DE102017205337B4

DE102017205337B4 - Tragbare qpcr- und qrt-pcr-vorrichtung

Info

Publication number: DE102017205337B4
Application number: DE102017205337.2A
Authority: DE
Inventors: Winston Wong jun.; Chang-Chi KAO Stephen; Ying-Ta Lai; Ming-Fa Chen; Chih-Rong Chen
Original assignee: Credo Biomedical Pte Ltd
Current assignee: Credo Biomedical Pte Ltd
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2022-07-14
Anticipated expiration: 2037-03-30
Also published as: DE102017205337A1

Abstract

Tragbare Vorrichtung zum Durchführen von unidirektionaler konvektiver qPCR oder qRT-PCR in einem Mischreagens, das eine Zielnukleinsäure und einen Fluoreszenzfarbstoff enthält, einschließlich Denaturierungs-, Anlagerungs- und Extensionsverfahren, wobei die Vorrichtungeinen asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälter zur Aufnahme des Mischreagens mit der Zielnukleinsäure und dem Fluoreszenzfarbstoff zur Durchführung von unidirektionaler konvektiver qPCR oder qRT-PCR, wobei der asymmetrische zirkulationsfördernde Behälter mindestens eine Öffnung, ein geschlossenes Schleifensystem, und einen Weg aufweist, der die Enden verbindet, der es ermöglicht, dass das Mischreagens in einem Zyklus durch verschiedene Zonen des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters fließt;eine Temperatursteuereinheit, die eine Wärmequelle zum Zuführen der Wärme und einen Temperatursensor zum Erfassen des Zustands der Wärmequelle aufweist, wobei die Temperatursteuereinheit in einem bestimmten Bereich im asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälter angeordnet und mit diesem in Kontakt gebracht ist, wobei das Mischreagens in der Nähe des kontaktierten Bereiches des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters daher zunächst erwärmt wird, um wegen der Auftriebs- und Schwerkraftsdifferenz innerhalb des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters eine unidirektionale Zirkulation zu bilden;eine Lichtquelle zum Anregen des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Mischreagens, um ein fluoreszierendes Signal zu emittieren, wenn die qPCR oder qRT-PCR initiiert ist, wobei die Lichtquelle in einem bestimmten Bereich angeordnet ist;einen Photodetektor zum Umwandeln des fluoreszierenden Signals in ein elektronisches Signal;ein optisches Element zum Lenken des fluoreszierenden Signals auf den Photodetektor, wobei das optische Element zwischen dem asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälter und dem Photodetektor angeordnet ist;einen Filter zum Herausfiltern einer nicht-vorbestimmten Wellenlänge der Lichtquelle, wobei der Filter zwischen dem optischen Element und dem Photodetektor angeordnet ist; undeinen Prozessor zum Empfangen und Analysieren des elektronischen Signals aufweist, das von der Temperatursteuereinheit und dem Photodetektor detektiert wird, wobei ein programmierter Algorithmus in dem Prozessor eingebaut ist, um die PCR oder RT-PCR in Echtzeit zu quantifizieren;wobei, wenn die Temperatur des kontaktierten Bereichs des zirkulationsfördernden Behälters auf die Reaktionstemperatur der Denaturierung ansteigt, eine unidirektionale Zirkulation des Mischreagens beginnt und die PCR- oder RT-PCR-Reaktion initiiert ist, wobei der Temperatursensor der Temperatursteuereinheit den Temperaturstatus an den Prozessor überträgt, um die Lichtquelle zu initiieren, um den Fluoreszenzfarbstoff anzuregen, um das fluoreszierende Signal zu emittieren, wobei das fluoreszierende Signal durch die optische Vorrichtung gefiltert und vom Photodetektor detektiert und in das elektronische Signal umgewandelt und durch einen programmierten Algorithmus im Prozessor zur Quantifizierung der PCR- oder RT-PCR-Produkte in Echtzeit analysiert wird.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (nachfolgend qPCR)- und quantitative reverse Transkriptase-Echtzeit-PCR (nachfolgend qRT-PCR)-Vorrichtung durch eine unidirektionale konvektive Zirkulation.
HINTERGRUND
Die Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (nachfolgend qPCR) und die quantitative reverse Transkriptase-Echtzeit-PCR (nachfolgend qRT-PCR) wurden basierend auf der Notwendigkeit zur Ziel-Quantifizierung zum Zeitpunkt 0, während und nach einem Test entwickelt. Im Vergleich zur herkömmlichen PCR, die die Produktkonzentration nach der Reaktion detektiert, erkennen qPCR und qRT-PCR diese in Echtzeit. Sowohl qPCR als auch qRT-PCR verwenden Fluoreszenz, um die Produktkonzentration während der Reaktion zu detektieren und zu quantifizieren, und sind somit effektiver als herkömmliche PCR. Darüber hinaus ermöglichen sowohl qPCR als auch qRT-PCR eine vollständige Reaktion und Detektion innerhalb einer Testzone. Daher sind die Vorteile von qPCR und qRT-PCR die Quantifizierung von Produkten in Echtzeit und die Minimierung der Chance einer DNA-Kontamination, wo PCR-Produkte durch Gelelektrophorese analysiert werden.
Zur schnellen und effizienten Amplifikation verschiedener Ziele wurden viele Geräte und Verfahren entwickelt. Die Entwicklungsprinzipien dieser Geräte und Verfahren folgen nach wie vor den grundlegenden PCR-Regeln. In den kommerzialisierten PCR-Kits, Verfahren und verwandten Vorrichtungen enthielt eine Probe eine Ziel-DNA, ein Paar Oligonukleotid-Primer, die komplementär zu einer spezifischen Region der Ziel-DNA sind, eine DNA-Polymerase, die thermisch stabil ist, und Desoxynukleotidtriphosphate (dNTP). Die Ziel-DNA wird durch Wiederholen eines bestimmten Temperaturzyklus amplifiziert, der sequentiell die Heiztemperatur der Probe ändert. Der Temperaturzyklus umfasst drei verschiedene Temperatureinstellungen, und die Temperatureinstellungen werden für die folgenden Schritte eingestellt.
Der erste Schritt ist die sogenannte „Denaturierung“, bei der die Temperatur etwa 90-95 °C beträgt. Die Probe wird auf eine relativ hohe Temperatur erwärmt, um eine doppelsträngige DNA (nachfolgend dsDNA) zu einer einzelsträngigen DNA (nachfolgend ssDNA) werden zu lassen. Der zweite Schritt ist das sogenannte „Anlagern“, bei dem die Temperatur auf eine relative niedrige Temperatur, d. h. etwa 45 bis 65 °C, abgesenkt wird, um die Primer an die einzelsträngige DNA binden und einen Primer-ssDNA-Komplex bilden zu lassen. Der letzte Schritt ist die sogenannte „Extension/Verlängerung“, bei der die Temperatur auf eine geeignete Temperatur erwärmt, oder bei einer geeigneten Temperatur gehalten wird, d. h. 72 °C, um den Primer des Primer-ssDNA-Komplexes durch die Wirkung der DNA-Polymerase zu verlängern, um eine neue ssDNA zu erzeugen, die komplementär ist zur Matrize der Ziel-DNA, um so neue dsDNA-Produkte zu erzeugen. Theoretisch kann die Ziel-DNA um Millionen oder eine höhere Anzahl von Kopien amplifiziert werden, indem die drei Schritte etwa 20 bis 40 Mal wiederholt werden.
In qPCR oder qRT-PCR wird die Zugabe von dsDNA-Fluoreszenzfarbstoffen wie üblich durchgeführt. Dann wird die Reaktion in einem qPCR-Instrument durchgeführt, und nach jedem Zyklus wird die Intensität der Fluoreszenz mit einem Photodetektor gemessen. Zwei gängige Verfahren zur Quantifizierung der PCR- oder RT-PCR-Produkte in Echtzeit sind: (1) unspezifische Fluoreszenzfarbstoffe, die mit jeder dsDNA interkalieren, und (2) sequenzspezifische DNA-Sonden, bestehend aus Oligonukleotiden, die mit einem fluoreszierenden Reporter markiert sind, der die Detektion erst nach der Hybridisierung der Sonde mit ihrer komplementären Sequenz erlaubt. Sowohl qPCR als auch qRT-PCR werden in einem sich wiederholenden Temperaturzyklus mit der Fähigkeit durchgeführt, jede Probe mit einem Lichtstrahl von mindestens einer spezifizierten Wellenlänge zu beleuchten und die von dem angeregten Fluorophor emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
Wenn die der PCR zugefügten unspezifischen Fluoreszenzfarbstoffe an die dsDNA binden, würde die Zunahme der Produkte während der PCR zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität führen, die bei jedem Zyklus gemessen wird. Jedoch werden dsDNA-Farbstoffe wie etwa SYBRO Green an alle dsDNA-PCR-Produkte binden, einschließlich unspezifischer PCR-Produkte (wie etwa Primer-Dimer). Dies kann möglicherweise die Genauigkeit der Quantifizierung der PCR-Produkte beeinträchtigen. Wenn die sequenzspezifischen DNA-Sonden zur PCR hinzugefügt werden, detektieren die fluoreszierenden Reportersonden nur die DNA, die die Sequenz enthält, die komplementär zur Sonde ist; daher erhöht die Verwendung von sequenzspezifischem Fluoreszenzfarbstoff die Spezifität signifikant und ermöglicht die Durchführung der Technik auch in Gegenwart anderer dsDNA. Der Vorteil von sequenzspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen ist, dass sie die Interferenz von Messungen, die durch Primer-Dimere verursacht werden, verhindern können.
Typischerweise sind die qPCR- und qRT-PCR-Vorrichtungen große Auftischsysteme, die eine lange Reaktionszeit benötigen (über 1 Stunde), da qPCR und qRT-PCR einen Mechanismus benötigen, der drei verschiedene Temperaturbereiche durchläuft, die Denaturierung, Anlagern und Verlängerung der Ziel-DNA-Segmente ermöglichen. Um diese Anforderung zu erfüllen, können qPCR- und qRT-PCR-Vorrichtungen ein bedeutendes Gewicht und eine bedeutende Größe aufweisen und auch eine beträchtliche Menge an Zeit zum Testen benötigen, wodurch die Tragbarkeit einer derartigen Vorrichtung ausgeschlossen ist.
ZUSAMMENFASSUNG
Um dieses Problem zu lösen, offenbart die vorliegende Erfindung einen tragbaren unidirektionalen zirkulierenden Flüssigkeitsstrom, der es durch thermische Konvektion ermöglicht, dass qPCR- und qRT-PCR-Reaktion innerhalb eines zirkulationsfördernden Behälters stattfinden. Die vorliegende Erfindung weist mindestens eine Temperatursteuereinheit, die mindestens eine Wärmequelle und einen Temperatursensor aufweist, einen zirkulationsfördernden Behälter, eine Lichtquelle, einen Photodetektor, einen Filter, einen Satz optischer Elemente, und einen Prozessor auf. Die vorgenannten Komponenten sind nicht auf eine bestimmte Anordnung oder Reihenfolge beschränkt.
Der zirkulationsfördernde Behälter weist mindestens eine Öffnung, ein geschlossenes Schleifensystem, und einen Weg auf, der die Enden verbindet, was es ermöglicht, dass das Mischreagens in einem Zyklus durch verschiedene Zonen des zirkulationsfördernden Behälters fließt.
Die qPCR- und qRT-PCR-Reagenzien werden in den zirkulationsfördernden Behälter geschüttet, wenn die Reaktion beginnt und der zirkulationsfördernde Behälter wird auf der Wärmequelle angeordnet und mit einem spezifischen Bereich mit ihr in Kontakt gebracht. Der zirkulationsfördernde Behälter kann symmetrisch oder asymmetrisch sein. Wenn die Temperatur des kontaktierten Bereichs des zirkulationsfördernden Behälters auf die Reaktionstemperatur der Denaturierung ansteigt, würde das nahe dem kontaktierten Bereich befindliche Mischreagens zuerst erwärmt und das weit von der Wärmequelle entfernte Mischreagens würde danach erwärmt. Die Dichte des Mischreagens, das näher an der Wärmequelle liegt, wäre niedriger als die Dichte des Mischreagens, das sich weiter weg von der Wärmequelle befindet; mit der Wirkung von Schwerkraft und Auftrieb entsteht eine kontinuierliche, unidirektionale Zirkulationsströmung. Wenn die Temperatur innerhalb des zirkulationsfördernden Behälters durch die vorgenannte thermische Konvektion den Reaktionspunkt erreicht, wird die PCR-Reaktion initiiert. Ohne Zeit für die Erwärmung und/oder Kühlung der thermischen Vorrichtung für die drei verschiedenen Reaktionstemperaturen zu verwenden, offenbart die vorliegende Erfindung eine Ausführungsform von drei verschiedenen Temperaturzonen, die Denaturierung, Anlagern und Verlängerung von PCR innerhalb des zirkulationsfördernden Behälters mit mindestens einer Wärmequelle ermöglichen, wodurch gleichzeitig Reaktionszeit und Gerätegröße eingespart werden.
Diese ZUSAMMENFASSUNG wird zur Verfügung gestellt, um einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung, die weiter unten in der BESCHREIBUNG beschrieben werden, kurz zu identifizieren. Diese ZUSAMMENFASSUNG ist weder dazu bestimmt, Schlüssel- oder wesentliche Merkmale der vorliegenden Offenbarung zu identifizieren, noch beabsichtigt sie, den Umfang irgendwelcher Ansprüche einzuschränken.
Der Begriff „Aspekte“ ist als „mindestens ein Aspekt“ zu verstehen. Die oben beschriebenen Aspekte und andere Aspekte der vorliegenden Offenbarung, die hierin beschrieben sind, sind durch Beispiel(e) dargestellt und nicht in den beigefügten Zeichnungen beschränkt.
Figurenliste
Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Offenbarung kann unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen verwirklicht werden, in denen:

1 ein schematisches Diagramm ist, das die erste Konfiguration einer qPCR und qRT-PCR der vorliegenden Offenbarung darstellt;
2 ein schematisches Diagramm ist, das die U-förmige Schleife der ersten Konfiguration darstellt;
3 ein schematisches Diagramm ist, das einen Temperaturgradienten innerhalb der U-förmigen Schleife während der Reaktion der ersten Konfiguration darstellt;
4 ein schematisches Diagramm ist, das eine zweite Konfiguration einer qPCR und qRT-PCR der vorliegenden Offenbarung darstellt;
5 ein schematisches Diagramm ist, das die U-förmige Schleife der zweiten Konfiguration darstellt;
6 ein schematisches Diagramm ist, das eine dritte Konfiguration einer qPCR und qRT-PCR der vorliegenden Offenbarung darstellt;
7 ein schematisches Diagramm ist, das die U-förmige Schleife der dritten Konfiguration darstellt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung weist mindestens eine Temperatursteuereinheit, die mindestens eine Wärmequelle und einen Temperatursensor aufweist, einen zirkulationsfördernden Behälter, eine Lichtquelle, einen Photodetektor, einen Filter, einen Satz optischer Elemente, und einen Prozessor auf. Die vorgenannten Komponenten sind nicht auf eine bestimmte Anordnung oder Reihenfolge beschränkt.
Der zirkulationsfördernde Behälter weist mindestens eine Öffnung, ein geschlossenes Schleifensystem, und einen Weg auf, der die Enden verbindet, was es ermöglicht, dass das Mischreagens in einem Zyklus durch verschiedene Zonen des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters fließt. Der zirkulationsfördernde Behälter könnte je nach Versuchsanforderungen asymmetrisch oder symmetrisch sein. Der zirkulationsfördernde Behälter könnte eine U-förmige Schleife, ein Würfel, oder andere Strukturen sein.
Die Temperatursteuereinheit weist eine Wärmequelle zum Zuführen der Wärme und einen Temperatursensor zum Erfassen des Zustands der Wärmequelle auf. Die Temperatursteuereinheit wird in einem bestimmten Bereich im zirkulationsfördernden Behälter angeordnet und mit diesem in Kontakt gebracht. Die Temperatursteuereinheit ist so konfiguriert, dass sie die Temperatur im Inneren des zirkulationsfördernden Behälters für Reaktionstemperatur und Strömungsfeldverteilung anpasst. Es ist möglich, eine oder mehrere Temperatursteuereinheiten in unterschiedlichen Bedingungen zu verwenden.
Die Symmetrie des zirkulationsfördernden Behälters ist ein Schlüsselfaktor für den Antrieb und die Initiierung eines unidirektionalen Zirkulationsflüssigkeitsstromes durch die Wirkung von Schwerkraft und Auftrieb, und ein solcher ist auch der kontaktierte Bereich zwischen dem zirkulationsfördernden Behälter und der Wärmequelle. Auch die Anzahl der Wärmequelle(n) ist ein Schlüsselfaktor. Jeder von ihnen könnte eine unidirektionale Zirkulation innerhalb des zirkulationsfördernden Behälters unabhängig oder zusammenwirkend verursachen.
Man kann die Strömungsrichtung der Flüssigkeit in dem zirkulationsfördernden Behälter weiter begrenzen, indem eine oder mehrere Wärmequellen in den spezifischen Bereichen angeordnet werden, um thermische und Auftriebsbedingungen zu kontrollieren, die eine Strömungsrichtung gegenüber einer anderen Richtung/anderen Richtungen begünstigen. Zum Beispiel kann anstelle der Verwendung einer Wärmequelle am Boden der Behälter an einem Bereich außerhalb der Mitte erwärmt werden. In einer unten beschriebenen Ausführungsform kann die Verwendung zweier Sätze von Temperatursteuereinheiten, die in unterschiedlichen Höhen vom Boden des zirkulationsfördernden Behälters aus angeordnet sind, auch das gleiche Ergebnis erreichen.
Die Lichtquelle ist eine spezifische Wellenlänge eines Lichtsystems, wie beispielsweise eine LED, eine Laserdiode, oder eine Halogenleuchte. Die Fluoreszenz ist eine Lichtemission durch eine Substanz, die die Lichtquelle absorbiert hat. Eine Substanz könnte solches Licht absorbieren und ein Fluoreszenzsignal abgeben, das dann zur Überwachung des Reaktionszustandes verwendet werden könnte. Der Photodetektor ist konfiguriert, um die optischen Signale in elektronische Signale umzuwandeln. Der Photodetektor kann eine einzelne Einheit sein, wie etwa eine Photovervielfacherzone (nachfolgend PMT), Photodioden, oder eine Photodetektoranordnung, beispielsweise eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (nachfolgend CCD) oder ein sich ergänzender Metalloxid-Halbleiter (nachfolgend CMOS).
Der Prozessor ist konfiguriert, um die elektronischen Signale, die von dem Temperatursensor, Photodetektor oder dem Photodetektorarray übertragen werden, zu empfangen und zu analysieren. Der Filter ist konfiguriert, um diese nicht-vorbestimmten Wellenlängen der Lichtquellen herauszufiltern und die vorbestimmten Wellenlängen durch den Filter hindurchzulassen. Man kann ein oder mehrere optische Elemente wie etwa eine Linse oder einen Lichtwellenleiter verwenden, um das gefilterte oder ungefilterte Fluoreszenzsignal an den Photodetektor zu leiten.
Die vorliegende Erfindung stellt einen kontinuierlich unidirektionalen zirkulierenden Flüssigkeitsstrom zur Verfügung, um PCR oder RT-PCR zu ermöglichen, innerhalb des zirkulationsfördernden Behälters durch thermische Konvektion zu reagieren. Ein derartiger zirkulationsfördernder Behälter ermöglicht den unidirektionalen Flüssigkeitsstrom durch Bereitstellen eines Weges, der die Enden verbindet, was es ermöglicht, dass das Reagens in einem Zyklus durch verschiedene thermische Zonen fließt und dass die möglichen Strömungswege für eine vorhersagbare Reaktionseffizienz begrenzt sind. Die thermische Konvektion der Flüssigkeit wird durch Auftrieb und Schwerkraft angetrieben. Wenn die Temperatur innerhalb des zirkulationsfördernden Behälters durch die vorgenannte thermische Konvektion bis zum Reaktionspunkt ansteigt, beginnt der Flüssigkeitsstrom und die PCR-Reaktion wird initiiert. Und der Temperatursensor überträgt diesen Status an den Prozessor, um den folgenden Prozess zu initiieren. Die Anwesenheit von PCR-Produkten wird mit Fluoreszenzfarbstoff interagieren und ein Fluoreszenzsignal würde emittiert und durch den Photodetektor detektiert werden. Ein programmierter Algorithmus ist in dem Prozessor eingebaut, um das Fluoreszenzsignal zu analysieren, um die PCR oder RT-PCR in Echtzeit zu quantifizieren.
In einer Ausführungsform, die unten beschrieben wird, ist es möglich, die Richtung des Strömungsweges weiter zu begrenzen, indem ein asymmetrischer Weg entworfen wird, der die Enden des zirkulationsfördernden Behälters verbindet. Der Winkel eines Endes des Weges unterscheidet sich von dem des anderen, was zu einer unterschiedlichen vertikalen Höhe dieser beiden Enden führt. Wenn die Temperatursteuereinheit anfängt, Wärme in dem kontaktierten Bereich bereitzustellen, ist die Dichte des Mischreagens, das näher an dem kontaktierten Bereich liegt, niedriger als die des Mischreagens, das weiter weg von dem kontaktierten Bereich liegt, um so zu einer Auftriebslücke innerhalb des Reagens zu führen und eine unidirektionale Zirkulationsflüssigkeitsströmung durch die Wirkung von Schwerkraft und Auftrieb zu initiieren.
Das Folgende veranschaulicht lediglich die Prinzipien der Offenbarung. Es versteht sich daher, dass der Fachmann in der Lage sein wird, verschiedene Anordnungen zu entwickeln, die, obwohl sie hier nicht explizit beschrieben oder gezeigt sind, die Prinzipien der Offenbarung verkörpern und in ihrem Geist und Umfang enthalten sind.
Darüber hinaus sind alle Beispiele und hierin erwähnte bedingte Sprache prinzipiell ausdrücklich nur für pädagogische Zwecke gedacht, um dem Leser beim Verständnis der Prinzipien der Offenbarung und den Konzepten zu helfen, die der/die Erfinder zur Förderung der Technik beigesteuert haben, und sollen ohne Einschränkung auf solche speziell aufgelisteten Beispiele und Bedingungen ausgelegt werden.
Darüber hinaus sollen alle hierin dargelegten Prinzipien, Aspekte und Ausführungsformen der Offenbarung sowie spezifische Beispiele davon sowohl strukturelle als auch funktionelle Äquivalente davon umfassen. Zusätzlich ist beabsichtigt, dass derartige Äquivalente sowohl gegenwärtig bekannte Äquivalente als auch Äquivalente enthalten, die in der Zukunft entwickelt werden, d. h. alle später entwickelten Elemente, die die gleiche Funktion erfüllen, unabhängig von der Struktur.
Wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, sind die Zeichnungen nicht maßstäblich.
Wir stellen nun einige nicht-einschränkende, veranschaulichende Beispiele zur Verfügung, die die betrieblichen Aspekte einer Mischvorrichtung und eines zugehörigen Verfahrens zur Vorbereitung von Materialien, die in biologischen oder biochemischen Assays verwendet werden, veranschaulichen.
Wie hierin verwendet beziehen sich Richtungsbegriffe, die wie etwa „horizontal“, „vertikal“, „proximal“, „distal“, „vorne“, „hinten“, „links“, „rechts“, „innere“, „äußere“, „innen“ und „außen“ verwendet werden können, auf eine Orientierung der offenbarten Vorrichtung aus der Perspektive eines typischen Benutzers, und geben keine permanenten intrinsischen Merkmale oder Eigenschaften der Vorrichtung an.
Wie in den drei Ausführungsformen unten verwendet wird der zirkulationsfördernde Behälter durch eine U-förmige Schleife vereinheitlicht.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Positionsbeziehung und die damit zusammenhängenden Begriffe, die wie etwa „vor“, „nach“, „vorne“ und „hinten“ verwendet werden können, auf eine Ankunftsreihenfolge eines reflektierten Lichtstrahls, der zwischen den Elementen der offenbarten Vorrichtung jeder der Ausführungsformen der Erfindung verläuft. Beispielsweise ist eine U-förmige Schleife das erste Element, das den Lichtstrahl reflektiert, und die U-förmige Schleife befindet sich in der hintersten Position jeder der offenbarten Vorrichtungen.
AUSFÜHRUNGSFORM 1
Wie in 1 gezeigt, weist die qPCR- und qRT-PCR-Vorrichtung 1 eine Temperatursteuereinheit, welche in dieser Ausführungsform eine Wärmequelle und ein Temperatursensor 12 ist, und einen zirkulationsfördernden Behälter, welcher in dieser Ausführungsform eine U-förmige Schleife 11 ist, auf. Eine Lichtquelle 13, ein Photodetektor 16, ein Filter 15, eine Linse 14, und ein Prozessor 17 sind in der 1 auch gezeigt.
Wie in 2 gezeigt, ist der asymmetrische zirkulationsfördernde Behälter eine U-förmige Schleife 11 mit einem Weg in unterschiedlicher vertikaler Höhe zwischen den beiden Enden der U-förmigen Schleife 11, die einen Schleifenweg bildet. Die U-förmige Schleife 11 hat eine linke Zone 111, eine rechte Zone 112, eine Verbindungszone 113, und eine untere Zone 114. Die linke und rechte Zone 111, 112 sind senkrecht zum Boden, und es gibt eine Öffnung 117 auf der Oberseite der linken Zone 111. Die Verbindungszone 113 ist mit der linken und rechten Zone 111, 112 in einem vorbestimmten Winkel verbunden. In dieser Ausführungsform ist das linke Ende der Verbindungszone 113 höher als das rechte Ende davon. Ferner kann die linke Zone 111 von einer linken Verbindungsstelle 115 aus in eine linke obere Zone 111a und eine linke untere Zone 111b unterschieden werden. Die rechte Zone 112 kann von einer rechten Verbindungsstelle 116 aus in eine rechte obere Zone 112a und eine rechte untere Zone 112b unterschieden werden. Die untere Zone 114, die mit der linken Zone 111 und der rechten Zone 112 verbunden ist, ist eine Biegezone mit symmetrischer Form und einem vorbestimmten Krümmungsradius. Die untere Zone 114 der U-förmigen Schleife 11 befindet sich dort, wo die Wärmequelle und der Temperatursensor 12 die Oberfläche der U-förmigen Schleife 11 berühren, und die U-förmige Schleife 11 ist im Wesentlichen senkrecht zum Boden. In dieser Erfindung beträgt der Innendurchmesser der linken Zone 111, der rechten Zone 112, der Verbindungszone 113, und der unteren Zone 114 der U-förmigen Schleife 11 zwischen 0,6 mm und 1,6 mm, und innerhalb der U-förmigen Schleife 11 ist ein verbundener Raum zur Aufnahme der Lösung. In dieser Ausführungsform beträgt der Innendurchmesser der U-förmigen Schleife 11 1,6 mm, und das Gesamtvolumen der Lösung in der U-förmigen Schleife 11 beträgt 150 µl. Wenn die Wärmequelle und ein Temperatursensor 12 der U-förmigen Schleife 11 Wärme zur Verfügung stellen und die Temperatur der U-förmigen Schleife 11 auf eine vorbestimmte Reaktionstemperatur erwärmen, ist die Struktur der U-förmigen Schleife 11 in der Lage, es einer darin befindlichen Lösung zu ermöglichen, in einer einheitlichen Richtung zu fließen und ein Strömungsfeld zu bilden.
Wenn die Wärmequelle und der Temperatursensor 12 beginnen, Wärme bereitzustellen, würde die Flüssigkeit der unteren Zone 114 zuerst erwärmt werden. Die linke Zone 111 und die rechte Zone 112 werden beide vom Boden bis zur Oberseite der Schleife erwärmt. Die Temperatur der linken Verbindungsstelle 115 ist niedriger als die Temperatur der rechten Verbindungsstelle 116 aufgrund der Höhe der linken Verbindungsstelle 115, die niedriger ist als die Höhe der rechten Verbindungsstelle 116. Daher ist die Dichte der linken Verbindungsstelle 115 höher als die Dichte der rechten Verbindungsstelle 116. Die Flüssigkeit der linken Verbindungsstelle 115 fließt durch die Wirkung des Auftriebs zur rechten Verbindungsstelle 116, und drückt somit die Flüssigkeit der rechten Verbindungsstelle 116 nach unten und zurück zur linken Verbindungsstelle 115, um eine im Uhrzeigersinn unidirektionale zirkulierende Strömung zu initiieren. Die Temperaturdifferenzierung ist wie in 3 gezeigt, wobei der Bereich höherer Temperatur innerhalb der U-förmigen Schleife 11 die linke untere Zone 111b ist, und der Bereich niedrigerer Temperatur innerhalb der U-förmigen Schleife 11 die rechte untere Zone 112b ist. In der Ausführungsform sind die Wärmequelle und ein Temperatursensor 12 im Bereich zwischen 90-110 °C eingestellt. Die Temperaturverteilung während der Reaktion ist wie unten beschrieben: die Temperatur der linken oberen Zone 111a liegt zwischen 30-40 °C, die Temperatur der linken unteren Zone 111b zwischen 90 und 100 °C, die Temperatur der rechten oberen Zone 112a zwischen 30-40 °C, die Temperatur der rechten unteren Zone 112b zwischen 45-60 °C, und die Temperatur der unteren Zone 114 zwischen 60-90 °C. Die Geschwindigkeit der unidirektionalen zirkulierenden Strömung beträgt etwa 1,7-6 mm/s und dauert 10-33 Sekunden für einen Zyklus.
Die 150 µl Lösung weist 30 µl Primer (Canine-GAPDH_7-2-F'-GTGGATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAAGCT-, 0,5 µM, 15 µl; und Canine-GAPDH_7-2-R'-CCTCAGTGTAGCCCAGGATGCCTTTGAGGG-, 0,5 µM, 15 µl), 75 µl 2x Mastermix (SensiFAST SYBR™ No-ROX, einschließlich dNTPs, DNA-Polymerase, SYBR™ Green), 3 µl Plasmid-DNA (3* 10³ Kopien), und 42 µl sekundäres steriles Wasser auf. SYBR™ Green ist eine Art der fluoreszierenden Substanzen. In dieser Ausführungsform wird die fluoreszierende Substanz, die in die U-förmige Schleife geladen wird, mit dem Amplikon interagieren und ein fluoreszierendes Signal emittieren, wenn sie durch die Lichtquelle angeregt wird. Durch Messung dieses fluoreszierenden Signals können wir die Konzentration des Amplikons in Echtzeit messen.
Die Lichtquelle 13, wie etwa LED-Leuchten, Laserdiodenleuchten, oder Halogenleuchten, kann einen Lichtstrahl mit einer vorbestimmten Wellenlänge für eine Fluoreszenzanregung emittieren. Der Bereich, an dem die Lichtquelle 13 angebracht ist, weist einen vorbestimmten Abstand und einen Vertiefungswinkel gegenüber der U-förmigen Schleife 11 auf. Die linke Zone 111, die rechte Zone 112, die Verbindungszone 113, und die untere Zone 114 haben im Wesentlichen die gleiche Bestrahlungsintensität. Außerdem tritt die fluoreszierende Substanz in den angeregten Zustand ein, wenn sie den Lichtstrahl empfängt, und verlässt mit Fluoreszenzemission den angeregten Zustand. In dieser Ausführungsform ist die Lichtquelle 13 eine LED-Leuchte und die Wellenlänge davon liegt zwischen 450 und 490 nm, und das SYBR™ Green hat einen maximalen Fluoreszenzwert zwischen 510 und 530 nm, wie durch die Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 450 bis 490 nm angeregt.
Die Linse 14 ist vor der U-förmigen Schleife 11 in einem vorbestimmten Abstand und auf derselben Seite wie die Lichtquelle 13 in Bezug auf die U-förmige Schleife 11 angeordnet. Die Linse 14 ist so konfiguriert, dass sie den Lichtstrahl empfängt, der von der U-förmigen Schleife 11 reflektiert wird. Außerdem ist der Abstand zwischen der Linse 14 und der linken Zone 111, der rechten Zone 112, der Verbindungszone 113, und der unteren Zone 114 im Wesentlichen gleich. Die Linse 14 ist so konfiguriert, dass sie einen Lichtstrahl bricht und den Lichtstrahl auf die lichtempfindliche Einheit fokussiert, um ein Bild der U-förmigen Schleife 11 zu bilden.
Der Filter 15 ist vor der Linse 14 in einem vorbestimmten Abstand zum Empfangen des Lichtstrahls von der Linse 14 angeordnet. Mit anderen Worten ist die Linse 14 zwischen dem Filter 15 und der U-förmigen Schleife 11 angeordnet.
Der Photodetektor 16 ist zum Umwandeln des gesammelten Lichtsignals, das vom Filter 15 empfangen wurde, in ein elektrisches Signal konfiguriert. Das elektrische Signal wird von einem Prozessor zur Analyse verarbeitet. In der Erfindung kann der Photodetektor 16 ein einzelnes Element sein, wie etwa eine Photovervielfacherröhre oder Photodioden. Der Photodetektor 16 kann auch ein Array sein, wie beispielsweise eine ladungsgekoppelte Vorrichtung oder ein sich ergänzender Metalloxid-Halbleiter. In der Ausführungsform ist der Photodetektor 16 eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD).
AUSFÜHRUNGSFORM 2
Unter Bezugnahme auf 4 und 5 umfasst eine qPCR- und qRT-PCR-Vorrichtung 2 eine Temperatursteuereinheit, welche in dieser Ausführungsform eine Wärmequelle und ein Temperatursensor 22 ist, und einen zirkulationsfördernden Behälter, welcher eine U-förmige Schleife 21 ist. Eine Lichtquelle 23, ein Photodetektor 26, eine Linse 24, ein Filter 25, und ein Prozessor 27 sind in der 4 und 5 auch gezeigt. Die Verbindung und der Bereich der Lichtquelle 23, des Photodetektors 26, der Linse 24, des Filters 25, und des Prozessors 27 sind im Wesentlichen die gleichen wie in 1 beschrieben. Die Verbindung und der Bereich der U-förmigen Schleife 21 und der Wärmequelle und eines Temperatursensors 22 unterscheiden sich jedoch von 1.
Wenn die Wärmequelle und ein Temperatursensor 22 der U-förmigen Schleife 21 Wärme zur Verfügung stellen, ist die asymmetrische Struktur der U-förmigen Schleife 21 in der Lage, es einer darin befindlichen Lösung zu ermöglichen, in einer unidirektionalen Weise zu fließen und ein Strömungsfeld zu bilden. Wie in 5 gezeigt, hat die U-förmige Schleife 21 eine linke Zone 211, eine rechte Zone 212, eine Verbindungszone 213, eine untere Zone 214, und eine vorstehende Zone 217, die mit der unteren Zone 214 verbunden ist. Die linken und rechten Zonen 211, 212 sind senkrecht zum Boden und es gibt eine Öffnung 218 an der Oberseite der linken Zone 211. Die Verbindungszone 213 ist mit den linken und rechten Zonen 211, 212 verbunden. Außerdem ist der Winkel von sowohl der linken Verbindungsstelle 215 als auch der rechten Verbindungsstelle 216 der Verbindungszone 213 parallel zum Boden. In der Ausführungsform ist das linke Ende der Verbindungszone 213 gleich hoch wie das rechte Ende davon. Ferner kann die linke Zone 211 von einer linken Verbindungsstelle 215 aus in eine linke obere Zone 211a und eine linke untere Zone 211b unterschieden werden. Die rechte Zone 212 kann von einer rechten Verbindungsstelle 216 aus in eine rechte obere Zone 212a und eine rechte untere Zone 212b unterschieden werden. Die untere Zone 214, die mit der linken Zone 211 und der rechten Zone 212 verbunden ist, ist eine Biegezone mit symmetrischer Form und einem vorbestimmten Krümmungsradius. Die vorstehende Zone 217 der U-förmigen Schleife 21 ist dort, wo die Wärmequelle und ein Temperatursensor 22 mit der U-förmigen Schleife 21 in Kontakt stehen. Die vorstehende Zone 217 würde die Wärme von der Wärmequelle und einem Temperatursensor 22 zu der U-förmigen Schleife 21 während der Reaktion übertragen. In dieser Ausführungsform ist die vorstehende Zone 217 auf der rechten Seite der unteren Zone 214 angeordnet. Der Durchmesser, das Lösungsvolumen und der Lösungsgehalt sind im Wesentlichen die gleichen wie in 1.
Wenn die Wärmequelle und ein Temperatursensor 22 beginnen, Wärme bereitzustellen, würde die vorstehende Zone 217 zuerst erwärmt werden und dann wird die Wärme auf die linke Zone 211 und die rechte Zone 212 übertragen. Die Temperatur steigt in der rechten Zone 212 schneller als in der linken Zone 211, da die Wärmequelle und ein Temperatursensor 22 und die vorstehende Zone 217 näher an der rechten Zone 212 sind. Wenn die Lösung nahe dem Boden der rechten Zone 212 erwärmt wurde, dehnt sich das Volumen der Lösung aus und die Dichte verringert sich. Die erwärmte Flüssigkeit steigt bis in die Nähe der rechten Verbindungsstelle 216 durch die Wirkung des Auftriebs auf, und entferntes Volumen würde durch die umgebende Flüssigkeit ergänzt werden. Wenn die Ergänzungsflüssigkeit auch durch die Wirkung des Auftriebs aufgestiegen ist, fließt die Flüssigkeit nahe der rechten Verbindungsstelle 216 zur linken Verbindungsstelle 215 und zurück zum Boden der rechten Zone 212, um eine entgegen den Uhrzeigersinn gerichtete unidirektionale zirkulierende Strömung zu initiieren. Der Bereich höherer Temperatur innerhalb der U-förmigen Schleife 21 ist die linke untere Zone 212b, wobei der Bereich niedrigerer Temperatur innerhalb der U-förmigen Schleife 21 211b ist. In der Ausführungsform sind die Wärmequelle und ein Temperatursensor 22 im Bereich zwischen 90 und 110 °C eingestellt. Die Temperaturverteilung während der Reaktion ist wie unten beschrieben: die Temperatur der linken oberen Zone 211a liegt zwischen 30 und 40 °C, die Temperatur der linken unteren Zone 211b liegt zwischen 45 °C und 60 °C, die Temperatur der rechten oberen Zone 212a liegt zwischen 30 und 40 °C, die Temperatur der rechten unteren Zone 212b zwischen 90 und 100 °C, und die Temperatur der unteren Zone 214 zwischen 60 und 90 °C. Die Geschwindigkeit der unidirektionalen zirkulierenden Strömung beträgt etwa 1,7-6 mm/s und dauert 10-33 Sekunden für einen Zyklus.
Wenn Nukleinsäureamplifikation stattfindet, wird die fluoreszierende Substanz, die in die U-förmige Schleife geladen wird, mit dem Amplikon interagieren und ein fluoreszierendes Signal emittieren, wenn sie durch die Lichtquelle angeregt wird. Die Fluoreszenz wird durch die Linse 24 fokussiert und durchläuft dann den Filter 25, um die nicht-vorbestimmten Wellenlängen herauszufiltern. In dieser Ausführungsform wird das emittierte Fluoreszenzsignal mit einer Wellenlänge von 510-530 nm durch die CCD 26 detektiert und die optischen Signale werden dann in die elektronischen Signale umgewandelt. Der Prozessor 27 analysiert die elektronischen Signale. Daher konnte diese Erfindung die Produktkonzentration in Echtzeit überwachen.
AUSFÜHRUNGSFORM 3
Unter Bezugnahme auf 6 und 7 umfasst eine qPCR- und qRT-PCR-Vorrichtung 3 zwei Temperatursteuereinheiten, welche in dieser Ausführungsform Wärmequellen und Temperatursensoren 32a und 32b sind, einen zirkulationsfördernden Behälter, welcher eine U-förmige Schleife 31 ist, eine Lichtquelle 33, einen Photodetektor 36, eine Linse 34, einen Filter 35, und einen Prozessor 37. Die Verbindung und der Bereich der Lichtquelle 33, des Photodetektors 36, der Linse 34, des Filters 35, und des Prozessors 37 sind im Wesentlichen die gleiche wie die in 1 beschriebenen. Die Verbindung und der Bereich der U-förmigen Schleife 31 und der Wärmequellen und Temperatursensoren 32a und 32b unterscheiden sich jedoch von 1.
Die Wärmequellen und Temperatursensoren 32a und 32b könnten als eine relativ höhere Wärmequelle und Temperatursensor 32a und eine relativ niedrigere Wärmequelle und Temperatursensor 32b definiert werden. Die bevorzugte Anordnung von beiden ist, dass die Höhe der relativ höheren Wärmequelle und des Temperatursensors 32a niedriger ist als die der relativ niedrigeren Wärmequelle und des Temperatursensors 32b. Die vorbestimmte Temperatur der relativ höheren Wärmequelle und des Temperatursensors 32a liegt zwischen 90-120 °C und 5-30 °C für die relativ niedrigere Wärmequelle und den Temperatursensor 32b. In dieser Ausführungsform sind die relativ höhere Wärmequelle und der Temperatursensor 32a in der Verbindungsstelle der linken Zone 311 und der unteren Zone 314 angeordnet, während die relativ niedrigere Wärmequelle und der Temperatursensor 32b in der rechten Zone 312 angeordnet sind, und die Höhe der relativ höheren Wärmequelle und des Temperatursensors 32a ist niedriger als die der relativ niedrigeren Wärmequelle und des Temperatursensors 32b.
Wenn die relativ höhere Wärmequelle und der Temperatursensor 32a und die relativ niedrigere Wärmequelle und der Temperatursensor 32b zu heizen beginnen, werden die Kontaktoberflächen der U-förmigen Schleife 31 zuerst erwärmt. Die Temperatur steigt in der linken Zone 311 schneller an als in der rechten Zone 312. Wenn die Lösung in der Nähe der Kontaktoberflächen der U-förmigen Schleife 31 und der relativ höheren Wärmequelle und des Temperatursensors 32a erwärmt wurde, wird das Volumen der Lösung ausgedehnt und die Dichte wird verringert. Die erwärmte Flüssigkeit steigt bis in die Nähe der der linken Verbindungsstelle 315 durch die Wirkung des Auftriebs auf, und entferntes Volumen würde durch die umgebende Flüssigkeit, die eine niedrigere Temperatur und eine höhere Dichte aufweist, ergänzt werden. Wenn die Ergänzungsflüssigkeit auch durch die Wirkung des Auftriebs aufgestiegen ist, fließt die Flüssigkeit nahe der linken Verbindungsstelle 315 zur rechten Verbindungsstelle 316 und zurück zum Boden der linken Zone 311, um eine im Uhrzeigersinn unidirektionale zirkulierende Strömung zu initiieren.
Wenn eine Nukleinsäureamplifikation stattfindet, wird die fluoreszierende Substanz, die in die U-förmige Schleife geladen wird, mit dem Amplikon interagieren und ein Fluoreszenzsignal emittieren, wenn sie durch die Lichtquelle angeregt wird. Die Fluoreszenz wird durch die Linse 34 fokussiert und durchläuft dann den Filter 35, um die nicht-vorbestimmten Wellenlängen herauszufiltern. In dieser Ausführungsform wird das emittierte Fluoreszenzsignal mit einer Wellenlänge von 510-530 nm durch die CCD 36 detektiert und die optischen Signale werden dann in die elektronischen Signale umgewandelt. Der Prozessor 37 analysiert die elektronischen Signale. Daher konnte diese Erfindung die Produktkonzentration in Echtzeit überwachen.

Claims

Tragbare Vorrichtung zum Durchführen von unidirektionaler konvektiver qPCR oder qRT-PCR in einem Mischreagens, das eine Zielnukleinsäure und einen Fluoreszenzfarbstoff enthält, einschließlich Denaturierungs-, Anlagerungs- und Extensionsverfahren, wobei die Vorrichtung einen asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälter zur Aufnahme des Mischreagens mit der Zielnukleinsäure und dem Fluoreszenzfarbstoff zur Durchführung von unidirektionaler konvektiver qPCR oder qRT-PCR, wobei der asymmetrische zirkulationsfördernde Behälter mindestens eine Öffnung, ein geschlossenes Schleifensystem, und einen Weg aufweist, der die Enden verbindet, der es ermöglicht, dass das Mischreagens in einem Zyklus durch verschiedene Zonen des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters fließt; eine Temperatursteuereinheit, die eine Wärmequelle zum Zuführen der Wärme und einen Temperatursensor zum Erfassen des Zustands der Wärmequelle aufweist, wobei die Temperatursteuereinheit in einem bestimmten Bereich im asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälter angeordnet und mit diesem in Kontakt gebracht ist, wobei das Mischreagens in der Nähe des kontaktierten Bereiches des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters daher zunächst erwärmt wird, um wegen der Auftriebs- und Schwerkraftsdifferenz innerhalb des asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälters eine unidirektionale Zirkulation zu bilden; eine Lichtquelle zum Anregen des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Mischreagens, um ein fluoreszierendes Signal zu emittieren, wenn die qPCR oder qRT-PCR initiiert ist, wobei die Lichtquelle in einem bestimmten Bereich angeordnet ist; einen Photodetektor zum Umwandeln des fluoreszierenden Signals in ein elektronisches Signal; ein optisches Element zum Lenken des fluoreszierenden Signals auf den Photodetektor, wobei das optische Element zwischen dem asymmetrischen zirkulationsfördernden Behälter und dem Photodetektor angeordnet ist; einen Filter zum Herausfiltern einer nicht-vorbestimmten Wellenlänge der Lichtquelle, wobei der Filter zwischen dem optischen Element und dem Photodetektor angeordnet ist; und einen Prozessor zum Empfangen und Analysieren des elektronischen Signals aufweist, das von der Temperatursteuereinheit und dem Photodetektor detektiert wird, wobei ein programmierter Algorithmus in dem Prozessor eingebaut ist, um die PCR oder RT-PCR in Echtzeit zu quantifizieren; wobei, wenn die Temperatur des kontaktierten Bereichs des zirkulationsfördernden Behälters auf die Reaktionstemperatur der Denaturierung ansteigt, eine unidirektionale Zirkulation des Mischreagens beginnt und die PCR- oder RT-PCR-Reaktion initiiert ist, wobei der Temperatursensor der Temperatursteuereinheit den Temperaturstatus an den Prozessor überträgt, um die Lichtquelle zu initiieren, um den Fluoreszenzfarbstoff anzuregen, um das fluoreszierende Signal zu emittieren, wobei das fluoreszierende Signal durch die optische Vorrichtung gefiltert und vom Photodetektor detektiert und in das elektronische Signal umgewandelt und durch einen programmierten Algorithmus im Prozessor zur Quantifizierung der PCR- oder RT-PCR-Produkte in Echtzeit analysiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der asymmetrische zirkulationsfördernde Behälter eine U-förmige Schleife ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der asymmetrische zirkulationsfördernde Behälter eine U-förmige Schleife ist, wobei die U-förmige Schleife eine linke Zone, eine rechte Zone, eine Verbindungszone und eine untere Zone umfasst, wobei die Verbindungszone die linke Zone und die rechte Zone mit einer asymmetrischen Höhe verbindet.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Innendurchmesser der U-förmigen Schleife 0,6 mm bis 1,6 mm beträgt und das Gesamtvolumen des in der U-förmigen Schleife enthaltenen Mischreagens 30-150 µl beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Umlaufgeschwindigkeit etwa 1,7-6 mm/s beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das optische Element eine Linse oder ein Lichtwellenleiter ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Photodetektor eine Photovervielfacherzone, oder Photodioden, oder ein Photodetektorarray ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der Photodetektorarray eine CCD oder ein CMOS ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Lichtquelle LED-Leuchten, Laserdiodenleuchten, oder Halogenleuchten ist.
Tragbare Vorrichtung zum Durchführen von unidirektionaler konvektiver qPCR oder qRT-PCR in einem Mischreagens, das eine Zielnukleinsäure und einen Fluoreszenzfarbstoff enthält, einschließlich Denaturierungs-, Anlagerungs- und Extensionsverfahren, wobei die Vorrichtung einen zirkulationsfördernden Behälter zur Aufnahme des Mischreagens mit der Zielnukleinsäure und dem Fluoreszenzfarbstoff zur Durchführung von unidirektionaler konvektiver qPCR oder qRT-PCR, wobei der zirkulationsfördernde Behälter mindestens eine Öffnung, ein geschlossenes Schleifensystem, und einen Weg aufweist, der die Enden verbindet, der es ermöglicht, dass das Mischreagens in einem Zyklus durch verschiedene Zonen des zirkulationsfördernden Behälters fließt; eine Vielzahl an Temperatursteuereinheiten, wobei jede Temperatursteuereinheit eine Wärmequelle zum Zuführen der Wärme und einen Temperatursensor zum Erfassen des Zustands der Wärmequelle aufweist, wobei die Vielzahl an Temperatursteuereinheiten in bestimmten Bereichen im zirkulationsfördernden Behälter angeordnet und mit diesem in Kontakt gebracht ist, wobei eine erste Temperatursteuereinheit, die in einem unteren Abschnitt des zirkulationsfördernden Behälters Wärme zuführt, niedriger in der Höhe angeordnet ist, um einen Bereich relativ hoher Temperatur zu erreichen, und eine zweite Temperatursteuereinheit, die in einem höheren Abschnitt des zirkulationsfördernden Behälters Wärme zuführt, höher in der Höhe des zirkulationsfördernden Behälters angeordnet ist, um einen Bereich relativ niedriger Temperatur erreichen, wobei das Mischreagens in der Nähe der ersten Temperatursteuereinheit eine relativ höhere Temperatur erreicht als das Mischreagens in der Nähe der zweiten Temperatursteuereinheit um daher wegen der Auftriebs- und Schwerkraftsdifferenz innerhalb des zirkulationsfördernden Behälters eine unidirektionale Zirkulation zu bilden; eine Lichtquelle zum Anregen des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Mischreagens, um ein fluoreszierendes Signal zu emittieren, wenn die qPCR oder qRT-PCR initiiert ist, wobei die Lichtquelle in einem bestimmten Bereich angeordnet ist; einen Photodetektor zum Umwandeln des fluoreszierenden Signals in ein elektronisches Signal; ein optisches Element zum Lenken des fluoreszierenden Signals auf den Photodetektor, wobei das optische Element zwischen dem zirkulationsfördernden Behälter und dem Photodetektor angeordnet ist; einen Filter zum Herausfiltern einer nicht-vorbestimmten Wellenlänge der Lichtquelle, wobei der Filter zwischen dem optischen Element und dem Photodetektor angeordnet ist; und einen Prozessor zum Empfangen und Analysieren des elektronischen Signals aufweist, das von der Temperatursteuereinheit und dem Photodetektor detektiert wird, wobei ein programmierter Algorithmus in dem Prozessor eingebaut ist, um die PCR oder RT-PCR in Echtzeit zu quantifizieren; wobei, wenn die Temperatur der ersten Temperatursteuereinheit auf die Reaktionstemperatur der Denaturierung ansteigt, eine unidirektionale Zirkulation des Mischreagens beginnt und die PCR- oder RT-PCR-Reaktion initiiert ist, wobei die Temperatursensoren sowohl der ersten Temperatursteuereinheit als auch der zweiten Temperatursteuereinheit den Temperaturstatus an den Prozessor übertragen, um die Lichtquelle zu initiieren, um den Fluoreszenzfarbstoff anzuregen, um das fluoreszierende Signal zu emittieren, wobei das fluoreszierende Signal durch die optische Vorrichtung gefiltert und vom Photodetektor detektiert und in das elektronische Signal umgewandelt und durch einen programmierten Algorithmus im Prozessor zur Quantifizierung der PCR- oder RT-PCR-Produkte in Echtzeit analysiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei der zirkulationsfördernde Behälter ein asymmetrischer zirkulationsfördernder Behälter oder ein symmetrischer zirkulationsfördernder Behälter ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der asymmetrische zirkulationsfördernde Behälter eine U-förmige Schleife ist, wobei die U-förmige Schleife eine linke Zone, eine rechte Zone, eine Verbindungszone, und eine untere Zone umfasst, wobei die Verbindungszone die linke Zone und die rechte Zone mit einer asymmetrischen Höhe verbindet.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der symmetrische zirkulationsfördernde Behälter eine U-förmige Schleife ist, wobei die U-förmige Schleife eine linke Zone, eine rechte Zone, eine Verbindungszone, und eine untere Zone umfasst, wobei die Verbindungszone die linke Zone und die rechte Zone mit einer symmetrischen Höhe verbindet.
Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Innendurchmesser der U-förmigen Schleife 0,6 mm bis 1,6 mm beträgt und das Gesamtvolumen des in der U-förmigen Schleife enthaltenen Mischreagens 30-150 µl beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Umlaufgeschwindigkeit etwa 1,7-6 mm/s beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei das optische Element eine Linse oder ein Lichtwellenleiter ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei der Photodetektor eine Photovervielfacherzone, oder Photodioden, oder ein Photodetektorarray ist.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der Photodetektorarray eine CCD oder ein CMOS ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Lichtquelle LED-Leuchten, Laserdiodenleuchten, oder Halogenleuchten ist.