CN103173434A - 一种在恒温热源下进行聚合酶链式反应的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在恒温热源下进行聚合酶链式反应的方法及装置。更具体地，首先，本发明涉及基于Rayleigh-Benard(雷诺本纳德)原理，对反应试管特定区域提供或移走热量，以建立反应管内试剂自下而上的温度梯度，在反应试剂不均匀受热下自发进行对流，并在流经不同温度区域时发生相应PCR扩增的方法。本发明提供一种实现上述方法的反应及实时荧光检测装置。

Description

一种在恒温热源下进行聚合酶链式反应的方法及装置
技术领域
本发明涉及一种聚合酶链反应方法及装置。更具体地，本发明涉及基于热对流建立液体自下而上的温度梯度的原理，在液体受热自发进行对流，并在流经不同温度区域时发生相应PCR扩增的方法，以及相应的装置。
背景技术：
聚合酶链反应技术(以下简称PCR技术)，是一种体外快速扩增DNA的技术，每个循环包括变性、退火和延伸三个过程，每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍，经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近109倍，PCR是体外大量获得目的DNA片段的方法，便于对核酸分子做进一步的分析和检验。目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，在基础研究中可用于克隆基因，并在此基础上对基因组DNA进行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中，则可以用于传染病的诊断、遗传疾病的检测及产前诊断、法医研究等。美国专利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188号对PCR技术做出了描述。
DNA的扩增在体内是由细胞内有关因子的参与下，双螺旋的DNA分子被解链成2条单链，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物与单链DNA碱基互补配对，形成引物单链DNA复合物；在DNA聚合酶作用下，沿着5’-3’方向，按碱基互补配对原则，在引物3’端开始，逐一将互补的三磷酸脱氧核苷酸接上，最终形成一条新的双链DNA分子。
而DNA分子在体外的PCR扩增模拟了体内的三个步骤：首先，在大约95℃的高温下加热双链DNA样品，双链间的氢键会断裂，使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子，这一过程称为高温解链反应；然后，温度迅速降到大约50-65℃的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应；退火反应结束后，温度要迅速升高到72℃左右进行延伸反应，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，增加了一倍。反复进行高温解链-低温退火-中温延伸三个过程，就可以获得数量更多的复制双链，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板。
目前，主流的PCR扩增技术的反应装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，通过金属块的加热、冷却，达到平衡温度后将热通过反应管传递至PCR反应液。这种装置的缺陷是：反应体积较大，即系统通常具有较大的体积和热容，常规PCR完成30个循环一般需要2-3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热通过反应管传递至PCR反应液，因此，PCR难以实现高效和高通量。而为了加快升降温的速度，也使得PCR仪器制造的困难加大，仪器成本大幅度提高。
在此基础上，20世纪九十年代，研究者们开始将微流控芯片技术应用于PCR扩增。微流控芯片技术是近十年来迅速发展起来的一种新的微型分析系统，它采用微加工技术在厘米尺寸的玻璃、塑料及硅橡胶材料上蚀刻出微米尺寸的反应管道及分析组件，由于各种分析过程可在微米尺寸的结构中完成，一方面可使珍贵的生物试样与试剂消耗降低到微升生至纳升级，另一方面使分析速度成十倍、百倍的提高，实现高通量的检测。PCR装置的微型化不仅降低了PCR样品的消耗量，而且较低的热容量显著提高了系统的热传导效率，使PCR反应速度大大加快。目前，PCR微流控芯片系统主要有两种形式：微室静态型PCR芯片和连续流动型PCR芯片。前者是传统PCR的微型化，即将反应混合物固定在反应池中，依赖于温度控制装置的温度循环变化进行热循环扩增，由于是传统PCR的微型化，体积和热容减少，因此反应时间大大减少，能量消耗也大幅度的降低；而后者通过微加工形成逶迤形流路，在一定推动力的作用下，使PCR反应液连续流经三个不同的温区，完成变性、退火和延伸过程，其优点是其反应温度无需来回反复地快速升降。虽然这两种PCR微流控芯片系统能够快速、高效扩增目的DNA片段，并已成功的实现了与毛细管电泳分离，实时荧光检测以及数组芯片杂交等过程的集成化。但前者其实只是传统PCR的微型化，仍没有突破依靠加热、冷却模块来反复升降温的模式，没有彻底解决升降温的耗时长问题；而后者虽然解决了反复升降温的耗时问题，却带来新的问题，即系统通常包含复杂的液体驱动系统，一方面增加了仪器及反应容器制作的复杂性和成本，另一方面操作比较复杂，限制了其广泛应用。
21世纪初，出现了一种新型的PCR扩增方法，利用自然对流即雷诺-本纳德对流原理进行PCR扩增的方法。该技术是将PCR反应液置于一个封闭的柱形反应腔内，反应腔的上下表面分别进行恒温控制，通常上端温度为60℃，下端温度为97℃，通过上下表面的温差驱动液体经过不同的温区，实现PCR扩增。这种方法不需要改变器件的温度，也不需要外加驱动来实现样品的流动，只需要一个反应腔，并控制控制其上下两端的温度为恒温，就可以实现PCR扩增。但该方法依然存在缺陷：首先，试剂需填满整个反应腔，需密封，存在潜在的泄漏问题；其次，试剂直接注入反应腔内，导致加热器与试剂直接接触，存在潜在的污染问题。
因此，现有技术中迫切需要一种新的聚合酶链反应扩增方法以及相应的装置，以解决其中存在的易污染、反应不稳定的问题。
发明内容
本发明一方面提供了一种通过聚合酶链反应扩增核酸的方法，其中包括：(1)提供一端开口的反应容器，在其中加入核酸扩增反应物；(2)在该开口容器内部或外部提供一个或多个可控制温度的恒温装置，所述恒温装置被构造成用于提供高于变性的温度，和供给或移走热量控制退火与延伸的温度，并且通过接触在反应容器的不同部位，建立管壁和管内空间的上下温度梯度分布以使管内液体产生稳定的对流；(3)利用管内液体对流进行聚合酶链式反应，扩增核酸。在一个实施方案中，所述方法还包括对扩增产物进行检测，例如进行实时监测。优选地，所述聚合酶链反应产物中包含荧光染料或探针，从而能够进行实时监测。
本发明在另一方面提供了一种核酸扩增反应装置，其中包含：(a)扩增反应容器，其中含有核酸扩增试剂；(b)一个或多个可控制温度的恒温装置；和(c)扩增反应容器间的隔热装置；其中通过不同的恒温热源接触在扩增反应容器的上下部位，建立管壁和管内垂直空间的温度梯度分布。任选地，本发明的装置还包含：(d)实时检测装置，例如荧光检测装置。
本发明的出现，解决了现有技术中各种方法的缺陷，它反应速度快；仪器与反应容器制作工艺简单、成本低廉；操作方便，无须密封，不与加热器直接接触，没有潜在的泄露与污染问题。
在本发明的方法和装置内，依据热对流原理，管内的PCR试剂会建立稳定的自下而上的温度梯度，进而自发驱动试剂产生对流运动，试剂在流动过程中会经过不同的温度区域，从而达到PCR扩增的目的。在一个优选的实施方案中，在扩增的同时，本发明的特殊装置可以采集扩增时及扩增后的荧光信号，可取代琼脂糖凝胶电泳的鉴定步骤，达到实时监测的目的。
首先，因不需反复升降温，本发明最终将提供一种在机构设计上更为简单，硬件装置上更为便宜的方法与装置，无需传统PCR仪的诸多复杂机构和电控，如精密温控的电路板、通过消耗电能来改变温度的装置等。
因此，基于本发明，我们可提供一种相比现有扩增技术，更容易将核酸扩增与检测相整合的方法及装置，本方法架构简单，易于微型化并且整合为更多功能的复合微型化设备，如芯片上的全系统分析。
其次，因不需反复升降温，应用本发明装置进行核酸扩增，相较传统PCR，本发明不仅省时，且能耗大大降低。
第三，不仅可以进行DNA的扩增，本发明也可对核糖核酸(RNA)进行反转录。当上下温控设置相同温度时，管内试剂因热传递而达设定的均温，此时反转录酶对样本进行反转录；转录结束后，重新设置上下温控，使试管内形成温度梯度，即可发生热对流，进行PCR扩增步骤。因此，仅需一次温度的变化，即可使RNA在一管内发生反转录和扩增两个过程。这个方法的重要之处在于可实现以RNA为遗传物质的病原体的检测，先前热对流核酸扩增技术尚无此类描述。
综上所述，本发明提供了一种比现有技术更加省时且更高效的核酸扩增与检测技术，克服现有方法因反复变温而导致的高耗时高耗能的缺点。本发明可解决的问题及本发明的优点，将在下文和附图中详细阐述。
具体实施方式
本发明提供一种通过聚合酶链反应扩增核酸的方法，其中包括：
(1)提供一端开口的反应容器，在其中加入核酸扩增反应物，任选地所述聚合酶链反应产物中包含荧光染料或探针；
(2)在该开口容器内部或外部提供一个或多个可控制温度的恒温装置，所述恒温装置被构造成用于提供高于变性的温度，和供给或移走热量控制退火与延伸的温度，并且通过接触在反应容器的不同部位，建立管壁和管内空间的上下温度梯度分布以使管内液体产生稳定的对流；
(3)利用管内液体对流进行聚合酶链式反应；以及；
(4)任选地对热对流聚合酶链式反应产物进行检测，例如实时监测。
在聚合酶链反应管内含有：待检样本核酸、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、反应缓冲液、二价镁离子、非主要成分的PCR添加剂(如：NP-40，tween-20，DMSO等)和至少两条与待检核酸序列特异互补的寡核苷酸引物，以及任选地与双链DNA结合的荧光染料或特异性荧光探针等。其后，用低密度的不易挥发物质(如石蜡油或是各种低熔点的蜡)或采用高透明度的塑料盖，覆盖于试剂表面以防止蒸发并使光源穿透。
在扩增反应时，在试剂与待测样本中建立并维持稳定的空间温度分布，这是通过下述实现的：使不同热源与反应管紧密接触进行热交换，对特定的区域供给热量或是移走热量，低温度的区域在垂直高度上低于高温度的区域；在反应试管中特定空间温度分布包含不同的特定空间区域，每个特定空间区域各自发生不同的PCR反应的步骤，所述的特定空间区域具有一定的温度范围，其温度条件适合于：1.变性反应，其中双链DNA解旋成为单链DNA；2.退火反应，引物与单链DNA的互补区域配对，形成引物-单链DNA复合物；3.延伸反应，聚合酶从引物-单链DNA配对区域开始逐个将三磷酸脱氧核糖核苷酸掺入，最终形成双链产物。因反应管内建立稳定的温度梯度分布会导致持续性的热对流，反应试剂因此反复循环流动进行变性退火及延伸步骤，30分钟内即可完成扩增反应。
优选地，在本发明的方法中还包括与反应同步的荧光监测步骤。
对聚合酶扩增反应进行实时监测是本领域技术人员熟知的技术。理论上PCR扩增的每一个循环可使新生成的双链DNA拷贝数增加一倍，经过20-30个循环可产生数目很大的双链DNA。然而，PCR扩增反应受引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的消耗以及酶活性等条件影响，细微的条件变化都会影响其扩增产量，反应到一定程度会进入平台期。用终点法从扩增产物的量来推算PCR反应体系中范本的初始量很难得到可靠的结果。因此，最好的途径是PCR实时定量，从扩增曲线上升的斜率以及临界循环数来估计范本的初始量。上世纪90年代初首先出现了5’核酸酶PCR技术(即TaqMan技术)来实时定量检测特异性PCR扩增产物；之后，又出现了用溴化乙锭染料实时测定双链DNA的生成量。同时，研究人员开发了荧光探针或TaqMan探针来改善检测特异性扩增产物的实时定量方法。上世纪末，出现了在芯片上对PCR产物进行实时定量的、均相的、特异性序列检测。
实时定量PCR是在普通PCR基础上发展起来的，采用针对扩增DNA的荧光染料，使扩增的DNA数量与检测到的荧光强度呈线性关系，大致得到DNA的扩增曲线。目前基于DNA和荧光染料的实时定量PCR通常有3种方法：TaqMan探针、SYBR Green I/EtBr染料检测双链DNA的生成量以及分子信标。
TaqMan探针是以一段与扩增范本中部序列完全互补的探针的两端，5’端与产荧光基团(荧光染料)相连，而3’端与荧光猝灭基团(猝灭剂)相连。由于荧光能量转移，荧光染料的荧光受猝灭剂的影响被猝灭。在PCR过程中，由于DNA聚合酶的5’-3’外切酶作用，使探针5’端的荧光染料被切断而脱落至溶液中，荧光染料与猝灭剂之间的距离增大，摆脱了猝灭剂的作用而产生荧光。随着PCR扩增反应的进行，越来越多的5’端荧光染料被切下，荧光也随之增强。此方法适用：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高；2、适用于扩增序列专一的体系的检测；3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测；4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决；5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量；6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量，在动物病原体基因的检测，畜禽产品的检验检疫，生物制品的鉴定。
SYBR Green I/EtBr染料则可用于检测双链DNA的生成量。EtBr是实时定量PCR中较常用的荧光染料，它含有一个可嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。SYBR Green I染料与DNA结合后荧光增强千倍，超过EtBr50倍，是目前最灵敏的双链DNA荧光染料，它对光稳定性好，不易发生光漂白(即荧光基团在激发态受到光的不可逆破坏)，激发波长494nm，发射波长530nm附近。由于PCR反应不断产生新的双链DNA，故可用SYBR Green I荧光的增强来实时定量检测双链DNA的生成量。此方法适用：1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上；2、通用性好，不需要设计探针，方法简便，省时，价格低廉；3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用；4、高通量大规模的定量PCR检测；5、专一性要求不高的定量PCR检测。
分子信标实质上是一个首尾序列互补且分别标记荧光基团与猝灭基团的环状探针。在PCR扩增过程，每个循环的退火阶段检测到PCR反应体系中的荧光信号。在退火阶段，PCR扩增产物与分子信标结合产生荧光，而没有结合的分子信标仍然保持闭合环状态不发生荧光。随着PCR循环数目的增加，荧光信号不断增强，荧光信号的强度与PCR扩增产物的浓度成正比关系。
而荧光信号的激发与采集装置是由光开关数组、自聚焦透镜和尾纤准直器及变增益微光O/E装置组成的有机整体，在以16位单片机为核心的电控装置管理下，能在毫秒级时间内完成多个标本快速均衡扫描检测，避免了机械扫描方式或CCD扫描方式引起的时间滞后或渐晕误差。实现标准样本的高通量实时荧光激发和定量检测。
在本发明中，通过特别设计的聚合酶链反应扩增方法和装置，可以实现PCR扩增和实时监测的效果。
在聚合酶链反应过程中，当反应管内建立稳定的温度梯度分布时，试剂会因热对流物理现象产生持续性与自发性的循环流动，进行变性退火及延伸步骤。而试剂中的荧光染料含有一个可嵌入DNA堆积碱基之间的三环平面基团，当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，这种行为几乎没有碱基序列特异性，会随扩增的进行而不断嵌入新生成的双链DNA分子中。嵌入基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加，因此通过对荧光信号的采集即可反应扩增状态。
除荧光插入染料，本发明也可借荧光探针来实现荧光检测的目的，荧光探针是一段与待检序列完全互补的寡核苷酸，首尾分别标记荧光基团与猝灭基团，受引物的限制，荧光信号被猝灭基团阻挡，因此检测不到荧光信号。在热对流循环过程中，试剂会持续性与自发性地进行变性退火及延伸步骤，探针会黏合在序列上后被DNA聚合酶水解，探针断裂后荧光基团不再受猝灭基团阻挡，发出荧光信号，此时采集器可以接受到荧光讯号，实现实时检测。随着试剂热对流循环数增加，探针不断被水解，荧光信号不断增强，荧光信号的强度与PCR扩增产物的浓度成正比关系。
优选地，本发明的方法还可以应用于扩增单链核糖核酸(RNA)。众所周知，许多病原体其遗传物质为RNA(如HIV、HCV、流感等)，利用常规聚合酶链反应无法实现一步法快速对其进行扩增。本发明由于特殊设计的程序和设备，可以实现RNA模板的联合逆转录和扩增，解决非DNA样本的问题，而先前热对流核酸扩增技术皆无此类描述。该步骤包括：将RT-PCR一步法试剂与待测样本注入反应试管，反应管内含有：样本RNA、逆转录酶、RNA酶抑制剂、无RNA酶的缓冲液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、二价镁离子、非主要成分的PCR添加剂(如：NP-40，tween-20，DMSO等)和至少两条与标本核酸序列特异性互补的寡核苷酸引物，以及任选地与双链DNA结合的荧光染料或特异性荧光探针。最后用低密度的不易挥发物质(如石蜡油或是各种低熔点的蜡)或采用高透明度的塑料盖，覆盖试剂表面以防止蒸发并使光源穿透。以上的试剂注入反应管后，插入本发明的装置的空洞中，第一步先进行反转录反应，设置上下温控器使其具有相同温度(35～70℃)，因热传递整管试剂内温度均一，此条件下可发生反转录过程；反转录结束后，调节下方的温度，使其增加至变性温度(90～99℃)，并因此而形成温度梯度，发生持续性的热对流，试剂内的反转录酶流经底部会因高温变性而不再具有转录活性，而DNA聚合酶在自发循环流动将以反转录出来的DNA作为模板，进行变性退火及延伸的PCR步骤。
为实践上述扩增方法，本发明提供一种应用于热对流PCR的核酸序列扩增装置，该装置提供：不同温度的热源，可针对反应管内不同特定区域供给热量或移走热量。
其中加热装置可以保持试管内样品的稳定温度分布，而低温度的区域在垂直高度上低于高温度的区域；反应试管中空间温度分布包含不同的特定区域，每个特定空间区域各自执行不同的PCR反应，所述的特定空间区域具有一定的温度范围，其温度条件适合于：1.变性反应，其中双链DNA解旋成为单链DNA；2.退火反应，引物与单链DNA的互补区域配对，形成引物-单链DNA复合物；3.延伸反应，聚合酶从引物-单链DNA配对区域开始逐个将三磷酸脱氧核糖核苷酸掺入，最终形成双链产物。因反应管内建立稳定的温度梯度分布会导致持续性的热对流，反应试剂因此反复循环流动进行变性退火及延伸步骤，30分钟内即可完成扩增反应。
在本发明技术中，反应容器内的样品试剂进行循环流动进行变性退火及延伸步骤，此过程序自动化且自发重复发生，与复杂电子和程控温度、时间的循环PCR机台比较，本发明在设计上和成本上有明显的优势。
本发明还提供一种温控热对流聚合酶链反应装置，其中包含：(a)扩增反应容器，例如反应试管，其中可以容纳核酸扩增试剂；(b)一个或多个可控制温度的恒温装置，其形状优选为环状的，套在反应容器的外面并与之接触；(c)位于扩增反应容器间的隔热装置；以及(d)任选地，实时荧光检测装置；
通过不同的恒温热源接触在扩增反应容器的上下部位，建立管壁和管内垂直空间的温度梯度分布。
1.扩增反应容器
先前热对流PCR反应腔有两大主流，一个是将细管(1～0.5mm)两端接起后形成液体对流腔，另一个是在两端开口的圆柱体中的空间进行反应。它们的缺点在于细管衔接困难且在试剂装载时容易产生气泡，进而影响试剂的正常对流；而两端开口的圆柱体，为了不让试剂外漏，其加热片必须紧贴于开口处，与试剂直接接触，容易造成污染问题。
本发明的反应容器为一端开口另一端闭口的管状或柱状容器，便于试剂加入与吸出，且容易制造，生产成本低可达抛弃式的目的。本发明的容器可以是反应试管的形式，并且可以用任何适当的材料制造，如玻璃(glass)、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)、聚砜(PSF)等。
2.环状加热装置：
先前热对流PCR皆使用加热块平贴在试管上做单面的加热，即有可能造成受热不均匀的问题。在本发明则采用环状加热的方式，即在一定厚度的加热片上钻孔，将反应管套入使其紧密接触，加热片热量通过接触面传导至内部试剂，从而达到均匀的温度。本发明中有两个环状加热装置，下方环状装置提供较高的温度加热于试管底部周围，试剂受热上浮，同时发生PCR反应中的变性步骤；上浮至上液面时，部分热量通过上方的环状加热片导出，并维持一定的温度，在该温度下发生PCR中的退火与延伸的步骤；此时试剂因冷却而再次下沉，到达底部后重新受热再次上浮，开始PCR反应的下一个循环。传统PCR反应时间通常需要2～3小时，为了缩短时间，PCR仪采用热传导率高的镀金/银块和致冷芯片，虽达到了目的，但大大增加了仪器成本。本发明使得PCR步骤无须反复升温、冷却，省却了升降温步骤的耗时，从而达到快速扩增的目的。针对于具有不同退火温度的引物，可调整上方环状加热装置的温度控制热对流PCR的最佳反应条件。
3.隔热装置：
本发明采用环状加热的方式，在一定厚度的加热片上钻孔，将反应管分别套入试管上方与底部，使其紧密接触。本发明中采用绝热材料将两块加热片中间填满，其优点为：
a.室温的变化会影响管内液体对流的流场与速度，本发明的隔热装置可以降低外界环境温度变化对管内流场的影响，维持管内试剂在不同外界条件下一致的反应；
b.上下两个加热片本身的温度不同，也会因空气对流与热传导而相互影响，从而导致温控上的波动，本发明的隔热装置可以降低两块加热片间的温度干扰，从而维持管内试剂一致的反应；
c.试管在加热过程中也会散发热量，进而影响相邻管的温度分布，本发明隔热装置可以阻隔相邻管间的热传导，降低互相的温度影响，维持管内试剂一致的反应。
本发明的隔热装置可以使用任何热传导系数低的材料，如：玻璃纤维棉、木头、耐热泡棉、云母片、耐热塑料等等。
4.荧光检测装置
利用荧光染料或探针，PCR扩增产物的量可通过荧光强度进行监测，随PCR产物增加，荧光强度增加，以此达到实时与终点检测的目的。
以往PCR为了让试管完全加热，用整块金属将试管周围完全包裹，因而荧光的光路配置只能采用上打光与上收光的方式，故大部分的实时定量PCR系统只能把光学系统架于试管上方，限制了硬件的设计。本发明则采用底部环状加热的方式，除了可控制接触试管表面与内部试剂均匀温度外，激发光源也因此可以安置于试管下方。因此激发光束可以从试管底部中间垂直穿透试剂，当试剂扩增时，激发光与发射光在经过光路中的窄频滤光盘时，激发光会被屏蔽，从而使上方光学接收受器接收到专一的产物荧光信号；窄频滤光盘可放置多种滤光片，以便进行多重产物的检测。本发明的荧光检测装置的优点为：以往实时PCR荧光信号采集装置和激发光发射装置必须设计在一起，因此需要使用复杂且昂贵的分光滤镜组将不同的荧光讯号分开。本发明中荧光信号采集装置和激发光发射装置可以分开，一方面使得光学路径上可采用多重方式，如：上打光下收光、下打光上收光、下打光试管侧面收光与上打光试管侧面收光等，另一方面无需昂贵的分光滤镜组。
配合本方法的荧光检测装置，可以配合扩增设备在扩增过程中实时监测核酸量的变化。通过扩增和检测设备，可以从含有DNA和/或RNA的待检测标本中高效扩增靶序列并实现实时荧光检测。
上述方法、目的、优势和特点将在下面附图做详细的阐述，在描述本发明时，当相关的现有技术不会造成本技术要点含混不清时，将不再对相关现有技术进行进一步说明与解释。
附图说明
图1：基于热对流的核酸序列扩增方法的原理示意图。
图2：本发明一个实施方案的核酸扩增装置与荧光检测装置横截面图。
图3：实施例2的温度量测，无绝热装置时的管内油水接口(Ti)。
图4：实施例2的温度量测，有绝热装置时的管内油水接口(Ti)。
图5：单一温控(A)，双温控(B)与具绝热方式的双温控(C)的管内油水界面(Ti)温度量测。
图6：电泳结果照片，说明实施例2扩增的结果(与传统PCR仪比较)。
图7：电泳结果照片，说明不同试剂体积和扩增长度的结果。
图8：电泳结果照片，说明上方不同温度时的RNA扩增结果。
图9：电泳结果照片，说明底部不同温度时的DNA扩增结果。
图10：电泳结果照片，说明实施例2在不同反应时间的结果。
图11：实时荧光纪录图，说明实施例2在不同浓度下的荧光扩增曲线图。(请详细说明图11中几条曲线表示的含义)
对图中重要部分的数字的解释
101：反应管
102：片状加热器
103：上方环状加热装置
104：温度传感器
105：支架
106：棒状加热器
107：激发光源
108：底部环状加热装置
109：绝热材料1
110：绝热材料2
111：滤光玻璃片
112：感光检测器
以下参考附图详细说明本发明的一些优选实施方案：
图1显示基于热对流物理现象所发明的核酸序列扩增方法的操作示意图。所描述的实施方案验证了整个原理的运行，一端开口和一端封闭的反应容器g加入试剂后，插进加热装置内，短暂时间内产生环流c，进而形成两个特定的温度区域a与b，在图一的实施方案中，试管与两个加热装置f与d紧密接触，通过试管壁向样品特定区域a与b提供或是带走热量，此时因试管内建立起了温度梯度而驱动试剂的流动；绝热材质e的包埋避免了外界环境温度和气流的干扰，也阻止了管与管之间通过空气进行热传递而相互影响的问题，提供了一个稳定的热条件帮助试剂形成稳定且持续的环流，从而执行不同的PCR反应步骤，上述的特定空间区域(a，b)具有一定的温度范围，其温度条件适合于：1.变性反应，其中双链DNA解旋成为单链DNA；2.退火反应，引物与单链DNA的互补区域配对，形成引物-单链DNA复合物；3.延伸反应，聚合酶从引物-单链DNA配对区域开始逐个将三磷酸脱氧核糖核苷酸掺入，最终形成双链产物。因反应管内建立稳定的温度梯度分布会导致持续性的热对流，反应试剂因此反复循环流动进行变性退火及延伸步骤。下面举例以说明更详尽的操作。
例如，在合适的管状或柱状反应容器中注入反应试剂，包括待测标本、DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、特异性引物、荧光染料、特异性荧光探针、二价镁离子和其他PCR添加剂。实验前先设定本装置的两个环状加热块的温度，底部加热块温度设定90～99℃；上方加热块温度设定45～65℃，此温度可依照不同退火温度的引物调整，短暂时间内即可达到设定的稳定温度。整根试管插入本发明的加热设备(见图2)，下方环状装置提供较高的温度加热于试管底部周围，试剂受热上浮，同时发生PCR反应中的变性步骤；上浮至上液面时，部分热量通过上方的环状加热片导出，并维持一定的温度，在该温度下发生PCR中的退火与延伸的步骤；此时试剂因冷却而再次下沉，到达底部后重新受热再次上浮，开始PCR反应的下一个循环。试剂在一分钟内即可达到稳定循环，25～30分钟后即可反应完全。
图2显示的是本发明的一个应用热对流物理现象的PCR核酸序列扩增与检测装置，其横截面图所示为反应试管、环状加热装置、隔热装置、荧光检测装置四大构件的相关位置和功用，图二所示的装置含有维持不同温度的热源装置，此装置在绝热材质的包埋下，避免外界环境温度和气流的干扰，也阻止了管与管之间通过空气进行热传递而相互影响的问题，提供了一个稳定的热条件帮助试剂形成稳定且持续的环流，在本具体实施方案，加热棒106将环状加热片108加温至DNA变性温度，109为隔热材料，阻隔热量的上传，制冷芯片102可加热或是冷却上方环状加热片103，利用热电偶104的温度回馈，可以让上方温度调整以满足RNA或是不同引物的扩增温度条件。在加热过程中，为避免受环境温度和气流影响，用绝热材料(本实施例采用压克力)将两块加热片中间填满，降低外界环境温度变化对管内流场的影响，维持管内试剂在不同外界条件下一致的反应；也降低两块加热片间的温度干扰，从而维持管内试剂一致的反应；并阻隔相邻管间的热传导，降低互相的温度影响，维持管内试剂一致的反应。架子105支撑整个结构，热对流反应过程中，特异性探针被DNA聚合酶水解或荧光插入染料嵌入双链而发出荧光，通过荧光强度信号的采集来对扩增过程进行实时检测。本装置采用底部环状加热的方式，激发光束从试管底部中间垂直穿透试剂，当试剂扩增时，激发光与发射光在经过光路中的窄频滤光盘时，激发光会被屏蔽(111)，从而使上方光学接收受器(112)接收到专一的产物荧光信号；窄频滤光盘可放置多种滤光片，以便进行多重产物的检测。本发明的荧光检测装置的优点为：以往real-timePCR荧光信号采集装置和激发光发射装置必须设计在一起，因此需要使用复杂且昂贵的分光滤镜组将不同的荧光讯号分开。本发明中荧光信号采集装置和激发光发射装置可以分开，一方面使得光学路径上可采用多重方式，如：上打光下收光、下打光上收光、下打光试管侧面收光与上打光试管侧面收光等，另一方面无需昂贵的分光滤镜组。
本发明不局限于图1与图2所描述的核酸序列扩增与检测装置，加热方式的改变与容器形状的改变皆属于本发明的范畴。
图3是实施例2的温度量测；在无绝热装置时的管内油水接口(Ti)的温度记录，在试管中试剂最低温度位于最高的上液面处，即矿物油和试剂接口的位置，这里的温度提供设计引物时退火温度的一个指针。本发明将T-type的热电偶极插入此接口上，计算机纪录15分钟的温度变化(PC-Based Data Acquisition Unit MX100，Yokogawa，Japan)。当室温24℃，无隔热装置，反应管曝露在空气中时，其结果显示该接口平均温度65.2℃，最大温差2.7℃。
图4是实施例2的温度量测；在有绝热装置时的管内油水接口(Ti)的温度记录，在试管中试剂最低温度位于最高的上液面处，即矿物油和试剂接口的位置，这里的温度提供设计引物时退火温度时的一个指针。本发明将T-type的热电偶极插入此接口上，用计算机纪录15分钟的温度变化(PC-Based Data Acquisition Unit MX100，Yokogawa，Japan)。当反应管处于室温24℃的环境，有隔热装置(本实施例采用压克力)时，测定结果显示其平均温度为64.3℃，最大温差0.6℃，相比无绝热装置的Ti温差(2.7℃)稳定。
图5是实施例2的温度量测；A组采用单一温控，只有一环状加热片(95℃)口热试管底部；B组分别有上下两组环状加热片(95℃/65℃)，但两加热片中间没有隔热装置；C组有上下两组环状加热片(95℃/65℃)，加热的同时以隔热材质将试管包覆。将T-type的热电偶极插入此接口上，用计算机纪录15分钟的温度变化(PC-Based DataAcquisition Unit MX100，Yokogawa，Japan)。其结果显示a.当室温24℃，只有单一温控，Ti无法达到65℃且温差波动大(5.3℃)；b.采用上下两个温控(95℃/65℃)，当室温24℃，无隔热设置时，其结果显示平均温度65.2℃，温差2.7℃；c.采用上下两个温控(95℃/65℃)，当室温24℃，且有隔热装置(本实施例采用压克力)时，其结果显示平均温度64.3℃，温差0.6℃。经比较，本发明的双温控及隔热装置可以达到最理想的扩增条件。
图6说明实施例2扩增的结果，实验前设定两个环状加热装置的温度，底部温度设定95℃；上方温度设定65℃。试管内形成相对的高温区、低温区与对流区，试剂受热上浮，同时发生PCR反应中的变性步骤；上浮至上液面时，部分热量通过上方的环状加热片导出，并维持一定的温度，在该温度下发生PCR中的退火与延伸的步骤；此时试剂因冷却而再次下沉，到达底部后重新受热再次上浮，开始PCR反应的下一个循环。本实例将阳性实验组和阴性对照组(样品用水替代)的试剂分别注入反应管内，以少量石蜡油覆盖试剂表面。将反应管垂直插入加热装置的孔洞中，静置30分钟。而传统机台设定参数如下：95℃10分钟；95℃20秒，65℃20秒和72℃30秒，循环35次；最后72℃7分钟。总耗时1小时50分钟。最后分别从管内取2μl产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。从电泳图可以看出，本发明装置与传统PCR仪扩增片段(169bps)的亮度(P2)相当(P1)；阴性对照组两种方法(N1、N2)的结果均为阴性，但本发明的引物二聚体弱于传统PCR仪。在反应时间上本发明比起传统PCR机台节省近四倍的时间。
图7说明不同试剂体积与可扩增长度之间的相关性结果，本发明原理是在一反应试管内建立热对流，即由温度梯度差导致液体的密度变化进而引起流体的运动，称为“自然对流”，这种自发性对流的现象和由驱动设备强制推动的流动是完全不同的。当流场稳定后试剂会形成相似的流动路径，当路径越长时，代表反应时间会越长，相当于增加PCR每一步骤(变性、退火、延伸)的反应时间。在本图中采用2～5mm之间的长度当作反应试管的直径，当试剂体积为75微升时，试剂完成一个循环需约18～25秒；当试剂体积增加致100微升时，试剂一个循环时间增加至28～33秒。琼脂糖凝胶电泳图的结果显示，当试剂体积只有75微升(1，2)时，产物并不明显；增加试剂体积到100微升后(3，4)，可以保证长度为300个碱基对的产物扩增成功。
图8说明实施例2的扩增结果，应用本发明不仅可以对不同长度的DNA扩增，也可对不同长度的RNA扩增。实验前设定两个环状加热装置的温度，底部温度设定48℃；上方温度也设定48℃，此温度可依不同的需要而调整(42℃～55℃)，五分钟后即可达到设定的稳定温度。将阳性实验组和阴性对照组(样本用水替代)的试剂分别注射入反应管内，以少量石蜡油覆盖试剂表面。将反应管垂直插入加热装置的孔洞中，静置20分钟即完成反转录步骤。之后底部温度调整至95℃，上方温度调至65℃，开始进行热对流PCR反应，20分钟后完成核酸扩增反应。图中所示3个片段分别为对3个长度的RNA进行扩增的结果，三个片段长度分别为858bp，371bp，175bp。
图9说明底部不同温度时DNA扩增结果。本实验设定装置的两个环状加热块的温度，底部分别为90、95与99℃；上方固定设定65℃，短暂时间内达到设定的稳定温度后，将整根试管插入本发明的加热设备，下方环状装置提供较高的温度加热于试管底部周围，试剂受热上浮，同时发生PCR反应中的变性步骤；上浮至上液面时，部分热量通过上方的环状加热片导出，并维持一定的温度，在该温度下发生PCR中的退火与延伸的步骤；此时试剂因冷却而再次下沉，到达底部后重新受热再次上浮，开始PCR反应的下一个循环。试剂在一分钟内达到稳定循环，25～30分钟后反应完全。琼脂糖凝胶电泳结果显示，本发明在底部温度设定90(2)、95(3)与99℃(4)时，皆可以扩增成功，其亮度与传统机台相当(1)。
图10说明实施例2在不同反应时间的结果，本实验标本使用乙肝病毒质粒(pHBV-48，GenBank编号NC003977)，浓度为每管10000拷贝，相同试剂和质粒浓度条件下，配置13管。将这13管同时插入本发明的装置加热，每隔一定时间点将管子取出插入冰中以停止循环反应，时间点分别为10分钟(1)、11分钟(2)、12分钟(3)、13分钟(4)、14分钟(5)、15分钟(6)、16分钟(7)、17分钟(8)、18分钟(9)、19分钟(10)、20分钟(11)、25分钟(12)、30分钟(13)。琼脂糖凝胶电泳结果显示，本装置在反应后第12分钟即可检测到明显的扩增条带，14分钟后每个时间点差异性不大，说明20分钟内即可完成反应，与传统PCR相比，耗时明显减少。
图11说明实施例3对DNA进行C-PCR扩增并同时进行实施荧光检测的结果。实验前设定两个环状加热装置的温度，底部温度设定95℃；上方温度设定65℃，此温度可依不同的引物而调整，五分钟后即可达到设定的稳定温度。将阳性实验组和阴性对照组(范本用水替代)的试剂分别注射入反应管内，以少量石蜡油覆盖试剂表面。将反应管垂直插入加热装置的孔洞中，静置30分钟。每隔五分钟激发光源(480nm LED)打开并持续三秒，收光装置(cool CCD)镜头前装有530nm滤光玻璃片阻挡蓝光通过，以曝光时间200毫秒的参数撷取图片。30分钟后反应结束。结果显示本发明装置可用于DNA的扩增并进行实时检测，数据分析显示本发明装置用于核酸的定量检测有很好的线性。
实施例
实施例1：
1.材料与方法
1.1反应试管
一端开口一端封闭的硼玻璃管，直径范围在2～5mm，整体长度在10～45mm，外径在3～6mm，经清洗灭菌后使用。
1.2样本
PCR试剂包含以下成分：2.1pg的HBV DNA样品、2pmol的169F引物(5’-GCA CGG GAC CAT GCA GAA CCT GCA CGA T-3’，SEQ  ID  NO：1)、3pmol  特异性探针(FAM5`-TGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACT-`3BHQ，SEQ ID NO：2)、2pmol的169R引物(5’-GCA AGC CAG GAG AAACGG ACT GAG GCC CAC T-3’，SEQ ID NO：3)、8μl的PCR聚合酶混合液LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture(Roche，Germany)、4mM二价镁离子，总体积为55μl。
1.3装置
本发明中热对流聚合酶链反应的扩增与荧光检测装置由下列组件构成：数个一端开口一端封口的反应试管、环状加热装置、隔热装置、荧光检测装置及支撑架，如图2所示。
1.4流程
实验前设定两个环状加热装置的温度，底部温度设定95℃；上方温度设定65℃，此温度可依不同的引物而调整，五分钟后即可达到设定的稳定温度。将阳性实验组和阴性对照组(范本用水替代)的试剂分别注射入反应管内，以少量石蜡油覆盖试剂表面。将反应管垂直插入加热装置的孔洞中，静置30分钟。
2.结果
2.1温度测量与比较
为了验证两个环状加热装置和绝热装置对管内温度稳定度的影响，我们采用电偶极的方法来测量管内试剂液面顶端的温度(Tl)，此温度的稳定可确保引物的退火与延伸步骤顺利进行。当底部温度设定95℃时，分别在三种不同条件下量测Tl温度30分钟：(i)单一温控，只有底部环状加热；(ii)双温控，上方环状加热(65℃)；(iii)双温控，上方环状加热(65℃)，管间用绝热材料(压克力)填满。结果发现只有单一温控温度差异达5.3℃，而加入上方环状温控后温度稳定度提高(温度差异2.7℃)，而加入隔热装置的实验，30分钟内温度变化只有0.6℃，证明本发明的有效性。
2.2扩增结果
在电泳条件(1.5％琼脂糖、150伏特、40分钟)下，分析热对流PCR和传统PCR的扩增产物，结果如图6。图上标示P为阳性实验组，N为阴性对照组；1为传统PCR仪扩增结果，2为本发明装置扩增结果。传统机台(T3gradient，Biometra，Germany)温度设定条件为：95℃十分钟；95℃20秒，65℃20秒与72℃30秒(45循环)；72℃7分钟；总耗时2小时15分钟。本发明装置无需温度变化，总耗时只需30分钟。结果显示本发明装置与传统PCR仪扩增片段(169bps)的亮度(P2)相当(P1)；阴性对照组两种方法(N1、N2)的结果均为阴性，但本发明的引物二聚体弱于传统PCR仪。
实施例2
1.方法
1.材料与方法
1.1试剂
RT-PCR一步法试剂包括以下成分：RNA样品5ul，上游引物10pmol，下游引物10pmol，AccessQuick Master Mix(promega)40ul，AMV Reverse Transcriptase 8u，DEPC水，其他非必要的PCR反应添加剂，总体积80ul。
本实施例中扩增了3套不同产物长度片段(858bp，371bp，175bp)的引物为：
CA16-VP1F2：TCCCATTGCAGATATGATT(SEQ ID NO：4)；
CA16-VP1R2：GTTGTTATCTTGTCTCTACTAGTG(SEQ IDNO：5)；
153Fa：CAAGCACTTCTGTTTCCC(SEQ ID NO：6)；
541R：CCCAAAGTAGTCGGTTCC(SEQ ID NO：7)；
CAF3：TGTGTTGAACCAYCACTCC(SEQ ID NO：8)；
CAR3b：TAGGTAAACAACTCGCATTT(SEQ ID NO：9)。
1.2装置
本发明中热对流聚合酶链反应的扩增装置由下列组件构成：数个一端开口一端封口的反应试管、环状加热装置、隔热装置、支撑架。
1.3流程
实验前设定两个环状加热装置的温度，底部温度设定48℃；上方温度也设定48℃，此温度可依不同的需要而调整(42℃～55℃)，五分钟后即可达到设定的稳定温度。将阳性实验组和阴性对照组(样本用水替代)的试剂分别注射入反应管内，以少量石蜡油覆盖试剂表面。将反应管垂直插入加热装置的孔洞中，静置20分钟即完成反转录步骤。之后底部温度调整置95℃，上方温度调至65℃，开始进行热对流PCR反应，20分钟后完成核酸扩增反应，总反应共70分钟，反应结束后从管内取2μl产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。电泳条件：1.5％琼脂糖、150伏特、40分钟。
2.结果
结果如图8。图上标示P为阳性实验组，N为阴性对照组；结果显示本发明装置可用于不同产物长度的RNA扩增，阴性对照结果为阴性。
实施例3
1.材料与方法
1.1试剂
PCR试剂包含以下成分：以10倍梯度稀释的HBV全长质粒、2pmol的169F引物(5’-GCA CGG GAC CAT GCA GAA CCT GCACGA T-3’，SEQ ID NO：1)、2pmol的169R引物(5’-GCA AGC CAGGAG AAA CGG ACT GAG GCC CAC T-3’，SEQ ID NO：3)、8μl的PCR聚合酶混合液LightCycler FastStart DNA Master HybridizationMixture(Roche，Germany)、4mM二价镁离子，8ul的Sybr-Gold荧光染料，总体积为80μl。
1.2装置
本发明中热对流聚合酶链反应的扩增与荧光检测装置由下列组件构成：数个一端开口一端封口的反应试管、环状加热装置、隔热装置、荧光检测装置及支撑架。
1.3流程
实验前设定两个环状加热装置的温度，底部温度设定95℃；上方温度设定65℃，此温度可依不同的引物而调整，五分钟后即可达到设定的稳定温度。将阳性实验组和阴性对照组(范本用水替代)的试剂分别注射入反应管内，以少量石蜡油覆盖试剂表面。将反应管垂直插入加热装置的孔洞中，静置30分钟。每隔五分钟激发光源(480nm LED)打开并持续三秒，收光装置(cool CCD)镜头前装有530nm滤光玻璃片阻挡蓝光通过，以曝光时间200毫秒的参数撷取图片。30分钟后反应结束。
2.结果
结果如图11。结果显示本发明装置可用于DNA的扩增并进行实时检测，数据分析显示本发明装置用于核酸的定量检测有很好的线性。
以上实施例1、2和3中的结果证实：
第一、依据本发明的热对流核酸扩增与检测装置可以成功的完成PCR反应。
第二、针对RNA的样本，本发明也可成功的扩增和检测，并且转录与扩增可在同一管内的进行，便与整体的操作，增加实用性，此法重要之处在于许多病原体是以RNA为遗传物质的，采用本发明可以解决非DNA样本的问题。
对于本领域的研究和操作人员，本发明并不被限制在所述实施案例和附图，凡围绕本发明的中心技术思想，可作出多种替代和变化，因此少数的附图和实施例仅用于举例说明，不成为限制本发明的依据。
Figure ISA00000648322100021
Figure ISA00000648322100031

Claims (21)

1.一种通过热对流进行聚合酶链式反应的方法，该方法包括：
(1)提供一端开口的反应容器，在其中加入核酸扩增反应物，任选地所述聚合酶链反应产物中包含荧光染料或探针；
(2)在该开口容器内部或外部提供一个或多个可控制温度的恒温装置，所述恒温装置被构造成用于提供高于变性的温度，和供给或移走热量控制退火与延伸的温度，并且通过接触在反应容器的不同部位，建立管壁和管内空间的上下温度梯度分布以使管内液体产生稳定的对流；
(3)利用管内液体对流进行聚合酶链式反应；以及；
(4)任选地对热对流聚合酶链式反应产物进行检测，例如实时监测。
2.权利要求1的方法，其中所述恒温装置是一个或多个。
3.权利要求1的方法，其中在反应容器内，位于扩增反应物上方加入低密度的不易挥发物质，防止试剂蒸发并使光源穿透。
4.权利要求1的方法，其中所述反应管具有高透明度的密闭盖，用于防止试剂蒸发并使光源穿透。
5.权利要求1的方法，其中所述扩增反应物内包含有利建立热对流且不影响反应的化学物质。
6.权利要求1的方法，其中增加扩增反应物体积以增加纵向的试剂反应空间。
7.权利要求1的方法，其中温度控制方法利用固体、液体、气体、光线或是微波加热或冷却反应混合物。
8.权利要求1的方法，其中还包括进行RNA反转录反应。
9.权利要求1的方法，其中反应物在热对流循环中会有荧光物质插入到的双链DNA中用于监测。
10.权利要求1的方法，其中在热对流循环中，特异的荧光探针被水解而产生荧光用于监测。
11.权利要求1的方法，其中在热对流循环中，特异的荧光探针杂交于靶序列上，可用于监测。
12.一种温控热对流聚合酶链反应装置，其中包含：
(a)扩增反应容器，其中可以容纳核酸扩增试剂；
(b)一个或多个可控制温度的恒温装置；
(c)扩增反应容器间的隔热装置；以及
(d)任选地，实时荧光检测装置；其中
通过不同的恒温热源接触在扩增反应容器的上下部位，能够建立管壁和管内垂直空间的温度梯度分布。
13.权利要求12的核酸扩增装置，扩增反应容器为管状或柱状，一端开口，另一端封口，优选所述反应容器由选自玻璃、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)和聚砜(PSF)等的材料制成。
14.权利要求12的核酸扩增装置，其中所述隔热装置是绝热材料，优选为任何热传导系数低的材料，更优选选自玻璃纤维棉、木头、耐热泡棉、云母片、耐热塑料等或其组合。
15.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管下方射入激发光束，在反应管上方由检测器收光。
16.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管上方射入激发光束，在反应管下方由检测器收光。
17.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管上方射入激发光束，在反应管侧面由检测器收光。
18.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管下方射入激发光束，在反应管侧面由检测器收光。
19.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管上方射入激发光束，在反应管上方由检测器收光。
20.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管下方射入激发光束，在反应管下方由检测器收光。
21.权利要求12的核酸扩增装置，其适用于由反应管侧面射入激发光束，在反应管侧面由检测器收光。
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