치를 사용함을 포함한다.
바람직하게, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
바람직하게, 상기 증폭은 PCR 반응 또는 역전사 반응이다.
바람직하게, 상기 방법은
1) 핵산 증폭 반응용 시약을 본 발명의 첫 번째 태양 중 어느 하나에 따른 반응 튜브에 주입하고;
2) 진동, 원심분리 또는 다른 방식에 의해 핵산 증폭 영역내로 상기 시약을 충전시키고; 임의로 상기 시약의 표면을 비휘발성 물질(예를 들어 파라핀 오일 또는 저융점 왁스)로 덮거나 또는 상기 반응 튜브를 튜브 뚜껑으로 닫고;
3) 상기 반응 튜브의 특정한 위치에서 온도 조절기에 의해 열을 제공하거나 제거하여 RNA 역전사 및/또는 DNA 증폭 반응을 완성시키고;
4) 임의로, 핵산 증폭 도중 또는 상기 증폭 후에 증폭산물을 검출하는
단계들을 포함한다.
본 발명은 또한 핵산 증폭에서 본 발명의 첫 번째 태양 중 어느 하나에 따른 반응 튜브 또는 본 발명 중 어느 하나에 따른 핵산 증폭용 반응 장치의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 키트의 제조에서 본 발명의 첫 번째 태양 중 어느 하나에 따른 반응 튜브의 용도를 제공하며, 상기 키트는 핵산 증폭에 사용된다.
본 발명에서, 상기 인서트의 물리적 장벽 효과로 인해 상기 튜브 중의 시약은 외력 또는 내력에 의해 구동된 이동시 오직 상기 인서트의 위아래로만 통과할 수 있을 뿐이며; 상기 반응 튜브의 외부 또는 내부에 배열된 하나 이상의 온도 조절기를 통해 상기 반응 튜브 중의 특정한 영역이 가열될 수 있다. 상기 방식에 의해, 순환 중인 시약이 상기 인서트 아래의 어떤 영역을 통과할 때 변성 반응이 발생할 수 있으며, 상기 순환 중인 시약이 상기 인서트 위의 영역을 통과할 때 어닐링 반응이 발생할 수 있다. 상기와 같은 순환 경로 및 온도 조절 방식은 하기의 이점들을 성취할 수 있다:
1. 증폭 효율 개선: (a) 변성 효율 개선: 도 1b에 나타낸 바와 같이, 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해, 순환 중인 시약이 반응 튜브의 하단부로 이동할 때 상기는 오직 인서트(2) 아래의 영역(D1)만을 통과할 수 있을 뿐이며, 온도 조절기에 의해 상기 영역은 변성 반응에 필요한 온도보다 더 높은 온도에서 유지될 수 있다. 따라서, 상기 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브의 인서트(2) 아래 영역(D1)을 통과할 때 유효한 변성 반응이 발생할 수 있다; (b) 어닐링 효율 개선: 도 1b에 나타낸 바와 같이, 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해, 순환 중인 시약이 반응 튜브의 상단부로 이동할 때 상기는 오직 인서트(2) 위의 영역(A1)만을 통과할 수 있을 뿐이며, 온도 조절기에 의해 상기 영역은 특정한 프라이머의 어닐링에 필요한 온도에서 유지될 수 있다. 따라서, 상기 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브의 인서트(2) 위를 통과할 때 유효한 어닐링 반응이 발생할 수 있다.
2. 증폭 특이성 보장: 도 1b에 나타낸 바와 같이, 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해, 순환 중인 시약이 반응 튜브의 상단부로 이동할 때 상기는 오직 인서트(2) 위의 영역(A1)만을 통과할 수 있을 뿐이며, 온도 조절기에 의해 상기 영역은 특정한 프라이머의 어닐링 온도 훨씬 아래가 아닌 상기 특정한 프라이머의 어닐링에 필요한 온도에서 유지될 수 있다. 따라서, 상기 순환 중인 시약이 상기 영역을 통과할 때, 하나의 프라이머내 또는 2개의 프라이머 사이, 또는 상기 프라이머와 주형(또는 증폭절) 사이의 비특이적인 짝짓기가 발생할 수 없어서 비특이적인 증폭이 발생될 수 없다.
3. 상이한 튜브 중의 증폭들간의 일관성 개선:
(a) 특이성 증가에 의한 상이한 튜브 중의 증폭들간의 일관성 개선: 상기에 언급한 2항에 기재된 바와 같이, 프라이머, 효소, dNTP 및 다른 반응 성분들에 대해 정확한 증폭과 경쟁하는 비특이적인 생성물의 무작위 형성이 발생하지 않을 것이기 때문에, 정확한 증폭의 효율은 비특이적인 증폭에 의해 영향을 받지 않을 것이고, 따라서 단위시간당 상이한 튜브 중의 증폭들간의 일관성이 개선될 수 있다; (b) 증폭 효율의 증가에 의한 상이한 튜브 중의 증폭들간의 일관성 개선: 대류 PCR이 시작될 때, 상기 반응 튜브 중의 인서트(2)의 물리적 장벽 효과 및 온도 조절기에 의한 조절 기능으로 인해, 상기 튜브 중의 모든 이중가닥 주형들은 유효 변성 영역을 통과하여 변성 반응을 겪을 수 있으며; 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브의 상단부로 이동할 때, 단일가닥 주형 및 프라이머는 모두 어닐링을 위한 영역을 통과하여 어닐링 반응을 겪을 수 있다. 따라서, 직렬 순환 경로로 인한 효력없는 주기(즉 상기 순환 중인 시약이 하부 위치로 이동할 때, 상기는 변성에 목적하는 온도에서 상기 영역을 통과하지 못하고(/못하거나) 상기 순환 중인 시약이 상부 위치로 이동할 때, 상기는 어닐링에 목적하는 온도에서 상기 영역을 통과하지 못한다)는 발생하지 않을 것이며, 따라서 단위시간당 상이한 튜브 중의 증폭들간의 일관성이 개선될 것이다. (c) 상기 증폭들간의 개선된 일관성으로 인해, 종점에서 나란한 반응들간에 상기 증폭산물의 일관성이 개선될 수 있으며, 따라서 나란한 반응들에서 단위시간당 증폭간에 일관성이 또한 개선될 수 있다. 따라서, 대류 PCR 증폭에서 초기 주형의 정량분석을 실시간 형광 검출에 의해 실현할 수 있다.
본 발명의 실시태양을 첨부되는 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 기재할 것이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 하기의 도면 및 실시예가 단지 본 발명을 예시하고자 할 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 알 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 태양들은 하기 도면의 상세한 설명 및 바람직한 실시태양에 따라, 당해 분야의 숙련가들에게 자명하다.
도 1a는 자연적인 대류 상태에서의 순환 궤적을 도시하고;
도 1b는 본 발명의 반응 튜브에 의해 조절되는 액체의 순환 궤적을 도시하고;
도 2a는 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브의 정면도이고;
도 2b는 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브의 측면도이고;
도 2c는 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브의 정면 분해도이고;
도 2d는 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브의 상면도이고;
도 3은 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브의 가열 및 형광 검출용 장치를 예시하는 도해를 도시하고;
도 4는 본 발명의 반응 튜브를 사용함으로써 DNA 주형으로부터 수득한 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 도시하고;
도 5는 본 발명의 반응 튜브를 사용함으로써 RNA 주형으로부터 수득한 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 도시하고;
도 6a는 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브를 사용함으로써 수득한 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 도시하고;
도 6b는 순환 조절 기능 없는 반응 튜브를 사용함으로써 수득한 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 도시하고;
도 7a는 상이한 증폭 시간 동안 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브를 사용함으로써 수득한 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 도시하고;
도 7b는 상이한 증폭 시간 동안 순환 조절 기능 없는 반응 튜브를 사용함으로써 수득한 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 도시하고;
도 8a는 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브에서 핵산 증폭의 실시간 형광 검출의 결과를 도시하고;
도 8b는 순환 조절 기능 없는 반응 튜브에서 핵산 증폭의 실시간 형광 검출의 결과를 도시한다.
본 발명에서, 본 명세서에 사용된 과학기술 용어들은 달리 명시되지 않는 한 당해 분야의 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에 사용된 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험 과정은 상응하는 분야에 널리 사용되는 통상적인 과정이다. 한편, 본 발명의 보다 양호한 이해를 위해서, 관련된 용어의 정의 및 설명을 하기에 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭"이란 용어는 RNA로부터의 DNA 또는 DNA의 임의의 제조 공정, 비제한적으로 PCR 반응, 역전사 반응 및 그의 다양한 변화(예를 들어 실시간 PCR 반응)를 포함하는 넓은 의미로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산"이란 용어는 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA)을 포함한다.
도 1a는 자연적인 대류 상태에서 반응 튜브 중의 순환 이동 궤적을 도시한다. 대류는 상기 반응 튜브내 특정한 섹션에서 온도 차이가 발생하는 경우 발생한다. 따라서, 상기 반응 튜브의 공간에서 순환 궤적은 단일하지 않고, 다층 또는 다-방향 특징을 나타낸다. 이때, 상기 다층 순환에서 (1) 주형 또는 증폭절은 온도가 변성에 필요한 온도 이상인 영역(D1)을 통과할 때 유효 변성 반응을 겪을 수 있지만; 주형 또는 증폭절이 영역(D1) 위에 위치한 영역(D2)를 통과할때는 유효 변성 반응을 겪을 수 없어서, 낮은 전체 변성 효율을 생성시킨다; (2) 단일가닥 주형 및 프라이머는 온도가 어닐링에 필요한 온도 이하인 영역(A1)을 통과할때 유효 어닐링 반응을 겪을 수 있지만; 단일가닥 주형 및 증폭절이 영역(A1) 아래에 위치한 영역(A2)를 통과할때는 유효 어닐링 반응을 겪을 수 없어서, 낮은 전체 어닐링 효율을 생성시킨다; (3) 단일가닥 주형 및(또는) 프라이머가, 순환 중 온도가 과도하게 낮은 영역을 통과할 때 어닐링의 특이성은 감소하고, 하나의 프라이머내 또는 2개의 프라이머 사이 또는 프라이머와 주형(또는 증폭절) 사이의 비특이적인 짝짓기가 쉽게 형성될 수 있으며, 연장 반응이 시작함에 따라 비특이적인 증폭산물이 형성된다; (4) 변성 후에, 상기 비특이적인 증폭산물은 다음 라운드의 비특이적인 증폭에서 주형으로 되며, 따라서 상기 비특이적인 증폭이 연속적으로 확대되고, 프라이머, 효소, dNTP 및 다른 반응 성분들의 유용성에 대해 정확한 증폭과 경쟁하여, 상기 정확한 증폭을 억제하고 반응 효율을 감소시시킨다. 그러나, 상기 비특이적인 반응이 발생하는 지의 여부 또는 발생하는 때를 알지 못하며, 상기 반응의 발생비율을 조절하지 못한다, 즉 어느 정도의 무질서도가 존재하며, 이는 상기와 같은 비특이적인 증폭이 발생하는 반응 튜브들간에 증폭 효율의 불일치를 도출할 것이다; (5) 상기 증폭의 불일치는 실시간 정량적인 검출에서 단위시간당 유효 증폭 효율의 차이로서 나타날 것이며, 이는 상기 핵산 주형을 표준 곡선과 함께 전통적인 형광 정량적 PCR 방법을 사용함으로써 정량분석할 수 없게 한다.
도 1b는 자연 대류를 기반으로 물리적 장벽의 통제하에서 형성된 단방향의, 비교적 집중되고 규칙적인 환상 궤적의 환상 경로를 도시한다. 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브에서, 상기 반응 튜브내 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해, 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브의 하부 영역으로 이동할 때 상기 시약은 오직 상기 인서트(2) 아래의 공간만을 통과할 수 있다. 또, 온도 조절기에 의해, 상기 영역은 변성 반응에 의해 요구되는 온도보다 높은 온도에서 유지될 수 있다. 따라서, 상기 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브의 인서트(2) 아래를 지날때, 유효 변성 반응이 일어날 수 있다. 또한, 상기 반응 튜브 중의 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해, 상기 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브의 상부 영역으로 이동할 때, 상기 시약은 오직 상기 인서트(2) 위의 공간만을 통과할 수 있으며, 온도 조절기에 의해, 상기 영역은 특정한 프라이머의 어닐링에 의해 요구되는 온도에서 유지될 수 있다. 따라서, 상기 순환 중인 시약이 상기 반응 튜브 중의 인서트(2) 위를 통과할 때 유효 어닐링 반응이 일어날 수 있다.
도 2a, 2b, 2c 및 2d에 관하여, 상술한 방법의 실시를 위해서, 본 발명은 먼저 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 실행 가능한 핵산 증폭용 반응 튜브의 바람직한 실시태양을 제공하며, 상기 튜브는 한쪽 단부가 폐쇄된 튜브 바디(1)를 포함하고 상기 튜브 바디(1)는 수용조 영역(4) 및 상기 수용조 영역 아래에 위치한 핵산 증폭 영역(3)을 포함하며; 인서트(2)가 상기 핵산 증폭 영역(3)에 배치되고, 이때 상기 인서트의 위에 상부 공간이 남아있고 상기 인서트의 아래에 하부 공간이 남아있다. 시약이 상기 반응 튜브내에 주입될 때, 상기 시약은 상기 인서트의 물리적 장벽 효과로 인해 내력 또는 외력하에서 상기 반응 튜브 중의 상부 공간 및 하부 공간을 관통하여 순환 경로를 따라 이동할 수 있다.
바람직하게, 상기 인서트(2)는 상기 튜브 바디(1)의 중심축을 따라 제공되며, 상기 인서트의 양쪽 측면(a) 및 (b)는 핵산 증폭 영역의 내벽에 연결된다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트의 측면(a) 및 (b)는 핵산 증폭 영역(3)의 내벽에 밀폐 연결된다. 상기 인서트(2)는 상기 핵산 증폭 영역(3)을 상기 튜브 바디(1)의 중심축을 따라 제1 영역(3-1) 및 제2 영역(3-2)으로 분할하며, 상기 제1 영역(3-1) 및 제2 영역(3-2)은 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 영역(3-A) 및 하부 영역(3-B)을 통해 연결된다.
바람직하게, 상기 인서트(2)의 하단부(d)와 상기 튜브 바디(1)의 기부(즉 상기 핵산 증폭 영역(3)의 하부 영역(3-B)의 높이) 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/2 미만이다. 보다 바람직하게, 상기 인서트(2)의 하단부(d)와 상기 튜브 바디(1)의 기부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/3 미만이다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트(2)의 하단부(d)와 상기 튜브 바디(1)의 기부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 4 ㎜ 이하이다.
바람직하게, 상기 인서트(2)의 상단부(c)와 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부(즉 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 영역(3-A)의 높이) 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/2 미만이다. 보다 바람직하게, 상기 인서트(2)의 상단부(c)와 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/3 미만이다. 더욱 바람직하게, 상기 인서트(2)의 상단부(c)와 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 3 ㎜ 이하이다.
바람직하게, 상기 튜브 바디(1)의 기부는 상기 튜브 바디(1)와 협력하는 기부 플러그(1-1)에 의해 폐쇄된다. 예를 들어, 상기 튜브 바디 및 기부 플러그는 서로, 회전식 나삿니 구조, 또는 고리형 소켓쇠 구조, 또는 범프 걸쇠 구조에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 밀폐식 연결에 의해 밀폐 연결된다.
바람직하게, 상기 튜브 바디(1)는 상기와 협력하는 튜브 뚜껑을 추가로 포함한다. 상기 튜브 바디(1) 및 상기 튜브 뚜껑은 서로, 회전식 나삿니 구조, 또는 고리형 소켓쇠 구조, 또는 범프 걸쇠 구조에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 밀폐식 연결에 의해 연결된다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 3 내지 12의 높이/내부 직경비를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 6 내지 9, 예를 들어 7 내지 8의 높이/직경을 갖는다. 상기 핵산 증폭 영역(3)은 10 ㎜ 이하, 예를 들어 5 ㎜ 이하의 내부 직경을 가지며, 또한 상기 수용조(4)의 내부 직경 미만의 내부 직경을 갖는 것이 추가로 바람직하다. 본 발명의 상기 치수 및 비를 갖는 구조는 상기 반응 튜브 중의 액체의 연속적이고 안정한 대류의 자발적인 형성을 효율적으로 보장하고 촉진할 수 있다. 본 발명에서, 상기 튜브 바디(1)의 상부 부분에 보다 큰 내부 직경을 갖는 영역이 상기 수용조 영역(4)으로서 제공될 수 있다. 상기 핵산 증폭 영역(3)의 내부 직경은 상대적으로 작기 때문에, 피펫 팁을 상기 기부에 쉽게 삽입할 수 없으며, 상기 액체도 또한 상기 기부로 자발적으로 흐를 수 없다. 따라서, 상기 반응 시약은 상기 수용조 영역(4)에 일시적으로 저장될 수 있으며, 이어서 상기 수용조 영역(4) 중의 상기 반응 시약은 원심분리, 진동 또는 다른 방법에 의해 상기 핵산 증폭 영역(3)내로 도입될 수 있고, 여기에서 증폭 반응 또는 형광 신호의 포착이 완료된다. 더욱이, 상기 수용조 영역(4)은 상기 핵산 증폭 영역(3)에 비해 더 큰 직경을 가지며, 따라서 상기 튜브를 붙잡아 유지하기가 보다 용이하여, 액체의 제조에서 작동기에 큰 편리성을 제공한다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 30 내지 200 ㎕의 부피를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 40 내지 150 ㎕의 부피를 갖는다.
더욱이, 상기 핵산 증폭 영역(3)의 내부 공동은 넓은 상부 및 좁은 기부의 횡단면을 갖는, 점점 가늘어지는 중공 구조 또는 다층 사다리꼴 중공 구조를 가질 수 있으며, 핵산의 증폭, RNA 전사, 실시간 검출에서 신호의 포착이 모두 상기 영역에서 수행된다. 상기 핵산 증폭 영역(3)의 넓은 상부 및 좁은 기부를 갖는 내부 공동의 이점은 하기와 같다: 시약의 대류가 상기 반응 튜브내에서 상부로부터 기부로의 온도 구배로 인해 발생할 때, 상기 시약은 상기 반응 튜브의 상부 부분 중의 보다 넓은 내부 직경을 갖는 영역에서 길어진 경로를 가질 수 있다, 즉 PCR 반응에서 "연장" 단계의 기간이 증가할 수 있으며, 이는 긴 단편의 연장을 촉진할 수 있다. 물론, 제조의 용이성을 위해서 상기 핵산 증폭 영역(3)의 내부 공동은 또한 동일한 상부 및 하부 내부 직경을 갖는 원주모양 중공 구조일 수도 있다.
바람직하게, 상기 튜브 바디(1) 및 인서트(2)는 내열성 물질로 제조된다. 예를 들어, 상기 내열성 물질은 유리, 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PE), 폴리에테르설폰(PES) 및 폴리설폰(PSF) 중에서 선택된다.
추가로, 바람직하게는 상기 튜브 바디(1)의 내벽을 소 혈청 알부민(BSA), 실릴화제 등에 의해 패시베이션시켜, 반응시약 중 핵산 또는 몇몇 성분의 흡착을 감소시킬 수 있다.
상기 언급한 반응 튜브는 시험하고자 하는 핵산 샘플, DNA 폴리머라제, 데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시티미딘 트리포스페이트, 반응 완충제, 2가 마그네슘 이온, 비-주성분으로서 PCR 첨가제(예를 들어 베타인, 소혈청 알부민, DMSO 등) 및 상기 시험하고자 하는 핵산 서열에 특이적으로 상보성인 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 임의로 형광 염료 또는 이중가닥 DNA에 결합할 수 있는 특이적인 형광 탐침을 함유할 수 있다. 그 후에, 증발을 방지하기 위해서, 낮은 밀도를 갖는 비휘발성 물질(예를 들어 파라핀 오일 또는 다양한 저융점 왁스)을 사용하여 시약의 표면을 덮거나, 또는 튜브 뚜껑을 사용하여 상기 반응 튜브를 막는다.
한편, 본 발명은 또한, 본 발명의 어느 하나에 따른 반응 튜브 및 열을 제공하거나 제거할 수 있는 하나 이상의 온도 조절기를 포함하고 상기 온도 조절기가 상기 반응 튜브의 외부 또는 내부에 배열되는 핵산 증폭용 반응 장치를 제공한다. 상기 온도 조절기는 하기의 기능을 갖는다: (1) 레일리-베나르 원리를 토대로 상기 반응 튜브 중에 상기 시약에 대한 온도 구배 및 밀도 구배를 확립시켜, 상기 반응 튜브 중의 상기 반응 시약의 자발적인 순환을 구동하고; (2) 상기 반응 튜브 및 상기 튜브 중의 특정 부위에서의 상기 시약의 온도를 조절하고; (3) 폴리머라제 쇄 반응 및 다른 핵산 증폭 반응을, 상기 시약의 자발적인 순환 및 온도 조절을 통해 완성시킨다. 반응 튜브 중에서 시약의 온도 구배 및 밀도 구배를 확립시킬 수 있는 온도 조절기는 당해 분야에 주지되어 있으며 예를 들어 발명 특허 CN103173434A, CN1571849A 및 CN101983236A에서 찾을 수 있다.
본 발명의 온도 조절기의 바람직한 실시태양을 도 3에 나타내며, 바람직하게 상기 온도 조절기는 상기 반응 튜브의 각각의 기부 및 상부 부분에서 열을 제공하거나 제거하기 위한 상부 가열 모듈(4) 및 하부 가열 모듈(5)을 포함하고, 상기와 같은 온도 조절에 의해, 상기 인서트 아래에 흐르는 시약이 유효 변성 반응을 확실히 겪을 수 있도록 하기 위해서, 변성에 적합한 온도를 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 상기 반응 튜브의 기부에 제공하여 유효 PCR 증폭을 실현하시키고; 상기 인서트 위에 흐르는 시약이 유효 어닐링 반응을 확실히 겪을 수 있도록 하기 위해서, 어닐링에 적합한 온도를 상기 반응 튜브의 상부 부분에 또한 제공한다. 추가로, 보다 낮은 열전달 계수를 갖는 모듈(6)을 상기 반응 튜브의 비-직접적인 가열 영역을 둘러싸도록 상기 상부 및 하부 가열 모듈 사이에 배치시킨다. 이와 같이 하여 상기는 외부 공기에의 상기 영역의 노출에 의해 야기되는 간섭을 피할 수 있으며, 또한 다중-채널 모듈의 중심 위치와 테두리 위치간의 열-방사능력의 차이에 의해 야기되는 상이한 반응 튜브간의 온도장 분포의 차이를 피할 수 있다.
바람직하게, 상기 장치는 형광 신호의 실시간 검출을 위한 모듈을 추가로 포함한다. 상기 모듈은 여기 광원(7), 필터(8) 및 광검출기(9)를 포함하며 밀리초 정도의 시간으로 다수 시편의 고속 평형 주사를 수행할 수 있다.
본 발명은 도 2 및 3에 기재된 반응 튜브 및 검출 장치로 제한되지 않으며, 상기 반응 튜브의 가열 방식 및 모양의 변화는 모두 본 발명의 범위내에 있다.
도 4는 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브를 사용함으로써 DNA 주형으로부터 수득된 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 나타낸다. 상기 적용에서, 상기 반응 튜브는 시험하고자 하는 DNA 샘플, DNA 폴리머라제, 데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시티미딘 트리포스페이트, 반응 완충제, 2가 마그네슘 이온, 비-주성분으로서 PCR 첨가제(예를 들어 베타인, 소혈청 알부민, DMSO 등) 및 상기 시험하고자 하는 핵산 서열에 특이적으로 상보성인 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유한다. 그 후에, 증발을 방지하기 위해서, 낮은 밀도를 갖는 비휘발성 물질(예를 들어 파라핀 오일 또는 다양한 저융점 왁스)을 사용하여 시약의 표면을 덮거나, 또는 튜브 뚜껑을 사용하여 상기 반응 튜브를 막는다. 증폭 중에, 상기 반응 튜브를 가열 장치에 넣고, 상기 반응 튜브의 기부 밖에 배치된 가열 모듈을 95 ℃로 설정하고, 상기 반응 튜브의 상부 부분 밖에 배치된 가열 모듈을 60 ℃로 설정하고, 반응 시간을 30분으로 설정한다. 상기 반응 튜브 중의 시약은 온도 차이의 구동하에서 연속적으로 흐를 것이며 상기 반응 튜브 중의 인서트의 물리적 장벽 효과로 인해 상기 인서트의 위와 아래로만 지날 것이다. 또, 상기 시약은 상기 인서트 아래로 흐를 때 변성 반응을 겪을 수 있고, 상기 인서트 위로 흐를 때는 어닐링 반응을 겪고 이어서 폴리머라제 활성을 위한 온도 범위에서 연장 반응을 겪을 수 있다. 증폭 후에, 5 ㎕의 생성물을 상기 튜브로부터 취하여 아가로스 젤 전기영동에 가한다. 레인 1 및 레인 2는 양성 샘플의 증폭 결과를 나타내고, 레인 3 및 레인 4는 음성 대조용(DEPC 수)의 증폭 결과를 나타낸다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 반응 튜브는 DNA 주형의 증폭을 가능하게 한다.
도 5는 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브를 사용함으로써 RNA 주형으로부터 수득된 증폭산물의 아가로스 젤 전기영동의 결과를 나타낸다. DNA 증폭과 달리, 상기 반응 튜브는 상기 DNA 증폭에 필요한 상기 언급한 작용제들 외에, RNA 주형으로부터의 cDNA의 합성을 위한 역전사효소를 또한 함유한다. 더욱이, RNA 증폭용 가열 모듈의 온도 설정도 또한 상이하다: 상기 반응 튜브의 기부 밖에 배치된 가열 모듈의 온도를 먼저 60 ℃로 설정하고, 20분 동안 유지시키고 이어서 30분 동안 95 ℃로 상승시키고; 상기 반응 튜브의 상부 부분 밖에 배치된 가열 모듈의 온도를 50분 동안 60 ℃의 항온으로 설정한다. 유사하게, 증폭 후에, 5 ㎕의 생성물을 상기 튜브로부터 취하여 아가로스 젤 전기영동에 가한다. 레인 1 및 레인 2는 양성 샘플의 결과를 나타내고, 레인 3 및 레인 4는 음성 대조용(DEPC 수)의 증폭 결과를 나타낸다. 상기 전기영동도로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 반응 튜브는 RNA 주형의 증폭을 또한 가능하게 한다.
도 6은 선행의 대류 PCR 방법과 비교하여, 튜브들간의 증폭 일관성 및 특이성을 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브를 사용함으로써 개선시킬 수 있음을 예시한다. 증폭을 거대세포바이러스(CMV)-양성 샘플(CMV DNA 농도는 103 사본/튜브이다)로부터 추출된 4개의 동일한 주형 샘플, 및 CMV-음성 및 HBV-양성 샘플(HBV DNA 농도는 106 사본/튜브이다)로부터 추출된 4개의 동일한 주형 샘플상에서, 각각 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브 또는 동일한 가열 장치를 갖는, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브를 사용함으로써 수행한다. 상기 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브에서의 증폭 결과를 도 6a에 나타내며, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에서의 증폭 결과는 도 6b에 나타낸다. 레인 1 내지 4는 CMV 핵산에 양성인 상기 4개의 동일한 샘플의 증폭 결과를 나타내고, 레인 5 내지 8은 대조용으로서 CMV 핵산에 음성이고 HBV 핵산에 양성인 샘플의 증폭 결과이다. 상기 결과들은 본 발명의 반응 튜브에서 나란히 증폭된 상기 4개의 양성 샘플의 종점에서 검출된 결과들간의 일관성(도 6a, 레인 1 내지 4)이, 상기 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브 중에서 증폭된 샘플의 결과들간의 일관성(도 6b, 레인 1 내지 4)보다 현저하게 더 우수하며, 이는 튜브들간의 증폭 일관성이 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브를 사용함으로써 개선될 수 있음을 암시한다. 추가로, 종점에서 검출된 결과는 또한, 상기 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브 중에서 증폭된 샘플(도 6b, 레인 5 내지 8)에 비해, 본 발명의 반응 튜브에서 나란히 증폭된 상기 4개의 음성 샘플(도 6a, 레인 5 내지 8)의 비특이적인 증폭의 현저한 감소를 나타내며, 이는 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브가 증폭의 특이성을 개선시킬 수 있음을 암시한다.
도 7은 증폭속도를 선행의 대류 PCR 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브를 사용함으로써 개선시킬 수 있음을 예시한다. 증폭을 각각 15분, 20분 및 25분 동안 3개의 그룹상에서 수행한다. 각각의 그룹에 대해서, 103 사본/㎖의 농도를 갖는 CMV DNA의 4개의 동일한 샘플, 및 음성 대조용으로서 DEPC 수의 샘플을, 각각 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브 또는 동일한 가열 장치를 갖는, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브를 사용함으로써 나란히 증폭시킨다. 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브에 의해 획득된 증폭 결과를 도 7a에 나타내고, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 의해 획득된 증폭 결과는 도 7b에 나타낸다. 상기 결과는, 증폭을 본 발명의 반응 튜브로 수행할 때 20분의 증폭 후에 약한 밴드가 양성 샘플에서 관찰될 수 있고, 25분 후에 강한 밴드가 양성 샘플에서 관찰될 수 있는 반면; 증폭을 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브로 수행하는 경우, 증폭 반응의 출발 후 25분 까지 양성 샘플에서 약한 밴드를 관찰할 수 있음을 나타낸다. 이는 상기 증폭 효율을, 선행의 대류 PCR 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브에 의해 개선시킬 수 있음을 입증한다.
도 8은 정량적인 검출의 정확성을 선행의 대류 PCR 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브에 의해 개선시킬 수 있음을 예시한다. 증폭을, 106 사본/튜브의 농도를 갖는 인간 거대세포바이러스(CMV) DNA, 105 사본/튜브의 농도를 갖는 CMV DNA의 양성 샘플, 및 DEPC 수의 음성 샘플상에서, 각각 본 발명에 따른 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브 또는 동일한 가열 장치를 갖는, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브를 사용함으로써 수행한다. 또, 증폭의 실시간 검출을 태크만(taqman) 가수분해 탐침으로 수행한다. 상기 결과는, 본 발명의 반응 튜브에 의해 획득된 동일한 농도를 갖는 샘플들로부터의 결과의 반복성이 상기 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 의해 획득된 경우보다 명백히 더 높음을 나타낸다.
실시예
이제 본 발명을 하기의 실시예들(단지 예시를 목적으로 사용되며 본 발명을 제한하고자 하지 않는다)을 참조하여 기재한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 생물학 실험 방법 및 면역분석을 실질적으로 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 문헌[F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 수행하며; 효소를 제품 제조사에 의해 권장된 조건하에서 사용한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 실시예들이 본 발명을 예시하기 위해 사용되는 것이지, 특허청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 알 것이다.
실시예 1: 액체의 자발적인 순환 경로를 조절하는 반응 튜브
도 2a, 2b, 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 증폭용 반응 튜브는 한쪽 단부가 폐쇄된 튜브 바디(1)를 포함하고 상기 튜브 바디(1)는 수용조 영역(4) 및 상기 수용조 영역 아래에 제공된 핵산 증폭 영역(3)을 포함하며, 인서트(2)가 상기 핵산 증폭 영역(3)에 배치되며, 이때 상기 인서트의 위에 상부 공간이 남아있고 상기 인서트(2)의 아래에 하부 공간이 남아있다. 시약이 상기 반응 튜브내에 주입될 때, 상기 시약은 상기 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해 내력 또는 외력하에서 상기 반응 튜브 중의 상부 공간 및 하부 공간을 관통하여 순환 경로를 따라 이동할 수 있다.
바람직하게, 상기 인서트(2)는 상기 튜브 바디(1)의 중심축을 따라 제공되며, 상기 인서트의 양쪽 측면(a) 및 (b)는 핵산 증폭 영역(3)의 내벽에 연결된다. 상기 인서트(2)는 상기 핵산 증폭 영역(3)을 상기 튜브 바디(1)의 중심축을 따라 제1 영역(3-1) 및 제2 영역(3-2)으로 분할하며, 상기 제1 영역(3-1) 및 제2 영역(3-2)은 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 영역(3-A) 및 하부 영역(3-B)을 통해 연결된다.
바람직하게, 상기 인서트(2)의 하단부(d)와 상기 튜브 바디(1)의 기부(즉 상기 핵산 증폭 영역(3)의 하부 부분(3-B)의 높이) 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/2 미만, 예를 들어 상기 핵산 증폭 영역 높이의 1/3 미만, 예를 들어 4 ㎜ 이하이다.
바람직하게, 상기 인서트(2)의 상단부(c)와 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부(즉 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 영역(3-A)의 높이) 사이의 거리는 0 ㎜ 초과(예를 들어 1 ㎜ 이상) 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/2 미만, 예를 들어 상기 핵산 증폭 영역 높이의 1/3 미만, 예를 들어 3 ㎜ 이하이다.
바람직하게, 상기 튜브 바디(1)의 기부는 상기 튜브 바디(1)와 협력하는 기부 플러그(1-1)에 의해 폐쇄된다. 바람직하게, 상기 튜브 바디 및 기부 플러그는 서로, 회전식 나삿니 구조, 또는 고리형 소켓쇠 구조, 또는 범프 걸쇠 구조에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 밀폐식 연결에 의해 밀폐 연결된다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 3 내지 12의 높이/내부 직경비를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 6 내지 9의 높이/직경을 갖는다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 30 내지 200 ㎕의 부피를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)은 40 내지 150 ㎕의 부피를 갖는다.
바람직하게, 상기 핵산 증폭 영역(3)의 내부 공동은 넓은 상부 및 좁은 기부의 횡단면을 갖는, 점점 가늘어지는 중공 구조 또는 다층 사다리꼴 중공 구조, 또는 동일한 상부 및 하부 내부 직경을 갖는 원주모양 중공 구조일 수 있다. 핵산의 증폭, RNA 전사, 실시간 검출에서 신호의 포착이 모두 상기 영역에서 수행된다.
상기 튜브 바디(1) 및 인서트(2)는 내열성 물질로 제조된다. 예를 들어, 상기 내열성 물질은 유리, 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PE), 폴리에테르설폰(PES) 및 폴리설폰(PSF) 중에서 선택된다.
추가로, 바람직하게는 상기 튜브 바디(1)의 내벽을 소 혈청 알부민(BSA), 실릴화제 등에 의해 패시베이션시켜, 반응시약 중 핵산 또는 몇몇 성분의 흡착을 감소시킬 수 있다.
상기 언급한 반응 튜브는 시험하고자 하는 핵산 샘플, DNA 폴리머라제, 데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시티미딘 트리포스페이트, 반응 완충제, 2가 마그네슘 이온, 비-주성분으로서 PCR 첨가제(예를 들어 베타인, 소혈청 알부민, DMSO 등) 및 상기 시험하고자 하는 핵산 서열에 특이적으로 상보성인 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 임의로 형광 염료 또는 이중가닥 DNA에 결합할 수 있는 특이적인 형광 탐침을 함유할 수 있다. 그 후에, 증발을 방지하기 위해서, 낮은 밀도를 갖는 비휘발성 물질(예를 들어 파라핀 오일 또는 다양한 저융점 왁스)을 사용하여 시약의 표면을 덮거나, 또는 튜브 뚜껑을 사용하여 상기 반응 튜브를 막는다.
실시예 2: 실시예 1의 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브에서 DNA 주형의 증폭 및 검출
1. 실험 물질
화학적 시약: 스피드스타(SpeedSTAR) HS DNA 폴리머라제(타카라(TaKaRa)), 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스)(타카라), dNTP(타카라), DEPC 수, 파라핀 오일, 6xDNA 로딩 완충제(Sybr 그린(Green) 포함)
장비 및 물질: 핵산 증폭용 수제 장비(출원 CN201110456811.9 참조); 실시예 1의 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브, 젤 전기영동 장비, 젤 이미저(바이오 래드(Bio-Rad))
프라이머: JxbUL54F1: GTGCGCCTTGACACTGTAC (서열번호 1)
JxbUL54R11: CGACAAGTACTTTGAGCAGG (서열번호 2)
시험 주형 1: CMV 바이러스의 DNA 추출물, 및 농도는 103 사본/㎖이다
시험 주형 2: DEPC 수
2. 실험 방법:
(1) 증폭 시약의 제조: 3.2 mM dNTP, 4 ㎕ 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스), 1 U 스피드스타 HS DNA 폴리머라제, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54F1, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54R11, 5 ㎕ 시험 주형; 및 DEPC 수를 사용하여 총 40 ㎕의 부피로 만든다.
(2) 핵산의 증폭: a. (1)에서 제조된 증폭 시약을 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 증폭용 반응 튜브에 주입하고, 10 ㎕의 파라핀 오일을 적가하고 핵산 증폭용 영역을 원심분리, 진동 또는 다른 수단에 의해 상기 증폭 시약으로 충전되게 하고; b. 상기 핵산 증폭용 수제 장비의 기부 온도를 95 ℃로 설정하고, 상부 온도를 60 ℃로 설정하고, 증폭 시간을 30분으로 설정한다. 상기 증폭 시약을 함유하는 반응 튜브를 핵산 증폭용 장비에 도입시키고, 증폭 과정을 시작하고, 상기 반응 튜브를 상기 과정이 완료된 후에 꺼낸다.
(3) 증폭산물의 전기영동 검출: 5 ㎕의 증폭산물을 상기 반응 튜브로부터 꺼내고 1 ㎕ 로딩 완충제와 혼합하고, 이어서 검출을 위해 3% 아가로스 젤 전기영동에 가한다.
3. 실험 결과: 도 4에 나타낸 바와 같이, 레인 1 및 레인 2는 양성 샘플의 증폭 결과를 나타내고, 레인 3 및 레인 4는 음성 대조용(DEPC 수)의 증폭 결과를 나타낸다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 반응 튜브는 DNA 주형의 증폭을 가능하게 할 수 있으며; 음성 대조용에서는 밴드가 관찰되지 않고, 이는 비특이적인 증폭이 발생하지 않음을 가리킨다.
실시예 3: 실시예 1의 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브에서 RNA 주형의 증폭 및 검출
1. 실험 물질
화학적 시약: 스피드스타 HS DNA 폴리머라제(타카라), 역전사효소 MMLV(트랜스젠(Transgen)), 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스)(타카라), dNTP(타카라), DEPC 수, 파라핀 오일, 6xDNA 로딩 완충제(Sybr 그린 포함)
장비 및 물질: 핵산 증폭용 수제 장비(출원 CN201110456811.9 참조); 실시예 1의 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브, 젤 전기영동 장비, 젤 이미저(바이오 래드).
프라이머:
CA16-WJ-F6-1: CAAGTAYTACCYACRGCTGCCAA (서열번호 3)
CA16-WJ-R6-1: CAACACACAYCTMGTCTCAATGAG (서열번호 4)
시험 주형 1: 콕삭키바이러스 A16(CA16 바이러스)의 RNA 추출물, 농도는 103 사본/㎖이다
시험 주형 2: DEPC 수
2. 실험 방법:
(1) 증폭 시약의 제조: 3.2 mM dNTP, 4 ㎕ 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스), 1 U 스피드스타 HS DNA 폴리머라제, 0.4 U MMLV, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54F1, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54R11, 5 ㎕ 시험 주형; 및 DEPC 수를 사용하여 총 40 ㎕의 부피로 만든다.
(2) 핵산의 증폭: a. (1)에서 제조된 증폭 시약을 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 증폭용 반응 튜브에 주입하고, 10 ㎕의 파라핀 오일을 적가하고 핵산 증폭용 영역을 원심분리, 진동 또는 다른 수단에 의해 상기 증폭 시약으로 충전되게 하고; b. 상기 장비 기부의 가열 모듈의 온도를 20분 동안 60 ℃로 설정하고, 이어서 30분 동안 95 ℃로 설정하고; 상기 장비 상부의 가열 모듈의 온도를 50분 동안 60 ℃의 항온으로 설정한다. 상기 증폭 시약을 함유하는 반응 튜브를 상기 장비에 도입시키고, 증폭 과정을 시작하고, 상기 반응 튜브를 상기 과정이 완료된 후에 꺼낸다.
(3) 증폭산물의 전기영동 검출: 5 ㎕의 증폭산물을 상기 반응 튜브로부터 꺼내고 1 ㎕ 로딩 완충제와 혼합하고, 이어서 검출을 위해 3% 아가로스 젤 전기영동에 가한다.
3. 실험 결과: 도 5에 나타낸 바와 같이, 레인 1 및 레인 2는 양성 샘플의 증폭 결과를 나타내고, 레인 3 및 레인 4는 음성 대조용(DEPC 수)의 증폭 결과를 나타낸다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 반응 튜브는 RNA 주형의 증폭을 가능하게 할 수 있으며; 음성 대조용에서는 밴드가 관찰되지 않고, 이는 비특이적인 증폭이 발생하지 않음을 가리킨다.
실시예 4: 순환 조절 기능이 있는 반응 튜브 및 상기 기능이 없는 반응 튜브에서 증폭들간의 일관성 및 특이성의 비교
1. 실험 물질
화학적 시약: 스피드스타 HS DNA 폴리머라제(타카라), 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스)(타카라), dNTP(타카라), DEPC 수, 파라핀 오일, 6xDNA 로딩 완충제(Sybr 그린 포함)
장비 및 물질: 핵산 증폭용 수제 장비; 실시예 1의 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브(출원번호 201110360350.5를 참조하시오), 젤 전기영동 장비, 젤 이미저(바이오 래드).
프라이머:
JxbUL54F1: GTGCGCCTTGACACTGTAC (서열번호 1)
JxbUL54R11: CGACAAGTACTTTGAGCAGG (서열번호 2)
시험 주형 1: CMV 바이러스의 DNA 추출물, 및 농도는 103 사본/㎖이다
시험 주형 2: DEPC 수
2. 실험 방법:
(1) 증폭 시약의 제조: 3.2 mM dNTP, 4 ㎕ 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스), 1 U 스피드스타 HS DNA 폴리머라제, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54F1, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54R11, 5 ㎕ 시험 주형; 및 DEPC 수를 사용하여 총 40 ㎕의 부피로 만든다.
(2) 핵산의 증폭: a. (1)에서 제조된 증폭 시약을 각각 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 증폭용 반응 튜브, 또는 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 주입한다. 10 ㎕의 파라핀 오일을 적가하고 핵산 증폭용 영역을 원심분리, 진동 또는 다른 수단에 의해 상기 증폭 시약으로 충전되게 하고; b. 핵산 증폭용 수제 장비의 기부 온도를 95 ℃로 설정하고, 상부 온도를 60 ℃로 설정하고, 증폭 시간을 30분으로 설정한다. 상기 증폭 시약을 함유하는 반응 튜브를 상기 장비에 도입시키고, 증폭 과정을 시작하고, 상기 반응 튜브를 상기 과정이 완료된 후에 꺼낸다.
(3) 증폭산물의 전기영동 검출: 5 ㎕의 증폭산물을 상기 반응 튜브로부터 꺼내고 1 ㎕ 로딩 완충제와 혼합하고, 이어서 검출을 위해 3% 아가로스 젤 전기영동에 가한다.
3. 실험 결과: 도 6의 레인 1 내지 4는 양성 샘플의 증폭 결과를 나타내고, 여기에서 본 발명의 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 핵산 튜브 중에서 증폭된 샘플로부터의 밴드(도 6a)는 순환 경로 조절 기능이 없는 반응 튜브에서 증폭된 샘플로부터의 밴드(도 6b)보다 현저하게 더 강한 강도를 갖는다. 도 6의 레인 5 내지 8은 음성 샘플의 증폭 결과를 나타내고, 여기에서 도 6a의 레인 5 내지 8은 투명 배경상에 밴드를 나타내지 않으며, 이는 프라이머 이량체와 같은 비특이적인 증폭이 본 발명의 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브에서 증폭된 샘플에서 생성되지 않음을 가리키는 반면; 상기 프라이머 이량체의 형성은 상기 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에서 증폭된 샘플에서 분명하게 관찰된다(도 6b). 상기 결과는 본 발명의 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 반응 튜브가 상이한 튜브들에서 증폭의 일관성 및 특이성을 개선시키는 기능을 가짐을 입증한다.
실시예 5: 순환 조절 기능이 있는 반응 튜브 및 상기 기능이 없는 반응 튜브의 증폭 효율의 비교
1. 실험 물질
화학적 시약: 스피드스타 HS DNA 폴리머라제(타카라), 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스)(타카라), dNTP(타카라), DEPC 수, 파라핀 오일, 6xDNA 로딩 완충제(Sybr 그린 포함)
장비 및 물질: 핵산 증폭용 수제 장비; 실시예 1의 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브(출원번호 201110360350.5를 참조하시오), 젤 전기영동 장비, 젤 이미저(바이오 래드).
프라이머:
JxbUL54F1：GTGCGCCTTGACACTGTAC (서열번호 1)
JxbUL54R11：CGACAAGTACTTTGAGCAGG (서열번호 2)
시험 주형 1: CMV 바이러스의 DNA 추출물, 및 농도는 103 사본/㎖이다
시험 주형 2: DEPC 수
2. 실험 방법:
(1) 증폭 시약의 제조: 3.2 mM dNTP, 4 ㎕ 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스), 1 U 스피드스타 HS DNA 폴리머라제, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54F1, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54R11, 5 ㎕ 시험 주형, 및 DEPC 수를 사용하여 총 40 ㎕의 부피로 만든다.
(2) 핵산의 증폭: a. (1)에서 제조된 증폭 시약을 각각 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 증폭용 반응 튜브, 및 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 주입한다. 10 ㎕의 파라핀 오일을 적가하고 핵산 증폭용 영역을 원심분리, 진동 또는 다른 수단에 의해 상기 증폭 시약으로 충전되게 하고; b. 핵산 증폭용 수제 장비의 기부 온도를 95 ℃로 설정하고, 상부 온도를 60 ℃로 설정하고, 증폭 시간을 15분, 20분 또는 25분으로 설정한다. 상기 증폭 시약을 함유하는 반응 튜브를 상기 장비에 도입시키고, 증폭 과정을 시작하고; 상기 반응 튜브를 상기 과정이 완료된 후에 꺼낸다.
(3) 증폭산물의 전기영동 검출: 5 ㎕의 증폭산물을 상기 반응 튜브로부터 꺼내고 1 ㎕ 로딩 완충제와 혼합하고, 이어서 검출을 위해 3% 아가로스 젤 전기영동에 가한다.
3. 실험 결과: 본 발명의 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 핵산 튜브에 의해 획득된 증폭 결과를 도 7a에 나타내고, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 의해 획득된 결과는 도 7b에 나타낸다. 상기 결과는, 증폭을 본 발명의 반응 튜브로 수행하는 경우, 20분의 증폭 후에 양성 샘플에서 약한 밴드가 관찰될 수 있고, 25분 후에, 양성 샘플에서 강한 밴드가 관찰될 수 있는 반면; 증폭을 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브로 수행하는 경우, 증폭 출발 후 25분까지 양성 샘플에서 약한 밴드가 관찰될 수 있음을 나타낸다. 이는 본 발명의 반응 튜브가 선행의 대류 PCR 방법에 비해 증폭 효율을 개선시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 6: 순환 조절 기능이 있는 반응 튜브 또는 상기 기능이 없는 반응 튜브에서 증폭에 대한 실시간 형광 검출 결과의 비교
1. 실험 물질
화학적 시약: 스피드스타 HS DNA 폴리머라제(타카라), 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스)(타카라), dNTP(타카라), DEPC 수, 파라핀 오일
장비 및 물질: 핵산 증폭 및 실시간 형광 검출용 수제 장비(출원번호 CN201110456811.9를 참조하시오); 실시예 1의 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브(출원번호 201110360350.5를 참조하시오)
프라이머:
JxbUL54F1：GTGCGCCTTGACACTGTAC（서열번호 1）
JxbUL54R11：CGACAAGTACTTTGAGCAGG（서열번호 2）
탐침: JxbUL54P1: FAM-AGCCGGCTCCAAGTGCAAG-BHQ-1 (서열번호 5)
시험 주형 1: CMV 바이러스로부터의 DNA 추출물의 주형, 및 농도는 106 사본/㎖이다
시험 주형 2: CMV 바이러스로부터의 DNA 추출물의 주형, 및 농도는 105 사본/㎖이다
시험 주형 3: DEPC 수
2. 실험 방법:
(1) 증폭 시약의 제조: 3.2 mM dNTP, 4 ㎕ 10x고속 완충제 I(Mg2+ 플러스), 1 U 스피드스타 HS DNA 폴리머라제, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54F1, 0.4 ㎕ 10 μM JxbUL54R11, 0.2 ㎕ 10 μM JxbUL54P1, 5 ㎕ 시험 주형, 및 DEPC 수를 사용하여 총 40 ㎕의 부피로 만든다.
(2) 핵산의 증폭: a. (1)에서 제조된 증폭 시약을 각각 액체의 순환 경로를 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 증폭용 반응 튜브, 및 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 주입한다. 10 ㎕의 파라핀 오일을 적가하고 핵산 증폭용 영역을 원심분리, 진동 또는 다른 수단에 의해 상기 증폭 시약으로 충전되게 하고; b. 핵산 증폭용 수제 장비의 기부 온도를 95 ℃로 설정하고, 상부 온도를 60 ℃로 설정하고, 증폭 시간을 30분으로 설정한다. 상기 증폭 시약을 함유하는 반응 튜브를 핵산 증폭 및 실시간 형광 검출용 수제 장비에 도입시키고, 상기 과정을 시작하고; 상기 과정이 완료된 후에 상기 반응 튜브를 꺼내고 데이터를 분석한다.
3. 실험 결과: 본 발명의 액체의 자발적인 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 핵산 튜브에 의해 획득된 증폭 결과를 도 8a에 나타내고, 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브에 의해 획득된 결과는 도 8b에 나타낸다. 상기 결과는, 증폭을 본 발명의 반응 튜브로 수행하는 경우, 동일한 농도를 갖는 샘플들의 증폭 곡선의 반복성이 순환 조절 기능이 없는 반응 튜브보다 명백히 우수하며, 이는 본 발명의 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭용 반응 튜브가 핵산 샘플상에서 정량적인 검출을 가능하게 할 수 있음을 암시한다.
본 발명의 특정한 실시태양들을 상세히 기재하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 개시된 모든 교시에 따라 상기 세부사항에 대해 다양한 변형 및 치환을 수행할 수 있으며, 이는 본 발명의 범위내에 있음을 알 것이다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 균등물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> XIAMEN UNIVERSITY；XIAMEN INNODX BIOTECH CO., LTD <120> REACTION TUBE FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION CAPABLE OF CONTROLLING LIQUID CIRCULATION PATH <130> IEC150041PCT <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtgcgccttg acactgtac 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgacaagtac tttgagcagg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caagtaytac cyacrgctgc caa 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caacacacay ctmgtctcaa tgag 24 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 agccggctcc aagtgcaag 19

Claims (25)

  1. 한쪽 단부가 폐쇄된 튜브 바디(1)를 포함하고 상기 튜브 바디(1)가 수용조 영역(4) 및 상기 수용조 영역 아래에 위치한 핵산 증폭 영역(3)을 포함하는 핵산 증폭용 반응 튜브로, 인서트(2)가 상기 핵산 증폭 영역(3)에 배치되며, 상기 인서트(2)의 위에 상부 공간이 남아있고 상기 인서트(2)의 아래에 하부 공간이 남아있는 반응 튜브.
  2. 제 1 항에 있어서,
    시약이 반응 튜브내에 주입될 때, 상기 시약이 인서트(2)의 물리적 장벽 효과로 인해 내력 또는 외력하에서 상기 반응 튜브 중의 상부 공간 및 하부 공간을 관통하여 순환 경로를 따라 이동할 수 있는 반응 튜브.
  3. 제 1 항에 있어서,
    인서트(2)가 튜브 바디(1)의 중심축을 따라 제공되고, 상기 인서트의 양쪽 측면(a,b)이 핵산 증폭 영역(3)의 내벽에 연결되는, 반응 튜브.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 인서트(2)가 상기 핵산 증폭 영역을 상기 튜브 바디(1)의 중심축을 따라 제1 영역(3-1) 및 제2 영역(3-2)으로 분할하며, 상기 제1 영역(3-1) 및 제2 영역(3-2)이 상기 핵산 증폭 영역의 상부 영역(3-A) 및 하부 영역(3-B)을 통해 연결되는 반응 튜브.
  5. 제 1 항에 있어서,
    인서트(2)의 하단부(d)와 튜브 바디의 기부 사이의 거리가 0 ㎜ 초과 및 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/2 미만인, 반응 튜브.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 인서트(2)의 하단부(d)와 상기 튜브 바디의 기부 사이의 거리가 0 ㎜ 초과 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/3 미만인, 반응 튜브.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 인서트(2)의 하단부(d)와 상기 튜브 바디의 기부 사이의 거리가 0 ㎜ 초과 4 ㎜ 이하인 반응 튜브.
  8. 제 1 항에 있어서,
    인서트(2)의 상단부(c)와 핵산 증폭 영역(3)의 상부 사이의 거리가 0 ㎜ 초과 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/2 미만인, 반응 튜브.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 인서트(2)의 상단부(c)와 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 사이의 거리가 0 ㎜ 초과 및 상기 핵산 증폭 영역(3) 높이의 1/3 미만인, 반응 튜브.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 인서트(2)의 상단부(c)와 상기 핵산 증폭 영역(3)의 상부 사이의 거리가 0 ㎜ 초과 3 ㎜ 이하인 반응 튜브.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 반응 튜브는 하기 중 어느 하나 이상에 의해 특징지어지는, 반응 튜브:
    (ⅰ) 튜브 바디(1)의 기부가 상기 튜브 바디(1)와 협력하는 기부 플러그(1-1)에 의해 폐쇄되는 반응 튜브
    (ⅱ)튜브 바디(1)가 상기 튜브 바디와 협력하는 튜브 뚜껑을 또한 포함하는 반응 튜브.
  12. 제 1 항에 있어서,
    핵산 증폭 영역(3)이 3 내지 12의 높이/내부 직경비를 갖는, 반응 튜브.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 영역(3)이 6 내지 9의 높이/내부 직경비를 갖는 반응 튜브.
  14. 제 1 항에 있어서,
    핵산 증폭 영역(3)이 30 내지 200 ㎕의 부피를 갖는, 반응 튜브.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 영역이 40 내지 150 ㎕의 부피를 갖는 반응 튜브.
  16. 제 1 항에 있어서,
    튜브 바디(1) 및 인서트(2)가 내열성 물질로 제조되는, 반응 튜브.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 내열성 물질이 유리, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에테르설폰 및 폴리설폰 중에서 선택되는 반응 튜브.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 반응 튜브 및 열을 제공하거나 제거할 수 있는 하나 이상의 온도 조절기를 포함하고, 상기 온도 조절기가 상기 반응 튜브의 외부 또는 내부에 배열되는 핵산 증폭용 반응 장치.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 반응 튜브를 포함하는 키트.
  20. 샘플 중의 표적 핵산을 증폭시키는 방법으로, 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 반응 튜브; 또는 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 반응 튜브 및 열을 제공하거나 제거할 수 있는 하나 이상의 온도 조절기를 포함하고, 상기 온도 조절기가 상기 반응 튜브의 외부 또는 내부에 배열되는 핵산 증폭용 반응 장치;를 사용함을 포함하는, 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA 또는 RNA인, 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 증폭이 PCR 반응 또는 역전사 반응인, 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    1) 핵산 증폭 반응용 시약을 반응 튜브에 주입하고;
    2) 진동, 원심분리 또는 다른 방식에 의해 핵산 증폭 영역(3)내로 상기 시약을 충전시키고;
    3) 상기 반응 튜브의 특정한 위치에서 온도 조절기에 의해 열을 제공하거나 제거하여 RNA 역전사 및/또는 DNA 증폭 반응을 수행하는;
    단계들을 포함하며,
    상기 반응튜브는 한쪽 단부가 폐쇄된 튜브 바디(1)를 포함하고 상기 튜브 바디(1)가 수용조 영역(4) 및 상기 수용조 영역 아래에 위치한 핵산 증폭 영역(3)을 포함하는 핵산 증폭용 반응 튜브로, 인서트(2)가 상기 핵산 증폭 영역(3)에 배치되며, 상기 인서트(2)의 위에 상부 공간이 남아있고 상기 인서트(2)의 아래에 하부 공간이 남아있는 반응 튜브 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 2) 단계는 상기 시약의 표면을 비휘발성 물질로 덮거나 또는 상기 반응 튜브를 튜브 뚜껑으로 닫는 단계를 더 포함하는, 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 방법은
    4) 핵산 증폭 도중 또는 상기 증폭 후에 증폭산물을 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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