RU2017821C1 - Способ амплификации днк и устройство для его осуществления - Google Patents

Способ амплификации днк и устройство для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
RU2017821C1
RU2017821C1 SU904870176A SU4870176A RU2017821C1 RU 2017821 C1 RU2017821 C1 RU 2017821C1 SU 904870176 A SU904870176 A SU 904870176A SU 4870176 A SU4870176 A SU 4870176A RU 2017821 C1 RU2017821 C1 RU 2017821C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
thermostat
cells
cooling
annealing
Prior art date
Application number
SU904870176A
Other languages
English (en)
Inventor
Анатолий Михайлович Онищенко
Original Assignee
Анатолий Михайлович Онищенко
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Анатолий Михайлович Онищенко filed Critical Анатолий Михайлович Онищенко
Priority to SU904870176A priority Critical patent/RU2017821C1/ru
Priority to PCT/SU1991/000200 priority patent/WO1992007089A1/ru
Priority to EP91918153A priority patent/EP0504435A1/en
Priority to KR927001369A priority patent/KR920703845A/ko
Application granted granted Critical
Publication of RU2017821C1 publication Critical patent/RU2017821C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Использование: относится к способам и устройствам для амплификации ДНК в методах генной инженерии и молекулярной биологии. Сущность изобретения: способ включает получение, амплификацию ДНК путем циклического нагревания и охлаждения реакционной смеси в замкнутой капиллярной системе, устройство которой представляет собой замкнутый капилляр из четырех сообщающихся ячеек, с определенным соотношением объемов. Каждая ячейка заключена в муфту, сообщенную с термостатом с регулятором градиента температур. Ячейки снабжены регулятором скорости потока. 2 с.п. ф-лы, 1 ил.

Description

Изобретение относится к биохимии, в частности к методу амплификации дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК).
Известны различные способы амплификации, которые в общем случае сводятся к следующему: к ДНК, выделенной из какого-либо организма, добавляют химически синтезированные олигонуклеотиды (праймеры), которые способны узнавать определенные последовательности ДНК и слипаться (комплементарно) с ним. Эти комплексы узнает ДНК-полимераза, которая из имеющихся в растворе нуклеотидов достраивает к концу олигонуклеотида последовательность, комплементарную исходной. Таким образом, процесс происходит в три основных этапа: плавление матричной ДНК, отжиг праймеров и достройка комплементарной цепи, затем цикл повторяется [1].
Наиболее близким к заявляемому является способ [2], заключающийся в следующем: готовят реакционную смесь, включающую 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4 при комнатной температуре), 1,5 мМ MgCl2 100 мкг/мл желатины, 250 мкМ каждого dNTР, 2,5 ед Taq-полимеразы, 1 мМ каждого праймера (олигонуклеотида) берут 50-100 мкл смеси. За исходное количество матрицы брали 102-105 копий ДНК Матричную ДНК расплавляют при t 94оС в течение 20 с, далее проводят отжиг праймеров при 55оС в течение 20 с и достройку комплементарной цепи при 72оС в течение 30 с. Для осуществления способа используют программируемый термостат при скорости нагрева 0,3оС/с и скорости охлаждения 1оС/с, для амплификации применяют фрагмент ДНК длиной от 150 до 3000 пар оснований, продолжительность цикла 3,75 мин. Всего проводят 30 циклов.
Однако описанный способ имеет ряд недостатков: количество целевого продукта в данной ситуации ограничено, поскольку наступает насыщение, поскольку комплементарные цепи при охлаждении слипаются между собой и тем самым выключаются из последующего процесса. Лимитирующим моментом в данном процессе является также скорость охлаждения смеси, чем быстрее охлаждение, тем меньше происходит самослипание молекул, тем соответственно эффективнее амплификация. В настоящее время амплификация проводится в пробирках, помещенных в программируемый термостат.
Целью изобретения является повышение выхода ДНК.
Цель достигается тем, что плавление ДНК, отжиг праймеров и достройку комплементарной цепи проводят при регулируемой скорости нагрева 0,3-6,0оС/с и скорости охлаждения 8,5оС/с, при этом цикличность температурного режима осуществляют в замкнутой трубке, внутри которой помещают реакционную смесь.
Известные в настоящее время устройства не позволяют достичь достаточно высокой скорости нагрева и охлаждения. Поэтому для осуществления описанного способа сконструировано специальное устройство (см. чертеж), с помощью которого значительно повышается выход ДНК.
Устройство представляет собой замкнутую капиллярную систему из стекла (или другого биологически инертного и пластичного материала), состоящую из капилляров различного диаметра.
Система имеет отверстие 1 для введения образца и отбора проб, капилляр ячейки охлаждения 2, помещенный в муфту 3, соединенную с термостатом 4. Капилляр ячейки охлаждения переходит в капилляр ячейки отжига затравки 5, помещенный в муфту 6, соединенную с термостатом 7, далее через регулятор скорости потока 8 трубка переходит в капилляр ячейки достройки комплементарной цепи 9, помещенный в муфту 10, соединенную с термостатом 11. Капилляр ячейки достройки переходит в капилляр ячейки плавления ДНК 12, помещенный в муфту 13 термостата 14. Термостаты 7 и 11 снабжены регуляторами градиента температуры (15, 16).
Важным условием работы устройства является соблюдение соотношения диаметра к длине капилляров в ячейках охлаждения и плавления ДНК 1:60, а соотношение рабочих объемов капилляров 2, 5, 9, 12 как 2:15:35:6.
Устройство работает следующим образом. Термостат охлаждения 4 выводят на режим работы 10-30оС, термостат отжига 7 на температуру 30-72оС, термостат 11 на 50-75оС, термостат 14 на 80-95оС в зависимости от свойств исходной реакционной смеси. В отверстие 1 помещают реакционную смесь (описанную в примере 1 осуществления способа), наслаивают вазелиновое масло для герметизации капиллярной системы (или другое масло). Скорость потока жидкости устанавливают с помощью регулятора 8 в зависимости от длины цепи конечного продукта и свойств исходных олигонуклеотидов. Под действием различных температур в каждом капилляре жидкость циркулирует по системе. Всего проводят около 30 циклов, отслеживая завершение работы по времени или при помощи маркера цикла. Отбор полученного продукта проводят с помощью микрошприца из отверстия 1. Технологический аспект работы устройства изложен далее в примерах осуществления способа.
П р и м е р 1. Термостаты устройства выводят на следующие рабочие режимы: термостат 4 на температуру 15оС, термостат 7 - на 42оС, термостат 11 на 68оС, термостат 14 - на 95оС. Готовят реакционную смесь следующего состава: 10 мкл буферного раствора, содержащего 500 мМ KCl, 100 мМ Трис-HCl /pH 8,4/, 15 мМ MgCl2, 0,1 мкг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), 1% Np-40, затем добавляют 100 пикомолей каждого олигонуклеотида
1/ праймер идентичной последовательности иРНК 223-250 оснований следующей первичной структуры:
5' - GGCACATGTCTAAACGATCACTCTTCAC-3'
2/ праймер комплементарной последовательности овальбумина иРНК в положении 561-587 (осн.):
5' - GCTTGTGTGTCTTGATCCTTAAATGC - 3'
в конечной концентрации 1 ммоль кДНК гена овальбумина в количестве 20 пг. Далее вносят 10 мкл dNTP /2,5 ммоль/, 2 ед ТТН-полимеразы и воду до 100 мкл. Полученной смесью заполняют капиллярную систему, наслаивают 30 мкл вазелинового масла для герметизации устройства. При этом достигается скорость охлаждения 8,5оС/с и скорость нагревания 6оС/с.
С помощью регулятора скорости потока 8 прибор выводят на режим 3,75 мин на один цикл, всего проводят 30 циклов.
Из отверстия 1 извлекают конечный продукт - ДНК фрагмента гена овальбумина длиной 364 пар оснований. Электрофореграмма результатов сравнительного анализа ДНК овальбумина амплифицированного по известному методу и заявленному способу показывает, что концентрация последней больше предыдущей в 3 раза.
С помощью разработанного прибора удается в способе амплификации достичь более высокого выхода целевого продукта за счет скорости нагревания около 6оС/с и скорости охлаждения около 8,5оС/с.
П р и м е р 2. Термостаты прибора выводят на режимы, указанные в примере 1. Нагрев в термостате 7 осуществляют градиентно 37-42оС, а в термостате 12 от 55 до 68оС с помощью регуляторов потока 15 и 16. Готовят реакционную смесь как в примере 1, за исключением олигонуклеотидов, используют следующие праймеры:
1/ праймер, идентичный последовательности ов-иРНК в положении 913-929 (пар оснований) 5'- CTGATCTGTTTAGCTCTTC - 3',
2/ праймер комплементарной последовательности ов иРНК в области 1056-1072 (пар оснований): 5' - GATCAGAGACGGTTGAC - 3'
При этом скорость охлаждения составляет 8,5оС/с, а скорость нагрева 0,3оС/с. Скорость потока устанавливают таким, чтобы время цикла составило 2,5 мин. Проводят 30 циклов. Конечный продукт - фрагмент (длинной 159 пар оснований).
Денситометрический анализ проб позиций 1 и 2 показывает, что концентрация последней в 5 раз выше, чем в первой.
Таким образом, осуществление заявленного способа с помощью нового устройства позволяет повысить концентрацию ДНК в 3-5 раз в сравнении с известным.
Современные методы амплификации (фирма Celus-Perken-Elmer) позволяют получить до 0,2-1,0 мкг ДНК в расчете на одну пробирку. Заявленный способ позволяет получить в аналогичной ситуации порядка 50-100 мкг ДНК, на 1-2 порядка в сравнении с известными конструкциями.

Claims (2)

1. Способ амплификации ДНК, включающий помещение в емкость реакционной смеси, состоящей из матричной ДНК, праймеров синтетических нуклеотидов и ДНК, отжиг праймеров и достройку комплементарной цепи в циклическом температурном режиме, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, плавление, отжиг и достройку проводят при скорости нагревания 0,3 - 6 град, скорости охлаждения 8,5 град, а цикличность температурного режима осуществляют в капиллярной системе, внутри которой помещают реакционную смесь.
2. Устройство для амплификации ДНК, включающее реакционную емкость с отверстием для ввода пробы, снабженную термостатом, отличающееся тем, что, с целью увеличения выхода ДНК, емкость представляет собой замкнутый капилляр, состоящий из четырех последовательно сообщающихся ячеек, служащих соответственно для охлаждения, отжига праймеров, достройки комплементарной цепи и плавления ДНК, при этом ячейки заключены в муфты, сообщенные с термостатом и снабженные регулятором скорости потока, а термостат снабжен регулятором градиента температуры, причем соотношение объемов указанных ячеек соответственно составляет 2 : 15 : 35 : 6, а соотношение диаметра и длины ячеек охлаждения и плавления ДНК - 1 : 60.
SU904870176A 1990-10-10 1990-10-10 Способ амплификации днк и устройство для его осуществления RU2017821C1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU904870176A RU2017821C1 (ru) 1990-10-10 1990-10-10 Способ амплификации днк и устройство для его осуществления
PCT/SU1991/000200 WO1992007089A1 (en) 1990-10-10 1991-10-09 Method and device for amplification of dna
EP91918153A EP0504435A1 (en) 1990-10-10 1991-10-09 Method and device for amplification of dna
KR927001369A KR920703845A (en) 1990-10-10 1992-06-09 Method of dna amplification and a device for its realization

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU904870176A RU2017821C1 (ru) 1990-10-10 1990-10-10 Способ амплификации днк и устройство для его осуществления

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2017821C1 true RU2017821C1 (ru) 1994-08-15

Family

ID=21538284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU904870176A RU2017821C1 (ru) 1990-10-10 1990-10-10 Способ амплификации днк и устройство для его осуществления

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0504435A1 (ru)
KR (1) KR920703845A (ru)
RU (1) RU2017821C1 (ru)
WO (1) WO1992007089A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2681914C2 (ru) * 2013-10-15 2019-03-13 Байо Молекьюлар Системс Пти Лтд Усовершенствованный амплификатор
RU2760915C2 (ru) * 2016-06-30 2021-12-01 ЛЮМИРАДЭКС Юкей ЛТД Усовершенствования в процессах амплификации нуклеиновой кислоты или связанные с таковыми
US11655496B2 (en) 2018-01-04 2023-05-23 Lumiradx Uk Ltd. Amplification of nucleic acids

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE208658T1 (de) * 1993-07-28 2001-11-15 Pe Corp Ny Vorrichtung und verfahren zur nukleinsäurevervielfältigung
ATE170001T1 (de) * 1993-10-21 1998-09-15 Abbott Lab Vorrichtung und verfahren zur überführung einer probe eines fluids
DE4409436A1 (de) * 1994-03-19 1995-09-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren
DE19646114B4 (de) * 1996-11-08 2004-09-16 Eppendorf Ag Laborthermostat mit Temperierblöcken
DE19646115C2 (de) * 1996-11-08 2000-05-25 Eppendorf Geraetebau Netheler Verwendung von Temperiereinrichtungen zur Temperierung eines Temperierblockes
DE29623597U1 (de) 1996-11-08 1999-01-07 Eppendorf - Netheler - Hinz Gmbh, 22339 Hamburg Temperierblock mit Temperiereinrichtungen
GB9826237D0 (en) 1998-11-30 1999-01-20 Hybaid Ltd Thermal cycler
US6586233B2 (en) * 2001-03-09 2003-07-01 The Regents Of The University Of California Convectively driven PCR thermal-cycling
KR100488281B1 (ko) * 2001-09-15 2005-05-10 아람 바이오시스템 주식회사 열 대류를 이용한 염기서열 증폭 방법 및 장치
WO2003038127A1 (en) 2001-10-30 2003-05-08 Ahram Biosystems Inc. Method and apparatus for amplification of nucleic acid sequences using immobilized dna polymerase
WO2005094981A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Agilent Technologies, Inc. Cyclic pcr system
KR101081316B1 (ko) * 2004-09-02 2011-11-08 (주)바이오니아 소형 실시간 모니터링 장치
US20060246493A1 (en) 2005-04-04 2006-11-02 Caliper Life Sciences, Inc. Method and apparatus for use in temperature controlled processing of microfluidic samples
US8735103B2 (en) * 2006-12-05 2014-05-27 Electronics And Telecommunications Research Institute Natural convection-driven PCR apparatus and method using disposable polymer chip
JP5940458B2 (ja) 2010-01-12 2016-06-29 アーラム バイオシステムズ インコーポレイテッド ３段熱対流装置及びその使用法
AU2011206360A1 (en) 2010-01-12 2012-08-23 Ahram Biosystems, Inc. Two-stage thermal convection apparatus and uses thereof
KR101318988B1 (ko) 2011-07-12 2013-10-16 강원대학교산학협력단 중력유동방식 ｐｃｒ 증폭 장치
CN103781543A (zh) * 2011-08-22 2014-05-07 松下电器产业株式会社 微流体器件
US20170282178A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Credo Biomedical Pte Ltd. Portable qpcr and qrt-pcr apparatus
DE102017205337B4 (de) 2016-03-30 2022-07-14 Credo Biomedical Pte Ltd. Tragbare qpcr- und qrt-pcr-vorrichtung

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
AU2735988A (en) * 1987-12-21 1989-07-13 Amoco Corporation Target and background capture methods with amplification for affinity assays
FI79342C (fi) * 1987-12-23 1989-12-11 Orion Yhtymae Oy Apparat, del av en apparat och foerfarande foer maongfaldigande av nukleinsyror.
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. "PCR Technology: principles and applications for DNA amplification", ed by Erlich, Munchen, Sfoc. Press, 1989. *
2. Science, v.239, р.487-494, 1988. *
3. Проспект Фирмы "ТЕОХНЕ", США, "Programmable dry - block lemperalire cyclers", опублик. 11.02.90. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2681914C2 (ru) * 2013-10-15 2019-03-13 Байо Молекьюлар Системс Пти Лтд Усовершенствованный амплификатор
RU2760915C2 (ru) * 2016-06-30 2021-12-01 ЛЮМИРАДЭКС Юкей ЛТД Усовершенствования в процессах амплификации нуклеиновой кислоты или связанные с таковыми
US11655496B2 (en) 2018-01-04 2023-05-23 Lumiradx Uk Ltd. Amplification of nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
EP0504435A1 (en) 1992-09-23
KR920703845A (en) 1992-12-18
WO1992007089A1 (en) 1992-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2017821C1 (ru) Способ амплификации днк и устройство для его осуществления
DE3752057T2 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung der automatischen Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen und Assays mit Heiz- und Kühlschritten
US5830657A (en) Method for single-tube sequencing of nucleic acid polymers
US5405746A (en) Method of sequencing DNA
DK171160B1 (da) Fremgangsmåde til multiplikation af en specifik nukleinsyresekvens
Phillips et al. Antisense RNA amplification: a linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells
US6063603A (en) Nucleic acid amplification process
DE3751423T2 (de) Primers und Sonden zum Nachweis von Nukleinsäuren.
AU2009201529B2 (en) Apparatus For Polynucleotide Detection and Quantitation
CN109251963A (zh) 恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒
JPH02434A (ja) 熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子
CA2258511A1 (en) Method for polynucleotide sequencing
US5545528A (en) Rapid screening method of gene amplification products in polypropylene plates
US20040241713A1 (en) Composition for immobilization of biological macromolecules in hydrogels, a method for preparing a composition, a biochip, and a method for performing the PCR over biochip
US20060182657A1 (en) Devices and methods for handling and processing punches
CN107287227A (zh) 一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用
CN105986020A (zh) 构建测序文库的方法及装置
JPH0630776A (ja) Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置
EP0322677B1 (en) Carrier for DNA-hybridization
CN113817748B (zh) 一种玉米抗盐主效qtl及其应用
EP0466367A1 (en) Process for detecting nucleic acid
Melera et al. Identification of mRNA in the slime mold Physarum polycephalum
JPH02215399A (ja) 核酸の検出法
JPH03262499A (ja) ポリヌクレオチド検出方法およびｐｃｒ反応装置
EP0582256A2 (en) Polynucleotide detecting method and apparatus