CN104611222B - 三阶段热对流装置及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了多阶段热对流装置及其用途。在一个实施方案中，本发明的特征是三阶段热对流装置，其包含用于辅助热对流介导之聚合酶链式反应(PCR)的温度成形元件(temperature shaping element)。本发明有多种应用，包括在无需与许多现有设备相关的笨重且昂贵的硬件的情况下扩增核酸。在一个典型的实施方案中，该装置可以放于使用者手掌上用作便携、操作简单且低成本的PCR扩增设备。

Description

三阶段热对流装置及其用途
本申请是申请日为2011年1月11日、申请号为“201180013468.9”、发明名称为“三阶段热对流装置及其用途”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/IB2011/050103的中国国家阶段申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年1月12日提交的美国临时申请No.61/294,445的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明的特征是多阶段热对流装置(特别是三阶段热对流装置)及其用途。所述装置包含至少一个辅助聚合酶链式反应(PCR)的温度成形元件(temperature shapingelement)。本发明有多种应用，包括在无需与现有设备相关的笨重且通常昂贵的硬件的情况下扩增DNA模板。在一个实施方案中，该装置可以放于使用者手掌上用作便携式PCR扩增设备。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是在每次温度变化循环完成时扩增多核苷酸序列的技术。参见例如，PCR：A Practical Approach，M.J.McPherson等，IRL Press(1991)；PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等，Academic Press(1990)；和PCR Technology：Principals and Applications for DNA Amplification，H.A.Erlich，Stockton Press(1989)。在许多专利(包括美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188、4,889,818、5,075,216、5,079,352、5,104,792、5,023,171、5,091,310和5,066,584)中也描述了PCR。
在许多应用中，PCR涉及使目的多核苷酸(“模板”)变性，然后使期望的引物寡核苷酸(“引物”)与变性的模板退火。退火之后，聚合酶催化合成新多核苷酸链，其包含引物并且对其进行延伸。这一系列的步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。这些步骤在PCR扩增过程中重复多次。
随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量以几何级数增加。在许多实施方案中，引物是成对选择的，它们可以与给定双链多核苷酸的相对链退火。在这种情况下，可以扩增两个退火位置之间的区域。
需要多在多循环PCR实验中改变反应混合物的温度。例如，DNA变性通常在约90℃至约98℃或更高的温度下发生，引物与变性DNA的退火通常在约45℃至约65℃下进行，而用聚合酶延伸退火引物的步骤通常在约65℃至约75℃下进行。为了使PCR以最佳状态进行，这些温度步骤必须被依次重复。
为了满足该需要，已开发多种市售设备用于进行PCR。许多设备的重要组件是热“循环仪”，其中的一个或更多个温度控制元件(有时称为“加热块”)容纳PCR样品。在一段时间中加热块的温度变化以支持热循环。遗憾的是，这些设备有重大缺点。
例如，大多数设备是巨大、笨重且通常昂贵的。通常需要大量电力来加热和冷却加热块以支持热循环。使用者常常需要接受大量培训。因此，这些设备一般不适于现场使用。
克服这些问题的尝试并不是完全成功的。例如，一种尝试涉及使用多个温度控制加热块，其中每个块保持在期望的温度并且使样品在加热块之间移动。但是，这些装置有其他缺点，如需要复杂的机械装置使样品在不同加热块之间移动，以及需要一次加热或冷却一个或几个加热块。
已有一些在一些PCR过程中使用热对流的尝试。参见Krishnan，M.等.(2002)Science 298：793；Wheeler，E.K.(2004)Anal.Chem.76：4011-4016；Braun，D.(2004)ModernPhysics Letters 18：775-784；和WO02/072267。但是，这些尝试都没有生产出小型、便携、更实惠，而且减少对电力的大量需求的热对流PCR设备。而且，这些热对流装置往往有低的PCR扩增效率和扩增子尺寸的限制。
发明内容
本发明提供了多阶段热对流装置(特别是三阶段热对流装置)及其用途。该装置通常包含至少一个辅助聚合酶链式反应(PCR)的温度成形元件。如下文所述，典型的温度成形元件是该装置中支持热对流PCR的结构和/或位置特征。温度成形元件的存在增加PCR扩增的效率和速度、支持小型化、并且减少对大量电力的需要。在一个实施方案中，该装置容易地放于使用者手掌上并且具有电池足以运行的低电力需求。在该实施方案中，该装置比许多现有PCR设备更小、更便宜且更便携。
因此，在一方面，本发明的特征是适于进行热对流PCR扩增的三阶段热对流装置(“装置”)。优选地，该装置具有至少一个(优选所有的)作为可操作连接组件的下述元件：
(a)用于对槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第一热源，所述槽适于容纳进行PCR的反应容器，
(b)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第二热源，所述下表面朝向第一热源的上表面，
(c)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第三热源，所述下表面朝向第二热源的上表面，其中所述槽由接触第一热源的底端和与第三热源的上表面邻接的通孔限定，并且其中底端与通孔的中心点之间形成槽轴，围绕其布置所述槽，
(d)至少一个适于辅助热对流PCR的温度成形元件；以及
(e)在第一热源内适于容纳所述槽的接收孔。
还提供了制造上述装置的方法，该方法包括以足以进行本文所述热对流PCR的可操作组合组装(a)-(e)中的每个。
在本发明的另一方面中，提供了适于使用至少一种本文所述装置进行PCR的热对流PCR离心机(“PCR离心机”)。
本发明还提供了通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法。在一个实施方案中，该方法包括至少一个(优选所有的)下述步骤：
(a)将包含接收孔的第一热源维持在适于使双链核酸分子变性并形成单链模板的温度范围内，
(b)将第三热源维持在适于使至少一条寡核苷酸引物与单链模板退火的温度范围内，
(c)将第二热源维持在适于支持引物沿单链模板聚合的温度；以及
(d)在足以产生引物延伸产物的条件下在接收孔和第三热源之间产生热对流。
另一方面，本发明提供了适于被本发明装置容纳的反应容器。
附图说明
图1为示意图，其显示装置的一个实施方案的俯视图。示出了穿过装置的剖面(A-A和B-B)。
图2A至C为示意图，其显示具有第一室100的装置的一个实施方案的剖面图。图2A至C为沿A-A面(图2A、2B)和B-B面(图2C)的横截面图。
图3A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。每个装置具有相对于槽轴80宽度不等的第一室100和第二室110。
图4A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)。图4B显示区域(由图4A中的虚线圆确定)的放大图。装置具有第一室100、第二室110和第三室120。第一室与第二室之间的区域包含第一热制动器130。第二室与第三室之间的区域包含第二热制动器140。
图5A至D为示意图，其显示装置的槽的一些实施方案(A-A面)。
图6A至J为示意图，其显示装置的槽的一些实施方案。剖面与槽轴80垂直。
图7A至I为图示，其显示装置的多种室的一些实施方案。剖面与槽轴80垂直。阴影线部分表示第二或第三热源。
图8A至P为图示，其显示装置的多种室和槽的一些实施方案。剖面与槽轴80垂直。阴影线部分表示第二或第三热源。
图9A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案的剖面图(A-A面)。第一室100呈锥形。
图10A至F为示意图，其显示具有第一热制动器130的多种装置的实施方案的剖面图(A-A面)。图10B、10D和10F分别显示图10A、10C和10E中所示虚线圆确定的区域的放大图，以说明第一热制动器130的结构细节。
图11A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)。图11B显示图11A中所示虚线圆确定的区域的放大图，以突出第一热制动器130和第二热制动器140的位置。
图12A为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)。第一热源20和第二热源30的特征为沿槽轴80有突出部(23、24、33、34)。显示第一热制动器130在第一室100之下。
图12B显示图12A所示装置的定位实施方案。装置相对于重力方向倾斜(倾斜θg确定的角度)。
图13为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)。接收孔73围绕槽轴80不对称布置并且形成接收孔间隙74。
图14A为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A面)。第一室100和第二室110分别位于第二热源30和第三热源40中。
图14B为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A面)。第一室100和第二室110位于第二热源30中，第三室120位于第三热源40中。第一热制动器130位于第二热源30内的第一室100与第二室110之间。
图14C为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)，其中第一室100和第二室110分别位于第二热源30和第三热源40中。显示第一热制动器130在第一室100之下。
图15A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案的剖面图(A-A面)，其中第一室100位于第三热源40中。图15B中，第一热源20的特征为围绕接收孔73对称布置突出部(23、24)。
图16A至C为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图。图16A至C为沿A-A面(图16A至B)和B-B面(图16C)的横截面图。第二热源30包含围绕槽轴80对称布置且沿第一室100的长度延伸的突出部(33、34)。
图17A至C为的装置的一个实施方案沿A-A面(图17A至B)和B-B面(图17C)的示意图。第一热源20、第二热源30和第三热源40包含突出部(23、24、33、34、43、44)，每个突出部围绕槽轴80对称布置。
图18A为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)。装置相对于重力方向倾斜(倾斜θg确定的角度)。
图18B显示装置的一个实施方案，其中在第二热源30中槽70和第一室100相对于重力方向倾斜。重力方向相对于热源保持垂直。
图19为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图(A-A)。在这种实施方案中，第一热源20的特征为具有接收孔间隙74的接收孔73。
图20A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。第一热源20包含接收孔间隙74。在由图20B所示的实施方案中，接收孔间隙74包含相对于槽轴80倾斜的上表面。
图21A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。第一热源20的特征为突出部23围绕接收孔73不对称布置。在图21A中，与接收孔73相邻的突出部23具有多个上表面，其中之一更高并且更接近第一室100。在图21B中，突出部23具有一个相对于槽轴80倾斜的上表面，从而使一侧与相对于接收孔73的另一侧相比更高且更接近第一室100。
图22A至D为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。在这些实施方案中，第一热源20和第二热源30的特征为突出部23和33围绕槽轴80不对称布置。突出部23和33的一侧与相对于槽轴80的另一侧相比更高。突出部23的顶端和突出部33的底端具有多个表面(图22A和22C)或相对于槽轴80倾斜(图22B和22D)。在图22A和22B中，第一室100的特征为底端102，其一部分与相对于槽轴80的另一部分相比更接近突出部23的一侧。在图22C和22D中，第一室100的底端102与突出部23上表面的距离基本恒定。
图23A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。在这些实施方案中，第一热源20的特征为突出部23围绕接收孔73对称布置，第二热源30的特征为突出部33围绕槽轴80不对称布置。在图23A中，第一室100的底端102的特征为具有多个表面，从而使底端102一侧的一部分比与槽轴80相对的另一部分更接近突出部23。在图23B中，第一室100的底端102相对于槽轴80倾斜，从而使底端102的一部分比与槽轴80相对的另一部分更接近突出部23。
图24A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。在这些实施方案中，第二热源30的特征为突出部33和34围绕槽轴80不对称布置。突出部33的底端和突出部34的顶端相对于槽轴80倾斜(图24A)或具有多个表面(图24B)。第一室100的特征为底端102的一部分比与槽轴80相对的另一部分更接近第一热源20的上表面。顶端101的特征也是其一部分比与槽轴80相对的另一部分更接近第三热源40的下表面。
图25为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其显示在第二热源30内，第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。
图26为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100包含相对于槽轴80以一定角度布置的壁103。
图27A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。在这些实施方案中，第二热源30的特征为突出部(33、34)围绕槽轴80不对称布置。突出部33的底端和突出部34的顶端相对于槽轴80倾斜(图27A)或具有多个表面(图27B)。在图27B中，第一热源20和第三热源40的特征为突出部(23、24、43、44)围绕槽轴80对称布置。在图27A和B两图中，第一室100底端102的一部分所处的位置比与槽轴80相对的另一部分更接近第一热源20的上表面。同样地，顶端101的一部分所处的位置比与槽轴80相对的另一部分更接近第三热源40的下表面。
图28A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第二热源30内有第一室100和第二室110。如图28B所示，该装置的特征为第一热制动器130围绕槽70不对称布置且处于第一室100和第二室110之间，其壁133接触槽70的一侧。
图29A为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图，其中第一室100在第二热源30内并且围绕槽70不对称布置(偏离中心)。
图29B至C为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图。第一室100围绕槽70不对称布置。如图29C所示，显示热制动器130围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
图30A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。在图30B所示的放大图中，显示热制动器130围绕槽70对称布置在第一室100和第二室110之间。热制动器130的壁133接触槽70。
图30C至D为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。第一室100垂直于槽轴80的宽度小于第二室110沿槽轴80的宽度。在图30D所示的放大图中，显示第一热制动器130围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
图31A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110沿A-A面以相反方向围绕槽轴80不对称布置。显示热制动器130围绕槽70对称布置并且壁133接触槽70。
图32A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。如图32B所示，第一热制动器130也围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
图32C至D为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内并且围绕槽轴80不对称布置。如图32D所示，第一热制动器130也围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
图33A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内并且沿A-A面以相反方向围绕槽轴80不对称布置。在图33B所示的放大图中，显示在第一室100中，第一热制动器130不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。还显示在第二室110中，第二热制动器140不对称布置并且壁143接触槽70的一侧。第一热制动器130的顶端131基本位于与第二热制动器140的底端142相同的高度。
图33C至D为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内并且沿A-A面以相反方向围绕槽轴80不对称布置。在图33D所示的放大图中，显示第一热制动器130和第二热制动器140不对称布置并且其壁(133、143)各自接触槽70的一侧。第一热制动器130顶端131所处的位置高于第二热制动器140的底端142。
图33E至F为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内并且沿A-A面以相反方向围绕槽轴80不对称布置。在图33F所示的放大图中，显示第一热制动器130和第二热制动器140不对称布置并且其壁(133、143)各自接触槽70的一侧。显示第一热制动器130顶端131所处的位置低于第二热制动器140的底端142。
图34A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内并且围绕槽轴80不对称布置。第一室100的顶端101和第二室110的底端112相对于槽轴80倾斜。第一室100的壁103和第二室110的壁113各自与槽轴80基本平行。在图34B所示的放大图中，显示第一热制动器130相对于槽轴80倾斜并且壁133接触槽70。
图35A至D为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100和第二室110在第二热源30内并且围绕槽轴80不对称布置。在图35A至D中，显示第一室100的壁103和第二室110的壁113相对于槽轴80倾斜。在图35B所示的放大图中，显示热制动器130围绕槽70对称布置并且壁133与槽70接触。在图35D所示的放大图中，显示第一热制动器130相对于槽轴80倾斜并且壁133接触槽70。
图36A至C为示意图，其显示多个装置的实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100在第二热源30内并且第二室110在第三热源40内(图36A和C)，或者第一室100和第二室110在第二热源30内并且第三室120在第三热源40内(图36B)。在所有图中，室围绕槽轴80对称布置。在图36A至C中，第二热源30的特征为突出部33限定出第一室100并且围绕槽轴80对称布置，第一热源20的特征为突出部23和24。在图36A至B中，第一室100的底端102接触第一绝热体50。在图36C中，第一室100的底端102接触第二热源30。
图37A至C为示意图，其显示多种装置的实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100在第二热源30内并且第二室110在第三热源40内(图37A和C)，或者第一室100和第二室110在第二热源30内并且第三室120在第三热源40内(图37B)。在所有图中，室围绕槽轴80对称布置。突出部23、24、33和34围绕槽轴80对称布置。在图37A至B中，第一室100的底端102接触第一绝热体50，而在图37C中，其接触第二热源30。
图38A至C为示意图，其显示多种装置的实施方案沿A-A面的剖面图。在图38A和C，第一室100在第二热源30内并且第二室110在第三热源40内，在图38B中，第一室100和第二室110在第二热源30内并且第三室120在第三热源40内。室围绕槽轴80对称布置。突出部23、24、33、34和43围绕槽轴80对称布置。在图38A至B中，第一室100的底端102接触第一绝热体50，而在图37C中，其接触第二热源30。
图39为示意图，其显示装置10的一个实施方案的俯视图，显示第一固定元件200、第二固定元件210、加热/冷却元件(160a至c)和温度传感器(170a至c)。指示了多个剖面(A-A、B-B和C-C)。
图40A至B为示意图，其显示图39所示的装置实施方案沿A-A(图40A)和B-B(图40B)面的截面图。
图41为第一固定元件200沿C-C面的截面图的示意图。
图42为装置一个实施方案的俯视图的示意图，其显示多个固定元件、热源结构、加热/冷却元件和温度传感器。
图43A至B为装置一个实施方案的俯视图(图43A)和截面图(图43B)的示意图，显示第一壳体元件300，其限定出第三绝热体310和第四绝热体320。
图44A至B为装置一个实施方案的俯视图(图44A)和截面图(图44B)的示意图，其包含第二壳体元件400和第五绝热体410及第六绝热体420。
图45A至B为一个PCR离心机的一个实施方案的示意图。图45A显示俯视图，图45B显示沿A-A面的截面图。
图46为示意图，其显示PCR离心机装置的一个实施方案沿A-A面的截面图。
图47A至B为示意图，其显示包含第一室和第一热制动器的PCR离心机的实施方案。在图47A中，沿A-A的剖面穿过槽70。在图47B中，沿B-B的剖面穿过第一固定工具200和第二固定工具210。
图48A至C为示意图，其显示用于图47A至B所示PCR离心机的第一热源(图48A)、第二热源(图48B)和第三热源(图48C)的一些实施方案。指示了穿过装置的剖面(A-A和B-B)。
图49A至B为示意图，其显示不包含室结构的PCR离心机的一个实施方案。在图49A中，沿A-A的剖面穿过槽70。在图49B中，沿B-B的剖面穿过第一固定工具200和第二固定工具210。
图50A至C为示意图，其显示用于图49A至B所示PCR离心机的第一热源(图50A)、第二热源(图50B)和第三热源(图50C)的一些实施方案。指示了穿过装置的剖面(A-A和B-B)。
图51A至D为示意图，其显示多种反应容器实施方案的截面图。
图52A至J为示意图，其显示多种反应容器实施方案垂直于反应容器轴95的截面图。
图53A至C为使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示用使用分别来自Takara Bio、Finnzymes和Kapa Biosystems的3种不同DNA聚合酶扩增来自1ng质粒样品的373bp序列。
图54A至C为使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自1ng质粒样品的三个目标序列(大小分别为177bp、960bp和1,608bp)的扩增。
图55显示使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自1ng质粒样品的多个目标序列(大小为约200bp至约2kbp)的扩增。
图56A至C为使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示在提高的变性温度(分别为100℃、102℃和104℃)下PCR扩增加速。
图57A至C为使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自10ng人基因组样品的三个目标序列(大小分别为363bp、475bp和513bp)的扩增。
图58为使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自10ng人基因组和cDNA样品的多个序列(大小为约100bp至约800bp)的扩增。
图59为使用图12A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自非常低拷贝的人基因组样品的363bpβ-珠蛋白序列的扩增。
图60显示当将目标温度分别设定为98℃、70℃和54℃时，图12A装置的第一、第二和第三热源作为时间的函数的温度变化。
图61显示了具有12个槽的图12A的装置作为时间的函数的功率消耗。
图62A至E为使用图12B的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为重力倾斜角度的函数的PCR扩增加速。图62A至E的重力倾斜角度分别为0°、10°、20°、30°和45°。
图63A至D为使用图12B的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为重力倾斜角度的函数的PCR扩增加速。图63A至D的重力倾斜角度分别为0°、10°、20°和30°。
图64A至B为使用图12B的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为重力倾斜角度的函数的PCR扩增加速。图64A的重力倾斜角度为0°，图64B的为20°。
图65为使用图12B的装置进行热对流PCR的结果，其显示当引入重力倾斜角度时来自非常低拷贝的人基因组样品的363bpβ-珠蛋白的扩增。
图66为使用图14C的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自1ng质粒样品的152bp序列的扩增。
图67为使用图14C的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自1ng质粒样品的多个序列(大小为约100bp至约800bp)的扩增。
图68A至B为使用图14C的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自10ng人基因组样品的500bpβ-珠蛋白(图68A)和500bpβ-肌动蛋白(图68B)序列的扩增。
图69为使用图14C的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自非常低拷贝的质粒样品的152bp序列的扩增。
图70A至D为使用图17A的装置进行热对流PCR的结果，其显示当接收孔深度为约2mm时作为室直径的函数的PCR扩增的依赖性。图70A的室直径为约4mm，图70B的为约3.5mm，图70C的为约3mm，图70D的为约2.5mm。
图71A至D为使用图17A的装置进行热对流PCR的结果，其显示当接收孔深度为约2.5mm时作为室直径的函数的PCR扩增的依赖性。图71A的室直径为约4mm，图71B的为约3.5mm，图71C的为约3mm，图71D的为约2.5mm。
图72A至D为使用图17A的装置进行热对流PCR的结果，其显示当接收孔深度为约2mm并且引入10°的重力倾斜角度时，作为室直径的函数的PCR扩增的依赖性。图72A的室直径为约4mm，图72B的为约3.5mm，图72C的为约3mm，图72D的为约2.5mm。
图73A至D为使用图17A的装置进行热对流PCR的结果，其显示当接收孔深度为约2.5mm并且引入10°的重力倾斜角度时，作为室直径的函数的PCR扩增的依赖性。图73A的室直径为约4mm，图73B的为约3.5mm，图73C的为约3mm，图73D的为约2.5mm。
图74A至F为使用具有第一热制动器的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为第一热制动器沿槽轴位置的函数的PCR扩增的依赖性。第一热制动器的底端位于第二热源底部上方的0mm(图74A)、约1mm(图74B)、约2.5mm(图74C)、约3.5mm(图74D)、约4.5mm(图74E)和约5.5mm(图74F)。第一热制动器沿槽轴的厚度为约1mm。
图75A至E为使用具有或不具有第一热制动器的装置进行热对流PCR的结果，其显示当不使用重力倾斜角度时作为第一热制动器沿槽轴之厚度的函数的PCR扩增的依赖性。第一热制动器沿槽轴的厚度为0mm(图75A，即没有第一热制动器)、约1mm(图75B)、约2mm(图75C)、约4mm(图75D)和约5.5mm(图75E，即仅有槽而无室结构)。第一热制动器的底端位于第二热源的底部。
图76A至E为使用具有或不具有第一热制动器的装置进行热对流PCR的结果，其显示当引入10°的重力倾斜角度时作为第一热制动器沿槽轴之厚度的函数的PCR扩增的依赖性。第一热制动器沿槽轴的厚度为0mm(图76A，即没有第一热制动器)、约1mm(图76B)、约2mm(图76C)、约4mm(图76D)和约5.5mm(图76E，即仅有槽而无室结构)。第一热制动器的底端位于第二热源的底部。
图77显示使用具有对称加热结构的图12A的装置进行热对流PCR的结果。
图78A至B显示使用具有不对称接收孔的装置进行热对流PCR的结果。接收孔的一侧比相对一侧深约0.2mm(图78A)和约0.04mm(图78B)。
图79显示使用具有不对称热制动器的装置进行热对流PCR的结果。
图80A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案的剖面图，所述实施方案具有一个或更多个光学检测单元600至603，这些检测单元沿槽轴80与第一热源20隔开并且足以检测来自反应容器90中的样品的荧光信号。所述装置包含单个光学检测单元600以检测来自多个反应容器的荧光信号(图80A)，或者包含多个光学检测单元601至603(图80B)以检测来自每个反应容器的荧光信号。在图80A至B所示的实施方案中，光学检测单元检测来自反应容器90的底端92的荧光信号。第一热源20包含光学端口(optical port)610，其位于槽70的底端72与第一热源突出部24之间的槽轴80周围，并且为光的激发和发射提供与槽轴80平行的路径(分别用向上和向下的箭头表示)。
图81A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案的剖面图，所述实施方案具有一个光学检测单元600(图81A)或多于一个光学检测单元601至603(图81B)。每个光学检测单元600至603沿槽轴80与第三热源40隔开并且足以检测位于反应容器90中的样品的荧光信号。在这些实施方案中，反应容器盖(未显示)的中心部分通常适合反应容器90的顶部开口并且作为与槽轴80平行的激发光和发射光的光学端口(图81A至B中分别用向上和向下的箭头表示)发挥作用。
图82为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图，所述实施方案具有与第二热源30隔开的光学检测单元600。在该实施方案中，光学端口610沿与槽轴80垂直的路径位于第二热源30中，光学端口610朝向足以从反应容器90中样品的侧面检测的荧光信号的光学检测单元600。光学端口610为反应容器90和光学检测单元600之间的激发光和发射光提供了路径(如指向左右的箭头所示，或反之亦然)。在这种实施方案中，沿光路的反应容器90的一侧部分和第一室100的一部分也作为光学端口起作用。
图83为示意图，其显示光学检测单元600的剖面图，光学检测单元600定位成从反应容器90底端92检测荧光信号。在这种实施方案中，配置光源620、激发透镜630和激发滤光器640以产生激发光，它们以相对于槽轴80呈直角的方向定位，检测器650、光圈或狭缝655、发射透镜660和发射滤光器670可操作用以检测发射光，它们沿槽轴80定位。还显示了传输荧光发射和反射激发光的二色分束器680。
图84为示意图，其显示光学检测单元600的剖面图，光学检测单元600定位成从反应容器90底端92检测荧光信号。在这种实施方案中，定位光源620、激发透镜630和激发滤光器640以产生沿槽轴80的激发光。沿相对槽轴80呈直角的方向定位检测器650、光圈或狭缝655、发射透镜660和发射滤光器670以检测发射光。还显示了传输激发光和反射荧光发射的二色分束器680。
图85A至B为示意图，其显示光学检测单元600的剖面图，光学检测单元600定位成从反应容器90底端92检测荧光信号。在这些实施方案中，使用单透镜635使激发光成形以及检测荧光发射。在图85A所示的实施方案中，光源620和激发滤光器640沿与槽轴80呈直角的方向定位。在图85B所示的实施方案中，检测荧光发射的光学元件(650、655和670)沿与槽轴80呈直角的方向定位。
图86为示意图，其显示光学检测单元600的剖面图，光学检测单元600定位成为反应容器90顶端91检测荧光信号。如图83中所示，沿与槽轴80呈直角的方向定位光源620、激发透镜630和激发滤光器640，沿槽轴80定位检测器650、光圈或狭缝655、发射透镜660及发射滤光器670。在这种实施方案中，还显示了以可密封方式连接至反应容器90的顶端91的反应容器盖690，并且其包含围绕反应容器90的顶端91的中心点布置且用于传输激发光和发射光的光学端口695。在这种实施方案中，光学端口695进一步被反应容器盖690的上部和反应容器90的上部限定。
图87A至B为示意图，其显示具有反应容器盖690和光学端口695的反应容器90的剖面图。反应容器盖690以可密封方式连接至反应容器90的上部和光学端口695。在这些实施方案中，使得在反应容器90被反应容器盖690密封时，光学端口695的底端696接触样品。在光学端口695的底端696和反应容器盖690一侧提供开放空间698，以使得当反应容器90被反应容器盖690密封时，样品可充满该开放空间。样品弯液面(meniscus)位于高于光学端口695的底端696的位置。在图87A至B中，光学端口695围绕反应容器盖690下部的中心点布置并且进一步被反应容器盖690的下部和反应容器90的上部限定。
图88为示意图，其显示在反应容器90之上布置光学检测单元600的反应容器90d的剖面图。反应容器90用反应容器盖690密封，反应容器盖690具有围绕反应容器90上部中心点布置的光学端口695，其足以接触样品。在这种实施方案中，在不通过反应容器90中所含空气的情况下，激发光和荧光发射通过光学端口695达到样品或反之亦然。
具体实施方式
以下附图标记可帮助读者更好的领会本发明，包含附图和权利要求：
10：装置实施方案
20：第一热源(底层)
21：第一热源的上表面
22：第一热源的下表面
23：第一热源突出部(指向第二热源)
24：第一热源突出部(指向操作台)
30：第二热源(中层)
31：第二热源的上表面
32：第二热源的下表面
33：第二热源突出部(指向第一热源)
34：第二热源突出部(指向第三热源)
40：第三热源(顶层)
41：第三热源的上表面
42：第三热源的下表面
43：第三热源突出部(指向第二热源)
44：第三热源突出部(指向单元外)
50：第一绝热体(或第一绝热间隙)
51：第一绝热体室
60：第二绝热体(或第二绝热间隙)
61：第二绝热体室
70：槽
71：槽/通孔的顶端
72：槽的底端
73：接收孔
74：接收孔间隙
80：槽的(中心)轴
90：反应容器
91：反应容器的顶端
92：反应容器的底端
93：反应容器的外壁
94：反应容器的内壁
95：反应容器的(中心)轴
100：第一室
101：第一室的顶端，限定出该室的上部界限
102：第一室的底端，限定出该室的下部界限
103：第一室的第一壁，限定出该室的水平界限
105：第一室的间隙
106：第一室的(中心)轴
110：第二室
111：第二室的顶端
112：第二室的底端
113：第二室的第一壁
115：第二室的间隙
120：第三室
121：第三室的顶端
122：第三室的底端
123：第三室的第一壁
125：第三室的间隙
130：第一热制动器
131：第一热制动器的顶端
132：第一热制动器的底端
133：第一热制动器的第一壁，基本上接触槽的至少一部分
140：第二热制动器
141：第二热制动器的顶端
142：第二热制动器的底端
143：第二热制动器的第一壁，基本上接触槽的至少一部分
160：加热/冷却元件
160a：第一热源的加热(和/或冷却)元件
160b：第二热源的加热(和/或冷却)元件
160c：第三热源的加热(和/或冷却)元件
170：温度传感器
170a：第一热源的温度传感器
170b：第二热源的温度传感器
170c：第三热源的温度传感器
200：第一固定元件，包含以下元件中的至少一个
201：螺钉或紧固件(通常由绝热体制得)
202a：垫圈或定位支座(通常由绝热体制得)
202b：间隔物或定位支座(通常由绝热体制得)
202c：间隔物或定位支座(通常由绝热体制得)
203a：第一热源的固定元件
203b：第二热源的固定元件
203c：第三热源的固定元件
210：第二固定元件(通常制成翼结构)
——用以将热源组件组装到第一壳体元件300上
300：第一壳体元件
310：第三绝热体(或第三绝热间隙)
——位于热源侧面与第一壳体元件侧壁之间；以及
——填充有绝热体(如空气、气体或固体绝热体)
320：第四绝热体(或第四绝热间隙)
——位于第一热源底部与第一壳体元件底壁之间；以及
——填充有绝热体(如空气、气体或固体绝热体)
330：底座
400：第二壳体元件
410：第五绝热体(或第五绝热间隙)
——位于第一壳体元件侧壁与第二壳体元件侧壁之间；以及
——填充有绝热体(如空气、气体或固体绝热体)
420：第六绝热体(或第六绝热间隙)
——位于第一壳体元件底壁与第二壳体元件底壁之间；以及
——填充有绝热体(如空气、气体或固体绝热体)
500：离心机单元
501：马达
510：离心旋转轴
520：旋转臂
530：倾斜轴
600至603：光学检测单元
610：光学端口
620：光源
630：激发透镜
635：透镜
640：激发滤光器
650：检测器
655：光圈或狭缝
660：发射透镜
670：发射滤光器
680：二色分束器
690：反应容器盖
695：光学端口
696：光学端口的底端
697：光学端口的顶端
698：反应容器内壁与光学端口侧壁之间的开放空间
699：光学端口的侧壁
如所讨论的，在一个实施方案中，本发明的特征为适于进行热对流PCR扩增的三阶段热对流装置。
在一个实施方案中，所述装置包含作为可操作连接的组件的以下元件：
(a)用于对槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第一热源，所述槽适于容纳进行PCR的反应容器，
(b)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第二热源，所述下表面朝向第一热源的上表面，
(c)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第三热源，所述下表面朝向第二热源的上表面，其中所述槽由与第一热源接触的底端和与第三热源的上表面邻接的通孔限定，并且其中底端与通孔的中心点之间形成槽轴，围绕其布置所述槽，
(d)围绕所述槽布置且在第二或第三热源的至少一部分内的至少一个温度成形元件，如至少一个间隙或空间(例如室)，所述室间隙足以降低第二或第三热源与槽之间的热传递；以及
(e)适于在第一热源内容纳所述槽的接收孔。
实施时，所述装置使用位于装置内的多个热源(通常为3个、4个或5个热源，优选为3个热源)，从而在典型的实施方案中每个热源与其它热源基本上平行。在这种实施方案中，装置将产生适于快速且有效的以对流为基础的PCR方法的温度分布。通常装置包含布置在第一、第二和第三热源内的多个槽，从而使得使用者可同时进行多个PCR反应。例如，装置可包含至少1个或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个至约10个、11个或12个、20个、30个、40个、50个或多至数百个延伸穿过第一、第二和第三热源的槽，对于许多发明应用一般优选约8个至约100个槽。一个优选的槽功能是接收装有使用者的PCR反应的反应容器，以及在反应容器与a)热源，b)温度成形元件和c)接收孔中的至少一个(优选全部)之间提供直接或间接的热交换。
三个热源中每个热源与其它热源的相对位置是本发明的重要特征。装置的第一热源通常位于底部并且保持适于核酸变性的温度，第三热源通常位于顶部并且保持适于变性的核酸模板与一种或更多种寡核苷酸引物退火的温度。在一些实施方案中，第三热源保持适于退火和聚合二者的温度。第二热源通常位于第一和第三热源之间并且保持适于引物沿变性的模板聚合的温度。因而，在一个实施方案中，第一热源中槽的底部和第三热源中槽的顶部分别具有适于PCR反应变性和退火步骤的温度分布。槽的顶部与底部之间(其中布置第二热源)是过渡区，其中发生大部分从第一热源的变性温度(最高温度)到第三热源的退火温度(最低温度)的温度变化。因而，在典型的实施方案中，过渡区的至少一部分具有的温度分布适于引物沿变性的模板聚合。当第三热源维持适于退火和聚合二者的温度时，除过渡区的上部之外，第三热源中槽的顶部也提供适于聚合步骤的温度分布。因此，过渡区中的温度分布对于完成有效的PCR扩增(特别是对于引物延伸)是重要的。反应容器内的热对流通常依赖于过渡区中产生的温度梯度的大小和方向，因而过渡区中的温度分布对于在反应容器内产生有助于PCR扩增适当的热对流也是重要的。多个温度成形元件可与装置一起使用以在过渡区中产生适当的温度分布，用以支持快速且有效的PCR扩增。
通常，将每个热源各自保持在适于引起热对流PCR的每个步骤的温度。另外，在装置的特征为具有三个热源的一些实施方案中，三个热源的温度被适当地排列以诱导经过反应容器内样品之热对流。本发明引起适当热对流的一个一般条件是，在装置内保持较高温度的热源比保持较低温度的热源位于更低的位置。因而，在一个优选的实施方案中，在装置中第一热源位于比第二或第三热源更低的位置。在这种实施方案中，一般优选的是在装置中将第二热源放置在低于第三热源的位置。只要实现预期结果，其它设置也是可行的。
如所讨论的，本发明的一个目的是提供具有至少一个温度成形元件的装置。在大多数实施方案中，装置的每个槽将包含少于约10个这样的元件，例如每个槽有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个温度成形元件。温度成形元件的一个功能是通过提供支持PCR的结构或位置特征而提供有效的热对流介导的PCR。如从以下实施例和讨论中将更加显而易见的，这些特征包括但不限于：至少一个间隙或空间(如室)；至少一个位于热源之间的绝热体或绝热间隙；至少一个热制动器；在第一、第二和第三热源的至少一个中的至少一个突出结构；装置内(尤其是槽、第一热源、第二热源、第三热源、间隙(如室)、热制动器、突出部、第一和第二绝热体或接收孔的至少一个中)的至少一个不对称布置的结构；或者至少一个结构的或位置的不对称。结构不对称通常根据槽和/或槽轴确定。位置不对称的一个实例为相对于重力方向倾斜或以另外方式放置装置。
词语“间隙”和“空间”常常在本文中互换使用。间隙是在装置内小的封闭或半封闭空间，其意在辅助热对流PCR。具有确定结构的大间隙或大空间在本文中称作“室”。在许多实施方案中，室包含间隙并在本文中称作“室间隙”。间隙可以是空的，或者被本文所述的绝热材料充满或部分充满。对于许多应用，用空气填充的间隙或室通常是有用的。
可在本发明装置中使用一个温度成形元件或其组合(相同或不同)。将详细讨论示例性的温度成形元件。
示例性温度成形元件
A.间隙或室
在本发明的一个实施方案中，每个槽包含至少一个作为温度成形元件的间隙或室。在一个典型的实施方案中，装置包含1个、2个、3个、4个、5个或者甚至6个围绕各个槽布置并且在第二和第三热源的至少一个中的室，例如，每个槽有1个、2个或3个这样的室。在本发明的这个实例中，室在槽与第二或第三热源之间产生了空间，允许使用者在装置内精确地控制温度分布。也就是说，所述室帮助控制过渡区中槽温度分布的形状。“过渡区”意指大致在接触第三热源的槽上部与接触第一热源的槽下部之间的槽区域。只要实现预期结果，所述室几乎可以位于槽周围的任何位置。例如，在第二热源、第三热源或第二和第三热源两者之内或附近定位的室(或多于一个室)将用于许多发明应用。在装置的槽具有多个室的实施方案中，装置中的每个室可以与其他室分开，并且在一些情况下可以与一个或更多个其它室接触。
一个间隙或室结构或者不同间隙或室结构的组合适用于本发明。一般的要求是，所述室应该在过渡区产生满足至少一个(优选全部)以下条件的温度分布：(1)产生的温度梯度(尤其是穿过槽的竖直面的)必须足够大以产生穿过反应容器内的样品的热对流；和(2)由温度梯度这样产生的热对流必须足够地慢(或适当地快)从而可以为PCR过程的每个步骤提供足够的时间。尤其地，由于聚合步骤通常比变性和退火步骤花费更多时间，因而特别重要的是要使聚合步骤的时间足够长。间隙或室配置的具体示例在以下公开。
如果期望，本发明装置内的槽可具有至少一个围绕槽轴基本对称或不对称布置的室。在许多实施方案中，优选具有1个、2个或3个室的装置。所述室可被布置在一个热源或热源的组合中，例如在第一热源、第二热源、第三热源或第二和第三热源两者中。对于一些装置，在第二热源或第二和第三热源内具有1个、2个或3个室将尤其有用。这些室的实施方案的实例提供如下。
在一个实施方案中，所述室将进一步由本文所称的“突出部”限定，所述“突出部”来自第一热源、第二热源和第三热源中的至少一个。在一个具体实施方案中，突出部以大体平行于槽轴的方向从第二热源向第一热源延伸。其它实施方案是可能的，如包括以大体平行于槽轴的方向从第二热源向第三热源延伸的第二突出部的实施方案。另外的实施方案包括这样的装置，其具有以大体平行于槽轴的方向从第一热源向第二热源延伸的突出部。还有一些实施方案包括这样的装置，其具有也以大体平行于槽轴的方向从第三热源向第二热源延伸的突出部。在一些实施方案中，所述装置可包含至少一个相对于槽轴倾斜的突出部。在本发明的这些实例中，可以大幅降低第一、第二和/或第三热源的体积以及热源之间的热传递，同时延长所述室沿槽轴的尺寸。已发现这些特征提高热对流PCR的效率并且降低功率消耗。
图2A、3A、4A、9B、12A、14A、15A和22A提供了用于本发明的可用的室的一些实例。其它适当的室结构在以下公开。
B.热制动器
本发明装置内的每个槽可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个热制动器(通常为一个或两个热制动器)以控制装置内的温度分布。在很多实施方案中，热制动器由顶端和低端以及任选地与槽热接触的壁限定。热制动器通常与间隙或室的壁(如果存在)相邻或在它们附近布置。可以通过包含作为温度成形元件的热制动器来控制(通常降低)不期望的从一个热源到另一个的温度分布谱干扰。如将在以下被详细描述，发现热对流PCR扩增效率对热制动器的位置和厚度敏感。可用的热制动器可相对于槽对称或不对称布置。
只要实现预期结果，本文所述的一个或更多个热制动器可以位于所装置各个槽周围的任何位置。因而，在一个实施方案中，可以将热制动器定位为与室相邻或靠近室以屏蔽或降低来自邻接热源的不期望的热流并实现适当的PCR扩增。
图10B、10D、10F、11b、14B和14C提供了用于本发明的适当热制动器的一些实例。其它适当的热制动器在以下公开。
C.位置或结构不对称
发现当本发明装置包含至少一个位置或结构不对称元件(例如，每个槽有1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个这样的元件)时，热对流PCR更快且更有效。这些元件可被置于一个或更多个槽周围甚至整个装置中。不希望受到理论约束，认为装置内存在的不对称元件以使扩增过程更快且更有效的方式增加了浮动力。发现通过在装置内引入至少一个可造成相对于槽轴或重力方向的“水平方向上不对称的加热或冷却”的位置或结构不对称，可以帮助热对流PCR。不希望受到理论约束，认为其中具有至少一个不对称元件的装置打破了装置对槽进行加热或冷却的对称性并且帮助或增加浮动力的产生，从而使扩增过程更快且更有效。“位置不对称元件”意指使槽轴或装置相对于重力方向倾斜的结构元件。“结构不对称元件”意指装置内相对于槽和/或槽轴不对称布置的结构元件。
如所讨论的，为了产生热对流(并且也为了满足PCR过程的温度需要)，有必要在样品流体内产生竖直的温度梯度。但是，即使存在竖直的温度梯度，如果温度分布的等温线相对于重力方向(即竖直方向)是平的(即水平的)，则可能不产生引起热对流的浮动力。在这样的平温度分布中，由于各部分流体与同一高度的其它部分流体具有相同的温度(以及因此造成的相同的密度)，流体不会经受任何浮动力。在对称的实施方案中，所有结构元件相对于槽或槽轴对称，并且重力方向基本上与槽或槽轴平行。在这些对称的实施方案中，槽或反应容器内温度分布的等温线相对于重力场常常是近乎或完全平的，因而常常很难产生足够快的热对流。不希望受到理论约束，认为可以在温度分布中引起波动或不稳定的一些干扰的存在常常帮助或增加浮动力的产生，并且使PCR扩增更快且更有效。例如，通常存在于一般环境中的小振动可干扰近乎或完全平的温度分布，或者装置中微小的结构缺陷可打破槽/室结构或反应容器结构的对称性，从而干扰近乎或完全平的温度分布。在这种经干扰的温度分布中，至少部分流体与同一高度的其它部分流体相比可具有不同的温度，因而，由于这种温度波动或不稳定，很容易产生浮动力。在对称的实施方案中，这种天然或偶然的干扰对产生热对流通常很重要。当装置内存在位置或结构不对称，可以可控地使槽或反应容器内的温度分布在同一高度中不均匀(即，水平方向上不均匀或不对称)。在这种水平方向上不对称的温度分布存在的情况下，可容易且通常更强烈地产生浮动力，以使热对流PCR更快且更有效。有用的位置或结构不对称元件引起槽相对于槽轴或重力方向有“水平方向上不对称的加热或冷却”。
通过一个策略或策略的组合，可以将不对称引入本发明装置中。在一个实施方案中，例如通过相对于重力方向倾斜装置或槽，可以使发明装置具有施加在该装置上的位置不对称。通过整合进能够相对于重力方向偏置槽轴的结构，可以使几乎任何本文公开的装置实施方案倾斜。可用结构的一个例子为楔形物或相关的倾斜形状，或者倾斜的槽。本发明实施方案的例子参见图12B和18A至B。
在另一些实施方案中，装置内至少一个以下元件可相对于槽轴不对称布置：a)槽；b)间隙(如室)；c)接收孔；d)第一热源；e)第二热源；f)第三热源；g)热制动器；和h)绝热体。因而，在一个发明实施方案中，装置的特征为作为结构不对称元件的室。在本发明的实例中，装置可包含一种或更多种其它结构不对称元件，如室、接收孔、热制动器、绝热体或一个或更多个热源。在另一个实施方案中，结构不对称元件是接收孔。在又一个实施方案中，结构不对称元件是热制动器或多于一个热制动器。所述装置可以包含一个或更多个其它不对称或对称结构元件，如第一热源、第二热源、第三热源、室、槽、绝热体等。
在第一热源、第二热源和/或第三热源的特征为结构不对称元件的一些实施方案中，该不对称可尤其存在于通常与槽轴平行地延伸的突出部(或多于一个突出部)。
以下提供另一些实例，具体参见图21A至B、22A至D、23A至B、24A至B、25、26和27A至B。
如所讨论的，槽和室之一或此二者可相对于槽轴对称或不对称地布置在装置中。实例还参见图6A至J、7A至I和8A至P，其中槽和/或室为对称或不对称结构元件。
通常理想的是其中接收孔为结构不对称元件的装置。不期望受任何理论约束，认为接收孔与室或第二热源底端之间的区域是装置中产生热对流流动的主要驱动力的位置。显而易见的是，该区域是发生最初加热至最高温度(即变性温度)和转变为最低温度(即聚合温度)的区域，因此最大的驱动力应源于该区域。
例如参见图13和21A至B，其显示不对称接收孔结构。
D.绝热体和绝热间隙
通常有用的是将各热源与其它热源隔离以实现本发明的目的。从以下讨论中显而易见的是，置于各热源之间的绝热间隙中的多种绝热体可用于所述装置中。因而在一个实施方案中，将第一绝热体置于第一与第二热源之间的第一绝热间隙中，将第二绝热体置于第二与第三热源之间的第二绝热间隙中。可使用具有低导热率的一种气体或固体绝热体或其组合。对于本发明的许多目的通常有用的绝热体是空气(静止空气在室温具有约0.024W·m-1·K-1的低导热率，随着温度增加逐渐增加)。尽管可以使用比静止空气导热率高的材料而不显著降低装置除功率消耗之外的性能，但是一般优选使用导热率与空气相似或小于空气的气体或固体绝热体。良好的热绝热体的例子包括但不限于木材、软木、织物、塑料、陶瓷、橡胶、硅、氧化硅、碳等。由这些材料制得的硬质泡沫尤其有用，因为它们显示出非常低的导热率。硬质泡沫的例子包括但不限于泡沫聚苯乙烯(Styrofoam)、聚氨酯泡沫、氧化硅气溶胶、碳气溶胶、SEAgel、硅酮泡沫或橡胶泡沫、木材、软木等。除空气外，聚氨酯泡沫、氧化硅气溶胶和碳气溶胶是在升高的温度下使用的尤其有用的绝热体。
在具有绝热间隙的本发明装置的实施方案中优势显而易见。例如，装置的使用者能够：1)通过大幅降低从一个热源到下一个热源的热传递来降低功率消耗；2)控制产生驱动力的温度梯度(以及因此控制热对流)，这是由于在绝热间隙区域中发生从一个热源到下一个热源的大幅温度变化；和3)平衡三个热源之间的热传递，从而简化同时保持三个邻接布置的热源的温度的机械装置，从而使功率消耗尽可能小。发现具有低导热率绝热体的较大绝热间隙一般有利于降低功率消耗。使用突出部结构对于大幅降低功率消耗尤其有用，这是因为可以提供较大的平均间隙，同时独立地控制各绝热间隙的不同区域(即，分别控制接近和远离槽的区域)。还发现改变绝热间隙(尤其在接近槽的区域中)可以控制热对流的速度，因而控制PCR扩增的速度。已发现控制接近槽区域的第一绝热间隙在调节热对流速度中尤其有用。另外，已发现第一和第二绝热间隙沿槽轴的平均厚度比在平衡三个热源之间的热传递中非常有用。两个邻接热源之间热传递的量与这两个热源之间的间距成反比。因此，由于三个热源之间热传递的平衡，通过调整第一和第二绝热间隙的平均厚度比，位于第一与第三热源之间的第二热源可被加热至接近期望温度而没有功率消耗。这不仅大幅降低装置的功率消耗，还极大简化了装置所需要的温度控制机械装置和机制。在许多例子中，通过选择适合于三个热源之期望温度的平均厚度比，制造所述装置可以仅使用加热元件而无需冷却元件，后者通常消耗更多功率且经常更庞大。具有绝热间隙的其它优势将从以下的讨论和实施例中显而易见。
从以下的讨论和实施例中显而易见的是，本发明的装置可包含一个前述温度成形元件或其组合。因而，在一个实施方案中，装置的特征为至少一个室(例如1个、2个或3个室)，其围绕槽对称地布置并且通常与将第一、第二和第三热源彼此分隔的第一和第二绝热体一起平行于槽轴。在这种实施方案中，所述装置还可包含一个或两个热制动器以进一步帮助热对流PCR。在所述装置包含两个室(例如在第二热源内)的一个实施方案中，每个室相对于槽轴可具有相同或不同的水平位置。在另一个实施方案中，第二热源的特征为突出部向第一和/或第三热源延伸并且一般平行于槽轴，其中突出部限定出室。在这种实施方案中，所述装置还包含从第一热源向第二热源延伸的突出部；以及任选地从第三热源向第二热源延伸并且一般平行于槽轴的突出部。在这些实施方案中，第二热源可不包含室、包含一个或两个相对于槽轴对称布置的室，第三热源可不包含室、包含一个或两个相对于槽轴对称布置的室，前提是至少一个所述热源包含室。
如所讨论的，通常有用的是在装置内包含不对称结构元件。因而，本发明的一个目的是在装置内包含相对于槽轴不对称布置的接收孔。在这种实施方案中，所述装置可包含一个或更多个相对于槽轴对称或不对称布置的室。可替换地或另外地，所述装置的特征可以是至少一个热制动器相对于槽轴不对称布置。在这种实施方案中，所述装置可包含相对于槽轴对称或不对称布置的一个或更多个室。可替换地或另外地，所述装置的特征可以是至少一个突出部相对于槽轴不对称布置。在一个实施方案中，从第一热源延伸出的突出部围绕槽轴不对称布置，而从第二热源延伸出的一个或两个突出部(和室)围绕槽轴对称布置。可替换地或另外地，第二热源的一个或更多个突出部(和室)可以围绕槽轴不对称布置。在这些实施方案中，所述装置还可包含从第三热源向第二热源延伸的突出部，其相对于槽轴对称或不对称布置。
但是，在另一个实施方案中，装置内的一个或更多个槽甚至所有的槽不需要包含任何室或间隙结构。在这种实例中，所述装置优选包含一个或更多个其他温度成形元件，如相对于重力的槽倾斜角(位置不对称的一个实例)。可替换地或另外地，槽可包含结构不对称或经受本文提供的离心加速度。例如，参见实施例6和图76E(仅有槽，具有10°的重力倾斜角)与图75E(仅有槽，没有重力倾斜角)比较。
应理解，可以在本发明的装置中存在替代的或额外的对称元件。例如，所述装置可包含两个或三个室，其中一个或更多个室相对于槽轴不对称布置。在装置包含单个室的实施方案中，该室可相对于槽轴不对称布置。一些实施方案包括这样的装置，其中从第二热源向第一和第三热源的每个延伸的突出部相对于槽轴不对称布置。
如期望，任何前述发明实施方案可包含位置不对称，其通过相对于重力方向倾斜装置或槽或者将装置或槽置于楔形物或其它倾斜形状上来实现。
应理解，只要实现期望结果，装置实施方案的几乎任何温度成形元件(无论在装置内相对于槽轴是对称还是不对称布置)可以与一个或更多个其他温度成形元件(包括装置的其它结构或位置特征)组合。
应理解，本发明是灵活的，并且包括每个槽包含相同或不同温度成形元件的装置。例如，所述装置的一个槽可以不具有室或间隙结构，而装置的另一个槽包含1个、2个或3个这样的室或间隙结构。只要实现期望结果，本发明不限于任何槽构造(或一组槽构造)。但是，通常优选的是本发明装置的所有槽具有相同数目和类型的温度成形元件，以简化使用和制造时的设计。
涉及以下附图和实施例意于提供对热对流PCR装置的更佳理解。其目的不在于并且不应被认为是限制本发明的范围。
见图1和2A至C，装置10的特征为作为有效连接组件的以下元件：
(a)用于加热或冷却槽70并且包含上表面21和下表面22的第一热源20，其中槽70适于容纳进行PCR的反应容器90；
(b)用于加热或冷却槽70并且包含上表面31和下表面32的第二热源30，其中下表面32朝向第一热源21的上表面；
(c)用于加热或冷却槽70并且包含上表面41和下表面42的第三热源40，其中下表面42朝向第二热源31的上表面，其中槽70由接触第一热源20的底端72和与第三热源上表面41邻接的通孔71限定。在这种实施方案中，底端72与通孔71之间的中心点形成槽轴80，围绕其布置槽70；
(d)围绕槽70布置并且在第二热源30或第三热源40的至少一部分内的至少一个室。在这种实施方案中，第一室100包含在第二热源30或第三热源40与槽70之间的室间隙105，其足以降低第二热源30或第三热源40与槽70之间的热传递；和
(e)其适于在第一热源20内容纳槽70的接收孔73。
短语“可操作连接”、“可操作结合”等意指装置的一个或更多个元件可操作性地连接至一个或更多个其它元件。更具体地，这种结合可以是直接的或间接的(例如热)、物理的和/或功能性的。一些元件被直接连接而另一些元件被间接连接(例如热)的装置在本发明的范围内。
在图2A所示的实施方案中，所述装置还包含位于第一热源20上表面21与第二热源30下表面32之间的第一绝热体50。所述装置还包含位于第二热源30上表面31与第三热源40下表面42之间的第二绝热体60。应理解，只要绝热体的数目足够实现预期结果，本发明的实施不限于仅具有两个绝热体。也就是说，本发明可包含多个绝热体(例如，2个、3个或4个绝热体)。在图2A所示的实施方案中，第一绝热体50沿槽轴80的长度大于第二绝热体60沿槽轴80的长度。在另一些实施方案中，第一绝热体50的长度可小于或基本上等于第二绝热体60的长度。但是，一般优选的是第一绝热体50的长度大于第二绝热体60的长度。这种实施方案的优势在于降低功率消耗和便于温度控制。在另一个实施方案中，优选沿槽轴80，第二热源30的长度大于第一热源20或第三热源30的长度。尽管在另一些实施方案中，第二热源30的长度可以小于或基本上等于第一热源20或第三热源40的长度，但是有利的是第二热源30具有较大长度以使聚合步骤有较长的路径长度。
在图2A所示的一个实施方案中，第一绝热体50、第二绝热体60或绝热体50、60二者填充有具有低导热率的绝热体。优选的热绝热体具有的导热率为约几十W·m-1·K-1至约0.01W·m-1·K-1或者更少。在这种实施方案中，将第一绝热体50沿槽轴80的长度(以及优选地第二绝热体60沿槽轴80的长度)制得较小，例如，约0.1mm至约5mm，优选约0.2mm至4mm。在本发明的这个实例中，从一个热源到邻接热源的热损失可非常大，在运行装置的过程中引起大的功率消耗。对于许多应用，通常优选的是将这三个热源(例如，20、30和40)中的至少一个与其它的隔离，优选为将两个热源彼此热隔离(例如，将20和30彼此隔离，30和40彼此隔离等)，对于许多发明应用而言，一般优选的是所有的三个热源(例如20、30和40)均彼此热隔离。使用一个或更多个绝热体常常是有用的。例如，在第一绝热间隙50和第二绝热间隙60中使用绝热体常常可降低功率消耗。
因此，在图2A至C所示的本发明的实施方案中，第一绝热体50包含固体或气体或者由其组成。可替换地或另外地，第二绝热体60包含固体或气体或者由其组成。
在图2A至C所示的装置中，第二热源内室壁103与槽70之间的室间隙105可部分或全部地填充绝热体(如气体、固体、或气体-固体组合)。通常有用的绝热体包括空气以及导热率与空气类似或比空气低的气体或固体绝热体。由于室间隙105的一个重要功能是控制(通常为降低)从第二热源向第二热源内的槽的热传递，所以也可以使用导热率高于空气的材料如塑料或陶瓷。但是，当使用这些导热率更高的材料时，与使用空气作为绝热体的实施方案相比，室间隙105应被调整为更大。类似地，如果使用导热率比空气更低的材料，与空气绝热体的实施方案相比，室间隙105应当被调整为更小。
尤其地，图2A至C显示了一个装置的实施方案，其中在第一绝热体50和第二绝热体60以及室间隙105中使用空气或气体作为绝热体。这些间隙内的槽结构用虚线描绘，以代表当空气(或气体)用作绝热体时这些结构的不可见性。如果期望实现特定的发明目的，可以使所述装置适合于将固体绝热体用于室间隙105。可替换地或另外地，所述装置可在第一绝热体50和第二绝热体60中包含固体绝热体。
图2B和2C显示图1中所标记的装置A-A和B-B剖面的透视图。显示了空气或气体被用作绝热体的实施方案。
如图1和2A至C的实施方案所示，所述装置的特征为具有12个槽(在本文中有时称作反应容器槽)。但是，根据预期用途可以有更多或更少的槽，例如，约1或2至约12个槽，或者约12至几百个槽，优选约8至约100个槽。优选地，每个槽独立地适于容纳反应容器90，反应容器90通常由第一热源20内的底端92和第三热源41顶部上的顶端91限定。第一热源20、第二热源30和第三热源40中的槽70通常穿过第一绝热体50和第二绝热体60。槽70的顶端71和底端72之间的中心点形成槽80的轴(在本文中有时称作槽轴)，围绕其布置热源和绝热体。
在图1和2A至C所示的实施方案中，槽70适合于使反应容器90可适合地安装在其中，即，槽70的大小形状与图2A所示的反应容器下部基本相同。在运行时，槽作为容纳反应容器的接收物发挥作用。但是，如以下更详细解释的，可相对于槽轴80调整和/或移动槽70的结构，以在反应容器90与热源20、30和40的一个或更多个之间提供不同热接触可能性。
例如，在第三热源中所形成的通孔71可作为槽70的顶部发挥功能。在这种实施方案中，第三热源40内的槽70与第三热源40物理接触。也就是说，延伸进第三热源40的通孔71的壁与反应容器90物理接触。在这种实施方案中，所述装置可提供从第三热源40至槽70和反应容器90的有效热传递。
对于许多发明应用，一般优选的是第三热源中通孔的尺寸与槽或反应容器的尺寸基本相同。但是，其他通孔的实施方案在本发明的范围内并且在本文中公开。例如，在图2A至C中，可以将第三热源40中的通孔71制造为比反应容器90的尺寸更大。但是，在这种情况下，从第三热源40到反应容器90的热传递可变得效率较低。在这种实施方案中，降低第三热源40的温度对于最优地实施发明可有用。对于大多数的发明应用，普遍有用的是第三热源40中通孔71的尺寸与反应容器90的尺寸基本相同。
在接收孔73具有在第一热源20中形成的封闭底端72的本发明实施方案中，其常常作为槽70的底部发挥作用。例如参见图2A。在这样的一个实施方案中，第一热源20的接收孔73的尺寸与反应容器92底部的尺寸基本相同，在大多数这种实施方案中，这将对反应容器90提供物理接触和有效的热传递。如将要讨论的，在一些本发明实施方案中，第一热源20中的接收孔73可以具有比反应容器底部稍大的部分室结构或尺寸。
室结构和功能
在图2A至C所示的装置中，第一室100围绕槽70对称布置且在第二热源30内。装置10内存在的这种物理上不接触(但是热接触)的空间提供了许多益处和优势。例如，不希望受到任何理论的限制，第一室100的存在以所期望的较低效率提供从第二热源30至槽70或反应容器90的热传递。也就是说，室100大幅降低了第二热源30与槽70或反应容器90之间的热传递。如从以下的讨论中更加显而易见的，本发明的该特征支持在装置10内进行稳定且更快的热对流PCR。
尽管通常有用的是在第二热源30内包含物理上不接触的空间，但是在装置10中一个或更多个其他热源(例如第一热源20和第三热源40之一或二者)内包含这样的空间也在本发明的范围内。例如，第一热源20或第三热源40可包含一个或更多个室，意在减少一个或更多个热源与室70或反应容器90之间的热传递。
图2A至C中所示的本发明实施方案在第二热源20中包含第一室100作为关键结构元件。在本发明的该实施例中，第一室100独立地适于容纳从第二热源顶部31向第二热源底部32和第一热源顶部21的槽70。第一室100由以下限定：第二热源30顶部上的顶端101、第二热源30底部上的底端102，以及围绕槽轴80布置并且与第二热源30内的槽70隔开的第一室壁103。室壁103以一定的距离围绕第二热源20内的槽70，形成室间隙105。在室壁103与槽70之间的室间隙105优选为约0.1mm至约6mm，更优选为约0.2mm至约4mm。第一室100的长度为约1mm至约25mm，优选为约2mm至约15mm。
本发明适于使用多种热源和绝热体构造。例如，第一热源20沿槽轴80的长度可以大于约1mm，优选为约2mm至约10mm；第二热源30沿槽轴80的长度可以为约2mm至约25mm，优选为约3mm至约15mm；第三热源40沿槽轴80的长度可以大于约1mm，优选为约2mm至约10mm。如所讨论的，一般有用的是装置具有第一绝热体50和第二绝热体60。例如，在没有突出部的实施方案中，第一绝热体50沿槽轴80的长度可以为约0.2mm至约5mm，优选为约0.5mm至4mm。第二绝热体60沿槽轴80的长度可以为约0.1mm至约3mm，优选为约0.2mm至约2.5mm。在存在突出部结构的另一些实施方案中，第一绝热体50和第二绝热体60沿槽轴80可具有不同的长度，其取决于相对于槽70的位置。例如，在接近槽或其周围的区域(即突出部内)，第一绝热体50沿槽轴的长度可以为约0.2mm至约5mm，优选为约0.5mm至4mm，第二绝热体60沿槽轴80的长度可以为约0.1mm至约3mm，优选为约0.2mm至2.5mm。在远离槽的区域(即，突出部结构外)，第一绝热体50沿槽轴的长度可以为约0.5mm至约10mm，优选为约1mm至8mm，第二绝热体60沿槽轴80的长度可以为约0.2mm至约5mm，优选为约0.5mm至4mm。
如所讨论的，本发明装置在至少一个热源(如第二热源)内可包含多个室(例如，2个、3个、4个、5个或更多个室)。
在图3A至B所示的实施方案中，所述装置包含完全位于第二热源30内的第一室100。在这种实施方案中，第一室100包含沿槽轴80面向第一室底端102的室顶端101。所述装置还包含完全位于第二热源30内并且与第一室100的顶端101接触的第二室110。第一室100的壁103基本上与槽轴80平行排列。第二室110还由位置与槽轴80基本上平行的壁113限定。第二室110还由与第二热源30的顶端31接触的顶端111以及与第一室100的顶端101接触的底端112限定。如所示，第一室100和第二室110分别包含间隙105和115。在所示的实施方案中，第二室110的顶端111和底端112各自与槽轴80垂直。如图3A中所示，第一室100距离槽轴80的宽度或半径小于第二室110距离槽轴80的宽度或半径(约小0.9至0.3倍)。但是，如图3B的实施方案所示，第一室100距离槽轴80的的宽度或半径大于第二室110距离槽轴80的宽度(大大约1.1至约3倍)。
在图3A至B中，第一室100和第二室110提供了高度有效的温度控制或成形作用。在这些实施方案中，第一室100(图3A)或第二室110(图3B)比其它室有更小的直径或宽度。与其它室相比，第二室110(图3B)或第一室100(图3A)的狭窄部分提供来自第二热源30的更有效的热传递。另外，在这些实施方案中所示的室构造优选阻碍来自更靠近狭窄部分的热源的热传递(例如，图3A中的第一热源20)。
除非另外指明，具有多个室的实施方案通过自从第一热源始(通常的位置为最靠近装置的底部)对室进行编号来描述。因此，最接近第一热源的室被指定为“第一室”，与第一热源第二接近的室被指定为“第二室”，依此类推。
热制动器的结构和功能
图4A显示了具有位于热源之一中的3个室的本发明实施方案。具体地，装置10具有位于第二热源30中的第一室100、第二室110和第三室120。在这种实施方案中，第三室120包含间隙125。第三室120包含位置基本上与槽轴80平行的壁123。第三室120还由与第二热源顶部31邻接的顶端121限定。第三室120还由与第二热源30内特定区域接触的底端122限定(参见图4A中的虚线圆)。如所示，第三室120的顶端121和底端122与槽轴80垂直。
图4B是图4A所示虚线圆的放大图。具体地，第一室100与第二室110之间的区域限定出第一热制动器130。如上所述，第一热制动器130意在控制装置10内的温度分布。在所示的实施方案中，第一热制动器130由顶端131和底端132以及基本上接触槽70的壁133限定。在这种实施方案中，第一热制动器130的功能是降低或屏蔽不期望的从第一热源20到第二热源30和第三热源40的温度分布谱干扰。第一热制动器130的另一个功能是在第二热源30与槽70之间提供有效的热传递，以使该区域中的槽快速地达到第二热源30的温度。第一热制动器130围绕槽70对称布置。
如图4B中所示，本发明的该实施方案包含第二热制动器140，其由第二室110与第三室120之间的区域限定。尤其地，第二热制动器140还由通过壁143基本上接触至少部分槽70的顶端141和底端142限定。第二热制动器140的一个重要功能是进一步帮助控制装置10内的温度分布。在这种实施方案中，第二热制动器140尤其用于降低或屏蔽不期望的从第三热源40到第二热源30的温度分布谱干扰，并且还在第二热源30与槽70之间提供有效的热传递，以便使该区域的温度保持为接近第二热源30的温度。第二热制动器140围绕槽70对称布置。
如期望，第一室100、第二室110和第三室120(或其部分)中的至少一个可包含适当的固体或气体绝热体。可替换地或另外地，所示的第一绝热体50和/或第二绝热体60之一或二者可包含适当的固体或气体或者由其组成。适当的绝缘气体的一个实例为空气。
槽结构
A.竖直形状
本发明完全适用数种槽构造。例如，图5A至D显示了适当槽构造的竖直剖面。如所示，槽的竖直形状可形成线形(图5C至D)槽或锥形(图5A至B)槽。在锥形的实施方案中，槽可从顶部到底部或者从底部到顶部逐渐变细。尽管对于槽的竖直形状而言可以有多种修饰(例如，具有弯曲侧壁的槽，或以两种或更多种不同的角度逐渐变细)，但是一般优选使用从顶部到底部逐渐变细(线性地)的槽，因为这种结构不仅便于制造过程，而且便于将反应容器引入槽。普遍有用的锥度角(θ)为约0°至约15°，优选为约2°至约10°。
在图5A至B所示的实施方案中，槽70还由开口顶部71和封闭底端72(其末端可与槽80垂直(图5A)或是弯曲的(图5B))限定。底端72可以是凸面形或凹面形弯曲，其具有的曲率半径等于或大于底端水平形状的半径或半宽。比其它形状更优选的是平的或接近平的底端(其曲率半径比底端水平形状的半径或半宽大至少两倍)，这是由于其可以为变性步骤提供加强的热传递。槽70还由沿槽轴80的高度(h)和与槽轴80垂直的宽度(w1)限定。
对于许多发明应用，有用的是槽70基本上是直的(即，不是弯曲的或锥形的)。在图5C至D所示的实施方案中，槽70具有开口顶部71和封闭底端72，封闭底端72可以与槽轴80垂直的(图5C)或是弯曲的(图5D)。与锥形槽实施方案中的相同，底端72可以具有凸面形或凹面形的弯曲，而通常较优选地是具有大曲率的平的或接近平的底端。在这些实施方案中，槽70还由沿槽轴80的高度(h)和与槽轴80垂直的宽度(w1)限定。
在图5A至D所示的槽实施方案中，高度(h)至少为约5mm至约25mm，对于约20微升的样品体积而言优选为8mm至约16mm。每个槽实施方案还由沿槽80的平均宽度(w1)(通常为至少约1mm至约5mm)限定。图5A至D中所示的每个槽实施方案还可由竖直长宽比(高度(h)与宽度(w1)之比)和水平长宽比(分别沿第一和第二方向的第一宽度(w1)与第二宽度(w2)之比，它们彼此垂直并与槽轴垂直排列)限定。一般适当的竖直长宽比为约4至约15，优选为约5至约10。水平的长宽比通常为约1至约4。在槽70为锥形的实施方案(图5A至B)中，槽的宽度或直径随槽的竖直形状改变。作为一般性指导的是，对于大于或小于20微升的样品体积，高度和宽度(或直径)可通过体积比的立方根或者有时平方根的因数确定。
如所讨论的，如图5A至D所示，槽的底端72可以是平的、圆的或弯曲的。当底端是圆的或弯曲的时，其通常具有凸面的或凹面的形状。如所讨论的，对于本发明的许多实施方案而言，平的或接近平的底端比其它形状更优选。不希望受到任何理论的限制，认为设计的这种底部可加强从第一热源20到槽70底端71的热传递，从而有助于变性过程。
前述的竖直槽形状均不相互排斥。也就是说，第一部分为直的而且第二部分为锥形的(相对于槽轴80)的槽在本发明的范围内。
B.水平形状
本发明还适用多种水平槽形状。当考虑制造的方便时，一般优选基本上对称的槽形状。图6A至J显示了几种可用的水平槽形状的实例，每个具有指定的对称性。例如，槽70相对于槽轴80可具有圆形(图6A)、正方形(图6D)、圆角正方形(图6G)或六角形(图6J)的水平形状。在另一些实施方案中，槽70可具有宽度大于长度(反之亦然)的水平形状。例如，如图6B、E和H的中间列所示，槽70的水平形状可以是椭圆形(图6B)、矩形(图6E)或圆角矩形(图6H)。当包含在一侧(例如，在左侧)向上和在相对侧(例如，在右侧)向下的对流模式时，这种类型的水平形状是有用的。由于包含的宽度面相比于长度相对较大，可以减少向上和向下对流的流之间的干扰，从而使循环流动更平稳。所述槽的水平形状的一侧可以比相对侧更窄。在图6C、F和I右列显示了一些实例。例如，示出的槽左侧比右侧更窄。当包含在一侧向上(例如，在左手侧)和在相对侧向下(例如，在右手侧)的对流模式时，这种类型的水平形状也是有用的。另外，当这种类型的形状被包含时，相对于向上流动，向下流动(例如，在右手侧)的速度可被控制(通常为降低)。因为在样品的连续介质内对流必须是连续的，所以当横截面面积变得较大时流动速度应降低(反之亦然)。这个特征对于增强聚合效率尤其重要。聚合步骤通常发生在向下的流中(即，退火步骤之后)，因此聚合步骤的时间可通过使向下流动相对于向上流动更慢而延长，引起更有效的PCR扩增。
因而，在一个本发明实施方案中，至少一部分槽70(包括全部的槽)具有沿与槽轴80基本上垂直的平面的水平形状。在一个本发明实施例中，水平形状具有至少一个镜像对称元素(σ)或旋转对称元素(Cx)，其中X为1、2、3、4直到∞(无穷大)。只要满足预期的发明目的，几乎任何水平的形状都是可用的。另一些可用的水平形状包括沿平面的圆形、菱形、正方形、圆角正方形、椭圆形、平行四边形、矩形、圆角矩形、卵形、半圆形、梯形或圆角梯形。如期望，与槽轴80垂直的平面可在第一热源20、第二热源30或第三热源40内。
前述的水平槽形状并不相互排斥。也就是说，例如，具有第一部分为圆形并且第二部分为半圆形(相对于槽80)的槽在本发明的范围内。
水平室形状和位置
如所讨论的，本发明的装置可包含至少一个室，优选为1个、2个或3个室以帮助控制装置(例如，槽的过渡区)内的温度分布。只要实现预期的发明结果，所述槽可具有一个适当的形状或形状的组合。
例如，图7A至I显示了适当的室的水平形状(第一室100仅用于说明)。在本发明的该实施方案中，室100的水平形状可制成多种不同的形状，但是基本上对称的形状常常便于制造过程。例如，第一室100可具有如左列中所示的圆形、正方形或圆角正方形的水平形状。参见图7A、D和G。第一室100可具有宽度大于长度的水平形状(反之亦然)，例如，中间列所示的椭圆形、矩形或圆角矩形。第一室100可具有右列所示的一侧比相对侧更窄的水平形状。参见图7C、F和I。
如所讨论的，室结构用于控制(通常为降低)从热源(通常为第二热源)到槽或反应容器的热传递。因此，重要的是根据本发明的目的实施方案改变第一室100相对于槽70的位置。在一个实施方案中，第一室100相对于槽70的位置对称布置，即，室轴(由室的顶端和低端的中心点形成的轴，106)与槽轴80重合。在这种实施方案中，意于使从热源20、30或40到槽的热传递在穿过槽水平面(在某个竖直位置)的全部方向上恒定。因此，在这种实施方案中优选使用与槽的形状相同的第一室100的水平形状。参见图7A至I。
但是，室结构的另一些实施方案在本发明的范围内。例如，装置内的一个或更多个室可相对于槽70的位置不对称布置。也就是说，特定室的顶端与底端之间所形成的室轴106相对于槽轴80可以是偏离中心的、倾斜的或者偏离中心且倾斜的。在这种实施方案中，一个或更多个槽70与室壁之间的室间隔在一侧较大并且在该室的相对侧较小。这些实施方案中的热传递在槽70的一侧较高并且在相对侧较低(而在与上述两侧位置垂直的方向上的两侧中相同或类似)。在一个具体的实施方案中，优选使用第一室100为圆形或圆角矩形的水平形状。一般更优选圆形。
因而，在装置的一个实施方案中，至少一部分第一室100(包括全部室)沿基本上与槽轴80垂直的平面具有水平形状。参见图7A和图2A至C。通常，水平形状具有至少一个镜像或旋转对称元素。供本发明使用的优选的水平形状包括沿与槽轴80垂直的平面的圆形、菱形、正方形、圆角正方形、椭圆形、平行四边形、矩形、圆角矩形、卵形、半圆形、梯形或圆角梯形。在一个实施方案中，与槽轴80垂直的平面在第二热源30或第三热源40内。
应理解，关于室结构和位置的前述讨论适用于除第一室100外的更多室实施方案。也就是说，在具有多个室的一个本发明实施方案(例如，具有第二室110和/或第三室120的实施方案)中，这些考虑也可应用。
不对称和对称槽/室构造
如所提及的，本发明适用多种槽和室构造。在一个实施方案中，适当的槽相对于室不对称布置。图8A至P显示了该概念的一些实例。
具体地，图8A至P显示了参照室100(第一室100仅用于说明目的)内槽70的位置，适当的槽和室结构的水平剖面。例如，第一室100和槽70的水平形状显示为圆形或圆角矩形。第一列(图8A、E、I和M)显示了对称定位的结构的实例。在这些实施方案中，室轴与槽轴70重合。因此，第一室壁(103，实线)和槽70(虚线)之间的间隙对于左侧和右侧以及上侧和下侧而言是相同的，这在两个方向上提供了对称的从热源到槽的热传递。第二列(图8B、F、J和N)显示了不对称定位的结构的实例。槽轴80的位置从室轴偏离中心(向左手侧)，并且第一室壁103与槽70之间的间隙在左侧更小(而上侧和下侧的间隙相同)，提供了从左侧的更高的热传递。第三列(图8C、G、K和O)和第四列(图8D、H、L和P)显示了提供更多不对称热传递的不对称定位结构的另一些实例。第三列(图8C、G、K和O)显示了其中室壁在一侧(左侧)与槽接触的实例。第四列(图8D、H、L和P)显示了其中一侧(右侧)形成了第一室100而相对侧(左侧)形成槽70的实例。在这两种实例中，来自左侧的热传递比来自右侧的热传递高得多。在第三和第四列中所示的物理接触侧意在作为热制动器发挥功能，尤其作为仅为一侧提供热制动的不对称热制动器。
因而，本发明的一个目的是提供这样的装置，其中至少有一个室(例如，第一室100、第二室110或第三室120中的一个或更多个)沿与槽轴基本上垂直的平面围绕槽基本对称布置。本发明的另一个目的是提供这样的装置，其中至少一个室沿与槽轴基本上垂直的平面围绕槽不对称布置。所有或部分特定的室可按照需要围绕槽轴对称或不对称布置。在至少一个室围绕槽轴不对称布置的实施方案中，室轴和槽轴可以基本上彼此平行但偏离中心、倾斜或者偏离中心且倾斜。在前述的更具体的实施方案中，至少一部分室(包括整个室)沿与槽轴垂直的平面围绕槽不对称布置。在另一些实施方案中，至少一部分槽沿与槽轴垂直的平面位于室内。在这种实施方案的一个实例中，至少一部分槽沿与槽轴垂直的平面与室壁接触。在另一个实施方案中，至少一部分槽沿与槽轴垂直的平面位于室外部并且接触第二或第三热源。对于一些本发明的实施方案，与槽轴垂直的平面接触第二或第三热源。
竖直室形状
本发明的另一个目的是提供这样的装置，其中第二热源包含至少一个室(通常为1个、2个或3个相同的室)以帮助控制温度分布。优选地，所述室帮助控制装置内从一个热源(例如，第一热源20)至另一个热源(例如，第三热源40)的过渡区的温度梯度。只要所述室产生的温度分布适于本发明基于对流的PCR过程，对室的多种改造都在本发明的范围内。
本发明的一个目的是提供这样的装置，其中至少室的一部分(多至并包括整个室)沿槽轴是锥形的。例如，在一个实施方案中，其中一个或更多个室(包括全部室)沿槽轴是锥形的。在一个实施方案中，一个或所有室的至少一部分位于第二热源内，并且垂直于槽轴的宽度(w)朝向第三热源的比朝向第一热源的更大。在一些实施方案中，室的至少一部分位于第二热源内，并且垂直于槽轴的宽度(w)朝向第一热源的比朝向第三热源的更大。在一个实施方案中，所述装置包含位于第二热源内的第一室和第二室，第一室与槽轴垂直的宽度(w)比第二室的宽度(w)更大(或更小)。对于一些实施方案，第一室朝向第一热源或第三热源。
另外的说明性装置实施方案
在本申请中描述了合适的热源、绝热体、槽、间隙、室、接收孔构造和PCR条件，并且它们可以根据需要用于本发明以下实施例中。
A.锥形室
现参照图9A-B，该装置实施方案的特征是与槽同轴的第一室100。在本发明的该实施例中，室轴(即通过室的顶端中心和底端中心形成的轴)与槽轴80重合。第一室100的室壁103相对于槽轴80具有一个角度。也就是说，室壁103从第一室100的顶端101至底端102逐渐变细(图9A)。在图9B中，室壁103从第一室100的底端102至顶端101逐渐变细。该结构在底部提供窄孔并在顶部提供宽孔，或者反之亦然。例如，如果如图9A所示将底部做得更窄，那么从第二热源30的底部32向槽70进行的热传递变得大于从第二热源30的顶部31进行的热传递。此外，与第三热源40相对低的退火温度相比，更优选屏蔽第一热源20通常的高变性温度。如图9B中，如果将第二热源31的顶部做得更窄，那么将更优选屏蔽第三热源的作用。
在图9A-B所示的实施例中，可利用锥形室结构来控制第二热源30内槽70的温度分布。根据所使用的DNA聚合酶的温度特性，可需要利用该结构来调节第二热源30内的温度条件，这是因为聚合效率对第二热源30内的温度条件敏感。对于大多数广泛使用的Taq DNA聚合酶或其衍生物而言，更优选从顶部到底部逐渐变细的第一室壁103，因为在常规操作条件中，与变性温度相比，Taq DNA聚合酶的最适温度(70℃左右)更接近退火温度。
B.一个或两个室，一个热制动器
现参照图10A，装置10的特征是在第二热源30中围绕槽轴80基本对称布置的第一室100和第二室110。在该实施方案中，第一室100位于第二热源30的底部，第二室110位于第二热源30的顶部。装置10包含第一热制动器130以帮助提供更有效的温度分布控制。在该实施方案中，第一室100与第二室110的宽度大致相同。然而，根据如以下讨论的所用DNA聚合酶的温度特性，第一室100和第二室110的高度可为约0.2mm至第二热源30沿槽轴80的长度的约80％或90％。图10B提供了由顶端131、底端132和接触槽70的壁133限定出的第一热制动器130的放大图。在该实施方案中，第一热制动器130沿槽轴80的位置和厚度将由第一室100和第二室110沿槽轴80的高度限定。热制动器130沿槽轴80的厚度为约0.1mm至第二热源30沿槽轴80的高度的约80％，优选约0.5mm至第二热源30的高度的约60％。根据所使用的DNA聚合酶的温度特性，第一热制动器130可在第二热源内位于第一室100与第二室110之间的几乎任意位置。如果与第一热源20的变性温度相比，所使用的DNA聚合酶的最适温度更接近第三热源40的退火温度，那么优选将第一热制动器130放置为更接近第二热源30的下表面32，或者反之亦然。
图10C是其中第一室100的宽度小于第二室110的宽度(例如小约0.9倍至约0.3倍，优选约0.8倍至约0.4倍)的实施例。根据所使用的DNA聚合酶的温度特性，也可采用相反的布置，即第一室100的宽度大于第二室110的宽度。图10D中示出第一热制动器130的放大图。
在图10A-D所示的实施方案中，该装置的特征是非锥形的第一室和第二室。在这些实施方案中，第一室与第二室以沿槽轴80以长度(l)分隔开。在一个实施方案中，以足以降低来自第一热源或向第三热源进行的热传递的面积和厚度(或体积)，第一室、第二室和第二热源限定出了在第一室与第二室之间接触槽的第一热制动器。
参照图10E-F，该装置的特征是围绕槽轴80对称布置的第一室100。第一热制动器130位于第一室100与第一绝热体50之间的第二热源30的底部上。
图10E-F中示出的第一热制动器130沿槽轴80的厚度由第一热制动器130的顶端131至底端132的距离限定。优选该距离为约0.1mm至第二热源30沿槽轴80的高度的约80％，更优选约0.5mm至第二热源30的高度的约60％。
在该实施方案中，该装置的特征是定位在第二热源底部上的第一室以及第一室与第一绝热体限定出第一热制动器。第一热制动器以足以降低来自第一热源的热传递的面积和厚度(或体积)在第一室与第一绝热体之间接触槽。在该实施方案中，第一热制动器包含上表面和下表面，其中第一热制动器的下表面与第二热源的下表面位于大致相同的高度。当使用与第一热源的变性温度相比，其最适温度更接近第三热源的退火温度的DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)时，该实施方案尤其有用。
C.一个、两个或三个室，两个热制动器
如所提到的，在一些本发明实施方案中，降低装置内一个或更多个热源(例如来自第一热源和第三热源)的温度分布谱干扰是有用的。在该实施方案中，包含两个热制动器一般是有用的。
现参照图11A，装置10包含第一室100、第一热制动器130和第二热制动器140。在该实施例中，第一热制动器130位于第一室100的下部以屏蔽或降低来自第一热源20的热传递。第二热制动器140位于第一室100的上部以进一步屏蔽或降低来自第三热源40的热传递。图11b示出装置内第一热制动器130和第二热制动器140的放大图。每个热制动器沿槽轴80的厚度可根据用途而变化。然而，热制动器130和140均优选为至少约0.1mm，更优选至少约0.2mm。两个热制动器130、140的厚度之和小于第二热源沿槽轴的高度的约80％，更优选小于该高度的约60％。热制动器130和140各自的尺寸可根据装置的预期用途而相同或不同。
图4A示出一个相关的实施方案。在该实施方案中，装置10包含第一室100、第一热制动器130、第二室110、第二热制动器140和第三室120。在该实施例中，第一热制动器130位于第一室100与第二室110之间的下部以屏蔽或降低来自第一热源20的热传递。第二热制动器140位于第二室110与第三室120之间的上部以进一步屏蔽或降低来自第三热源40的热传递。图4B示出装置内第一热制动器130和第二热制动器140的放大图。每个热制动器沿槽轴80的厚度可根据用途而变化。然而，热制动器130和140均优选为至少约0.1mm，更优选至少约0.2mm。两个热制动器130、140的厚度之和小于第二热源沿槽轴的高度的约80％，更优选小于该高度的约60％。热制动器130和140各自的尺寸可根据装置的预期用途而相同或不同。
在另一些实施方案中，装置10可在第二热源中包含两个室和两个热制动器。在一个实施方案中，第一热制动器位于第一室与第一绝热体之间的第二热源底部，第二热制动器位于第二热源内的第一室与第二室之间。在另一实施方案中，第一室位于第二热源的底部，第一热制动器位于第一室与第二室之间。在该实施方案中，第二热制动器位于第二室与第二绝热体之间的第二热源顶部。
D.一个室、第一热源和第二热源、突出部
在一些本发明实施方案中，通过改变至少一个热源的结构来改造一个或更多个室的结构是有用的。例如，可将第一热源、第二热源和第三热源的至少一个适配成包含一个或更多个突出部，该突出部限定出间隙或室并且一般与槽轴或室轴基本平行地延伸。突出部可围绕槽轴或室轴对称或不对称布置。大部分突出部在装置内从一个热源向另一热源延伸。例如，第二热源突出部从第二热源向第一热源或第三热源的方向延伸。在这些实施方案中，突出部接触室并限定出室间隙或室壁。在一个具体的实施方案中，第二热源突出部沿槽轴的宽度或直径随着对第二热源的远离而减小，而与突出部邻接的第一绝热体或第二绝热体沿槽轴的宽度增加。每个室可具有相同或不同的突出部(包括没有突出部的情况)。突出部的一个重要优点是帮助减小热源沿槽轴的大小以及延长室和绝热体或绝热间隙沿槽轴的尺寸。发现这些和另一些益处促进装置中的热对流PCR同时显著降低装置的功率消耗。
图12A中示出具有突出部的本发明装置的一个具体实施方案。该装置包含围绕槽轴80基本对称布置的第二热源30的突出部(33，34)。重要的是，在第二热源底部32与第一热源顶部21之间有间隙。在该实施方案中，第一热源20还包含围绕槽70对称布置并且从第一热源20向第二热源30或从第一热源的下表面22向外延伸的突出部23、24。在该实施方案中，第一热源突出部23、24沿槽轴80的宽度或直径随着对第一热源20的远离而减小。该装置还包含定位在第一室底端102与第二热源30的下表面32之间的热制动器130。如图12A所示，第二热源30包含围绕槽70对称布置并且从第二热源30向第三热源40延伸的突出部34。在该实施方案中，在第一室顶部101与第三热源底部41之间有间隙。
如图12A所示，接收孔73围绕槽轴80对称布置。在该实施方案中，接收孔73垂直于槽轴80的宽度或直径与槽70的宽度或直径大致相同。可替选地，接收孔73垂直于槽轴80的宽度或直径可以稍大于槽70的宽度或直径(例如，大出约0.01mm至约0.2mm)。
如所讨论的，本发明的一个目的是提供包含至少一个温度成形元件的进行热对流PCR的装置，该温度成形元件在一个实施方案中可在装置上布置为位置不对称。图12B示出该实施方案的一个重要实施例。如所示出的，该装置相对于重力方向以角度θg(倾斜角度)倾斜。该类型的实施方案尤其可用于控制(通常增加)热对流PCR的速度。如将在下文中讨论的，增加倾斜角度通常引起更快且更稳定的热对流PCR。将在下文中更详细地描述包含一个或更多个位置不对称的另一些实施方案。
图12A-B所示的实施方案尤其适于许多发明应用，包括“困难”样本如基因组的或染色体靶序列或长序列靶模板(例如，长于约1.5kbp或2kbp)的扩增。具体地，图12A示出具有对称的室和槽构造的热源。热制动器130有效地屏蔽朝向第一室100内的第一热源20的高温干扰，因为第一热制动器定位在第二热源底部32上。在使用时，第一绝热体区域50中的温度迅速地从第一热源20的高变性温度(约92℃至约106℃)降至第二热源30的聚合温度(约75℃至约65℃)。在通常情况下，在第二绝热体区域60中从第二热源30到第三热源(约45℃至约65℃)的温度下降相对较小。因此，第二热源30内的温度较窄地分布于第二热源30的聚合温度左右(由于之前通过第一热制动器对高变性温度进行了屏蔽)以使得第二热源30内的大量体积(和时间)可用于聚合步骤。
图12A与12B所示实施方案之间的主要区别是图12B的装置具有倾斜角度θg。当装置结构最优化时，不具有倾斜角度的装置(图12A)运行良好，其需要约15分钟至25分钟来扩增1ng质粒样本以及约25分钟至30分钟来扩增10ng人基因组样本(3000个拷贝)。如果如图12B中所示的引入约2°至约60°(更优选约5°至约30°)的倾斜角度，则可以进一步提高该装置的PCR扩增效率。利用引入该结构的重力倾斜角度(图12B)，10ng人基因组样本的PCR扩增可在约20分钟至25分钟内完成。参见下述实施例1和2。
E.不对称接收孔
如所提到的，本发明的一个目的是提供具有至少一个水平不对称的温度成形元件的装置。“水平不对称”意指沿垂直于槽和/或槽轴的方向或平面不对称。显而易见地，本文提供的许多装置实施例可适配为水平不对称。在一个实施方案中，接收孔在第一热源中相对于槽轴不对称布置，其足以产生适于引起稳定、定向对流流动的水平不对称温度分布。不希望受到理论约束，认为接收孔与室底端之间的区域是可以产生热对流流动的主要驱动力的位置。显而易见地，该区域是初始加热至最高温度(即变性温度)以及过渡至较低温度(即聚合温度)发生的位置，因而最大驱动力可产生于该区域。
因此本发明的一个目的是提供具有至少一个水平不对称的装置，其中第一热源中至少一个接收孔(例如，全部)的宽度或直径大于第一热源中槽的宽度或直径。优选地，宽度不等使得接收孔从槽轴偏离中心。在本发明的该实施例中，接收孔不对称产生了间隙，其中与相对侧相比，接收孔一侧的位置更接近槽。认为在该实施方案中，该装置显示出从第一热源向槽的水平方向上不对称的加热。
图13中示出这种本发明装置的一个实施例。如所示出的，接收孔73相对于槽轴80不对称布置从形成接收孔间隙74。也就是说，接收孔73相对于槽轴80轻微地偏离中心，例如偏离约0.02mm至约0.5mm。在该实施例中，接收孔73垂直于槽轴80的宽度或直径大于槽70的宽度或直径。例如，接收孔73的宽度或直径可以比槽70的宽度或直径大出约0.04mm至约1mm。
在图13所示的实施方案中，槽70的一侧(左侧)与第一热源20相接触并且相对侧(右侧)不与第一热源20相接触，从而形成接收孔间隙74。而本发明适用多种间隙大小，典型的接收孔间隙可以小至约0.04mm，尤其是在另一侧与槽相接触的情况下。换句话说，一侧形成为槽并且另一侧为小空间。在该实施方案中，认为对一侧(左侧)的加热优先于相对侧(右侧)，提供了引导向上流动至优先加热侧(左侧)的水平方向上不对称的加热。利用与接收孔的壁之间的间隙在一侧小于相对侧的接收孔可以得到类似的作用。
如图13所示，第二热源30的第一突出部33限定出第一绝热体50的部分51(称为第一绝热室)和第二热源30。如所示出的，第一突出部33还将第一绝热体50与第一室100以及槽70分隔开。第二热源30的第二突出部34还限定出部分第一室100或槽70。在该实施方案中，第二突出部34还限定出第二绝热体60的部分61(称为第二绝热室)和第二热源30。此外，第二热源30的第二突出部34将第二绝热体60与第一室100以及槽70分隔开。
F.多个室，第二热源和第三热源
如所讨论的，本发明提供了进行热对流PCR的装置，其包含至少一个、两个或三个室多至约四个或五个这种室。在一个实施方案中，一个、两个或三个这种室可对称地定位在部分地或全部的第二热源、第三热源或第二热源与第三热源二者内。图14A-C中提供了一些实施例。
具体地，图14A示出其中第一室100对称地布置在第二热源30内并且第二室110对称地布置在第三热源40内(相对于槽轴80)的装置。第一室100的底端102接触第二热源30的底部32。在图14C中，还示出该装置中对称地布置在第二热源30内的第一室100以及对称地布置在第三热源40内第二室110(相对于槽轴80)。然而，第一室100不接触第二热源30的底部32。相反，它相对于槽轴80的长度较短，即第一热源100的底端102接触第二热源30的内部。在图14A和图14C的两种实施方案中，接收孔73围绕槽轴80对称布置。然而与图14A所示的实施方案不同，图14C的装置包含定位在第一室100的底部102与第二热源底部32之间的第一热制动器130。第一热制动器130的该位置用于许多本发明实施方案中，以降低或屏蔽来自第一热源20的不期望的热流动。
图14B示出其中第一室100与第二室110对称地布置在第二热源30内(相对于槽轴80)的一个本发明实施方案。该装置还包含对称地布置在第三热源40内的第三室120(也相对于槽轴80)。在该实施方案中，接收孔73围绕槽轴80对称布置。在该实施方案中，根据第一热制动器130沿槽轴80的厚度和位置，将其定位在第一室100与第二室110之间以帮助降低或屏蔽来自第一热源20和/或向第三热源40的不期望的热流动。
G.一个室，第二热源或第三热源
本发明还提供了其中至少一个室(例如一个、两个或三个室)定位在第三热源内的装置。如需要，与图2A所示的实施方案相比，至少一个热源沿槽轴的长度可减小。可替选地和另外地，至少一个热源沿槽轴的长度可增加。
在图15A中，第一室100完全位于第三热源40内并且其相对于槽轴80对称布置。在图15B所示的实施方案中，第一热源20包含围绕槽70对称布置的突出部23，从而在邻近突出部23的区域中在第一热源20与第二热源30之间形成较大的绝热间隙。
如需要，第三热源40还可包含围绕槽70对称布置并且向第二热源30的顶部31延伸的突出部43。在这种实施方案中，较大的绝热间隙可以邻近突出部43的区域中在第二热源30与第三热源40之间形成。在这些实施方案中，第二热源30沿槽轴80的长度大于约1mm，优选约2mm至约6mm，并且第三热源40沿槽轴80的长度为约2mm至20mm，优选约3mm至约10mm。在图15A中，优选接收孔73围绕槽对称布置。已描述了第一绝热体和第二绝热体的优选长度。
在图16A-C所示的实施方案中，第二热源30包含从第二热源20向第一热源20延伸的突出部33。第二热源20还包含向第三热源40延伸的突出部34。在本发明的该实施例中，突出部(33，34)各自围绕第一室100以及槽轴80对称布置。在该实施方案中，突出部33帮助限定出第一室100或槽70、第一绝热体50以及第二热源30，并且将第一绝热体50与第一室100或槽70分隔开。突出部34帮助限定出第一室100或槽80、第二绝热体60和第二热源30，并且将第二绝热体60与第一室100或槽70分隔开。
在所示出的实施方案中，第一室100的顶部101与底部102基本垂直于槽轴80。第一室100的长度为约1mm至约25mm，优选约2mm至约15mm。此外，接收孔73围绕槽70和槽轴80对称布置。
参照图17A-C所示的实施方案，第一热源20包含从第一热源20延伸出并且向第二热源30延伸的突出部23。突出部23和接收孔73均围绕槽轴80对称布置。在该实施方案中，装置10的特征是从第二热源30向第一热源20或第三热源40延伸并且围绕第一室100和槽轴80对称布置的突出部33、34。装置10的特征还有围绕第一室100和槽轴80对称布置的第三热源突出部43。突出部43从第三热源40向第二热源30延伸。在该实施方案中，突出部23帮助限定出槽70、第一绝热体50和第一热源20，并且将第一绝热体50与槽70分隔开。突出部43帮助限定出槽80、第二绝热体60和第三热源40，并且将第二绝热体60与槽70分隔开。第一室的顶端101和第一室的底端102基本垂直于槽轴80。一个间隙将突出部23与第一室的底端102分隔开。另一间隙将第一室的顶端101与突出部43分隔开。此外，接收孔73围绕槽70和槽轴80对称布置。
H.第二热源中的一个室，倾斜的
如所提到的，本发明的一个目的是提供其中多种温度成形元件(如一个或更多个槽、接收孔、突出部(如果存在)、间隙如室、绝热体或绝热间隙以及热制动器)均围绕槽轴对称布置的装置。在使用时，常常将该装置放置于平的、水平表面上以使槽轴与重力方向基本对齐。处于这样的方向时，认为浮动力由槽内的温度梯度产生并且该浮动力还平行于槽轴。还认为浮动力方向与重力方向相反并且大小与温度梯度成比例(沿垂直方向)。因为在该实施方案中槽和一个或更多个室围绕槽轴对称布置，所以认为槽内产生的温度分布(即温度梯度的分布)也应相对于槽轴对称。因此，浮动力的分布也应相对于槽轴对称并且其方向平行于槽轴。
通过移动槽轴离开重力的方向可以将水平方向上的不对称引入装置。在这些实施方案中，可以进一步提高装置中基于对流的PCR的效率和速度。因而本发明的一个目的是提供特征是一个或更多个水平方向上的不对称的装置。
图18A-B提供了具有水平方向上位置不对称的本发明装置的一些实施例。
在图18A中，槽轴80相对于重力方向偏移以使装置在水平方向上位置不对称。具体地，槽和室相对于槽轴对称地形成。然而，整个装置相对于重力方向旋转(或倾斜)了角度θg。在该倾斜结构中，槽轴80不再平行于重力方向，因而温度梯度在槽底产生的浮动力变得相对于槽轴80倾斜，因为认为浮动力方向与重力方向相反。不希望受到理论约束，即使槽/室结构相对于槽轴80对称，浮动力的方向也相对于槽轴80呈角度θg。在该结构设置中，向上的对流流动将采用槽或反应容器一侧的路径(在图18A的情况下为左侧)，向下流动将采用相对侧的路径(即在图18A的情况下为右侧)。因此，认为对流流动的路径或模式基本锁定为由这种结构设置确定的路径或模式，因此对流流动变得更稳定并且对来自环境的或小结构缺陷的小干扰不敏感，使得对流流动更稳定而且PCR扩增提高。已经发现重力倾斜角度的引入帮助提高热对流速度，从而支持更快且更稳定的对流PCR扩增。倾斜角度θg可为约2°至60°，优选约5°至约30°。该倾斜结构可以与本发明中提供的全部对称的或不对称槽/室结构组合使用。
图18A中示出的倾斜角度θg可由一个元件或不同元件的组合引入。在一个实施方案中，手动引入该倾斜。然而，常常通过将装置10放置于斜面上(例如通过将装置10放置于楔形物或类似形状的基底上)来更方便地引入该倾斜角度θg。
然而，对于一些本发明实施方案，将装置10倾斜是无用的。图18B示出引入水平方向上的不对称的另一种方法。如所示出的，一个或更多个槽和室相对于重力方向倾斜。也就是说，槽轴80(和室轴)相对于垂直热源水平表面的轴偏移(偏θg)。在该发明实施方案中，当将该装置放置于平的、水平表面上以使其底部相对并且平行于该表面时(如通常的情况)，槽轴80相对于重力方向呈角度θg。根据该实施方案，并且不希望受到理论约束，在如上述实施方案的情况下，由温度梯度在槽底产生的浮动力(认为其方向与重力方向相反)相对于槽轴呈角度θg。这种结构设置使得对流在一侧向上流动(即在图18B的情况下为左侧)并且在相对侧向下流动(即在图18B的情况下为右侧)。倾斜角度θg可优选为约2°至约60°，更优选约5°至约30°。该倾斜结构也可以与本发明中提供的全部槽和室结构特征组合使用。
几乎所有的本发明中公开的装置实施方案均可通过将其放置于能够相对于重力方向将槽轴80偏移约2°至约60°的结构上来进行倾斜。如所提到的，可用的结构的实例是能够产生倾斜的表面(如楔形物或相关形状)。
I.一个室，不对称接收孔
如所讨论的，在第一热源中引入一个或更多个不对称以辅助热对流PCR在本发明的范围内。在一个实施方案中，第一热源的接收孔包含一个或更多个结构不对称以达到该目的。
现参照图19的本发明装置，接收孔73围绕槽轴80不对称布置从而形成接收孔间隙74。优选地，该不对称足以在水平方向上引起从第一热源20向槽70的不均匀热传递。因此，接收孔73相对于槽轴80偏离中心(约0.02mm至约0.5mm)。进一步优选的接收孔73垂直于槽轴80的宽度或直径优选大于槽70的宽度或直径，例如，比槽70的宽度(w1或w2)或直径大出约0.04mm至约1mm。如所示出的，在槽70周围的区域中，该装置的第二热源30沿槽轴80的高度恒定。
如图19所示，当接收孔的一侧与槽相接触时，可得到甚至更大的不对称。在该实施方案中，即使具有不同间隙结构的接收孔构造(例如在接收孔73的两个相对侧上)也在本发明的范围内，但是由接收孔73引入装置的不对称也帮助驱动热对流。在图19所示的具体实施方案中，由于与第一热源20有更好的热接触，对槽70一侧(例如，在图19的情况下为左侧)的加热优先于另一侧，因而在该侧产生更大驱动力，从而促进向上的对流流动通过该路径。在该实施方案中，接收孔73的宽度或直径可做成比槽70的宽度或直径大出至少约0.04mm多至约1mm，并且接收孔中心的位置可偏离中心至少约0.02mm多至约0.5mm。
为了提高不对称，可使接收孔的一侧相对于第一热源比另一侧深(并且更接近室和第二热源)。现参照图20A-B所示的装置，接收孔73在孔的一侧(左侧)与同槽70相对的一侧(右侧)相比的深度更大。在该实施方案中，接收孔73的两侧保持与槽70相接触。如图20A中所示，移动接收孔73侧壁的顶部以形成由槽70与第一热源20大致限定的接收孔间隙74。接收孔间隙74的底部可垂直于槽轴80(图20A)或者其可布置为与槽轴80呈角度(图20B)。接收孔间隙74的侧壁可平行于槽轴80(图20A)或其可与槽轴80呈角度(图20B)。在图20A-B所示的两个实施方案中，相对于第一热源20，槽70一侧的深度大于具有接收孔间隙74的另一侧的深度。不希望受到理论约束，认为图20A-B所示的实施方案中具有较大深度的槽一侧由于来自第一热源的热传递更多而优先被加热，在该侧产生较大浮动力。还认为通过将这种不对称接收孔73和接收孔间隙74加入装置，槽70一侧的温度梯度比相对侧增加(温度梯度通常与距离成反比)。还认为这些特征在一侧(例如图20A和B中的左侧)产生较大驱动力并且支持向上的热对流沿该侧流动。应理解接收孔73和接收孔间隙74的一种配置或不同配置的组合可达到该目的。然而，对于许多本发明实施方案，使接收孔两个相对侧的深度差异约0.1mm多至接收孔深度的约40％至50％一般是有用的。
J.一个室，不对称或对称的接收孔，突出部
图21A-B示出合适的装置实施方案的另一些实施例，其中接收孔73围绕槽不对称布置。与其它部分相比，接收孔部分在第一热源中更深并且更接近室或第二热源，从而提供向第二热源的不均匀的热流动。
在图21A所示的装置中，接收孔73具有与第一热源20的顶部21重合的两个表面。每个表面均面向第二热源30，并且相对于第二热源30的下表面32，所述表面的一个(图21A中右侧的表面)在槽70一侧的间隙大于与槽70相对的表面(左侧的表面)的间隙。也就是说，与另一个表面相比，一个表面更接近第一室100的底部102或第二热源30的下表面32。在该实施方案中，接收孔73的两侧保持与槽70相接触。两个表面之间的接收孔深度差异优选为约0.1mm多至接收孔深度的约40％至50％。第二热源30的特征是围绕槽轴80对称布置的突出部33、34。在该实施方案中，第三热源40包含围绕槽轴80对称布置的突出部43、44。
在图21B中，接收孔73具有与第一热源20的顶部21重合的单个倾斜表面。相对于垂直于槽轴80的轴，倾斜角度为约2°至约45°。在该实施方案中，倾斜表面的顶点相对接近第一室100的底部102。第二热源30的特征是围绕槽轴80对称布置的突出部33、34。在该实施方案中，第三热源包含各自围绕槽轴80对称布置的突出部43、44。
在图22A-B所示的实施方案中，第一室100围绕槽轴80不对称布置，足以引起从第二热源20到槽70的水平方向上不均匀的热传递。如图21A-B所示，接收孔73还可围绕槽70不对称布置。在图22A所示的实施方案中，第一室100位于第二热源30内，并且在室的一侧的高度大于相对于槽轴80的另一侧的高度。也就是说，沿槽轴80，第一室顶端101的一个表面与第一室底端102的一个表面之间的长度(图22A的左侧)大于第一室顶端101的另一表面与第一室底端102的另一表面之间的长度(图22A的右侧)。两个相对侧之间的室高度差异优选为在约0.1mm多至约5mm。在第一室100的底部101(或第二热源的下表面)与接收孔73的顶端之间有间隙，该间隙在槽70的左侧小于另一侧。
在图22B中，第一室100的底端102相对于垂直于槽轴80的轴倾斜约2°至约45°。在该实施例中，倾斜的顶点更接近接收孔73。与第一热源20上表面21重合的接收孔73顶部相对于槽轴80倾斜。在该实施方案中，接收孔倾斜顶点更接近第一室的底端102。也就是说，在第一室100的底部(或第二热源的下表面)与接收孔73的顶端之间有间隙，该间隙在槽70的左侧小于另一侧。
图22A-B所示的构造使得优先加热接收孔73中槽70的一侧(即左侧)，因此初始向上的对流流动可优先在该侧开始。然而，由于在该侧有较长的室长度，第二热源30优先使得在该侧进行冷却。因此，根据第一室的不对称程度，向上流动可将其路径改变至另一侧。
在图22C-D中，第一室100的顶端101与底端102之间相对于槽轴80的长度在一侧(右侧)大于另一侧。在这里，优先在图22C-D所示的室的右侧进行从第二热源进行的冷却。通过接收孔73在槽70的一侧(即图22C-D的左侧)比另一侧更大的深度提供另外的不对称。在接收孔73中，将优先在槽70的左侧进行加热。在该实施方案中，室100的底部102与接收孔73的顶部之间的间隙在槽70周围基本恒定。
图22C-D中示出的构造支持优先加热接收孔73中槽70的一侧(即左侧)，并且优先冷却第一室100中的相对侧，因此向上的对流流动将优先停留于左侧。
在图22A-D所示的实施方案中，由室构造引入的不对称足以引起从第二热源向槽的水平方向上不均匀的热传递。在这些实施方案中，突出部23、33相对于槽轴80不对称布置并且突出部43围绕槽轴80对称布置。在这些实施方案中，该装置包含第一绝热体50和第二绝热体60，其中第一绝热体50沿槽轴80的长度大于第二绝热体60沿槽轴80的长度。
具有至少一个结构不对称的另一些装置实施方案在本发明的范围内。
例如，如图23A-B所示，第一室的底端102布置相对于槽轴80不对称布置。第一室100的顶端101与底端102之间相对于槽轴80的长度在一侧(图23A-B的左侧)大于另一侧。第一室的底部102与接收孔73的顶部之间的间隙在槽70的一侧(图23A-B的左侧)小于另一侧。在这些实施方案中，突出部23围绕槽轴80对称布置。在这些实施方案中，由于接收孔73右侧有较大的间隙(相对于槽轴80)，所以优先在该侧进行加热(由于较大间隙，在该侧通过第二热源的冷却不那么显著)，因此在槽70的右侧产生较大的驱动力，以及在该侧上有更显著的向上流动。此外，第二热源30的特征是围绕槽轴80不对称布置的突出部33。在该实施方案中，第二热源的特征是围绕槽轴80不对称布置的突出部34。第三热源包含围绕槽轴80对称布置的突出部43、44。在图23A-B所示的实施方案中，该装置包含第一绝热体50和第二绝热体60，其中第一绝热体50沿槽轴80的长度大于第二绝热体60沿槽轴80的长度。
具有至少一种结构不对称的另一些装置实施方案在本发明的范围内。
在图24A-B所示的装置实施方案中，第二热源30的特征是各自围绕槽轴80不对称布置的突出部(33、34)。在图24A所示的实施方案中，第一室100的底端102相对于垂直于槽轴80的轴倾斜约2°至约45°，以使得底端102的一部分比相对于槽轴80的另一部分更接近第一热源20。在该实施方案中，底端102与第一热源20之间的间隙在槽轴80的一侧小于另一侧。在该实施方案中，第一热源20和第三热源40都不包含向第二热源30延伸的突出部。此外，第一室的顶端101相对于垂直于槽轴80的轴倾斜约2°至约30°。
在图24B中，第一室底端102的表面的位置比底端102的另一表面更接近第一热源突出部23。在该实施方案中，第一室100的底端102与接收孔73顶部之间的间隙在一侧(在左侧)更小。在图24B中，第三热源40的特征是围绕槽70对称布置的突出部43。第一室100的特征是具有两个表面的顶端101，其中一个表面的位置比另一表面更接近第三热源突出部43(左侧)。
在图24A-B所示的装置实施方案中，由于优先在槽70的右侧从接收孔73进行加热，所以促进了初始向上对流流动沿该侧进行(由于该侧有较大的绝热间隙，通过第二热源进行的冷却不那么显著)。根据第一室上部的不对称程度，向上的流动可将其路径改变至相对侧(即左侧)，这是因为由于右侧有较大的第二绝热间隙，从第一热源40进行的冷却优先发生在该侧。在这两个实施方案中，第一绝热体50平行于槽轴80的长度大于第二绝热体60平行于槽轴80的长度。
K.不对称的室
如所讨论的，本发明的一个目的是提供例如在第二热源中有一个、两个或三个室的装置。在一个实施方案中，至少一个室具有水平方向上的不对称。该不对称帮助在装置中产生水平方向上不对称的驱动力。例如，在图25所示的实施方案中，第一室100和第二室110各自从槽轴80沿相反的方向偏离中心。具体地，第一室的顶端101所处高度与第二室的底端112基本相同。第一室和第二室可具有不同的宽度或直径。在两个相对侧的室间隙105、115相差可以至少约0.2mm多至约4mm至6mm。
除图25所示的偏离中心的室结构以外，可通过包含相对于槽轴80倾斜(歪斜)的结构以使一个或更多个室水平方向上不对称。例如，如图26中所示，第一室100可相对于槽轴80倾斜。在该实施方案中，第一室的第一壁103相对于槽轴80倾斜(例如，相对于槽轴80倾斜小于约30°的角度)。由室的中轴(或室壁103)与槽轴之间的角度限定的倾斜角度可为约2°至约30°，更优选约5°至约20°。
在图25和图26所示的装置实施方案中，由于优先在槽70的右侧从接收孔73进行加热，所以促进了向上对流流动从槽70的底部沿该侧进行(由于在该侧有较大的室间隙，通过第二热源进行的冷却不那么显著)。类似地，由于优先从第三热源40或通孔71进行冷却，所以促进了向下的流动从槽70的顶部沿槽70的左侧进行(由于在该侧有较大的室间隙，通过第二热源30进行的加热不那么显著)。
现参照图27A-B所示的装置实施方案，可将第一室100的顶端101和/或底端102构造成在槽轴80的两个相对侧提供不同的间隙(从第三热源或第一热源)。例如，参照图27A，第一室100的顶端101和/或底端102可相对于垂直于室轴(或槽轴80)的轴倾斜约2°至约30°。可替选地，如图27B所示，第一室100可具有多个顶端面和底端表面。
在图27A-B所示的实施方案中，第一室的底端102与第一热源的顶端21之间，以及第一室的顶端101与第三热源的底端42之间的间隙在两个相对侧(即图27A-B中的左侧和右侧)不同。因此，与图25和图26所示的实施方案相类似，由于优先从接收孔73在槽70的右侧进行加热，所以促进了向上对流流动从槽70的底部沿该侧进行(由于该侧有较大的绝热间隙，通过第二热源进行的冷却不那么显著)。由于优先从第三热源40或通孔71进行冷却，所以促进了向下的流动从槽70的顶部沿槽70的左侧进行(由于该侧有较大的绝热间隙，通过第二热源30进行的加热不那么显著)。
在图27A-B所示的实施方案中，突出部33、34相对于槽轴80围绕第一室100不对称布置。此外，接收孔73围绕槽轴80对称布置。图27B所示的实施方案还包含围绕槽轴80对称布置的突出部23和43。
L.两个室，不对称的热制动器
本发明的一个目的是提供具有一个或更多个热制动器(例如一个、两个或三个热制动器)的装置，其中一个或更多个热制动器水平方向上不对称。参照图28A-B所示的装置，第一热制动器130水平方向上不对称。在该实施方案中，形成于第一热制动器130中的通孔(通常将其制作成适合于槽)大于槽70并且从槽轴80偏离中心，从而在一侧提供较小(或无)间隙，在相对侧提供较大间隙。发现与室的不对称(即第一室壁103不对称)相比，温度分布对热制动器的不对称更敏感。优选地，可将热制动器中的通孔制作成大出至少约0.1mm多至约2mm，并且从槽轴偏离中心至少约0.05mm多至约1mm。
在结构不对称存在于第一热制动器130或第二热制动器140(或第一热制动器130与第二热制动器140二者)的实施方案中，该装置可包含围绕槽轴80对称或不对称布置的至少一个室。在图28A所示的实施方案中，第一室100与第二室110位于第二热源30内并且围绕槽轴80对称布置。在该实施方案中，第一室100与第二室110沿槽轴80以长度l间隔开。第二热源30的一部分接触槽70，从而形成足以降低来自第一热源20或向第三热源40的热传递的第一热制动器130。第一热制动器130围绕槽70不对称布置。第一热制动器130在第一室100与第二室110之间接触槽70的一侧，槽70的另一侧与第二热源30间隔开。图28B示出表示壁133接触槽70的左侧的第一热制动器130的放大图。当一个或更多个热制动器涉及结构不对称时，根据热制动器沿槽轴的位置和厚度，可促进相对于槽轴的槽的一侧或相对侧的向上和向下对流流动。
M.具有和不具有热制动器的一个或两个不对称室
参照图29A，第一室100相对于槽轴80偏离中心。在该实施方案中，接收孔73围绕槽轴80对称布置并且深度恒定。第一室100从槽70偏离中心从而使得室间隙105在一侧小于相对侧。如图29B所示，室100可进一步从槽70偏离中心从而使得槽70的一侧或壁与室壁相接触。在该实施方案中，形成槽的一侧(例如图29B中的左侧)的作用是第一热制动器130，其顶端131和底端132与第一室100的顶端101和底端102重合。在该实施方案中，第二热源30与槽70之间的热传递在室间隙105较小或不存在的一侧(即图29A和图29B中的左侧)上更大，从而产生水平方向上不对称的温度分布。图29C提供了第一热制动器130的放大图。两个相对侧的室间隙的可接受差异优选为约0.2mm至约4mm至6mm，因而室轴从槽轴偏离中心至少约0.1mm多至约2mm至3mm。
应理解整个或部分室可制成相对于槽轴80不对称，例如，整个或部分室可以偏离中心。对于大多数发明应用，使整个室偏离中心是有用的。
有时有用的是具有在第二热源中围绕槽轴80对称或不对称布置的一个、两个或三个室的本发明装置。在一个实施方案中，该装置具有第一室、第二室和第三室，其中所述室中的一个或两个围绕槽轴80不对称布置并且其他室围绕该轴对称布置。在装置包含各自围绕槽轴80不对称的第一室和第二室的实施方案中，这些室可全部或部分位于第二热源中。
图30A-D中示出本发明该实施方案的一些具体实例。
在图30A中，第一热制动器130接触第二热源30中槽70的部分高度。第一室100和第二室110均位于第二热源30中并且第一室100与第二室110沿槽轴80以长度(l)间隔开。在该实施方案中，热制动器130在第一室100和第二室110之间以长度(l)接触槽70的整个外周。在相同的水平方向上，第一室100和第二室110各自从槽轴80偏离中心。图30B提供了其中壁133接触槽70的第一制动器130的放大图。
在图30C中，在相同的水平方向上，第一室100和第二室110各自从槽轴偏离中心。第一室100和第二室110的宽度或直径可相同或不同。在该实施方案中，第一热制动器130在第一室100内以从第一热制动器130的底端132至顶端131的长度接触槽70的一侧(即左侧)，该长度与图30C所示的实施方案中第一室100沿槽轴80的长度相同。图30D提供了示出壁133接触槽70的第一热制动器130的放大图。
在图30A-D所示的每个实施方案中，接收孔73围绕槽70对称布置。
图31A示出其中第一室100与第二室110相对于槽轴80以相反的方向各自偏离中心约0.1mm多至约2mm至3mm的一个本发明实施方案。第一热制动器130相对于槽轴80对称布置。在该实施方案中，部分第二热源30接触槽70，从而形成足以降低来自第一热源20或向第三热源40的热传递的第一热制动器130。在本发明的该实施例中，第一热制动器130在第一室100与第二室110之间以长度(l)接触槽70的整个外周。在另一些实施方案中，第一热制动器130可接触槽70的一侧，另一侧与第二热源30间隔开。图31B提供了示出壁133接触槽70的第一热制动器130的放大图。
参照图32A所示的实施方案，在相同的水平方向上，第一室100和第二室110各自相对于槽轴80偏离中心(例如，约0.1mm多至约2mm至3mm)。在该实施方案中，第一热制动器130相对于槽轴80不对称布置。第一热制动器130与室壁103以相同方向偏离中心。在该实施方案中，第一热制动器130接触槽70的一侧(即左侧)，另一侧与第二热源30间隔开。图32B示出第一热制动器130的放大图。
在图32C中，在相同的水平方向上，第一室100和第二室110各自相对于槽轴80偏离中心，并且第一热制动器130在相反的方向上偏离中心。在该实施方案中，第一热制动器130接触槽70的一侧(即右侧)，另一侧与第二热源30间隔开。图32D示出第一热制动器130的放大图。
在另一本发明实施方案中，该装置在第二热源30中具有两个室，其中每个室以不同的水平方向从另一个偏移。图33A示出一个实例。这里，在相反的水平方向上，第二热源30中的第一室100和第二室110各自相对于槽轴80偏移(例如，约0.5mm至约2mm至2.5mm)。第一室的壁103布置为沿槽轴80低于第二室的壁113。在第一室100中，第一热制动器的壁133在槽70下部接触槽70的一侧(即左侧)，在第二室110中，第二热制动器的壁143在槽70的上部接触槽的另一侧(即右侧)。第一热制动器的顶端131所处高度与第二热制动器的底端142基本相同。该布置一般足以在第二热源30与槽70之间引起水平方向上不均匀的热传递。图33B示出第一热制动器130和第二热制动器140的放大图。
图33C示出其中第一热制动器顶端131所处位置高于第二热制动器底端142的一个本发明实施方案。第一热制动器的壁133和第二热制动器的壁143均接触槽70的一侧。图33D示出第一热制动器130和第二热制动器140的放大图。
图33E示出其中第一热制动器顶端131所处位置低于第二热制动器底端142的一个实施方案。第一热制动器的壁133和第二热制动器的壁143均接触槽70的一侧。图33F示出第一热制动器130和第二热制动器140的放大图。
本发明提供了另一些实施方案，其中通过相对于槽轴倾斜(歪斜)一个或更多个热制动器或室来将不对称引入装置。现参照图34A，相对于垂直于槽轴80的轴，第一室的顶端101和第二室的底端112均倾斜约2°至约45°。在该实施方案中，第一热源的顶端21与第一热制动器的底端132之间的距离相对于槽轴80在一侧(即左侧)更小，使得第一室100的该侧温度梯度偏向于更大。由于第三热源的底端42与第一热制动器的顶端131之间的距离在第二室110的相对侧(即右侧)更小，可预期类似的作用。热制动器130在第一室100与第二室110之间接触槽70的整个外周并且一侧的位置高于另一侧。图34B示出第一室100、第一热制动器130和其中壁133接触槽70的第二室110的放大图。
在一些本发明实施方案中，相对于槽轴倾斜的至少一个室(例如，一个、两个或三个室)是有用的。事实上，可采用倾斜结构或歪斜结构的不同组合来达到预期的水平方向上不对称的温度分布。图35A-D中示出了几个实例。
具体地，图35A示出的情况是第一室100和第二室110各自相对于槽轴80倾斜或歪斜约2°至约30°。在该实施方案中，第一热制动器130未倾斜。图35B示出第一室100、第一热制动器130和其中壁133接触槽70的第二室110的放大图。
图35C示出的实施例中第一室100、第二室110以及第一热制动器130都各自相对于槽轴80倾斜。第一室100和第二室110各自可相对于槽轴80倾斜或歪斜约2°至约30°。第一热制动器130的顶端131和底端132各自可相对于垂直于槽轴80的轴倾斜或歪斜约2°至约45°。在该实施方案中，第一热制动器130在第一室与第二室之间接触槽的整个外周并且在一侧的位置高于另一侧。
在图31A-B、32A-D、33A-F、34A-B和35A-D所示的实施方案中，接收孔73围绕槽轴80对称布置。
N.另外的实施方案
图36A-C、图37A-C和图38A-C中示出了另外的装置实施方案。
在图36A中，装置10的第一室100在第二热源30内并且第二室110在第三热源40内。第二热源突出部33围绕槽轴80对称布置。装置10还包含围绕槽轴80对称布置的第一热源突出部23。在该实施方案中，接收孔73围绕槽轴80对称布置。
在图36B所示的实施方案中，装置10的第一室100和第二室110在第二热源30内。该装置还包含第三热源40中的第三室120。该装置还包含在第二热源30内布置在第一室100和第二室110之间的第一热制动器130。第二热源突出部33围绕槽轴80对称布置。该装置还包含围绕槽轴80对称布置的第一热源突出部23。在该实施方案中，接收孔73围绕槽轴80对称布置。
在图36C所示的实施方案中，第一室底部102在第二热源30内。而在图36A所示的装置实施方案中，第一室底部102与第二热源的下表面32重合。图36C所示的装置包含第二热源30内的第一室100和第三热源40内的第二室110。该装置还包含在第一室底端102与第二热源底部32之间布置在第二热源30底部上的第一热制动器130。接收孔73相对于槽轴80对称布置。
在图36A-C所示的实施方案中，每个装置还包含至少由第一热源20、第一热源的第一突出部23、第二热源30和第二热源的第一突出部33限定出的第一绝热室51。
图37A-C所示的装置还包含围绕槽轴80对称布置的第二热源的第二突出部34，以及至少由第三热源40、第二热源30和第二热源的第二突出部34限定出的第二绝热室61。在图37A所示的实施方案中，该装置包含第二热源30内的第一室100和第三热源40内的第二室110。接收孔73相对于槽轴80对称布置。
在图37B中，所示装置的特征是位于第二热源30内的第一室100和第二室110。第三室120在第三热源40内。该装置还包含在第二热源30中位于第一室100和第二室110之间的第一热制动器130。在该实施方案中，装置10包含相对于槽轴80各自对称布置的突出部(23、33、34)。接收孔73相对于槽轴80对称布置。
在图37A-B所示的实施方案中，第一室的底端102接触第一绝热体50。然而在图37C所示的实施方案中，第一室的底端102在第二热源20内，并且第一热制动器130在第一室底端102与第二热源底部32之间位于第二热源30的底部上。图37C所示的装置还包含围绕槽轴80各自对称布置的突出部23、33、34。在图37B-C所示的实施方案中，第一热制动器130相对于槽轴80对称布置。
图38A-C所示的装置还包含围绕槽轴80对称布置的第三热源的第一突出部43，以及至少由第三热源40、第三热源突出部43、第二热源30和第二热源的第二突出部34限定出的第二绝热室61。在图38A所示的实施方案中，该装置包含第二热源30内的第一室100和第三热源40内的第二室110。接收孔73相对于槽轴80对称布置。
在图38B所示的装置实施方案中，第一室100和第二室110均位于第二热源30内。第三室120位于第三热源40内。该装置还包含在第二热源30中位于第一室100与第二室110之间的第一热制动器130。在该实施方案中，装置10包含相对于槽轴80各自对称布置的突出部(23、33、34、43)。接收孔73相对于槽轴80对称布置。
在图38C所示的实施方案中，第一室的底端102在第二热源20内，并且第一热制动器130在第一室的底端102与第二热源的底部32之间位于第二热源30的底部上。图37C所示的装置还包含围绕槽轴80各自对称布置的突出部23、33、34、43。接收孔73相对于槽轴80对称布置。
制造、使用以及温度成形元件的选择
A.热源
对于大多数本发明实施方案，与用于其它热循环式装置的材料相比，热源的一个或更多个可以用导热率相对低的材料来制造。在本发明中，通常可避免快速的温度变化过程。因此，使用导热率相对低的材料可容易地实现穿过每个热源的温度的高均匀性(例如，温度变化小于约0.1℃)。热源可由导热率与样品或反应容器的导热率相比足够大(例如，优选大出至少约10倍，更优选大出至少约100倍)的任意固体材料制成。待加热样品通常为在室温下导热率为0.58W·m-1·K-1的水，并且反应容器通常由导热率通常为约几十个W·m-1·K-1的塑料制成。因此，合适材料的导热率为至少约5W·m-1·K-1或更大，更优选至少约50W·m-1·K-1或更大。如果反应容器由导热率大于塑料的玻璃或陶瓷制成，优选使用导热率稍大的材料，例如导热率大于约80或约100W·m-1·K-1的材料。大多数金属和金属合金以及一些高导热率陶瓷满足该要求。尽管具有较高导热率的材料一般提供穿过每个热源得更好的温度均匀性，但是铝合金和铜合金是常用材料，因为它们相对便宜且易于加工同时有高导热率。
以下说明书一般可用于制造和使用本文所述的装置实施方案。根据预期用途，例如根据邻近的槽/室结构之间的间距，可以将第一热源、第二热源和第三热源沿垂直于槽轴的轴的宽度和长度尺寸选择为任意值。邻近的槽/室结构之间的间距可以为至少约2mm至3mm，优选约4mm至约15mm。一般优选采用工业标准，即4.5mm或9mm的间距。在典型的实施方案中，槽/室结构布置为等距的行和/或列。在这种实施方案中，优选将每个热源的宽或长(沿垂直于槽轴的轴)制作成至少约相当于所述间距与行或列数目的乘积的值，至多至比该值大出约一个至约三个所述间距。在另一些实施方案中，槽/室结构可布置成圆形模式并且优选将它们等距间隔开。该实施方案中的间距也为至少约2mm至3mm，优选约4mm至约15mm，更优选工业标准4.5mm或9mm的间距。在这些实施方案中，优选热源具有类似多纳圈的形状，其通常在中心有一个孔。槽/室结构可定位在一个、两个、三个，多至约十个同心圆上。每个同心圆的直径可由预期用途的几何需要(例如根据槽/室结构的数目、该圆环中邻近槽/室结构之间的间距等)来确定。热源的外径优选比最大同心圆的直径大出至少约一个间距，热源的内径优选比最小同心圆的直径小出至少约一个间距。
已讨论了第一热源、第二热源和第三热源沿槽轴的长度或厚度。在第二热源中包含至少一个室的实施方案中，第一热源沿槽轴的厚度大于约1mm，优选约2mm至约10mm。第二热源沿槽轴的厚度为约2mm至约25mm，优选3mm至约15mm。第三热源沿槽轴的厚度大于约1mm，优选约2mm至约10mm。与第二热源中包含至少一个室的实施方案相比，在仅包含一个布置在第三热源中的室的另一些实施方案中，第二热源和第三热源沿槽轴的厚度可以不同。例如，第二热源沿槽轴的厚度大于1mm，优选约2mm至约6mm。在这些实施方案中，第三热源沿槽轴的厚度为约2mm至约20mm，优选约3mm至约10mm。第一热源沿槽轴的厚度可以与其它实施方案在相同的范围内，例如大出约1mm，优选约2mm至约10mm。
槽的尺寸可由图5A-D和6A-J所示的几个参数限定。对于约20微升的样品体积，槽沿槽轴的高度(h)为至少约5mm至约25mm，优选8mm至约16mm。锥形角度(θ)为约0°至约15°，优选约2°至约10°。槽沿垂直于槽轴的轴的宽度(w1)或直径(或其平均值)为至少约1mm至约5mm。由高度(h)与宽度(w1)之比所限定的竖直长宽比为约4至约15，优选约5至约10。由分别沿第一方向和第二方向(互相垂直并且垂直于槽轴)的第一宽度(w1)和第二宽度(w2)之比限定的水平长宽比通常为约1至约4。
接收孔与槽的宽度或直径在相同的范围内，即至少约1mm至约5mm。当槽为锥形时，根据逐渐变细的方向，接收孔的宽度或直径小于或大于槽的宽度或直径。接收孔的深度通常为至少约0.5mm多至约8mm，优选约1mm至约5mm。
室沿垂直于槽轴的轴的宽度或直径通常为至少约1mm至约10mm或12mm，优选约2mm至约8mm。室结构的存在在槽与室壁之间提供了室间隙，该室间隙通常为约0.1mm至约6mm，更优选约0.2mm至约4mm。室沿槽轴的长度或高度可根据不同实施方案而异。例如，如果装置在第二热源中包含一个室，那么该室沿槽轴的高度可以为约1mm至约25mm，优选约2mm至约15mm。在第二热源中具有两个或更多个室的实施方案中，每个室的高度为约0.2mm至第二热源沿槽轴厚度的约80％或90％，其中两个或更多个室的高度之和可以与第二热源的厚度一样大。在仅有一个室布置在第三热源的实施方案中，室沿槽轴的高度为约0.2mm多至第三热源沿槽轴厚度的约60％或70％。
热制动器和绝热体(或绝热间隙)的尺寸也非常重要。请参照如上已提供的一般性说明。
虽然一般在本发明的最优应用中不需要，但是提供具有突出部24、44或其二者的装置在本发明的范围内。例如参见图22C。
应理解，在加工或制造机械结构时常常存在一定的公差。因此，在实际操作中，必须将物理接触的孔(例如在具体实施方案中第三热源中的通孔或第一热源中的接收孔)设计成相对于反应容器的大小有正公差。否则，通孔或槽可被制作成小于或等于反应容器的大小，从而不允许将反应容器正常地安装到槽上。在标准制造过程中，物理接触的孔在实践中接受的公差为约+0.05mm。因此，如果描述两个物体“物理接触”，那么应将其解释为两个接触物体之间的间隙小于或等于约0.05mm。如果描述两个物体“未物理接触”或“间隔开”，那么应将其解释为两个物体之间的间隙大于约0.05mm或1mm。
B.使用
本文描述的几乎任何热对流PCR装置可用于进行不同PCR扩增技术的一种或组合。一种合适的方法包括至少一个且优选全部以下步骤：
(a)将包含接收孔的第一热源保持在适于使双链核酸分子变性并且形成单链模板的温度范围，
(b)将第三热源保持在适于使至少一种寡核苷酸引物与单链模板退火的温度范围，
(c)将第二热源保持在适于促进引物沿单链模板聚合的温度；以及
(d)在足以生成引物延伸产物的条件下在接收孔与第三热源之间产生热对流。
在一个实施方案中，该方法还包括提供包含双链核酸和寡核苷酸引物之水缓冲溶液的反应容器的步骤。通常，反应容器还包含一种或更多种DNA聚合酶。如期望，酶可被固定。在反应方法的一个更具体的实施方案中，该方法包括使反应容器接触(直接地或间接地)接收孔、通孔以及布置在第二热源或第三热源的至少一个内的至少一个温度成形元件(通常为至少一个室)的步骤。在该实施方案中，该接触足以支持反应容器中的热对流。优选地，该方法还包括使反应容器接触第一热源与第二热源之间的第一绝热体以及第二热源与第三热源之间的第二绝热体的步骤。在一个实施方案中，第一热源、第二热源和第三热源的导热率比其中的反应容器或水溶液的导热率大出约十倍，优选约一百倍。第一绝热体和第二绝热体的导热率可比其中的反应容器或水溶液的导热率小至少约5倍，其中第一绝热体和第二绝热体的导热率足以降低第一热源、第二热源和第三热源之间的热传递。
在前述方法的步骤(c)中，在反应容器内，使热对流流体流动围绕槽轴基本对称或不对称。优选地，在每个反应容器中，上述方法的步骤(a)-(d)消耗小于约1W、优选小于约0.5W的功率来生成引物延伸产物。如期望，用于进行该方法的电力通过电池供给。在常规的实施方案中，PCR延伸产物在约15分钟至约30分钟或者更短的时间内生成，并且反应容器的体积可小于约50微升或100微升，例如小于或等于约20微升。
在该方法与本发明的热对流PCR离心机一起使用的实施方案中，该方法还包括向反应容器施用或施加有利于进行PCR的离心力的步骤。
在通过热对流进行PCR的方法的一个更具体实施方案中，该方法包括以下步骤：在足以生成引物延伸产物的条件下，向本文公开的任意装置容纳的反应容器中加入寡核苷酸引物、核酸模板和缓冲液。在一个实施方案中，该方法还包括向反应容器中加入DNA聚合酶的步骤。
在通过热对流进行PCR的方法的另一实施方案中，该方法包括以下步骤：在足以生成引物延伸产物的条件下，向本文公开的任意PCR离心机所容纳的反应容器中加入寡核苷酸引物、核酸模板和缓冲液，并且向反应容器施加离心力。在一个实施方案中，该方法包括向反应容器中加入DNA聚合酶的步骤。
本发明的实施适用于PCR技术(包括定量PCR(qPCR)、多重PCR、连接介导的PCR、热启动PCR、等位基因特异性PCR以及其他扩增技术的变化形式)的一种或组合。本发明的以下具体使用参照图1和图2A所示的实施方案。然而，应理解，该方法通常可用于本发明中提到的其他实施方案。
参照图1和图2A，第一热源20在槽的底部或下部(在本文中有时称为变性区域)产生适于变性过程的温度分布。通常将第一热源20保持在用于将目的核酸模板(例如，约1fg至约100ng的基于DNA的模板)解链的温度。在该实施方案中，应将第一热源20保持在约92℃至约106℃、优选约94℃至约104℃、并且更优选约96℃至约102℃。应理解，根据已知的参数如目的核酸、期望的灵敏度和PCR过程应具有的速度，其他温度范围可更适于本发明的最佳实践。
第三热源40在槽的顶部或上部(在本文中有时称为退火区域)产生适于退火过程的温度分布。根据例如所使用的寡核苷酸引物的解链温度和PCR反应技术人员已知的其他参数，通常将第三热源的温度保持在约45℃至约65℃。
第二热源30在槽70的中间区域(在本文中有时称为聚合区域)产生适于聚合过程的温度分布。对于许多本发明应用，在使用Taq DNA聚合酶或其相对热稳定的衍生物的情况下，通常将第二热源30的温度保持在约65℃至约75℃、更优选约68℃至约72℃。如果使用其活性温度范围不同的DNA聚合酶，那么可以改变第二热源的温度范围以与所使用的聚合酶的温度范围相匹配。关于在PCR过程中使用热敏感和热稳定聚合酶，参见美国专利No.7,238,505和其中公开的参考文献。
其他装置实施方案的使用信息参见实施例部分。
C.温度成形元件的选择
以下部分旨在提供选择和使用温度成形元件的进一步指导。并非意图将本发明限于具体的装置设计或使用。
用于本发明装置的一个温度成形元件或其组合的选择将由具体的目的PCR应用来指导。例如，靶模板的特性对于选择最适于具体PCR应用的温度成形元件是重要的。例如，靶序列可相对较短或较长；和/或靶序列可具有相对简单(如质粒或细菌DNA、病毒DNA、噬菌体DNA或cDNA)或复杂的结构(如基因组或染色体DNA)。一般地，具有较长序列和/或复杂结构的靶序列更难以扩增，并且通常需要较长的聚合时间。此外，常常需要较长的退火时间和变性时间。另外，可获得的靶序列可以是大量或小量的。小量的靶序列更难以扩增并且通常需要更多PCR反应时间(即更多PCR循环)。根据具体用途，其他因素也可以是重要的。例如，PCR装置可用于生成一定量的靶序列，以进行后续的应用、实验或分析，或者检测或鉴定样品中的靶序列。进一步考虑，该PCR装置可在实验室或现场、或在某些特殊环境(例如在车、船、潜艇或太空船中)、在恶劣的天气条件下等使用。
如所讨论的，本发明的热对流PCR装置一般提供比现有PCR装置更快且更有效的PCR扩增。此外，与现有PCR装置相比，本发明装置的功率需求显著降低且尺寸小得多。例如，热对流PCR装置通常快出至少约1.5倍至2倍(优选约3倍至4倍)，并且需要少至少约5倍(优选约10倍至数十倍)的运行功率，而大小或重量小至少约5倍至10倍。因此，如果可以选择合适的设计，使用者可拥有一个可耗费更少时间、能量和空间的装置。
为了选择合适的装置设计，重要的是理解预期温度成形元件的关键功能。如下述表1中所归纳的，对于热对流PCR装置的性能，每个温度成形元件具有特定的功能。例如，与没有室的结构相比，室结构通常增加存在室的热源内热对流的速度，与具有室结构而不具有热制动器的结构相比，热制动器通常降低热对流的速度。然而，重要的是，在第二热源内整合热制动器结构和室结构使得可用于聚合步骤的时间长度或样品体积变大，从而可以使得需要更长聚合时间的靶序列进行PCR扩增的效率增加。因此，根据以下讨论的具体应用，室结构可以与或不与热制动器一起使用。同样如表1中归纳的，无论其他热源结构为何(包括仅有槽的结构(即没有室的结构))，可以使用任意对流加速元件(如位置不对称，结构不对称和离心加速)或其组合来增加热对流的速度。因此，根据需要，至少一种这些对流加速元件或其组合可以与几乎所有热源结构组合以提高热对流速度。如所讨论的，本发明装置比现有PCR装置需要的能量少得多，这主要是因为消除了对流循环过程(即改变热源温度的过程)的需要。同样如所讨论的，第一绝热体和第二绝热体的适当组合(即绝热间隙的厚度以及使用适当的绝热体)可使本发明装置的能量消耗进一步降低。此外，突出部结构的使用又可以进一步显著降低本发明装置的能量消耗(例如，参见实施例1至3)，并且增加室的长度从而增加聚合时间。还可以使用其他参数如接收孔深度和第一热源、第二热源以及第三热源的温度来调节热对流速度以及可用于聚合步骤、退火步骤和变性步骤的每一个的时间。如以下所讨论的，这些温度成形元件的每一种可单独使用或者与一种或更多种其他元件组合使用，以构建适于具体应用的具体热对流PCR装置。
表1 温度成形元件的关键功能
虽然本发明提供了许多有用的装置实施方案，但是以下组合特别有用并且易于预测本发明装置的性能。
用于许多应用的可接受热对流PCR装置通常包含槽以及第一和第二绝热体(或第一和第二绝热间隙)作为基本元件。一个或更多个其它温度成形元件可与这些基本元件组合使用。对于一些PCR应用，仅使用槽和绝热体的装置可能不是最佳的。仅有槽结构时，由于来自热源的有效热传递，每个热源内样品中的温度梯度可能太小，因而热对流变得太慢或不能正确发生。使用室结构可以弥补这个缺陷。如所讨论的，每个热源内热对流的速度可通过将室结构整合入该热源中来增加。使用室作为另外的温度成形元件的热对流PCR装置最适于快速扩增结构简单的相对较短(例如，比约1kbp短，优选比500bp或600bp短)的靶序列，如质粒DNA或细菌DNA、病毒DNA、噬菌体DNA、cDNA等。例如，根据靶序列的量和大小，在第二热源中具有宽度或直径为约3mm至6mm的平直室的装置设计可在少于约25分钟或30分钟内、优选约10分钟至20分钟内进行这种样品的PCR扩增(例如参见实施例1和3)。热对流PCR速度的进一步提高可通过整合至少一种对流加速元件来实现(例如，参见实施例2和7)。
包含室的本发明装置(无热制动器)还可用于扩增较长的靶序列(例如大于约1kbp多至约2kbp或3kbp)或具有复杂结构的靶序列(例如，基因组DNA或染色体DNA)，以及具有简单结构的较短序列。在这种实施方案的一个类型中，室仅存在于第二热源中或者在第二热源和第三热源二者中，并且定位在第二热源中的室的宽度或直径可以被减小(部分地或全部地)或者具有减小的宽度或直径的其他室可整合入第二热源内。减小的室宽度或直径通常小于约3mm。在这种设计中，来自第二热源的热传递增加(在具有减小的宽度或直径的室区域中)使得可用于聚合步骤的时间长度增加，因此扩增较长的序列和/或具有复杂结构的序列变得有效。然而，使用减小的室宽度或直径通常导致热对流速度降低。如果对流速度对于使用者的应用而言变得太低，那么可组合进至少一种对流加速元件以增加对流速度。在另一类型的实施方案中，室可仅存在于第三热源中。在该类型实施方案中，通常推荐使用具有相对高解链点(例如，高于约60℃)的引物以扩增以上提到的不同类型的靶序列。
如以上所讨论的，热制动器是对流减速元件，并且当与通常在第二热源内的室结构组合时，热制动器通常使聚合时间变长。因此，热制动器和室结构在第二热源内的组合是一个良好的设计实例，其可以提供适当慢的热对流速度，从而提供充足的聚合时间而且足够快速地进行快速PCR扩增。如实施例1中所证实的，大宽度的室(例如，室的宽度或直径大于约3mm)和薄热制动器(例如，热制动器沿槽轴的长度为小于约2mm)的组合是装置设计的一个良好实例，其能够对短和长的靶序列(例如，多至约2kbp或3kbp的目的质粒)二者以及具有复杂结构的靶序列(例如，多至约1kbp或约800bp的目的人基因组)进行足够快速的扩增。重要的是，这种设计为不同类型的靶序列提供显著快速的扩增(即在小于约25分钟或30分钟内，优选小于约10分钟至20分钟内)而无需使用任何对流加速元件。如所证实的，对流加速元件(例如实施例2中的位置不对称)的整合可以提供进一步加速的热对流PCR。
热对流PCR装置的动态范围的进一步增强可通过将窄室(例如室宽度或直径小于约3mm)和/或热制动器整合入第二热源内来实现。在第二热源中使用具有减小(部分地或全部地)的宽度或直径的室或者热制动器使得从第二热源到槽的热传递增加，因而降低热对流速度。在这种减速的热源结构中，可增加聚合时间以扩增较长序列，例如多至约5kbp或6kbp的序列。然而，由于慢的热对流速度，总PCR反应时间会不可避免地增加，例如，根据靶序列的大小和结构为约35分钟至多至约1小时或更长。还可按照期望将一种或更多种对流加速元件与该类型的装置设计组合，以提高热对流PCR的速度。
上述对流加速元件(即位置不对称、结构不对称和离心加速)可以不同程度地影响热对流的速度。位置或结构不对称通常可以将热对流速度提高约10％或20％多至约3倍至4倍。在加速离心的情况下，可使该提高尽可能地大，例如如所讨论的，当R＝10cm时在10000rpm约为11200倍。实用的使用范围为提高多至约10倍至约20倍。当使用这些对流加速元件的任意一种时，可增加热对流的速度。因此，每当使用者的应用需要进一步提高热对流速度时，可以方便地整合这种特征。包含至少一种对流加速元件的一个具体设计是不包含室的热源结构(即只有槽)。如实施例6所证明的(比照图76E和图75E)，使用对流加速元件可以使仅有槽的设计可运行。这种仅有槽的设计是有利的，因为它可以提供可用于聚合步骤的尽可能最大的时间和样品体积。然而，如所讨论的，这种设计提供的热对流速度通常太慢。使用任意一种或更多种对流加速元件可以通过根据使用者的需求增加热对流速度来弥补这种缺陷。
即使没有突出部结构，以上讨论的所有装置实施例所需的能量也比现有PCR装置少得多，并且可做成便携式装置(即可利用电池操作)。如所讨论的，使用突出部结构能够显著降低能量消耗，因此如果便携式PCR装置对于使用者的应用而言是必要的，那么更推荐使用突出部结构。
此外，以上讨论的装置设计可以扩增非常低拷贝数的样品(当最优化时)。例如，如实施例1、2和3中所证实的，即使比约100个拷贝少得多的靶序列也可以在约25分钟或约30分钟内扩增。
此外，不同于仅可以在受控条件下(如在实验室内)使用的许多现有PCR装置，以上讨论的装置设计可以在实验室或现场，或在某些特殊条件下使用。例如，我们已经在开动的车中测试了几个本发明装置，并且证实其可以如在实验室内一样实现快速且有效的PCR扩增。此外，我们还在特殊温度条件下(从低于-20℃至高于约40℃)测试了几个本发明装置，并且证实不管外部的温度如何，PCR扩增都快速且有效地进行。
最后，如在实施例中所例证的，本发明的热对流PCR装置可以进行不仅快速而且非常有效的PCR扩增。因此，证实了本发明的装置一般地适于PCR装置的几乎全部多种不同应用，而且用手掌大小的便携式PCR装置这一新特征提供了改进的性能。
具有壳体和控温元件的装置
可以将上述发明装置单独使用，或者与合适的壳体、温度感测以及加热和/或冷却元件组合使用。在图39所示的一个实施方案中，第一热源20、第二热源30和第三热源40的特征为有至少一个第一固定元件200(通常为螺孔)和第二固定元件210，其中各元件均适合于将热源、第一绝热体50和第二绝热体60固定在一起作为单独的可操作单元。第二固定元件210优选为“翼形”，从而帮助向额外的绝热间隙提供边界(见下文)。加热和/或冷却元件160a、160b和160c各自分别位于第一热源20、第二热源30和第三热源40中。各热源通常配备至少一个加热元件。可用的加热元件通常为耐热或导热型。根据预期用途，一个或更多个热源还可以配备一个或更多个冷却元件和/或一个或更多个加热元件。优选的冷却元件通常为风扇或Peltier冷却器。众所周知，Peltier冷却器可以用作加热元件和冷却元件二者。特别优选地，当需要产生温度梯度以提供穿过热源的不同温度时，在一个或更多个热源的不同位置使用多于一个加热元件或加热元件和冷却元件二者。第一热源20、第二热源30和第三热源40还包含分别位于各热源中的温度传感器170a、170b和170c。对于大多数的实施方案而言，各热源通常配备有一个温度传感器。但是在一些实施方案中，例如在一个或更多个热源中具有产生温度梯度能力的那些实施方案中，两个或更多个温度传感器可位于热源的不同位置。
图40A至B提供了图39所示实施方案的截面图。除了槽和室结构的截面图外，还作为一个实例示出了加热和/或冷却元件的位置。如该实例所示，优选加热和/或冷却元件均匀地位于各热源，从而提供穿过各热源的均匀的加热和/或冷却。例如如图40B所示，加热和/或冷却元件位于各槽和室结构之间，并且彼此等距地间隔开(例如，参见图42)。例如，图40A所示的截面图示出了从各槽和室结构之间的一个位置至另一个位置的加热和/冷却元件之间的连接(即环)。在另一些类型的实施方案中，例如具有产生温度梯度选项的那些实施方案中，可以将两个或更多个加热或冷却元件用于一个或更多个热源中，并且它们位于所述热源的不同位置，从而提供穿过所述热源的有偏向性的加热/冷却。
在图41中，剖面穿过第二固定元件210和第一固定元件200中的一个。如所示，第一固定元件200包含螺钉201、垫圈202a、第一热源的固定元件203a、间隔物202b、第二热源的固定元件203b、间隔物202c和第三热源的固定元件203c。优选地，螺钉201、垫圈202a以及间隔物202b和202c中至少一个且优选全部由绝热材料制成。实例包括塑料、陶瓷和塑料复合材料(例如具有碳或玻璃纤维的塑料复合材料)。更优选的是，材料具有高机械强度，高熔点和/或挠曲温度(例如约100℃或更高，更优选为约120℃或更高)和低导热率(例如导热率小于约几十W·m-1·1-1的塑料或导热率小于约几W·m-1·K-1的陶瓷)。更具体的实例包括塑料如PPS(聚亚苯基硫醚)、PEEK(聚醚醚酮)、Vesper(聚酰亚胺)、RENY(聚酰胺)等或者它们的碳或玻璃复合材料；以及低导热率的陶瓷如Macor、熔融硅石、氧化锆、Mullite、Accuflect等。
图42提供了具有多个固定元件和控温元件的装置实施方案的放大图。很明显除了图42所示的具体的固定结构外，其它结构也是可以的。因此在一个实施方案中，第一和/或第二固定元件(200，210)中的至少一个位于第一热源20、第二热源30、第三热源40、第一绝热体50和第二绝热体60中的至少一个且优选全部的的其它区域。也就是说，尽管示出第三热源40包含第二固定元件210，但是任何其它或所有的热源和/或绝热体也可包含第二固定元件210。在另一实施方案中，第一固定元件和/或第二固定元件(200，210)中的至少一个位于第一热源20、第二热源30、第三热源40、第一绝热体50和第二绝热体60中的至少一个且优选全部的内部区域。
尽管前述的本发明实施方案对于很多PCR应用普遍有用，但经常期望加上保护壳体。图43A至B示出了一个实施方案。如所示，装置10的特征为第一壳体元件300围绕着第一热源20、第二热源30、第三热源40、第一绝热体50和第二绝热体60。在该实施方案中，各第二固定元件210均具有翼形结构，其与装置10的其它结构元件配合形成至少一个绝热间隙，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个这种间隙。各间隙可以用合适的绝热材料填充，例如本文公开的诸如气体或固体绝热体。对于许多应用而言空气是优选的绝热材料。绝热间隙的存在提供了优点，例如降低了装置10的热量损失，因此降低了功率消耗。
因此，在图43A至B所示的实施方案中，第三热源40包含4个第二固定元件210，其中每对第二固定元件限定出第三绝热间隙310。具体地，图43A示出了第三绝热间隙310的四个部分，它们各自由第一壳体元件300和一对第二固定元件210限定。图43A还示出了位于第一热源20的底部和第一壳体元件300之间的第四绝热间隙320。还示出了底座330，用于使固定的热源悬在第一壳体元件300内，从而有助于形成第三绝热间隙310和第四绝热间隙320。
经常期望进一步为本发明装置添加外壳，例如以提供进一步的保护和绝热间隙。参照图44A至B，所述装置还包含围绕第一壳体元件300的第二壳体元件400。在该实施方案中，装置10还包含由第一壳体元件300和第二壳体元件400所限定的第五绝热间隙410。装置10还可以包含位于第一壳体元件300的底部与第二壳体元件400的底部之间的第六绝热间隙420。
如期望，本发明装置还可以包含至少一个风扇单元，用来从装置去除热量。在一个实施方案中，所述装置包含位于第三热源40之上的第一风扇单元，用以从第三热源40去除热量。如期望，所述装置还可以包含位于第一热源20之下的第二风扇单元，用以从第一热源20去除热量。
整合了离心加速的对流PCR仪
本发明的一个目的是提供“离心加速”作为本文所述装置实施方案的任选的额外特征。如以上所讨论的，认为当在流体内产生竖直的温度梯度(并且任选地或额外地，在使用位置或结构不对称时的水平方向上不对称的温度分布)时，可以使热对流最优。与竖直温度梯度的大小成比例地产生的浮动力驱动流体内的对流流动。本发明装置所产生的热对流通常必须满足引导PCR反应的多种条件。例如，热对流必须连续且重复地流过多个空间区域，同时保持各空间区域在适合于PCR反应各步骤(即变性、退火和聚合步骤)的温度范围。此外，必须控制热对流具有合适的速度，从而使得三个PCR反应步骤的每个都有合适的时间。
不希望受到任何理论的约束，认为可以通过控制温度梯度(更确切的是通过控制流体内温度梯度的分布)来控制热对流。温度梯度(dT/dS)取决于两个参照位置的温差(dT)和间距(dS)。因此，可以改变温差或间距以控制温度梯度。但是，在对流PCR装置中，温度(或其差异)和间距均不容易改变。样品流体内不同空间区域的温度具有由适合三个PCR反应步骤的各步骤的温度所限定特定的范围。没有太多机会来改变样品内不同(通常至少是竖直方向上的不同)空间区域的温度。此外，因为样品流体的体积小，不同空间区域的竖直位置(为了产生用于引发浮动力驱动力的竖直温度梯度)经常受到限制。例如，PCR样品的体积通常仅为约20至50微升，并且有时候更小。这样的小体积和空间限制不允许自由地改变PCR反应不同空间区域的竖直位置。
如所讨论的，浮动力与竖直温度梯度成比例，后者继而取决于两个参照点之间的温差和间距。但是，除了这种依赖关系外，浮动力还与重力加速度(地球上为g＝9.8m/秒2)成比例。该力场参数恒定，是不能控制或改变的变量，而仅由万有引力定律所定义。因此，几乎所有基于热对流的PCR装置都依赖于高度受限的特定结构，不可避免的适用重力。
本发明的离心加速度的使用为这个问题提供了解决方案。通过使基于对流的PCR装置承受离心加速度力场，无论限定温度梯度大小的结构为何，均可以控制浮动力驱动力的大小，从而在没有太多限制的情况下控制对流速度。
图45A至B示出了根据本发明的PCR离心机500的一个实施方案。在该实施例中，装置10连接至旋转臂520，后者旋转连接至马达501。在该实施方案中，旋转臂520包含倾斜轴530，其提供改变旋转轴510与槽轴80之间的角度的自由度。只要得到预期目的，PCR离心机可以包含任何数目的装置10，例如2个、4个、6个、8个、10个或甚至12个。装置10可包含或不包含如以上所讨论的保护壳体，但是具有一些保护壳体一般是有用的。
倾斜轴530优选配置为能够相对于旋转轴倾斜热源的角度(更具体的是槽轴80的角度)的角度引入元件。倾斜角度可以根据转速(即根据离心加速度的大小)进行调整，这样图46中所示的槽轴80与净加速度矢量之间的倾斜角度可以在约0°至约60°之间进行调整。在一个实施方案中，图45A中的角度引入元件为旋转轴(显示为圆圈)，其位于水平臂与热源组件所处的臂之间的连接区域中心。
在图45A至B所示实施方案中，置于装置10内的反应容器内的样品流体除了承受重力加速度力外，还承受离心加速度力。参见图46。应理解，离心加速度gc的方向与离心旋转轴垂直(并且向外)，并且其大小由式gc＝Rω2给出，其中R是离心旋转轴到样品流体的距离，ω是角速度，单位为弧度/秒。例如，当R＝10cm并且离心旋转的速度为100rpm(对应于ω＝约10.5弧度/秒)时，离心加速度的大小为约11m/秒2，类似于地球上的重力加速度。因为离心加速度与旋转速度的平方(或角速度的平方)成比例，所以离心加速度随着旋转速度的增加二次方地增加，例如，当R＝10cm时，在200rpm时约为重力加速度的4.5倍，在1,000rpm时约为112倍，而在10,000rpm时约为11,200倍。通过采用这样的离心加速度可以自由控制作用在样品流体上的净力场的大小。因此，可以根据需要控制(通常为增加)浮动力，从而使对流速度和所需要的一样快。实际上，只要在样品流体中可以产生小的竖直温度梯度，对于将热对流引导至足以进行非常高速的PCR反应的极高流速几乎没有限制。因此，当根据本发明与离心加速度组合后，可以最小化或避免之前对于热源组件和使用的限制。
如图46所示，使样品流体承受由添加离心加速度和重力加速度所产生的净力场。在一个典型的实施方案中，槽轴80平行于净力场，或相对于净力场有倾斜角度θc。如所讨论的，为了使对流流动保持在稳定的路线，一般优选存在倾斜角。倾斜角θc为约2°至约60°，更优选为约5°至约30°。
应理解，图1和2A至C示出了用于举例说明PCR离心机500的装置实施方案。但是，PCR离心机500适于使用本文所述一个本发明装置或不同本发明装置的组合。具体地，只要可以在样品内产生小的竖直温度梯度，PCR离心机500还可以与几乎任何类型的本文所述热源结构和反应容器一起使用。例如，几乎任何上文和别处(例如Benett等的WO02/072267和Malmquist等的美国专利NO.6,783,993)所描述的热源结构都可以与本发明的离心元件组合，从而加强装置的扩增速度和性能。此外，在典型的重力驱动模式中不可操作(或者不能用来提供高PCR扩增速度)的其它热源结构在与离心加速度结构组合后可以被操作。例如，不包含本文所述室而仅包含槽结构的热源也可以被操作。例如，参见PCT/KR02/01900，PCT/KR02/01728和美国专利No.7,238,505。在该实施方案中，无室的现有热源结构提供了改变缓慢的第二热源内的温度分布，推测这是由于从第二热源的高热传递。结果是第二热源内的小的温度梯度。仅利用重力，热对流对于许多PCR应用而言是不令人满意或太慢的。但是，根据本发明引入离心加速度可以使热对流足够快并且稳定，从而成功和有效地引导PCR反应。
在热对流PCR离心机500的典型运行中，旋转轴510基本上平行于重力方向。参见图46。在该实施方案中，槽轴80基本上平行于由重力和离心力产生的净力的方向或相对于其倾斜。也就是说，槽轴80可以相对于由重力和离心力产生的净力的方向倾斜。对于大多数实施方案而言，槽轴80和净力方向之间的倾斜角度θc为约2°至约60°。倾斜轴530适于控制槽轴80与净力之间的角度。在运行中，旋转轴510通常位于第一热源20、第二热源30和第三热源40的外部。可替换地，旋转轴510基本上位于或接近于第一热源20、第二热源30和第三热源40的中心。在这些实施方案中，装置10包含相对于旋转轴510同轴定位的多个槽70。
圆形热源
在热对流PCR离心机的另一实施方案中，一个或更多个热源为圆形或半圆形。图47A至B、48A至C、49A至B和50A至C示出了这种热源结构的具体实施方案。
图47A至B示出了经离心加速之对流PCR装置的具体实施方案的竖直剖面。具体地，图47A和47B分别示出了沿槽和固定元件区域的截面。这两个剖面在图48A至C中限定，它们分别示了第一热源20、第二热源30和第三热源40的水平俯视图。如图47A至B中所示，将三个圆形热源装配以形成通过旋转臂520旋转连接至PCR离心机500的旋转轴510的装置实施方案。热源组件的中心相对于旋转轴510同轴布置，从而离心旋转半径由旋转臂从旋转轴至槽70中心的水平长度所确定。三个热源20、30和40彼此基本上平行地装配，其中一个热源的顶部面对毗邻热源的底部。如另外所示的，热源组件相对于旋转轴被定向，从而槽轴80平行于图46所示的净加速度矢量或从其倾斜。
图48A至C所示的三个热源通过使用一组第一固定元件装配，所述第一固定元件包含如图47B所示热源中形成的螺钉201、间隔物或垫圈202a至c以及固定元件203a至c。使用图47B和48C所示的第三热源40中形成的第二固定元件210在第一壳体元件300内安装装置。
几乎任何本申请公开的装置实施方案(包括多种槽和室结构)都可以用于本文所述离心加速的热对流PCR装置。但是也可以使用没有任何室结构的装置。图49A和50A至C示出了一个实例，其中每个热源都适于仅提供槽，即槽70作为在第一热源20中具有封闭底端的孔形成，并且经过第二热源30延伸至第三热源40。作为另一实施方案，图47A示出了一个实例的竖直剖面，其中将在第二热源的底部具有第一热制动器130的室结构100与槽结构组合使用。图48B示出了第二热源的水平俯视图，其包含图47A的实例中所使用的室100和第一热制动器130。第一热源和第三热源分别具有与图50A和50C相同的结构。
在前述热对流PCR离心机的一个实施方案中，所述装置被制成便携的并且优选利用电池运行。例如，图45A至B中所示的实施方案可用于高通量大规模的PCR扩增。在该实施方案中，所述装置可以用作独立的模块，因此可以被简单地在离心单元上装载和拆卸。
反应容器
合适的装置的槽适于在装置内容纳反应容器，从而可以实现预期结果。在大多数情况下，槽具有的构造基本上与反应容器下部的构造相同。在该实施方案中，反应容器的外部形状(特别是下部)基本与槽的竖直和水平形状一致。反应容器的上部(即朝向顶端)可根据预期用途具有几乎任何形状。例如，反应容器的上部可以具有更大的宽度或直径，以方便引入样品，并且其可以包含盖以在引入待进行热对流PCR的样品后封闭反应容器。
在合适的反应容器的一个实施方案中，参照图5A至D，反应容器的外部形状可以与槽70上至槽70顶端71的形状相同。反应容器的内部的形状可以具有与反应容器的外部不同的形状(如果反应容器的壁厚度被制成不同)。例如，水平剖面的外部形状可以是圆形的而内部形状是椭圆形的，反之亦然。外部和内部形状的不同组合是可以的，只要适当挑选外部形状以提供与热源的适当热接触，并且适当挑选内部形状用于预期的热对流模式。但是，在一些典型的实施方案中，反应容器的壁厚度大致恒定或变化不大，即反应容器的内部形状通常与外部形状一致或相似。尽管壁厚度可以根据所使用的材料变化，但其通常为约0.1mm至约0.5mm，更优选为约0.2mm至约0.4mm。
如期望，反应容器的竖直形状也可以定形为形成线形或锥形管，以适合如图5A至D中所示的槽。当为锥形时，反应容器可以从顶部向底部或者从底部向顶部逐渐变细，但是从顶部向底部逐渐变细(呈线性)的反应容器一般是优选的，对槽也是如此。反应容器的锥度角θ通常为约0°至约15°，更优选为约2°至约10°。
也可以将反应容器的底端制成平的、圆的或弯曲的，如图5A至D中所示槽的底端一样。当底端为圆的或弯曲的时，它可以具有凸面或凹面形状，其曲率半径等于或大于底端水平形状的半径或半宽。平的或近乎平的底端比其它形状更为优选，因为它可以提供增强的热传递从而有利于变性过程。在这些优选实施方案中，平或接近于平的底端的曲率半径比底端水平形状的半径或半宽大出至少两倍。
同样如期望，可以将反应容器的水平形状制成多种不同的形状，但是具有特定对称的形状一般是优选的。图6A至J示出了具有特定对称的槽的水平形状的一些例子。可以制造适合这些形状的可用反应容器。例如，反应容器可以具有与图6A、D、G和J所示槽70的形状大致相同的圆形(上、左)、正方形(中、左)或圆角正方形(下、左)水平形状。因此，反应容器水平形状的宽度可以大于长度(反之亦然)，例如与图6B、E和H中间列所示的槽70大致相同的椭圆形(上、中)、矩形(中、中)或圆角矩形(下、中)。当具有在一侧向上(例如在左侧)而在相对侧向下(例如在右侧)的对流模式时，反应容器的这种水平形状很有用。由于相比长度具有相对较大的宽度形状，可以减少向上和向下对流流动之间的干扰，产生更平稳的循环流动。反应容器可以具有一侧比相对侧更窄的水平形状。在图6A至J的右列示出了槽形状的一些实例。具体地，可以将反应容器制成使反应容器的左侧比右侧更窄，如图6C、F和I所示的槽70。当具有在一侧向上(例如在左侧)而在相对侧向下(例如在右侧)的对流模式时，这种水平形状也很有用。此外，当具有这种形状时，可以控制(通常是降低)相对于向上流动的向下流动(例如在右侧)的速度。因为样品的连续介质中对流必须是连续的，当截面面积变大时流速应该降低(反之亦然)。这种特征对于提高聚合效率尤其重要。聚合步骤通常发生在向下流动期间(即在退火步骤后)，因此可以通过减慢向下流动(相比于向上流动)来延长扩增步骤的时间，从而产生更有效的PCR扩增。
图51A至D提供了合适的反应容器的另一些实例。如所示，反应容器90包含顶端91和底端92，这些端包含限定反应容器中轴95的中心点。反应容器90还由外壁93和内壁94所限定，其围绕容纳PCR反应混合物的区域。在图51A至B中，反应容器90从顶端91向低端92逐渐变细。一般有用的锥度角(θ)为约0°至约15°，优选为约2°至约10°。在图51A所示的实施方案中，反应容器90具有平的或接近平的底端92，而在图52B所示的实施例中，底端是弯曲的或圆的。在图51A至D中标出了槽的顶端71和底端72。
图51C至D提供了合适的反应容器的实例，其从顶端91向底端92为直壁。图51C所示的反应容器90具有平的或近似平的底端92，而在图51D所示的实施例中，底端为弯曲的或圆的。
优选地，图51A至D所示反应容器90之外壁93的竖直长宽比为至少约4至约15，优选约5至约10。反应容器的水平长宽比由对应于上至槽70顶端71的位置的高(h)与宽(w1)之比确定(如同槽的情况)。外壁93的水平长宽比通常为约1至约4。水平长宽比由分别沿彼此垂直且与槽轴垂直的第一和第二方向的反应容器的第一宽度(w1)与第二宽度(w2)之比确定。优选地，反应容器90沿反应容器轴95的高度为至少约6mm至约35mm。在该实施方案中，外壁的平均宽度为约1mm至约5mm，反应容器内壁的平均宽度为约0.5mm至约4.5mm。
图52A至J示出了适用于本发明的反应容器的水平截面图。只要能够实现预期结果，本发明适用其它反应容器构造。因此，可用的反应容器水平形状可以是圆形、半圆形、菱形、正方形、圆角正方向、椭圆形、平行四边形、矩形、圆角矩形、卵形、三角形、圆角三角形、梯形、圆角梯形或长椭圆形中的一种或其组合。在很多实施方案中，内壁相对于反应容器轴基本对称布置。例如，反应容器壁的厚度可以为约0.1mm至约0.5mm。优选地，反应容器壁的厚度沿着反应容器轴95基本不变。
在反应容器90的一个实施方案中，将内壁94布置为相对于反应容器轴95偏离中心。例如，反应容器壁的厚度为约0.1mm至约1mm。优选地，反应容器壁的厚度在一侧比另一侧薄至少约0.05或0.1mm。
如所讨论的，合适的反应容器底端可以是平的、弯曲的或圆的。在一个实施方案中，底端相对于反应容器轴基本对称布置。在另一实施方案中，底端相对于反应容器轴基本不对称布置。底端可以是封闭的，并且可以包含塑料、陶瓷或玻璃或由它们组成。对于一些反应，反应容器还可以包含固定化的DNA聚合酶。几乎本文所述的任何反应容器都可以包含与反应容器密封接触的盖。
在反应容器与本发明的、热对流PCR离心机一起使用的一些实施方案中，通过离心旋转产生相对大的力。优选地，槽和反应容器具有较小的直径或宽度，这样可以使用大的竖直形状。槽和反应容器外壁的直径或宽度为至少约0.4mm至多至约4～5mm，并且反应容器内壁的直径或宽度为至少约0.1mm至多至约3.5～4.5mm。
包含光学检测单元的对流PCR仪
本发明的一个目的是提供“光学检测”作为本文所述装置实施方案的额外特征。在PCR反应期间或之后快速准确地检测聚合酶链式反应(PCR)的过程或结果很重要。通过提供同时扩增和检测PCR反应的装置和方法，光学检测特征对于这些需求可非常有用。
在一些典型的实施方案中，将可根据扩增的PCR产物量产生光学信号的可检测探针引入样品中，在不打开反应容器的情况下，在PCR反应期间或之后监控或检测来自可检测探针的光学信号。可检测探针通常为可检测的DNA结合剂，它根据与DNA分子的结合或不结合或者与PCR反应和/或PCR产物的相互作用来改变其光学性质。有用的可检测探针的例子包括但不限于：能结合双链DNA的嵌入染料和多种具有可检测标记的寡核苷酸探针。
可以用于本发明的可检测探针通常根据PCR扩增来改变其荧光性质，例如荧光强度、波长或偏振。例如，嵌入染料(例如SYBR green 1、YO-PRO 1、溴化乙锭和类似染料)在染料与双链DNA结合时产生增强或活化的荧光信号。因此，可以检测来自这些嵌入染料的荧光信号，以监控PCR产物的扩增量。利用嵌入染料进行检测对于双链DNA序列是非特异性的。多种可以与本发明一起使用的寡核苷酸探针在本领域是已知的。这些寡核苷酸探针通常具有至少一种可检测标记以及可以与扩增的PCR产物或模板特异性杂交的核酸序列。因此，能够进行经扩增PCR产物的序列特异性检测，包括等位基因的区分。寡核苷酸探针通常标记有相互反应的标记物对，例如两种荧光剂的对，或者一种荧光剂与一种淬灭剂的对，两个标记物之间的相互反应(例如“荧光共振能量转移”和“无荧光能量转移”)随着它们之间距离的变短而增强。大多数寡核苷酸探针被设计成使这两种相互反应的标记之间的距离由其与靶DNA序列的结合(通常为较长距离)或未结合(通常为较短距离)来调控。这种依赖于杂交的距离调控导致荧光强度或荧光波长根据PCR产物的扩增量而改变(增加和减少)。在另一些类型的寡核苷酸探针中，探针被设计成在PCR反应的延伸步骤中进行特定的化学反应，例如荧光剂标记由于DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性或者探针序列的延伸而水解。这种依赖于PCR反应的探针改变导致来自荧光剂的荧光信号被活化或增强，从而成为PCR产物量的改变的信号。
多种合适的可检测探针和用于检测这些探针的设备在以下中描述：美国专利No.5,210,015、No.5,487,972、No.5,538,838、No.5,716,784、No.5,804,375、No.5,925,517、No.5,994,056、No.5,475,610、No.5,602,756、No.6,028,190、No.6,030,787、No.6,103,476、No.6,150,097、No.6,171,785、No.6,174,670、No.6,258,569、No.6,326,145、No.6,365,729、No.6,703,236、No.6,814,934、No.7,238,517、No.7,504,241、No.7,537,377以及非美国的对应申请和专利。
本文所使用的词组“光学检测单元”(包括复数形式)是指用来检测PCR扩增的设备，其适用于本文公开的一种或更多种PCR热对流装置和PCR方法。配置优选的光学检测单元以检测荧光信号，例如在PCR扩增反应进行时。通常，该设备提供信号的检测，并且优选地提供其定量而无需打开可操作连接至装置的至少一个反应容器。如期望，可以配置光学检测单元和本发明的一种或更多种PCR热对流仪来检测反应容器中核酸的扩增量(例如，实时或定量PCR扩增)。通常用于本发明的光学检测单元包含一个或更多个可操作性组合的以下组件：合适的光源、透镜、滤光器、镜子和分束器，以检测通常在约400nm至约750nm之间的可见区的荧光。优选的光学检测单元位于反应容器的下方、上方和/或侧面，以足以接收和输出检测反应容器内的PCR扩增的光。
如果光学检测单元能够稳定、灵敏和快速地检测本发明热对流PCR装置中进行的PCR扩增，那么该光学检测单元就适用于所述装置。在一个实施方案中，热对流PCR仪包含能够检测反应容器中样品的光学性质的光学检测单元。待检测的光学性质优选为在一个或更多个波长(取决于所使用的可检测探针)的荧光，但是有时候检测样品的吸光率也有用。当检测来自样品的荧光时，光学检测单元用激发光照射样品(或者一部分，或者整个样品)并且检测来自样品的荧光信号。激发光的波长通常比荧光短。在检测吸光率的情况下，光学检测单元用光(通常以选定的波长或扫描波长)照射样品，并且测量穿过样品之前和之后的光强度。一般优选荧光检测，这是因为其更灵敏并且对待检测的目标分子特异。
涉及以下图和描述意在对包含用于荧光检测之光学检测单元的热对流PCR仪提供更深理解。而不是意图并且不应当理解为限制本发明的范围。
参见图80A至B，该装置实施方案的特征为一个或更多个光学检测单元600至603，其从反应容器90的底端92或者槽70的底端72可操作地检测来自反应容器90中样品的荧光信号。图80A示出了一个实施方案，其中使用单个光学检测单元600检测来自多个反应容器90的荧光。在该实施方案中，产生宽的激发光束(以向上箭头示出)以照射多个反应容器，并且检测来自多个反应容器90的荧光信号(以向下箭头示出)。在该实施方案中，用来检测荧光的检测器650(例如见图83)优选具有成像能力，从而可以从荧光图像中区分来自不同反应容器的荧光信号。可替换地，可以整合入多个检测器650，各检测器用来检测来自各自反应容器的荧光信号。
在图80B所示实施方案中，整合了多个光学检测单元601至603。在该实施方案中，各光学检测单元用激发光照射各自反应容器90中的样品，并且检测来自各样品的荧光信号。该实施方案的优点在于更精确地控制各反应容器的激发谱，并且还同时且独自地测量来自不同反应容器的不同荧光信号。这种实施方案的优点还在于构建出小型化的装置，这是因为在单个光学检测单元的实施方案中产生宽激发光束需要较大的光学元件和较大的光路径，而该实施方案可以避免这些。
再参见图80A至B，在光学检测单元600至603位于反应容器90的底端92时，第一热源20包含用于每个槽70的光学端口610，来向激发光或发射光到达反应容器70提供路径。光学端口610可以是通孔或者由光学透明或半透明材料制成(部分或整个)的光学元件，所述材料如玻璃、石英或具有这种光学性质的聚合物材料。如果光学端口610被制成通孔，光学端口的直径或宽度通常小于槽70的底端72或反应容器90的底端92的直径或宽度。在图80A至B所示的实施方案中，反应容器90的底端92也作为光学端口使用。因此，一般期望反应容器90的全部或者至少是底端92由光学透明或半透明材料制成。
在图81A至B中，该装置实施方案的特征为具有位于反应容器90的顶端91上方的单个光学检测单元600(图81A)或多个光学检测单元601至603(图81B)。另外，当整合入单个光学检测单元600时(图81A)，产生宽的激发光束(以向下箭头示出)以照射所述多个反应容器，并且检测来自多个反应容器90的荧光信号(以向上箭头示出)。在整合入多个光学检测单元601至603时(图81B)，各光学检测单元用激发光照射各自的反应容器90中的样品，并且检测来自各自样品的荧光信号。
在图81A至B所示实施方案中，通常将适合反应容器90顶端(开口)91的反应容器盖(未示出)的中心部分作为激发和发射光的光学端口。因此，反应容器盖的全部或者至少中心部分由光学透明或半透明材料制成。
图82示出了装置实施方案，其特征为位于反应容器90侧面的光学检测单元600。在该特定实施方案中，光学端口610形成在第二热源30的侧面。可替换地，光学端口610可以形成在第一热源20、第二热源30和第三热源40，以及第一绝热体50和第二绝热体60中的任意一个或更多个的侧面，这取决由特定应用目的所需要的荧光检测的位置。在该实施方案中，沿光路径的反应容器90的侧面部分和第一室100的部分也作为光学端口，因此反应容器90和第一室100的全部或至少部分由光学透明或半透明材料制成。当光学检测单元600位于反应容器90的侧面时，槽90通常形成线形或圆形布置的一个或两个排列。槽70的这种布置使得能够检测来自每个槽70或反应容器90的荧光信号，而不受其它槽的干扰。
在以上所述的实施方案中，激发和荧光检测均在相对于反应容器90的同侧进行，因此激发部件和荧光检测部件二者位于同侧，通常位于光学检测单元600至603的同一区间内。例如，在图80A至B所示的实施方案中，包含这两种部件的光学检测单元600至603位于反应容器90的底端92。类似地，在图81A至B所示的实施方案中，整个光学检测单元位于反应容器90的顶端91的上方，而在图82所示的实施方案中，位于反应容器90的侧面部分。可替换地，可以调整光学检测单元600至603以使激发光部件和荧光检测部件分开定位。例如，激发部件位于反应容器90的底部(或顶部)，而荧光检测部件位于反应容器90的顶部(底部)或者侧面部分。在另一些实施方案中，激发部件可位于反应容器90的一侧(例如左侧)，而荧光检测部件可位于另一侧(例如，顶侧、底侧、右侧、前侧或后侧；或者除了激发一侧外的侧面部分)。
光学检测单元600至603通常包含激发部件(产生具有选定波长的激发光)和荧光检测部件(检测来自反应容器90的样品的荧光信号)。激发部件通常包含光源、波长选择元件和/或光束成形元件的组合。光源的实例包括但不限于：弧光灯(例如汞弧灯、氙弧灯和金属-卤化物弧灯)、激光和发光二级管(LED)。弧光灯通常产生多波段或宽波段的光，而激光和LED通常产生单色光或窄波段的光。波长选择元件用于从光源产生的光中选择激发光波长。波长选择元件的实例包括与裂缝或孔(用于选择波长)组合的光栅或棱镜(用于分散光)，以及滤光器(用于传播选定的波长)。一般优选滤光器，因为它可以以小的尺寸有效地选择特定波长，并且相对便宜。优选的滤光器为具有薄膜涂层的干扰滤光器，其可以传播特定波段的光(带通滤光器)或者波长比特定截断值(cut-on value)波长更长(长通滤光器)或更短(短通滤光器)的光。声光滤波器和液晶可调滤波器可以是极好的波长选择元件，这是因为尽管相对昂贵，但这些滤波器种类可以以小的尺寸快速精确地通过电子控制改变传播波长。也可以用有色滤光玻璃作为波长选择元件，以作为其它种类的波长选择元件的便宜代替物或与它们组合，从而增强对不期望的光(例如，IR、UV或其它散射光)的排除。滤光器的选择取决于光源产生的光的性质和激发光的波长，以及装置的其它几何学需求，例如尺寸。使用光学成形元件来使发射光束成形并且对其进行引导。光束成形元件可以是透镜(凸或凹)、镜子(凸、凹或椭圆)和棱镜中的任一种或它们的组合。
荧光检测部件通常包含检测器、波长选择元件和/或光束成形元件的组合。检测器的实例包括但不限于光电倍增管(PMT)、光电二极管、电荷耦合器件(charge-coupleddevice，CCD)和摄影机。光电倍增管通常最为灵敏。因此，在荧光信号非常弱使得灵敏性成为关键因素时，光电倍增管可以是适当的选择。但是，如果需要小尺寸和成像能力，光电倍增管就不合适(因为其尺寸大)。用例如微通道板增强的CCD、硅光电二极管和摄影机可具有类似于光电倍增管的灵敏度。如果不需要对荧光信号进行成像但小型化很重要(例如在各反应容器都具有光学检测单元的实施方案中)，具有或不具有增强器的光电二极管或CCD是好的选择，因为这些元件小且相对便宜。如果需要成像(例如在针对多个反应容器具有单个光学检测元件的实施方案中)，可以整合入CCD列阵、光电二极管阵列或摄影机(同样具有或不具有增强器)。与激发部件类似，使用波长选择元件从由样品收集的光中选择发射波长，而使用光束成形元件来成形并引导发射光，从而进行有效检测。波长选择元件和光束成形元件的实例与对激发部件描述的例子相同。
除了上述的光学元件外，光学检测单元可以包含分束器。在激发部件和荧光检测部件相对于反应容器90位于同侧时，分束器尤其有用。在这样的实施方案中，激发和发射光束的路径(沿相反方向)彼此与对方一致，因此有必要利用分束器分开光束路径。通常有用的分束器为二色分束器或二色镜，其具有类似于薄膜滤光器的薄膜干扰涂层。通常分束器反射激发光并且传播荧光(长通类型)，反之亦然(短通类型)。
现在参见图83至84、85A至B和86，它们描述了光学检测单元600的结构的一些设计实例。
在图83中，示出了光学检测单元600的一个实施方案。在该实施方案中，激发光光学元件(620、630和640)沿相对于槽轴80呈直角的方向定位，而荧光检测光学元件(650、655、660和670)沿槽轴80定位。传播荧光发射并且反射激发光(即，长通类型)的二色分束器680定位在中间周围。通常，由光源620产生的光通过激发透镜630收集，并且用激发滤光器640过滤以选择具有期望波长的激发光。之后选定的激发光被二色分束器反射并且照射到样品上。来自样品的荧光发射在经过二色分束器680和发射滤光器670后由发射光透镜660收集，以选择具有期望波长的发射光。之后将由此收集的荧光聚焦在光圈或狭缝655上或检测器650上，以测量荧光信号。光圈或狭缝655的功能是发射的“空间过滤”。通常，荧光聚焦在光圈或狭缝655上或其附近，因此来自样品的特定(竖直)位置的荧光图像形成在光圈或狭缝655上。这种光学布置能够有效收集来自样品内某些限定位置(例如，退火、延伸或变性区域)的荧光信号，同时不接收来自其它位置的光。根据所使用的可检测探针的类型任选地使用光圈或狭缝655。如果荧光信号由样品内特定区域所产生，优选使用一个或更多个光圈或狭缝655。如果荧光信号由样品内(无论位置为何)产生，光圈或狭缝655的使用就不是必要的，或者可以使用具有较大开口的光圈或狭缝。
如图84的实施方案所示，可以调整光学检测单元600以使其沿槽轴80定位激发光学元件(620、630、640)并且沿与槽轴80呈直角的方向定位荧光检测光学元件(650、655、660和670)。对该类实施方案有用的二色分束器680为短通类型，其传播激发光并且反射发射光。
图83至84所示实施方案中使用的激发透镜630可以用多于一个透镜的组合或者透镜和镜子的组合代替。在使用这种光学元件的组合时，为了有效收集激发光，第一透镜(通常为凸透镜)优选靠近光源并且在光源前布置。为了进一步增加激发光的收集效率，可以将镜子(通常为凹的或椭圆的)置于光源的后侧。在需要使激发光束很大时(例如在具有用于照射多个反应容器90的单个光学检测单元600的实施方案中)，可以额外使用凹透镜或凸的镜子以扩大激发光束。在一些实施方案中，可以将一个或更多个光学元件(例如一个或更多个透镜或镜子)置于其他位置，例如在反应容器90与二色分束器680或激发滤光器640之间。在另一方面中，激发光通常定型为基本共线的光束，以照射更大体积的样品。在一些特定的应用中，例如在使用多光子激发方案时，可以将激发光紧密聚焦在样品内的特定区域。
在图83至84所示实施方案中使用的发射透镜660也可以用多于一个透镜或透镜与镜子的组合代替。在使用这种光学元件的组合时，为了更加有效地收集荧光，第一透镜(通常为凸透镜)优选位于反应容器90的附近(例如，在反应容器90与二色分束器680或发射滤光器670之间)。在一些实施方案中，可以将一个或更多个光学元件(例如，透镜或镜子)置于其他位置，例如，在反应容器90与二色分束器680或发射滤光器670之间。
图85A至B示出了一些实施方案，其中使用一个透镜635为激发光束和发射光束二者定形。示出了布置激发光学元件(620和640)和荧光检测光学元件(650、655和670)的两个实例。激发光学元件(620和640)在图85A中沿着与槽轴80呈直角的方向布置，而在图85B中沿着槽轴80布置。在使光学检测单元600小型化时使用单个透镜的这种类型的实施方案很有用，例如在图80B、81B和82中所示整合入多个光学检测单元的实施方案。
图86示出了一个装置实施方案，其中光学检测单元600位于反应容器90的顶侧。所示的光学元件的布置和图83所示的实施方案相同。也可以整合入其它类型的光学布置(例如，图84和85A至B所示)。当光学检测单元600(或者激发或者荧光检测部件)位于反应容器90的顶侧时，反应容器盖690的中心部分作为光学端口610。因此，如所讨论的，在这种实施方案中反应容器盖690或者至少其中央部分优选由光学透明或半透明材料制成。
再参见图86，为了避免PCR反应期间样品的蒸发损失，反应容器90和反应容器盖690通常彼此具有紧密闭合的关系。在图86所示的反应容器实施方案中，紧密闭合关系制作在反应容器90的内壁和反应容器盖690的外壁之间。可替换地，可以将紧密闭合关系制作在反应容器90的外壁和反应容器盖690的内壁之间，或者在反应容器90的上表面和反应容器盖690的下表面之间。在一些实施方案中，反应容器盖690可以是光学透明或半透明的薄膜粘性带。在这些实施方案中，紧密闭合关系制作在反应容器90的上表面和反应容器盖690的下表面之间。
上述的反应容器实施方案对于本发明的所有用途不一定是最优的。例如，如图86所示，通常在样品和反应容器盖690(或反应容器盖690的光学端口部分)之间形成样品弯液面(即，水-空气界面)。在运行时，由于PCR反应涉及高温过程，样品中的水蒸发并且凝结在反应容器盖690(或反应容器盖690的光学端口部分)的内表面。对于一些应用，这样凝结的水可稍微干扰激发光束和荧光束，尤其是在光学检测单元位于反应容器90上侧时。
图87A至B所示的反应容器实施方案提供了另一个方法。如所示，反应容器90和反应容器盖690被设计成具有接触样品的光学端口695。形成的样品弯液面比光学端口695的下表面696更高或大约在同一高度。与上述的通常反应容器实施方案不同，激发光束和荧光束直接从光学端口695传播到样品(或反之亦然)，而不经过反应容器90内的空气或任何凝结水。以下是对这种实施方案的结构需求：
首先，如图87A至B所示，反应容器盖690和反应容器90的上部以及光学端口695具有紧密闭合关系。如所讨论的，反应容器90和反应容器盖690之间的紧密闭合可以制作在反应容器的内壁(如图87A至B)或反应容器90的外壁或顶端91。反应容器盖690和光学端口695之间的紧密闭合可以制作在光学端口695的上表面697(图87A)或侧壁699(图87B)。可替换地，可以将反应容器盖690和光学端口695制成一体，优选使用相同或类似的光学透明或半透明材料。
此外，将光学端口695的直径或宽度(如果反应容器盖690的壁所处高度与光学端口695的下表面696接近或相同，则还有反应容器盖690的壁的直径或宽度)制成小于与光学端口695之下表面696接近或处于同一高度的反应容器90部分的内壁的直径或宽度。此外，光学端口695的下表面696布置得比反应容器盖690内部的下部更低，或大体在同一高度。当满足这些结构需要时，就会在反应容器90的内壁和光学端口595的侧面部分之间提供开放空间698。因此，在用反应容器盖690密封反应容器90时，样品可以填充开放空间的一部分以在光学端口695的底部696之上形成样品弯液面，从而使光学端口的底部与样品接触。
在图88中，示出了上面所讨论的光学无干扰反应容器的使用。如所讨论的，光学端口695的底部696接触样品，并且样品弯液面在光学端口695的底部696的上方形成。使用位于反应容器90的顶端91上的光学检测单元600，激发光束和荧光束直接从光学端口695传播到样品(或反之亦然)，而无需经过反应容器90中的空气或任何凝结水。这种光学结构可以极大地提高本发明的光学检测特征。
为了更加全面地理解本发明，给出以下实施例仅作说明目的。除非另外特别说明，这些实施例的目的不在于以任何方式限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
使用购自Takara Bio(日本)、Finnzymes(芬兰)和Kapa Biosystems(南非)的三种不同DNA聚合酶来测试多种本发明装置的PCR扩增性能。使用包含多种插入序列的质粒DNA、人类基因组DNA和cDNA作为模板DNA。质粒DNA通过将不同大小的插入序列克隆到pcDNA3.1载体中来制备。人类基因组DNA由人胚胎肾细胞(293，ATCC CRL-1573)制备。cDNA通过提取自HOS或SV-OV-3细胞的mRNA的逆转录来制备。
PCR混合物的组分如下：根据实验的不同量的模板DNA、各约0.4μM的正向引物和反向引物、各约0.2μM的dNTP、根据所使用的DNA聚合酶约0.5至1单位的DNA聚合酶、约1.5mM至2mM的MgCl2，使用由各制造商提供的缓冲溶液混合成20μL的总体积。
反应容器由聚丙烯制作，并且具有图51A所示的结构特征。反应容器具有逐渐变细的圆柱形状，其底端封闭，并且包含适合反应容器顶端内径的盖，从而在引入PCR混合物后密封反应容器。反应容器从顶端到底端逐渐变细(线性地)，从而上部具有较大的直径。图51A所示的锥度角为约4°。为了促进来自第一热源中的接收孔的热传递，将反应容器的底端制成平的。反应容器从顶端到底端的长度为约22mm至约24mm，底端的外径为约1.5mm，底端的内径为约1mm，壁厚为约0.25mm至约0.3mm。
各反应所使用的PCR混合物的体积为20μL。20μL体积的PCR混合物在反应容器内约有12至13mm高。
在以下实施例中使用的所有装置都用DC电源运行。使用可充电的Li+聚合物电池(12.6V)或DC电源运行装置。在实施例中使用的装置具有12(3×4)、24(4×6)或48(6×8)个槽，这些槽以图39所示的多排和多列以阵列形式排列。将相邻槽之间的间距制成9mm。在实验中，在装置的三个热源加热到期望温度后，将包含PCR混合物样品的反应容器引入槽中。在经过期望的PCR反应时间后，从装置中取出PCR混合物样品，并且用琼脂糖凝胶电泳进行分析，使用溴化乙锭(EtBr)作为荧光染料使扩增的DNA带可视化。
实施例1.利用图12A的装置进行热对流PCR
在该实施例中使用的装置具有图12A所示结构，其包含槽70、第一室100、第一热制动器130、接收孔73、通孔71、第二热源30的突出部33，34、第一热源20的突出部23，24。第一、第二和第三热源沿槽轴80的长度分别为约4mm、约5.5mm和约4mm。第一和第二绝热体(或绝热间隙)沿着槽轴80在槽区域附近(即，在突出部区域内)的长度分别为约2mm和约0.5mm。第一和第二绝热体沿槽轴80在槽区域外(即，在突出部区域外)的长度分别为约6mm至约3mm(取决于位置)和约1mm。第一室100位于第二热源30的上部并且为圆柱形状，其沿槽轴80的长为约4.5mm并且直径为约4mm。第一热制动器130位于第二热源30的底部，并且沿槽轴80的长度或厚度为约1mm，第一热制动器的壁133接触槽70或反应容器90的整个外周。接收孔73沿槽轴80的深度为约1.5mm至约3mm。在该装置中，槽70由第三热源40中的通孔71、第二热源30中第一热制动器130的壁133，以及第一热源20中的接收孔73所限定。槽70具有逐渐变细的圆柱形状。槽的平均直径为约2mm，其中底端的直径(在接收孔中)为约1.5mm。在该装置中，所有的温度成形元件相对于槽轴对称布置的包括第一室、第一热制动器、接收孔、第一和第二绝热体以及突出部。
如下面将提出的，发现在没有重力倾斜角度的情况下，该实施例中使用的具有图12A所示结构的装置在约25至约30分钟内足以有效地从10ng人类基因组样品(约3,000个拷贝)进行扩增。对于1ng的质粒样本，在短至约6或8分钟的时间内，PCR扩增生成可检测的扩增产物。因此，这是不使用重力倾斜角度也可以提供有效的PCR扩增的对称加热结构的良好证明实例。如将在实施例2中提出的，在引入重力倾斜角度时，这种结构也能更好地工作。但是，对于大多数应用，小的倾斜角度(约10°至20°或更小)可以是足够的。
1.1 从质粒样品中进行PCR扩增
图53A至C示出了使用上述三种不同的DNA聚合酶(分别购自Takara Bio、Finnzymes和Kapa Biosystems)从1ng质粒DNA模板进行PCR扩增的结果。预计扩增子的大小为373bp。所使用的正向引物和反向引物分别为5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACC-3’(SEQID NO：1)和5’-TAGAAGGCACAGTCGAGGCT-3’(SEQ ID NO：2)。在图53A至C中，最左侧的泳道是DNA大小标准(2-Log DNA Ladder(0.1至10.0kb)购自New England BioLabs)，泳道1至5是使用热对流PCR装置分别用10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟的PCR反应时间(如在各图像底部所示)所得到的结果。本发明装置的第一、第二和第三热源的温度分别设定为98℃、70℃和54℃。接收孔沿着槽轴的深度为约2.8mm。泳道6(在底端标记为C)是使用Biometra的T1Thermocycler所做的对照试验的结果。在对照实验中使用含有相同量的质粒模板的相同PCR混合物。对照试验(包含热启动的预热(5分钟)和最终的延伸(10分钟))的总PCR反应时间为约1小时30分钟。如图53A至C所示，热对流装置产生了和对照试验大小相同的扩增产物，但PCR反应时间短得多(即，短3至4倍)。PCR扩增在约10至15分钟达到了可检测水平，并在约20或25分钟内变为饱和。如所示出的，发现在热对流PCR仪中使用三种DNA聚合酶几乎等效。
图54A至C示出了热对流PCR的另一些例子。将第一、第二和第三热源的温度分别设定为98℃、70℃和54℃。接收孔沿槽轴的深度为约2.8mm。图54A至C分别为从三种不同的质粒DNA模板(具有177bp、960bp和1608bp大小的扩增子)进行扩增所得到的结果。各反应使用的模板质粒的量为1ng。所使用的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。如所示，甚至较大的扩增子(约1kbp和1.6kbp)也在非常短的反应时间内被扩增，即约20分钟内达到可检测水平并且约30分钟内达到饱和水平。短的扩增子(177bp)在短得多的反应时间内被扩增，即约10分钟内达到可检测水平而且在约20分钟内达到饱和水平。
图55示出了从多种不同质粒模板(具有约200bp至约2kbp大小的扩增子)得到的热对流PCR扩增的结果。将第一、第二和第三热源的温度分别设定为98℃、70℃和54℃。接收孔沿着槽轴的深度为约2.8mm。各反应使用的模板质粒的量为1ng。所使用的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。预计扩增子的大小为泳道1的177bp、泳道2的373bp、泳道3的601bp、泳道4的733bp、泳道5的960bp、泳道6的1,608bp、泳道7的1,966bp。泳道1至6的PCR反应时间为25分钟，泳道7为30分钟。如所示，在短的反应时间中所有扩增子都观察到几乎饱和的产物带。该结果证明热对流PCR不仅快且有效，还具有宽的动态范围。
1.2 升高的变性温度加速PCR扩增
图56A至C所示的结果证明升高的变性温度加速热对流PCR。所使用的模板为可以产生373bp扩增子的1ng质粒。除了变性温度外，使用的全部其它实验条件(包括模板和引物)均与图53A至C所示实验的条件相同。将第二和第三热源的温度分别设定为70℃和54℃，而第一热源的温度增加至100℃(图56A)、102℃(图56B)和104℃(图56C)。如图56A至C所示，变性温度(即，第一热源的温度)的增加导致PCR扩增的加速。当变性温度为100℃时(图56A)，8分钟的反应时间内几乎不能观察到373bp的产物，而当变性温度增加至102℃时(图56B)，在相同的8分钟反应时间内373bp的产物变得更强。当变性温度进一步增加至104℃时(图56C)，373bp的产物甚至在6分钟的反应时间内就能观察到。
1.3 从人类基因组和cDNA样品进行PCR扩增
图57A至C示出从人类基因组样品中进行热对流PCR扩增的三个实施例。第一、第二和第三热源的温度分别设定为98℃、70℃和54℃。接收孔沿着槽轴的深度为约2.8mm。各反应所使用的人类基因组模板的量为10ng，相当于仅约3,000个拷贝。图57A示出了β-珠蛋白基因的363bp片段的扩增结果。该序列所使用的正向引物和反向引物分别为5’-GCATCAGGAGTGGACAGAT-3’(SEQ ID NO：3)和5’-AGGGCAGAGCCATCTATTG-3’(SEQ ID NO：4)。图57B示出了GAPDH基因的469bp片段的扩增结果。该实验所使用的正向引物和反向引物分别为5’-GCTTGCCCTGTCCAGTTAA-3’(SEQ ID NO：5)和5’-TGACCAGGCGCCCAATA-3’(SEQ IDNO：6)。图57C示出了β-珠蛋白基因的514bp片段的扩增结果。该实验所使用的正向引物和反向引物分别为5’-TGAAGTCCAACTCCTAAGCCA-3’(SEQ ID NO：7)和5’-AGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(SEQ ID NO：8)。
如图57A至C所示，热对流PCR在非常短的反应时间从大约3,000个拷贝的人类基因组样品产生正确大小的扩增子。PCR扩增在约20或25分钟达到可检测水平，在约25或30分钟变得饱和。这些结果证明了热对流PCR从低拷贝数样品快速且非常有效地进行扩增。
图58示出了从10ng人类基因组或cDNA样品进行热对流PCR扩增的另一些例子。PCR反应时间为30分钟。所有其它实验条件与图57A至C中所示实验的条件相同。如所示，在30分钟的反应时间内成功扩增了大小约100bp至约800bp的所有14个基因片段。在下表2中总结了靶基因和对应的引物序列。所用的模板为：泳道1、3至5和9至14为人类基因组DNA(10ng)；泳道2、6、7和8为cDNA(10ng)。cDNA样品由从HOS细胞(泳道2和7)或SK-OV-3(泳道6和8)细胞提取的mRNA经逆转录制备。
表2.用于图58的实验的引物序列和目标基因
表2中的缩写如下。PRPS1：磷酸核糖焦磷酸合成酶1；NAIP：NLR家族，凋亡抑制蛋白；CYP27B1：细胞色素P450，家族27，亚家族B，多肽1；HER2：ERBB2，v-erb-b2成红白球细胞白血病病毒癌基因同系物2；CDK4：细胞周期蛋白依赖性激酶4；CR2：补体受体2；PIGR：多聚免疫球蛋白受体；GAPDH：甘油醛3-磷酸脱氢酶。
1.4 从非常低拷贝的人类基因组样品进行PCR扩增
图59示出了使用本发明装置从非常低拷贝数的样品进行PCR扩增。所使用的模板样品为从293细胞提取的人类基因组DNA。该实验所用引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。靶序列为β-珠蛋白的363bp片段。PCR反应时间为30分钟。所有其它的实验条件(包括三个热源的温度和接收孔的深度)与在图57A至C和58所示实验的条件相同。如在图59的底部所示出的，各反应所使用的人类基因组样品的量依次降低，从10ng(约3,000个拷贝)开始到1ng(约300个拷贝)、0.3ng(约100个拷贝)和0.1ng(约30个拷贝)。如所表明的，热对流PCR成功地从少至30个拷贝的样品产生了PCR扩增。还检测了单拷贝样品的热对流PCR扩增。发现从单拷贝样品中成功扩增有约30％至40％的概率，可能是因为与单拷贝取样几率相关的统计概率。
1.5 本发明装置的温度稳定性和功率消耗
测试了具有图12所示结构的本发明装置的温度稳定性和功率消耗。本实验所用装置具有如图39和42所示的彼此间隔9mm布置的12个槽(3×4)。第一、第二和第三热源分别装配有图42所示的位于槽之间的NiCr加热丝(160a至c)。所述装置还包含在第三热源上方的风扇，在需要的时候提供对第三热源的冷却。将来自可充电Li+聚合物电池(12.6V)的DC电源提供给各加热丝，并且由PID(proportional-integral-derivative，比例-积分-微分)控制算法进行控制，从而使三个热源各自的温度维持在预设的目标值。
图60示出了当目标温度分别设定为98℃、70℃和54℃时，第一、第二和第三热源的温度变化。环境温度为约25℃。如所示，三个热源在少于约2分钟的时间内达到目标温度。在达到目标温度后的约40分钟的时间段内，三个热源的温度稳定并且精确的维持在目标温度。在40分钟的时间段中，各热源的平均温度相对于各自目标温度在约±0.05℃内。温度波动同样非常小，即，各热源的温度的标准偏差在约±0.05℃内。
图61示出了具有12个槽的本发明装置的功率消耗。如所示，功率消耗在起始时期(即，多至约2分钟)高，在该时期发生了向目标温度的快速加热。在三个热源达到目标温度后(即，约2分钟后)，功率消耗降低至较低值。约2分钟后观察到的大波动是主动控制各热源的能源供给的结果。因为这种主动的功率控制，三个热源的温度可以如图60所示稳定和精确地维持在目标温度。如图61所表示，在温度维持区域(即，约2分钟后)平均功率消耗为约4.3W。因此，每个槽或每个反应的功率消耗少于约0.4W。因为约30分钟或更少的时间足够本发明装置进行PCR扩增，所以完成一个PCR反应的能量消耗仅为约700J或更少，相当于将约2mL的水从室温加热到约100℃一次所需要的能量。
还测试了具有24个和48个槽的本发明装置。24个槽的装置平均功率消耗为约7至8W，48个槽的装置为约9至10W。因此，发现对于较大装置每个PCR反应的功率消耗甚至更低，即24个槽的装置为约0.3W，而48个槽的装置为约0.2W。
实施例2.使用图12B的装置的热对流PCR
在该实施例中，检查了重力倾斜角度θg对热对流PCR的影响。在该实施例中使用的装置具有与实施例1所用装置相同的结构和尺寸，只是整合入了图12B所示的重力倾斜角度θg。该装置在底部装配有倾斜的楔形物，从而使槽轴相对于重力方向倾斜θg。
如以下示出的，引入重力倾斜角造成更快的热对流，因而加速了热对流PCR。因此确认可以向装置或槽施加重力倾斜角度的结构元件(例如楔形物或腿)或者倾斜的槽在构建有效且快速的热对流PCR装置中是有用的结构元件。
2.1 从质粒样品进行PCR扩增
图62A至E示出了作为重力倾斜角度的函数的从质粒样品进行扩增的热对流PCR的结果。第一、第二和第三热源的温度分别设置为98℃、70℃和54℃。接收孔沿槽轴的深度为约2.8mm。各反应所用质粒模板的量为1ng。所使用的引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。扩增子的预期大小为373bp。图62A示出了在零重力倾斜角度时获得的结果。图62B至E分别示出了在θg等于10°、20°、30°和45°时所获得的结果。零重力倾斜角度时(图62A)，扩增产物在15分钟的反应时间时几乎不能被看到，在20分钟时变强。相比之下，当引入10°的重力倾斜角度时(图62B)，在10分钟的反应时间时观察到扩增产物有明显的强度。随着倾斜角增加到20°(图62C)，观察到产物条带的强度在10分钟和/或15分钟的反应时间时进一步增加。倾斜角度大于20°时(图62D至E)，观察到的扩增速度接近于在20°时观察到的速度。
2.2 从人类基因组样品进行PCR扩增
图63A至D示出了证明重力倾斜角的作用的另一实施例。在该实验中，使用10ng的人类基因组样品(约3,000个拷贝)作为模板DNA，并且使用具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列的引物。靶基因是β-珠蛋白基因的363bp片段。其它实验条件与上述图62A至E中示出实验的条件相同。图63A至D分别示出当将θg设置为0°、10°、20°和30°时所得到的结果。如所示，当引入重力倾斜角后，热对流PCR被加速(即，与图63A相比的图63B至D)。观察到PCR扩增的速度随着重力倾斜角的增加而增加。在20°(图63C)和30°(图63D)观察到近似的扩增速度。
图64A至B示出了另一实施例，其中使用具有高解链温度(高于60℃)的引物。在该实验中，使用10ng的人类基因组样品(约3,000个拷贝)作为模板DNA。所使用的正向引物和反向引物分别为：5’-GCTTCTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCG-3’(SEQ ID NO：30)和5’-CCAAAAGCCTTCATACATCTCAAGTTGGGGG-3’(SEQ ID NO：31)。扩增目标为β-肌动蛋白基因的521bp片段。第一、第二和第三热源的温度分别设置为98℃、74℃和64℃。接收孔沿着槽轴的深度为约2.8mm。将PCR反应时间设置为30分钟，并且对于每个倾斜角度，实验使用一式两份样品(泳道1和2)进行。图64A和B分别示出了θg＝0°和20°时所得到的结果。如所示，在0°时两个PCR样品均未观察到显著的扩增(图64A)。相比之下，在引入20°的倾斜角后观察到了强产物带(图64B)。与图63A至D中出现的实验相比，第三和第二热源的温度分别提高了10℃和4℃，而第一热源的温度相同。因此，由于降低了热源间的温度差异，所以减慢了热对流。在没有使用重力倾斜角度的情况下(图64A)，热对流PCR变得太慢以致不能快速进行PCR扩增。但是，通过引入重力倾斜角度(图64B)，热对流PCR变得足够快，并且在短的反应时间内从低拷贝的人类基因组样品(约3,000个拷贝)有效地产生强的产物条带。
2.3 从非常低拷贝的人类基因组样品中进行PCR扩增
图65示出了在使用重力倾斜角度时从非常低拷贝的人类基因组样品中进行热对流PCR扩增的结果。所使用的引物与图64A至B所示实验中使用的引物相同。因此，扩增目标为β-肌动蛋白基因的521bp片段。将第一、第二和第三热源的温度分别设定为98℃、74℃和60℃。接收孔沿着槽轴的深度为约2.5mm。重力倾斜角度设定为10°，PCR反应时间设定为30分钟。如图65所示，热对流PCR从低至30个拷贝的样品中成功的产生了PCR扩增。
实施例3.使用图14C的装置进行热对流PCR。
该实施例所使用的装置具有图14C所示结构，包含：槽70、第一室100、第二室110、第一热制动器130、接收孔73和通孔71。在该装置中未使用突出部结构。第一、第二和第三热源沿槽轴80的长度分别为约5mm、约4mm和约5mm。第一和第二绝热体(或绝热间隙)沿槽轴80的长度分别为约2mm和约1mm。第一室100位于第二热源30的上部，并且是沿槽轴80长约3mm、直径约4mm的圆柱形。第一热制动器130位于第二热源30的底部，并且沿槽轴80的长或厚为约1mm，第一热制动器130的壁133与槽70或反应容器90的整个外周接触。第二室110位于第三热源40的底部，并且为直径约4mm的圆柱形。第二室110沿槽轴80的长度为从约1.5mm至约0.5mm，这取决于接收孔73的深度。接收孔73沿槽轴80的深度为约2mm至约3mm。在该装置中，槽由第三热源40中的通孔71、第二热源30中第一热制动器130的壁133以及第一热源20中的接收孔73所限定。槽70具有逐渐变细的圆柱形状。槽的平均直径为约2mm，底端直径(在接收孔中)为约1.5mm。在该装置中，所有的温度成形元件包括第一和第二室、第一热制动器、接收孔以及第一和第二绝热体，它们都相对于槽轴对称布置。
3.1 从质粒样品中进行PCR扩增
图66示出了使用两个具有下列序列的引物从1ng质粒样品得到的PCR扩增结果：5’-AAGGTGAGATGAAGCTGTAGTCTC-3’(SEQ ID NO：32)和5’-CATTCCATTTTCTGGCGTTCT-3’(SEQID NO：33)。扩增子的预期大小为152bp。第一、第二和第三热源的温度分别设置为98℃、70℃和56℃。第二室沿槽轴的长度为约1mm，接收孔沿槽轴的深度为约2.5mm。如图66所示，热对流PCR在短至10分钟的时间中成功产生了扩增，这证明在这种本发明装置中进行了快速且有效的PCR扩增。
图67示出了从多种不同质粒模板(具有大小为约200bp至约2kbp的扩增子)进行热对流PCR扩增的结果。将第一、第二和第三热源的温度分别设置为98℃、70℃和56℃。第二室沿槽轴的长度为约1.5mm，接收孔沿着槽轴的深度为约2mm。各反应所使用的模板质粒的量为1ng。使用序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。扩增子的预期大小为：泳道1为177bp、泳道2为373bp、泳道3为601bp、泳道4为733bp、泳道5为960bp、泳道6为1,608bp以及泳道7为1,966bp。泳道1至6的PCR反应时间为30分钟，泳道7的为35分钟。如所示，观察到在短的反应时间中所有的扩增子都达到几乎饱和的产物条带。这些结果证明了热对流PCR不仅快速有效，而且还具有宽的动态范围。
3.2 从人类基因组样品进行PCR扩增
图68A至B示出了从人类基因组样品中进行扩增的热对流PCR的两个实施例。将第一、第二和第三热源的温度分别设为98℃、70℃和56℃。第二室沿槽轴的长度为约1mm，接收孔沿着槽轴的深度为约2.5mm。各反应所使用的人类基因组模板的量均为10ng(对应于约3,000个拷贝)。图68A示出了扩增β-珠蛋白基因的500bp片段的结果。该序列所用的正向引物和反向引物分别为5’-GCATCAGGAGTGGACAGAT-3’(SEQ ID NO：3)和5’-CTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’(SEQ ID NO：34)。图68B示出了β-肌动蛋白基因的500bp片段的扩增结果。该序列的正向引物和反向引物分别为5’-CGGACTATGACTTAGTTGCG-3’(SEQ ID NO：35)和5’-ATACATCTCAAGTTGGGGGA-3’(SEQ ID NO：36)。
如图68A至B所示，热对流PCR在短的反应时间中从约3,000个拷贝的人类基因组样品种产生了正确大小的扩增子。在约20或25分钟观察到了显著的扩增，在约30分钟内扩增达到饱和。这些结果证明了从低拷贝数的样品中进行了快速且有效的热对流PCR扩增。
3.3 从非常低拷贝的质粒样品中进行PCR扩增
图69示出了使用本发明装置从非常低拷贝数的质粒样品进行PCR扩增。除了质粒样品的量，所有的其它实验条件(包括三个热源的温度和接收孔的深度)与图66所示实验中使用的条件相同。所使用的模板质粒和引物也相同。PCR反应时间为30分钟。如在图69的底部标注的，各反应所使用的质粒样品的量依次减少，从约10,000个拷贝(泳道1)开始到约1,000个拷贝(泳道2)、100个拷贝(泳道3)和10个拷贝(泳道4)。如所证实的，热对流PCR成功地从少至10个拷贝的样品中产生了PCR扩增。还检验了单拷贝样品。发现成功从单拷贝中扩增有约30％至40％的几率。
3.4 本发明装置的温度稳定性和功率消耗
还测试了具有图14C所示结构的本发明装置的温度稳定性和功率消耗。本实验所使用的装置具有彼此间隔9mm布置的48个槽(6×8)。观察到该发明装置的温度变动稍大于具有图12A所示结构的装置(用于实施例1中的实验)(参见以上1.5部分)。在保持温度期间，各热源的平均温度相对于各自的目标温度在的±0.1℃内。各热源的温度波动(即，标准偏差)在约±0.1℃内。在保持温度期间，平均功率消耗为约15W至约20W，这取决于环境温度。与具有图12A所示结构的装置相比，功率消耗大出约1.5至约2倍，这是因为在不存在图12A装置中所使用的突出部结构的情况下绝热间隙的减小。这些结果证明了使用突出部结构有效降低本发明装置的功率消耗。
实施例4 使用图17A的装置进行热对流PCR。
在该实施例中使用的装置具有图17A所示的结构，但是没有第三热源40的突出部43，44。该装置包含槽70、第一室100、接收孔73、通孔71、第二热源30的突出部33，34以及第一热源20的突出部23，24。第一室100位于第二热源30中并且未使用热制动器结构。第一、第二和第三热源沿槽轴80的长度分别为约4mm、约6.5mm和约4mm。第一和第二绝热体(或者绝热间隙)在槽区域附近(即，在突出部区域中)沿槽轴80的长度分别为约1mm和约0.5mm。第一和第二绝热体在槽区域外部(即，在突出部区域外部)的长度分别为约6mm至约3mm(取决于位置)和约1mm。第一室100为圆柱形，其沿槽轴80的长度等于第二热源沿槽轴80的长度(即，约6.5mm)。第一室100的直径为约4mm至约2.5mm。接收孔73沿槽轴的深度为约2mm至约3mm。在该装置中，槽70由第三热源40中的通孔71和第一热源20中的接收孔73所限定。槽70为逐渐变细的圆柱形状，平均直径约2mm，底端的直径(在接收孔中)为约1.5mm。在该装置中，所有的温度成形元件包括第一室、接收孔以及第一和第二绝热体，它们均相对于槽轴对称布置。
在本实施例中，测试了室直径、接收孔深度和重力倾斜角度对热对流PCR的速度的影响。
4.1 室直径和接收孔深度的作用
在本实施例中，在不同的接收孔深度测试作为室直径的函数的热对流PCR。所使用的模板DNA为1ng质粒。使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的两种引物，扩增子大小为373bp。第一、第二和第三热源的温度分别设为98℃、70℃和54℃。
图70A至D示出当第一室的直径为约4mm(图70A)、约3.5mm(图70B)、约3mm(图70C)和约2.5mm(图70D)时得到的结果。接收孔沿槽轴的深度为约2mm。如所示，发现对流PCR随第一室直径的降低而减慢。当第一室的直径为约4.0mm时，PCR产物甚至在10分钟的反应时间内就扩增至明显的水平(图70A)。但是，当室直径降低至约3.5mm(图70B)和约3mm(图70C)时，达到类似的条带强度需要更多的反应时间。当室直径降低至约2.5mm(图70D)时，甚至在30分钟的反应时间后也观察不到可检测的PCR条带。第二热源与槽之间的室间隙的减小导致第二热源与槽之间更有效的热传递。因此，槽内的温度梯度在较小的室直径下变小，导致热对流速度降低。
图71A至D示出当接收孔的深度增加至约2.5mm而第一室直径保持不变(即约4mm(图71A)、约3.5mm(图71B)、约3mm(图71C)和约2.5mm(图71D))时得到的结果。相比于图70A至D所示结果，由于较深的接收孔中加热的增强，对于所有不同直径的第一室，热对流都变快。甚至当第一室的直径为最小时(即约2.5mm)，热对流PCR也变得足够快，并且在约15分钟的反应时间中有效地产生可检测的产物条带。
本实施例的结果表明室直径或室间隙是可用于控制热对流PCR速度的重要结构元件。发现较大的室直径导致较快的热对流PCR，或者反之亦然。尽管一般来说优选使热对流尽可能快，但是有时候优选降低热对流的速度。例如，如果对流速度太快，一些模板样品(例如具有长的靶序列或基因组DNA的某些靶基因)可能无法成功进行PCR扩增(因为受大尺寸或某些复杂结构的限制)。再例如，所使用的DNA聚合酶的聚合速度与热对流PCR的速度相比可能太慢。在这些情况下，使用具有不同(通常更小)直径或室间隙的室结构对于控制(通常降低)热对流PCR的速度可非常有用。
4.2 重力倾斜角度的作用
在本实施例中，通过引入重力倾斜角度θg进一步测试了本发明装置的热对流PCR。除了重力倾斜角度外，其它所有实验条件(包括所使用的模板DNA和引物)都与图70A至D和71A至D所示实施例中使用的条件相同。
图72A至D和73A至D示出当引入10°的重力倾斜角度时得到的结果。接收孔的深度在图72A至D中为约2.0mm，在图73A至D中为约2.5mm。与在图70A至D和71A至D中一样，第一室的直径为约4mm(图72A和73A)、约3.5mm(图72B和73B)、约3mm(图72C和73C)和约2.5mm(图72D和73D)。如所示，发现当引入重力倾斜角度时热对流PCR的加速是明显的。但是，当接收孔的深度为约2mm时，热对流PCR速度的增加更明显(图72A至D相比于图70A至D)。与图70A至D所示结果相比，当室直径为约4mm(图72A)和约3.5mm(图72B)时，观察到PCR反应时间减少约5分钟，而当室直径为约3mm(图72C)和约2.5mm(图72D)时，观察到PCR时间减少至少约10至15分钟。当接收孔的深度为约2.5mm时，在室直径为约4mm(图73A相比于图71A)、约3.5mm(图73B相比于图71B)和约3mm(图73C相比于图71C)时，观察到热对流PCR速度仅稍有增加。当室直径为约2.5mm(图73D相比于图71D)时，观察到PCR反应时间减少很多(减少约10分钟)。
本实施例的结果表明重力倾斜角度是可以用于加快热对流PCR速度的重要结构元件。此外，该结果表明在加速热对流PCR中可有某些限制(除了装置本身外)。例如，尽管改变了室直径(已经发现室直径显著影响对流速度)，但是观察到在图73A至C所示结果中热对流PCR的速度大致相等。类似地，不论是否存在重力倾斜角度，图73A至C所示结果与图71A至C所示结果相差不大。这些结果表明，尽管本发明装置的对流速度可以根据期望尽可能地增加，但是热对流PCR的最终速度可受限于所使用的DNA聚合酶的聚合速度。
实施例5.第一热制动器的位置的作用
在本实施例中使用了两种装置。使用的第一装置具有图12A所示结构，其包含：槽70、第一室100、第一热制动器130、接收孔73、通孔71、第二热源30的突出部33和34、以及第一热源20的突出部23和24。因此，如图12A所示，第一热制动器130位于第二热源30的底部，并且第一室100位于第二热源30的上部。第一热制动器130沿槽轴80的厚度为约1mm。
使用的第二装置除了室/热制动器结构外，具有与图12A所示相同的结构。如图10A所示的结构，第二装置包含：位于第二热源30底部和顶部的第一室100和第二室110，第一热制动器130位于第一室100和第二室110之间。第一热制动器130沿槽轴80的厚度为约1mm。第一热制动器130的位置沿槽轴80不同。
在两种装置中，第一、第二和第三热源沿槽轴80的长度分别为约4mm、约6.5mm和约4mm。第一和第二绝热体(或绝热间隙)在槽区域附近(即在突出部区域内)沿槽轴80的长度分别为约1mm和约0.5mm。第一和第二绝热体在槽区域外(即在突出部区域外)的长度分别为约6mm至约3mm(取决于位置)和约1mm。第一室100和第二室110两者都为直径约4mm的圆柱形。第一热制动器130沿槽轴80的长度或厚度为约1mm，并且第一热制动器130的壁133接触槽70的整个外周。接收孔73沿槽轴的深度为约2.8mm。槽70为逐渐变细的圆柱形状。槽的平均直径为约2mm，并且底端直径(在接收孔中)为约1.5mm。在该装置中，所有温度成形元件(包括第一室、第二室、第一热制动器、接收孔以及第一和第二绝热体)均相对于槽轴对称布置。
在本实施例中使用的模板DNA为1ng质粒DNA。使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述序列的两种引物，扩增子的大小为373bp。第一、第二和第三热源的温度分别设置为98℃、70℃和54℃。
图74A至F示出在第一热制动器的位置沿槽轴变化时得到的结果。第一热制动器的底端132的位置从第二热源的底部(图74A)到第二热源的底部上方约1mm(图74B)、约2.5mm(图74C)、约3.5mm(图74D)、约4.5mm(图74E)或约5.5mm(图74F)变化。如图74A至F所示，根据第一热制动器沿槽轴的位置来调整热对流PCR的速度。相比于其它位置，当第一热制动器位于第二热源的底部时(图74A)，热对流PCR产生相对慢的PCR扩增。随着第一热制动器向上移动最多约3.5mm(图74B至D)，PCR扩增的速度增加。在最高位置(图74E至F)，观察到扩增速度稍微下降。
本实施例的结果表明热制动器的位置是可以用来调节或控制热对流PCR速度的有用结构元件。
实施例6.第一热制动器的厚度和重力倾斜角度的作用
该本实施例使用了三种装置。使用的第一种装置具有图12A所示结构，其包含：槽70、第一室100、第一热制动器130、接收孔73、通孔71、第二热源30的突出部33，34、以及第一热源20的突出部23，24。因此，如图12A所示，第一热制动器130位于第二热源30的底部，并且第一室100位于第二热源30的上部。第一热制动器130沿槽轴80的厚度不同。
如图17A所示结构，使用的第二种装置仅具有位于第二热源中的第一室(无第一热制动器)。其它结构与第一种装置的相同。
使用的第三种装置无室结构，并且其它结构与第一种装置的相同。因此，第三种装置仅具有槽结构(其充当热制动器)而无室。
在这三种装置中，第一、第二和第三热源沿槽轴80的长度分别为约4mm、约5.5mm和约4mm。第一和第二绝热体(或绝热间隙)在槽区域附近(即在突出部区域内)沿槽轴80的长度分别为约2mm和约0.5mm。第一和第二绝热体在槽区域外(即在突出部区域外)的长度分别为约6mm至约3mm(取决于位置)和约1mm。第一室100为直径约4mm的圆柱形。热制动器130沿槽轴80的长度或厚度为约1mm至约5.5mm(在不存在室时)，并且第一热制动器130的壁133接触槽70的整个外周。接收孔73沿槽轴的深度为约2.8mm。槽70为逐渐变细的圆柱形状。槽的平均直径为约2mm，并且底端直径(在接收孔中)为约1.5mm。在这些装置中，所有温度成形元件(包括第一室、第一热制动器、接收孔以及第一和第二绝热体)均相对于槽轴对称布置。
在本实施例中使用的模板DNA为1ng质粒DNA。使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述序列的两种引物，并且扩增子的大小为373bp。第一、第二和第三热源的温度分别设置为98℃、70℃和54℃。
图75A至E示出当第一热制动器沿槽轴的厚度变化时得到的结果。图75A示出当不存在热制动器(即仅有第一室)时得到的结果。图75B至E示出当第一热制动器的厚度为约1mm(图75B)、约2mm(图75C)、约4mm(图75D)和约5.5mm(图75E，即仅有槽而无室结构)时得到的结果。如所示，PCR扩增速度随第一热制动器厚度的增加而降低。当无热制动器时(图75A)观察到最高的扩增速度。第一热制动器存在时，相比于无热制动器的结构(图75A)，扩增速度降低(图75B至E)。如所示，较厚的热制动器赋予了“较强的热制动”，导致较慢的PCR扩增。当无室结构时(图75E)，因为仅有槽结构导致非常强的热制动，观察不到明显的PCR扩增。
图76A至E示出引入10°的重力倾斜角度时得到的结果。除了重力倾斜角度，其它所有实验条件与图75A至E所示结果的实验条件相同。图76A示出当不存在热制动器(即仅有第一室)时得到的结果。图76B至E示出当第一热制动器的厚度为约1mm(图76B)、约2mm(图76C)、约4mm(图76D)和约5.5mm(图76E，即仅有槽而无室结构)时得到的结果。相比于不引入重力倾斜角度的图75A至E所示结果，通过使用重力倾斜角度加速了PCR扩增。甚至在无室结构时(即，仅有槽结构，图76E)，引入重力倾斜角使得在约30分钟的反应时间中能够成功进行PCR扩增。当无重力倾斜角度时，在无室结构时未观察到明显的PCR扩增(图75E)。
本实施例的结果表明热制动器、室和重力倾斜角度是可以用来根据不同应用调节或控制热对流PCR速度的有用结构元件。发现室结构和重力倾斜角度可用于加速热对流PCR，而热制动器(包括其厚度)可用于减慢热对流PCR速度。证明可以按照期望通过使用一个或更多个这种温度成形元件来调节热对流PCR的速度。
实施例7.使用结构不对称的装置进行热对流PCR
在该实施例中使用了三种装置。使用的第一种装置具有图12A所示结构，其包含：槽70、第一室100、第一热制动器130、接收孔73、通孔71、第二热源30的突出部33，34、以及第一热源20的突出部23，24。如图12A所示，第一热制动器130位于第二热源30的底部，并且第一室100位于第二热源30的上部。第一热制动器沿槽轴的厚度为约1mm。在该装置中，所有温度成形元件(包括第一室、第一热制动器、接收孔以及第一和第二绝热体)均相对于槽轴对称布置。
使用的第二种装置有具有图21A所示结构的不对称接收孔。相比于在槽轴相对侧的一半，将接收孔的另一半制作得在第一热源中更深并且接近于第二热源。两个相对侧的接收孔深度差为约0.2mm至约0.4mm。第二种装置的其它结构与第一种装置的相同。
使用的第三种装置具有制成不对称的第一热制动器。将该装置中的第一热制动器制成具有图28A所示的结构，使得热制动器的一侧接触槽而相对侧与槽间隔开。在第一热制动器中形成的通孔制作得比槽的直径大出约0.4mm，并且布置为相对于槽轴偏离中心约0.2mm。第三种装置的其它结构(包括第一热制动器沿槽轴的厚度和位置)与第一种装置的相同。
在这三种装置中，第一、第二和第三热源沿槽轴80的长度分别为约4mm、约6.5mm和约4mm。第一和第二绝热体(或绝热间隙)在槽区域附近(即在突出部区域内)沿槽轴80的长度分别为约1mm和约0.5mm。第一和第二绝热体在槽区域外(即在突出部区域外)的长度分别为约6mm至约3mm(取决于位置)和约1mm。第一室100为直径约4mm的圆柱形。热制动器130沿槽轴80的长度或厚度为约1mm。接收孔73沿槽轴的深度为约2.8mm。槽70为逐渐变细的圆柱形状。槽的平均直径为约2mm并且底端的直径(在接收孔内)为约1.5mm.
在本实施例中所使用的模板DNA为1ng质粒DNA。使用具有SEQ ID NO：1和2中所述序列的两种引物，并且扩增子大小为373bp。将第一、第二和第三热源的温度分别设定为98℃、70℃和54℃。
图77示出利用第一种装置获得的结果，该装置具有相对于槽轴对称布置的所有温度成形元件。如所示，在20分钟的反应时间中观察到弱的产物条带，而在25分钟后观察到了几乎饱和的强的产物条带。
图78A至B示出用具有不对称的接收孔结构的第二种装置获得的结果。在两个相对侧上的接收孔深度之差在图78A为约0.2mm，在图78B为约0.4mm。如图78A至B所示，PCR扩增比利用对称装置(图77)获得的结果快几乎两倍(并且有效)。这表明，接收孔中小的水平不对称足以显著加快热对流PCR。
图79示出用具有不对称第一热制动器的第三种装置获得的结果。如图79所示，PCR扩增速度比利用对称装置(图77)获得的结果快多于两倍(并且有效)。与利用第二种装置所获得的结果一致，第一热制动器中小的水平不对称足以显著加快热对流PCR。
该实施例的结果表明不对称结构元件(例如不对称接收孔、不对称热制动器、不对称室、不对称绝热体等)是有用的结构元件。可以将这些不对称结构元件单独使用或与其它温度成形元件组合使用，以按照期望调整(通常是提高)热对流PCR的速度。
本文提到的所有参考文献的公开内容(包括所有的专利和科技文献)通过引用并入本文。本发明通过参照其具体实施方案进行了详细描述。但是，应当理解，本领域的技术人员在考虑本公开内容后，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
以下实施方案内容对应于原申请的权利要求书：
1.一种适于进行热对流PCR的装置，其包含：
(a)用于对槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第一热源，所述槽适于容纳进行PCR的反应容器，
(b)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第二热源，所述下表面朝向所述第一热源的上表面，
(c)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第三热源，所述下表面朝向所述第二热源的上表面，其中所述槽由接触所述第一热源的底端和与所述第三热源的上表面邻接的通孔限定，并且其中所述底端与所述通孔之间的中心点形成槽轴，围绕其布置所述槽，
(d)至少一个温度成形元件，如位于所述槽周围并且在所述第二或第三热源之至少一部分中的室，所述室包含所述第二或第三热源与所述槽之间的室间隙，所述室间隙足以降低所述第二或第三热源与所述槽之间的热传递；以及
(e)所述第一热源内适于容纳所述槽的接收孔。
2.实施方案1所述的装置，其中所述装置包含位于所述第一热源的上表面与所述第二热源的下表面之间的第一绝热体。
3.实施方案1至2中任一项所述的装置，其中所述装置包含位于所述第二热源的上表面与所述第三热源的下表面之间的第二绝热体。
4.实施方案3所述的装置，其中所述第一绝热体沿所述槽轴的长度大于所述第二绝热体沿所述槽轴的长度。
5.实施方案1至4中任一项所述的装置，其中沿所述槽轴的所述第二热源的长度大于所述第一热源或所述第三热源的长度。
6.实施方案1至5中任一项所述的装置，其中所述装置包含完全位于所述第二热源或所述第三热源内的第一室。
7.实施方案6所述的装置，其中所述第一室位于所述第二热源内并且包含沿所述槽轴朝向第一室底端的第一室顶端。
8.实施方案7所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第二热源内的第二室。
9.实施方案8所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第二热源内的第三室。
10.实施方案7所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第三热源内的第二室。
11.实施方案8所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第三热源内的第三室。
12.实施方案6所述的装置，其中所述第一室位于所述第三热源内并且包含沿所述槽轴朝向第一室底端的第一室顶端。
13.实施方案7至12中任一项所述的装置，其中所述室还包含至少一个围绕所述槽轴布置的室壁。
14.实施方案13所述的装置，其中所述室进一步由所述槽沿所述槽轴限定。
15.实施方案13所述的装置，其中所述室壁布置成基本平行于所述槽轴。
16.实施方案13至15中任一项所述的装置，其中所述第一室顶端和所述第一室底端各自基本垂直于所述槽轴。
17.实施方案2至16中任一项所述的装置，其中所述第一绝热体包含固体或气体。
18.实施方案3至17中任一项所述的装置，其中所述第二绝热体包含固体或气体。
19.实施方案6至16中任一项所述的装置，其中至少一个室包含固体或气体。
20.实施方案19所述的装置，其中所述第一绝热体和所述第二绝热体包含固体或气体。
21.实施方案17至20中任一项所述的装置，其中所述气体是空气。
22.实施方案1至21中任一项所述的装置，其中所述槽进一步由沿所述槽轴从所述槽的底端至所述通孔的顶端的高度(h)限定。
23.实施方案22所述的装置，其中所述槽进一步由沿基本垂直于所述槽轴的第一方向的第一宽度(w1)限定。
24.实施方案23所述的装置，其中所述槽进一步由基本垂直于所述第一方向和所述槽轴的第二宽度(w2)限定。
25.实施方案23至24中任一项所述的装置，其中所述第一和/或第二宽度(w1和/或w2)从所述顶端到所述底端沿所述槽轴减小。
26.实施方案25所述的装置，其中所述槽的所述第一和第二宽度(w1或w2)由约0°至约15°的锥角(θ)限定。
27.实施方案23至24中任一项所述的装置，其中所述第一和/或第二宽度(w1和/或w2)沿所述槽轴基本不变。
28.实施方案22至27中任一项所述的装置，其中所述槽的底端是圆的、平的或弯曲的。
29.实施方案22至28中任一项所述的装置，其中所述高度(h)至少为约5mm至约25mm。
30.实施方案22至29中任一项所述的装置，其中所述第一或第二宽度(w1或w2)沿所述槽轴的平均值至少为约1mm至约5mm。
31.实施方案24至30中任一项所述的装置，其中由所述高度(h)与所述第一或第二宽度(w1或w2)之比定义的所述槽的竖直长宽比为约4至约15。
32.实施方案24至31中任一项所述的装置，其中由所述第一宽度(w1)与所述第二宽度(w2)之比定义的所述槽的水平长宽比为约1至约4。
33.实施方案1至32中任一项所述的装置，其中所述槽的至少一部分沿基本垂直于所述槽轴的平面具有水平形状。
34.实施方案33所述的装置，其中所述水平形状具有至少一个镜像或旋转对称元素。
35.实施方案34所述的装置，其中所述水平形状在所述平面上是圆形、菱形、正方形、圆角正方形、椭圆形、平行四边形、矩形、圆角矩形、卵形、半圆形、梯形或圆角梯形。
36.实施方案33至35中任一项所述的装置，其中垂直于所述槽轴的所述平面在所述第一、第二或第三热源内。
37.实施方案6至36中任一项所述的装置，其中所述室的至少一部分沿基本垂直于所述槽轴的平面具有水平形状。
38.实施方案37所述的装置，其中所述水平形状具有至少一个镜像或旋转对称元素。
39.实施方案38所述的装置，其中所述水平形状在所述平面上是圆形、菱形、正方形、圆角正方形、椭圆形、平行四边形、矩形、圆角矩形、卵形、半圆形、梯形或圆角梯形。
40.实施方案37至39中任一项所述的装置，其中垂直于所述槽轴的所述平面在所述第二或第三热源内。
41.实施方案6至40中任一项所述的装置，其中所述室沿垂直于所述槽轴的平面围绕所述槽基本对称地布置。
42.实施方案6至40中任一项所述的装置，其中所述室的至少一部分沿垂直于所述槽轴的平面围绕所述槽不对称布置。
43.实施方案41或42所述的装置，其中所述槽的至少一部分沿垂直于所述槽轴的平面位于所述室内。
44.实施方案42所述的装置，其中所述槽的至少一部分沿垂直于所述槽轴的平面与所述室壁接触。
45.实施方案42所述的装置，其中所述槽的至少一部分沿垂直于所述槽轴的平面位于所述室外并且与所述第二或第三热源接触。
46.实施方案41至45中任一项所述的装置，其中所述垂直于所述槽轴的平面在所述第二或第三热源内。
47.实施方案41至46中任一项所述的装置，其中所述室的至少一部分沿所述槽轴呈锥形。
48.实施方案47所述的装置，其中所述室的至少一部分位于所述第二热源内，并且其垂直于所述槽轴的宽度(w)在接近所述第三热源处大于接近所述第一热源处。
49.实施方案47所述的装置，其中所述室的至少一部分位于所述第二热源内，并且其垂直于所述槽轴的宽度(w)在接近所述第一热源处大于接近所述第三热源处。
50.实施方案41至46中任一项所述的装置，其中所述装置包含位于所述第二热源内的所述第一室和所述第二室，所述第一室垂直于所述槽轴的宽度(w)不同于所述第二室的宽度(w)。
51.实施方案50所述的装置，其中所述第一室朝向所述第一热源。
52.实施方案1至51中任一项所述的装置，其中所述接收孔围绕所述槽轴对称布置。
53.实施方案52所述的装置，其中所述接收孔垂直于所述槽轴的宽度与所述槽的宽度(w1或w2)大致相同。
54.实施方案52所述的装置，其中所述接收孔垂直于所述槽轴的宽度比所述槽的宽度(w1或w2)长约0.01mm至约0.2mm。
55.实施方案6至54中任一项所述的装置，其中所述装置包含位于所述第二热源内的所述第一室和所述第二室，并且所述第一室与所述第二室沿所述槽轴以长度(l)间隔开。
56.实施方案55所述的装置，其中所述第一室、所述第二室和所述第二热源限定出在所述第一室与第二室之间接触所述槽的第一热制动器，其面积和厚度(或体积)足以降低来自所述第一热源或者到所述第三热源的热传递。
57.实施方案56所述的装置，其中所述第一热制动器包含上表面和下表面。
58.实施方案57所述的装置，其中所述长度(l)为约0.1mm至所述第二热源沿所述槽轴的高度的约80％。
59.实施方案6至54中任一项所述的装置，其中所述第一室位于所述第二热源中，并且所述第一室和所述第一绝热体限定出在所述第一室与所述第一绝热体之间接触所述槽的第一热制动器，其面积和厚度(或体积)足以降低来自所述第一热源的热传递。
60.实施方案59所述的装置，其中所述第一热制动器包含上表面和下表面。
61.实施方案60所述的装置，其中所述第一热制动器的下表面与所述第二热源的下表面处于大致相同的高度。
62.实施方案61所述的装置，其中所述第一室与所述第一绝热体沿所述槽轴以长度(l)间隔开。
63.实施方案62所述的装置，其中所述长度(l)为约0.1mm至所述第二热源沿所述槽轴的高度的约80％。
64.实施方案56所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第二热源内并且与所述第二热源之上表面接触的第三室。
65.实施方案64所述的装置，其中所述第三室、所述第二室和所述第二热源限定出在所述第二室与所述第三室之间接触所述槽的第二热制动器，其面积和厚度(或体积)足以降低到所述第三热源的热传递。
66.实施方案65所述的装置，其中所述第一和第二热制动器的厚度之和小于所述第二热源沿所述槽轴的高度的约80％。
67.实施方案6至54中任一项所述的装置，其中所述装置包含第一室、位于所述第一室与所述第一绝热体之间的第一热制动器，以及在所述第二热源中位于所述第一室与所述第二绝热体之间的第二热制动器，其中所述第一和第二热制动器各自与所述槽接触的面积和厚度(或体积)均足以降低来自所述第一热源或者到所述第三热源的热传递。
68.实施方案6至67中任一项所述的装置，其中所述接收孔相对于所述槽轴而言是偏离中心的。
69.实施方案68所述的装置，其中所述接收孔偏离中心约0.02mm至约0.5mm。
70.实施方案68至69中任一项所述的装置，其中所述接收孔垂直于所述槽轴的宽度大于所述槽的宽度(w1或w2)。
71.实施方案70所述的装置，其中所述接收孔的宽度(w)比所述槽的宽度(w1或w2)长约0.04mm至约1mm。
72.实施方案6至71中任一项所述的装置，其中所述装置还包含所述第三热源内的第二室。
73.实施方案72所述的装置，其中所述第一室和所述第二室的室壁大致位于同一轴上。
74.实施方案72至73中任一项所述的装置，其中所述装置还包含所述第二热源内的第三室。
75.实施方案74所述的装置，其中所述第一、第二和第三室的室壁大致位于同一轴上。
76.实施方案75所述的装置，其中热制动器位于所述第二热源内的所述第一与第三室之间。
77.实施方案72至73中任一项所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第一室与所述第二热源的下表面之间的热制动器。
78.实施方案6至67中任一项所述的装置，其中所述第一室完全位于所述第三热源内。
79.实施方案1至78中任一项所述的装置，其中所述第二热源包含至少一个从所述第二热源延伸出的突出部。
80.实施方案79所述的装置，其中所述第二热源的突出部基本平行于所述槽轴并且向所述第一或第三热源延伸。
81.实施方案79至80中任一项所述的装置，其中所述第二热源包含向所述第一热源延伸并且限定出部分所述第一室或所述槽的第一突出部。
82.实施方案81所述的装置，其中所述第二热源的第一突出部限定出所述第一绝热体和所述第二热源的一部分。
83.实施方案81所述的装置，其中所述第二热源的第一突出部将所述第一绝热体与所述室或所述槽分隔开。
84.实施方案81所述的装置，其中所述第二热源还包含向所述第三热源延伸并且限定出一部分所述室或所述槽的第二突出部。
85.实施方案84所述的装置，其中所述第二热源的第二突出部限定出所述第二绝热体和所述第二热源的一部分。
86.实施方案84所述的装置，其中所述第二热源的第二突出部将所述第二绝热体与所述室或所述槽分隔开。
87.实施方案1至86中任一项所述的装置，其中所述第一热源包含至少一个从所述第一热源延伸出的突出部。
88.实施方案87所述的装置，其中所述第一热源的突出部基本平行于所述槽轴，并且向所述第二热源延伸或从所述第一热源的下表面延伸出。
89.实施方案87至88中任一项所述的装置，其中所述第一热源包含向所述第二热源延伸并且限定出一部分所述槽的第一突出部。
90.实施方案89所述的装置，其中所述第一热源的第一突出部限定出所述第一绝热体和所述第一热源的一部分。
91.实施方案89所述的装置，其中所述第一热源的第一突出部将所述第一绝热体与所述槽分隔开。
92.实施方案89所述的装置，其中所述第一绝热体包含第一绝热体室，其至少由所述第一热源、所述第一热源的第一突出部、所述第二热源的第一突出部和所述第二热源限定。
93.实施方案1至92中任一项所述的装置，其中所述第三热源包含至少一个从所述第三热源延伸出的突出部。
94.实施方案93所述的装置，其中所述第三热源的突出部基本平行于所述槽轴，并且向所述第二热源延伸或从所述第三热源的上表面延伸出。
95.实施方案93至94中任一项所述的装置，其中所述第三热源包含向所述第二热源延伸并且限定出一部分所述槽或所述室的第一突出部。
96.实施方案95所述的装置，其中所述第三热源的第一突出部限定出所述第二绝热体和所述第三热源的一部分。
97.实施方案95所述的装置，其中所述第三热源的第一突出部将所述第二绝热体与所述槽或所述室分隔开。
98.实施方案95所述的装置，其中所述第二绝热体包含第二绝热体室，其至少由所述第三热源、所述第三热源的第一突出部、所述第二热源的第二突出部和所述第二热源限定。
99.实施方案1至98中任一项所述的装置，其中所述装置适配成使得所述槽轴相对于重力方向倾斜。
100.实施方案99所述的装置，其中所述槽轴垂直于所述第一、第二和第三热源之中任一个的上或下表面，并且所述装置是倾斜的。
101.实施方案99所述的装置，其中所述槽轴相对于垂直于所述第一、第二和第三热源之中任一个的上或下表面的方向倾斜。
102.实施方案99所述的装置，其中所述倾斜由所述槽轴与重力方向之间的角度θg定义，所述倾斜的角度为约2°至约60°。
103.实施方案1至102中任一项所述的装置，其中所述接收孔围绕所述槽轴不对称布置，足以引起从所述第一热源到所述槽的水平方向上不均匀的热传递。
104.实施方案103所述的装置，其中所述接收孔包含相对于所述槽轴偏离中心(约0.02mm至约0.5mm)的接收孔间隙。
105.实施方案104所述的装置，其中所述接收孔的至少一部分垂直于所述槽轴的宽度大于所述槽的宽度(w1或w2)。
106.实施方案105所述的装置，其中所述接收孔的宽度(w)比所述槽的宽度(w1或w2)长约0.04mm至约1mm。
107.实施方案103所述的装置，其中所述装置包含沿所述槽轴一侧的深度比另一侧的深度更大的所述接收孔。
108.实施方案107所述的装置，其中所述第一热源包含向所述第二热源的下表面延伸并且沿所述槽轴一侧的高度比另一侧的高度更大的第一突出部。
109.实施方案107至108中任一项所述的装置，其中所述第二热源在所述槽周围的区域中沿所述槽轴的高度恒定。
110.实施方案107至108中任一项所述的装置，其中所述第二热源在所述槽周围的区域中沿所述槽轴一侧的高度比另一侧的高度更大。
111.实施方案109至110中任一项所述的装置，其中所述接收孔的顶端沿所述槽轴在一侧比另一侧更接近所述第二热源的下表面。
112.实施方案110所述的装置，其中所述接收孔的顶端所处位置沿所述槽轴距所述第二热源的下表面的高度恒定。
113.实施方案6至112中任一项所述的装置，其中所述室的至少一部分围绕所述槽轴不对称布置，足以引起从所述第二或第三热源到所述槽的水平方向上不均匀的热传递。
114.实施方案113所述的装置，其中所述第一室位于所述第二热源内并且沿所述槽轴一侧的高度比另一侧的高度更大，足以引起从所述第二热源到所述槽的水平方向上不均匀的热传递。
115.实施方案114所述的装置，其中所述接收孔在所述槽周围沿所述槽轴的深度恒定。
116.实施方案115所述的装置，其中所述接收孔的顶端沿所述槽轴在一侧比另一侧更接近所述第二热源的下表面。
117.实施方案114所述的装置，其中所述接收孔沿所述槽轴一侧的深度比另一侧的深度更大。
118.实施方案117所述的装置，其中所述接收孔的顶端沿所述槽轴在一侧比另一侧更接近所述第二热源的下表面。
119.实施方案117所述的装置，其中所述接收孔的顶端所处位置沿所述槽轴距所述第二热源的下表面的高度恒定。
120.实施方案114至119中任一项所述的装置，其中所述第二热源包含向所述第一热源的上表面延伸并且沿所述槽轴一侧的高度比另一侧的高度更大的第一突出部。
121.实施方案114至120中任一项所述的装置，其中所述第二热源包含向所述第三热源的下表面延伸并且任选地沿所述槽轴一侧的高度比另一侧的高度更大的第二突出部。
122.实施方案113所述的装置，其中所述装置包含位于所述第二热源内的所述第一室和所述第二室，它们各自沿相反方向从所述槽轴偏离中心。
123.实施方案122所述的装置，其中所述第一室的顶端与所述第二室的底端所处高度基本相同。
124.实施方案113所述的装置，其中至少一个室的所述室壁相对于所述槽轴倾斜。
125.实施方案124所述的装置，其中所述倾斜的角度为约2°至约30°。
126.实施方案113所述的装置，其中所述第二热源中的至少一个所述室具有布置成一侧比另一侧更高的室壁，足以引起从所述第二热源到所述槽的水平方向上不均匀的热传递。
127.实施方案6至112中任一项所述的装置，其中所述第一和第二室位于所述第二热源内并且围绕所述槽轴对称布置。
128.实施方案127所述的装置，其中所述第一室与所述第二室沿所述槽轴以长度(l)间隔开。
129.实施方案127至128中任一项所述的装置，所述装置还包含在所述第一与第二室之间的所述长度(l)上接触所述槽的所述第二热源之一部分，所述接触作为足以降低来自所述第一热源或者到所述第三热源的热传递的热制动器而发挥功能。
130.实施方案129所述的装置，其中所述热制动器在所述第一与第二室之间的长度(l)上接触所述槽的一侧，所述槽另一侧与所述第二热源间隔开。
131.实施方案113所述的装置，其中所述室的至少一部分相对于所述槽轴偏离中心约0.1mm至约3mm。
132.实施方案131所述的装置，其中所述室的至少一部分沿垂直于所述槽轴的方向具有一侧比另一侧更大的室间隙。
133.实施方案131至132中任一项所述的装置，其中所述装置还包含接触所述槽的所述第二热源的一部分，所述接触发挥足以降低来自所述第一热源或者到所述第三热源的热传递之热制动器的功能。
134.实施方案133所述的装置，其中所述热制动器接触所述槽一侧，另一侧与所述第二热源间隔开。
135.实施方案134所述的装置，其中所述热制动器接触所述第二热源内所述槽的一侧的整个高度。
136.实施方案133所述的装置，其中所述热制动器接触所述第二热源内所述槽的部分高度。
137.实施方案136所述的装置，其中所述装置包含位于所述第二热源中的所述第一室和所述第二室，并且所述第一室与所述第二室沿所述槽轴以长度(l)间隔开。
138.实施方案137所述的装置，其中所述热制动器在所述第一室与第二室之间的所述长度(l)上接触所述槽的整个外周。
139.实施方案138所述的装置，其中所述第一室和所述第二室沿同一方向从所述槽轴偏离中心。
140.实施方案138所述的装置，其中所述第一室和所述第二室沿相反方向从所述槽轴偏离中心。
141.实施方案137所述的装置，其中所述热制动器在所述第一与第二室之间的所述长度(l)上接触所述槽的一侧，所述槽的另一部分与所述第二热源间隔开。
142.实施方案136所述的装置，其中所述第一室的顶端与所述第二室的底端所处高度基本相同，并且所述热制动器在所述第一或第二室内接触所述槽一侧，所述槽的另一侧与所述第二热源间隔开。
143.实施方案137所述的装置，其中所述第一室和所述第二室沿同一方向从所述槽轴偏离中心。
144.实施方案137所述的装置，其中所述第一室和所述第二室沿相反方向从所述槽轴偏离中心。
145.实施方案143至144中任一项所述的装置，其中所述热制动器在所述第一室与第二室之间的所述长度(l)上接触所述槽的一侧，所述槽的另一侧与所述第二热源间隔开。
146.实施方案122所述的装置，其中所述装置包含在所述第一室内接触所述槽的一侧的第一热制动器，另一侧与所述第二热源间隔开。
147.实施方案146所述的装置，其中所述装置还包含在所述第二室内接触所述槽的一侧的第二热制动器，另一侧与所述第二热源间隔开。
148.实施方案147所述的装置，其中所述第一热制动器的顶端与所述第二热制动器的底端所处高度基本相同。
149.实施方案147所述的装置，其中所述第一热制动器的顶端所处位置高于所述第二制动器的底端。
150.实施方案147所述的装置，其中所述第一热制动器的顶端所处位置低于所述第二制动器的底端。
151.实施方案137所述的装置，其中所述第一室的顶端和所述第二室的底端各自相对于垂直于所述槽轴的方向倾斜。
152.实施方案151所述的装置，其中所述热制动器在所述第一室与所述第二室之间接触所述槽的整个外周并且一侧的所在位置比另一侧更高。
153.实施方案137所述的装置，其中所述第一室和所述第二室各自相对于所述槽轴倾斜。
154.实施方案153所述的装置，其中所述第一室的底端和所述第二室的顶端各自基本垂直于所述槽轴。
155.实施方案154所述的装置，其中所述热制动器在所述第一室与所述第二室之间接触所述槽的整个外周。
156.实施方案153所述的装置，其中所述第一室的底端和所述第二室的顶端各自相对于垂直于所述槽轴的方向倾斜。
157.实施方案156所述的装置，其中所述热制动器在所述第一室与所述第二室之间接触所述槽的整个外周并且一侧的所在位置比另一侧更高。
158.实施方案3至157中任一项所述的装置，其中所述第一热源、第二热源和第三热源各自包含至少一个固定元件。
159.实施方案158所述的装置，其中所述第一绝热体和第二绝热体各自包含至少一个固定元件。
160.实施方案158至159中任一项所述的装置，其中所述装置包含围绕所述第一热源、第二热源、第三热源、第一绝热体和第二绝热体的第一壳体元件。
161.实施方案160所述的装置，其中所述装置还包含围绕所述第一壳体元件的第二壳体元件。
162.实施方案160至161中任一项所述的装置，其中所述固定元件适配成将所述第一热源、第二热源、第三热源、第一绝热体和第二绝热体彼此固定或固定至所述第一壳体元件上。
163.实施方案162所述的装置，其中至少一个所述固定元件位于所述第一热源、第二热源、第三热源、第一绝热体和第二绝热体中的至少一个、优选所有的外部区域中。
164.实施方案162至163中任一项所述的装置，其中至少一个所述固定元件位于所述第一热源、第二热源、第三热源、第一绝热体和第二绝热体中的至少一个、优选所有的内部区域中。
165.实施方案158至164中任一项所述的装置，其中所述第一热源、第一绝热体、第二热源、第二绝热体和第三热源的至少一个包含至少一个翼结构。
166.实施方案165所述的装置，其中所述翼结构包括第一、第二、第三和第四翼结构。
167.实施方案165至166中任一项所述的装置，其中所述第三热源包含所述翼结构。
168.实施方案165至167中任一项所述的装置，其中所述翼结构在所述第一、第二和第三热源与所述第一壳体元件之间限定出第三绝热体。
169.实施方案168所述的装置，其中所述第一和所述第二翼结构限定出所述第三绝热体的第一部分。
170.实施方案169所述的装置，其中所述第二和所述第三翼结构限定出所述第三绝热体的第二部分。
171.实施方案170所述的装置，其中所述第三和第四翼结构限定出所述第三绝热体的第三部分。
172.实施方案171所述的装置，其中所述第四和所述第一翼结构限定出所述第三绝热体的第四部分。
173.实施方案169至172中任一项所述的装置，其中所述第三绝热体的所述第一、第二、第三和第四部分各自进一步由所述第一壳体元件限定。
174.实施方案173所述的装置，其中所述第一热源底部和所述第一壳体元件限定出第四绝热体。
175.实施方案174所述的装置，其中所述装置还包含由所述第一壳体元件和所述第二壳体元件限定的第五绝热体和/或第六绝热体。
176.实施方案158至175中任一项所述的装置，其中所述第一、第二和第三热源各自包含至少一个加热和/或冷却元件。
177.实施方案176所述的装置，其中所述第一、第二和第三热源还各自包含温度传感器。
178.实施方案177所述的装置，其中所述装置还包含至少一个风扇单元以从所述第一、第二和/或第三热源移除热量。
179.实施方案178所述的装置，其中所述装置包含位于所述第三热源之上的第一风扇单元以从所述第三热源移除热量。
180.实施方案179所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第一热源之下的第二风扇单元以从所述第一热源移除热量。
181.实施方案1至180中任一项所述的装置，其中所述装置适于在所述槽内部产生离心力以调节所述对流PCR。
182.实施方案181所述的装置，其中所述装置至少包含与转子转动连接的所述第一、第二和第三热源，所述转子用于使所述热源围绕旋转轴旋转。
183.实施方案182所述的装置，其中所述装置包含与所述转子连接的旋转臂，其限定从所述旋转轴到所述槽中心的离心式旋转半径。
184.实施方案182至183中任一项所述的装置，其中所述旋转轴基本平行于重力方向。
185.实施方案182至184中任一项所述的装置，其中所述槽轴基本平行于由重力和离心力产生的净力的方向。
186.实施方案182至184中任一项所述的装置，其中所述槽轴相对于由重力和离心力产生的所述净力的方向是倾斜的。
187.实施方案186所述的装置，其中所述槽轴与所述净力方向之间的倾斜角度为约2°至约60°。
188.实施方案185至187中任一项所述的装置，其中所述装置还包含适于控制所述槽轴与所述净力之间角度的倾斜轴。
189.实施方案182至188中任一项所述的装置，其中所述旋转轴位于所述第一、第二和第三热源以外。
190.实施方案182至188中任一项所述的装置，其中所述旋转轴基本上位于所述第一、第二和第三热源的中心。
191.实施方案190所述的装置，其中所述装置包含相对于所述旋转轴同心定位的多个槽。
192.实施方案191所述的装置，其中所述第一、第二和第三热源为圆形形状。
193.适于在离心条件下进行聚合酶链式反应(PCR)的PCR离心机，所述PCR离心机包含实施方案181-192中任一项所述的装置。
194.通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包括下述步骤中的至少一个且优选全部：
(a)将包含接收孔的第一热源维持在适于使双链核酸分子变性并且形成单链模板的温度范围，
(b)将第三热源维持在适于使至少一条寡核苷酸引物与所述单链模板退火的温度范围，
(c)将第二热源维持在适于支持所述引物沿所述单链模板聚合的温度；以及
(d)在足以产生引物延伸产物的条件下，在所述接收孔与所述第三热源之间产生热对流。
195.实施方案194所述的方法，其中所述方法还包括提供反应容器的步骤，所述反应容器包含在水溶液中的所述双链核酸和所述寡核苷酸引物。
196.实施方案195所述的方法，其中所述反应容器还包含DNA聚合酶。
197.实施方案196所述的方法，其中所述DNA聚合酶是固定化的DNA聚合酶。
198.实施方案195至197中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述反应容器接触所述接收孔和至少一个温度成形元件的步骤，所述温度成形元件例如是布置在所述第二或第三热源中至少一个之内的室，所述接触足以支持所述反应容器内的所述热对流。
199.实施方案198所述的方法，其中所述方法还包括使所述反应容器接触所述第一与第二热源之间的第一绝热体和所述第二与第三热源之间的第二绝热体的步骤。
200.实施方案199所述的方法，其中所述第一、第二和第三热源的导热率为所述反应容器或其中水溶液的导热率的至少约10倍。
201.实施方案200所述的方法，其中所述第一和第二绝热体的导热率比所述反应容器或其中水溶液的导热率低至少约5倍，其中所述第一和第二绝热体的导热率足以降低所述第一、第二和第三热源之间的热传递。
202.实施方案194至201中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述反应容器中产生围绕所述槽轴基本对称的流体流的步骤。
203.实施方案194至201中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述反应容器中产生围绕所述槽轴不对称的流体流的步骤。
204.实施方案195至203中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)-(c)在每个反应容器中消耗少于1W的功率来产生所述引物延伸产物。
205.实施方案204所述的方法，其中进行所述方法的所述功率由电池提供。
206.实施方案194至205中任一项所述的方法，其中所述PCR延伸产物在约15至约30分钟或更短的时间内产生。
207.实施方案195至206中任一项所述的方法，其中所述反应容器的体积小于约50微升。
208.实施方案207所述的方法，其中所述反应容器的体积小于约20微升。
209.实施方案194至208中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述反应容器施加有助于进行所述PCR的离心力的步骤。
210.通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包括以下步骤：在足以产生引物延伸产物的条件下，将寡核苷酸引物、核酸模板和缓冲液加入实施方案1至192中任一项所述装置所容纳的反应容器中。
211.实施方案210所述的方法，其中所述方法还包括将DNA聚合酶加入所述反应容器的步骤。
212.通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包括以下步骤：在足以产生引物延伸产物的条件下，将寡核苷酸引物、核酸模板和缓冲液加入实施方案193所述PCR离心机所容纳的反应容器中，以及向所述反应容器施加离心力。
213.实施方案212所述的方法，其中所述方法还包括将DNA聚合酶加入所述反应容器的步骤。
214.适于被实施方案1至192所述装置或实施方案193所述PCR离心机容纳的反应容器，所述反应容器包含顶端、底端、外壁和内壁，并且所述外壁的竖直长宽比至少为约4至约15，所述外壁的水平长宽比为约1至约4，并且所述外壁的锥角θ为约0°至约15°。
215.实施方案214所述的反应容器，其中所述外壁顶端和底端的中心点限定反应容器轴。
216.实施方案215所述的反应容器，其中所述反应容器沿所述反应容器轴的高度为至少约6mm至约35mm。
217.实施方案216所述的反应容器，其中所述外壁的平均宽度为约1mm至约5mm。
218.实施方案217所述的反应容器，其中所述内壁的平均宽度为约0.5mm至约4.5mm。
219.实施方案215至218中任一项所述的反应容器，其中所述外壁和所述内壁沿所述反应容器轴有基本相同的垂直形状。
220.实施方案219所述的反应容器，其中所述外壁和所述内壁沿垂直于所述反应容器轴的横截面有基本相同的水平形状。
221.实施方案215至218中任一项所述的反应容器，其中所述外壁和所述内壁沿所述反应容器轴有不同的垂直形状。
222.实施方案221所述的反应容器，其中所述外壁和所述内壁沿垂直于所述反应容器轴的横截面有不同的水平形状。
223.实施方案220和222中任一项所述的反应容器，其中所述水平形状为圆形、菱形、正方形、圆角正方形、椭圆形、平行四边形、矩形、圆角矩形、卵形、三角形、圆角三角形、梯形、圆角梯形或长椭圆形中的一种或更多种。
224.实施方案219至223中任一项所述的反应容器，其中所述内壁相对于所述反应容器轴基本对称布置。
225.实施方案224所述的反应容器，其中所述反应容器壁的厚度为约0.1mm至约0.5mm。
226.实施方案225所述的反应容器，其中所述反应容器壁沿所述反应容器轴的厚度基本不变。
227.实施方案219至223中任一项所述的反应容器，其中所述内壁相对于所述反应容器轴布置是偏离中心的。
228.实施方案227所述的反应容器，其中所述反应容器壁的厚度为约0.1mm至约1mm。
229.实施方案228所述的反应容器，其中所述反应容器壁的厚度在一侧比另一侧薄至少约0.05mm。
230.实施方案214至229中任一项所述的反应容器，其中所述底端是平的、弯曲的或圆的。
231.实施方案230所述的反应容器，其中所述底端相对于所述反应容器轴基本对称布置。
232.实施方案230所述的反应容器，其中所述底端相对于所述反应容器轴不对称布置。
233.实施方案230至232中任一项所述的反应容器，其中所述底端是封闭的。
234.实施方案214至233中任一项所述的反应容器，其中所述反应容器包含塑料、陶瓷或玻璃或由其组成。
235.实施方案214至234中任一项所述的反应容器，其还包含固定化的DNA聚合酶。
236.实施方案214至235中任一项所述的反应容器，其还包含与所述反应容器密封接触的盖。
237.实施方案236所述的反应容器，其中所述盖包含光学端口。
238.实施方案237所述的反应容器，其还包含所述反应容器的内壁与所述光学端口的侧面部分之间的开放空间。
239.实施方案1至192中任一项所述的装置，其还包含至少一个光学检测单元。
240.实施方案193所述的PCR离心机，其中实施方案181至192中任一项所述的装置还包含至少一个光学检测单元。
241.实施方案194至209中任一项所述的方法，其还包括使用至少一个光学检测单元实时检测所述引物延伸产物的步骤。
242.实施方案210至213中任一项所述的方法，其还包括使用至少一个光学检测单元实时检测所述引物延伸产物的步骤。

Claims (55)

1.一种适于进行热对流PCR的装置，其包含：
(a)用于对槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第一热源，所述槽适于容纳进行PCR的反应容器，
(b)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第二热源，所述下表面朝向所述第一热源的上表面，
(c)用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第三热源，所述下表面朝向所述第二热源的上表面，其中所述槽由接触所述第一热源的底端和与所述第三热源的上表面邻接的通孔限定，并且其中所述底端与所述通孔之间的中心点形成槽轴，围绕其布置所述槽，
(d)至少一个温度成形元件，其为在所述第一热源、第二热源和第三热源的至少一个中的至少一个突出部，所述突出部向邻接热源延伸或者从包含所述突出部的热源的上表面或下表面向外延伸；以及
(e)所述第一热源内适于容纳所述槽的接收孔。
2.权利要求1所述的装置，其中所述装置包含位于所述第一热源的上表面与所述第二热源的下表面之间的第一绝热体。
3.权利要求2所述的装置，其中所述装置包含位于所述第二热源的上表面与所述第三热源的下表面之间的第二绝热体。
4.权利要求3所述的装置，其中所述第一绝热体沿所述槽轴的长度大于所述第二绝热体沿所述槽轴的长度。
5.权利要求1所述的装置，其中沿所述槽轴的所述第二热源的长度大于所述第一热源或所述第三热源的长度。
6.权利要求1所述的装置，其中所述装置包含位于所述槽周围并且在所述第二或第三热源之至少一部分中的第一室，所述第一室包含所述第二或第三热源与所述槽之间的室间隙，所述室间隙足以降低所述第二或第三热源与所述槽之间的热传递。
7.权利要求6所述的装置，其中所述第一室位于所述第二热源内并且包含沿所述槽轴朝向第一室底端的第一室顶端以及至少一个围绕所述槽轴布置的室壁。
8.权利要求7所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第二热源内的第二室。
9.权利要求7所述的装置，其中所述装置还包含位于所述第三热源内的第二室。
10.权利要求7所述的装置，其中所述第一室壁布置成基本平行于所述槽轴。
11.权利要求7所述的装置，其中所述第一室顶端和所述第一室底端各自基本垂直于所述槽轴。
12.权利要求2所述的装置，其中所述第一绝热体包含固体或气体。
13.权利要求3所述的装置，其中所述第二绝热体包含固体或气体。
14.权利要求6所述的装置，其中所述第一室包含固体或气体。
15.权利要求12至13中任一项所述的装置，其中所述气体是空气。
16.权利要求6所述的装置，其中所述第一室沿垂直于所述槽轴的平面围绕所述槽基本对称地布置。
17.权利要求6所述的装置，其中所述第一室的至少一部分沿垂直于所述槽轴的平面围绕所述槽不对称布置。
18.权利要求16至17中任一项所述的装置，其中所述第一室的至少一部分沿所述槽轴呈锥形。
19.权利要求16至17中任一项所述的装置，其中所述第一室垂直于所述槽轴的宽度不同于所述第二室的宽度。
20.权利要求8所述的装置，其中所述第一室与所述第二室沿所述槽轴以长度l间隔开。
21.权利要求20所述的装置，其中所述第一室、所述第二室和所述第二热源限定出在所述第一室与第二室之间接触所述槽的第一热制动器，其面积和厚度或体积足以降低来自所述第一热源或者到所述第三热源的热传递。
22.权利要求6所述的装置，其中所述装置包含位于所述第一热源的上表面与所述第二热源的下表面之间的第一绝热体，并且其中所述第一室位于所述第二热源中，并且所述第一室和所述第一绝热体限定出在所述第一室与所述第一绝热体之间接触所述槽的第一热制动器，其面积和厚度或体积足以降低来自所述第一热源的热传递。
23.权利要求22所述的装置，其中所述第一热制动器包含上表面和下表面。
24.权利要求23所述的装置，其中所述第一热制动器的下表面与所述第二热源的下表面处于大致相同的高度。
25.权利要求1所述的装置，其中所述第二热源包含至少一个从所述第二热源延伸出并向所述第一或第三热源延伸的突出部。
26.权利要求1所述的装置，其中所述第一热源包含至少一个从所述第一热源延伸出并向所述第二热源延伸或从所述第一热源的下表面延伸出的突出部。
27.权利要求1所述的装置，其中所述第三热源包含至少一个从所述第三热源延伸出且向所述第二热源延伸或从所述第三热源的上表面延伸出的突出部。
28.权利要求1所述的装置，其中所述装置适配成使得所述槽轴相对于重力方向倾斜。
29.权利要求28所述的装置，其中所述槽轴垂直于所述第一、第二和第三热源之中任一个的上或下表面，并且所述装置是倾斜的。
30.权利要求28所述的装置，其中所述槽轴相对于垂直于所述第一、第二和第三热源之中任一个的上或下表面的方向倾斜。
31.权利要求28所述的装置，其中所述倾斜由所述槽轴与重力方向之间的角度θg定义，所述倾斜的角度为2°至60°。
32.权利要求1至14、16至17和20至31中任一项所述的装置，其中所述装置通过至少具有与转子转动连接的所述第一、第二和第三热源而适于在所述槽内部产生离心力以调节所述对流PCR，所述转子用于使所述热源围绕旋转轴旋转。
33.适于在离心条件下进行聚合酶链式反应(PCR)的PCR离心机，所述PCR离心机包含权利要求32所述的装置。
34.通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将包含接收孔的第一热源维持在适于使双链核酸分子变性并且形成单链模板的温度范围，
(b)将第三热源维持在适于使至少一条寡核苷酸引物与所述单链模板退火的温度范围，
(c)将第二热源维持在适于支持所述引物沿所述单链模板聚合的温度，其中槽由接触所述第一热源的所述接收孔之底端和与所述第三热源的上表面邻接的通孔限定，并且其中所述接收孔之所述底端与所述通孔之间的中心点形成槽轴，围绕其布置所述槽；以及
(d)在足以产生引物延伸产物的条件下，在所述接收孔与所述第三热源之间产生热对流，
其中所述方法还包括提供在所述第一热源、第二热源和第三热源的至少一个中的至少一个突出部的步骤，所述突出部向邻接热源延伸或者从包含所述突出部的热源的上表面或下表面向外延伸。
35.权利要求34所述的方法，其中所述方法还包括提供反应容器的步骤，所述反应容器包含在水溶液中的所述双链核酸和所述寡核苷酸引物，以及在水溶液中的DNA聚合酶或固定化的DNA聚合酶。
36.权利要求35所述的方法，其中所述方法还包括使所述反应容器接触所述接收孔和至少一个温度成形元件的步骤，所述温度成形元件是布置在所述第二或第三热源中至少一个之内的室，所述接触足以支持所述反应容器内的所述热对流。
37.权利要求36所述的方法，其中所述方法还包括使所述反应容器接触所述第一与第二热源之间的第一绝热体和所述第二与第三热源之间的第二绝热体的步骤。
38.权利要求35所述的方法，其中所述方法还包括在所述反应容器中产生围绕所述槽轴基本对称的流体流的步骤。
39.权利要求35所述的方法，其中所述方法还包括在所述反应容器中产生围绕所述槽轴不对称的流体流的步骤。
40.权利要求35所述的方法，其中至少步骤(a)-(c)在每个反应容器中消耗少于1W的功率来产生所述引物延伸产物。
41.权利要求40所述的方法，其中进行所述方法的所述功率由电池提供。
42.权利要求34所述的方法，其中所述PCR延伸产物在15至30分钟或更短的时间内产生。
43.权利要求34至42中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述反应容器施加有助于进行所述PCR的离心力的步骤。
44.通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包括以下步骤：在足以产生引物延伸产物的条件下，将寡核苷酸引物、核酸模板、DNA聚合酶和缓冲液加入权利要求1至14、16至17和20至31中任一项所述装置所容纳的反应容器中。
45.通过热对流进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包括以下步骤：在足以产生引物延伸产物的条件下，将寡核苷酸引物、核酸模板、DNA聚合酶和缓冲液加入权利要求33所述PCR离心机所容纳的反应容器中，以及向所述反应容器施加离心力。
46.适于被权利要求1至14、16至17和20至31所述装置或权利要求33所述PCR离心机容纳的反应容器，所述反应容器包含顶端、底端、外壁和内壁，并且所述外壁的竖直长宽比至少为4至15，所述外壁的水平长宽比为1至4，并且所述外壁的锥角θ为0°至15°。
47.权利要求46所述的反应容器，其还包含与所述反应容器密封接触的盖。
48.权利要求47所述的反应容器，其中所述盖包含光学端口。
49.权利要求48所述的反应容器，其还包含所述反应容器的内壁与所述光学端口的侧面部分之间的开放空间。
50.权利要求1至14、16至17和20至31中任一项所述的装置，其还包含至少一个光学检测单元。
51.权利要求33所述的PCR离心机，其中所述装置还包含至少一个光学检测单元。
52.权利要求34至35、36至37和38至42中任一项所述的方法，其还包括使用至少一个光学检测单元实时检测所述引物延伸产物的步骤。
53.权利要求44所述的方法，其还包括使用至少一个光学检测单元实时检测所述引物延伸产物的步骤。
54.权利要求43所述的方法，其还包括使用至少一个光学检测单元实时检测所述引物延伸产物的步骤。
55.权利要求45所述的方法，其还包括使用至少一个光学检测单元实时检测所述引物延伸产物的步骤。
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