DE60022363T2

DE60022363T2 - System zur durchführung von thermozyklen an fluiden in patronen

Info

Publication number: DE60022363T2
Application number: DE60022363T
Authority: DE
Inventors: Urban Schnell; Olivier Elsenhans; Thomas Caratsch; Lukas Birrer; Emad Sarofim
Original assignee: Roche Holding AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-09-04
Filing date: 2000-09-02
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-09-03
Also published as: JP3664680B2; EP1080785A1; US7256035B1; ES2248121T3; ATE303207T1; JP2003508768A; WO2001017683A2; EP1214148A2; EP1214148B1; WO2001017683A3; DE60022363D1

Description

Diese Erfindung ist auf ein System zum Durchführen von Thermozyklen von Flüssigkeiten in Kassetten gerichtet, um eine Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuresequenzen zu erreichen. Es ist ein spezifischer Aspekt der Erfindung, dass die Amplifikation und Überwachung des Amplifikationsvorgangs gleichzeitig durchgeführt werden können, ohne die Position der Kassette zu verändern. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die vollständige und blasenfreie Befüllung von Kassetten mit Flüssigkeiten zum Durchführen von Thermozyklen. Die Überwachung des Amplifikationsvorgangs kann verwendet werden um die Anfangskonzentration einer Zielnukleinsäure mengenmäßig zu bestimmen.
Eine Vorrichtung zum Durchführen von Nukleinsäureamplifikationen in Reaktionskassetten ist aus US 5 567 617 bekannt. Dieses US-Patent befasst sich mit einer Erfindung zur Nukleinsäureamplifikation in einer flexiblen Küvette. Zur Amplifikation wird diese Küvette in eine Heizvorrichtung mit einem dünnen Heizelement mit einem zentralen Fenster, das einen optischen Durchgang bereitstellt, platziert. Eine solche Ausführungsform hat den Nachteil, dass das Heizen und die Detektion sich den freien Platz in der seitlichen Richtung der Reaktionsküvette streitig machen. Ein weiteres Problem des in US 5 567 617 verwendeten Systems ist die flexible Art der Küvette mit darin befindlichen Flüssigkeitskanälen. Es müssen Maßnahmen ergriffen werden, um sicher zu stellen, dass die Flüssigkeitsverbindung innerhalb der Küvette nicht behindert wird, wenn die Küvette in der Heizvorrichtung platziert wird.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein System zum Durchführen von Thermozyklen gerichtet, das dem in US 5 567 617 beschriebenen System ähnelt, aber das den Vorteil hat, dass die Heizeffizienz nicht durch den für die Detektion benötigten freien Raum beschränkt wird. Es ist ein weiterer Vorteil verglichen mit US 5 567 617 , dass eine Verengung von Flüssigkeitsdurchgängen innerhalb der Kassette unkritisch ist.
Die Druckschrift WO 98/38487 beschreibt einen Aufbau mit einer Thermomanschette zur Steuerung der Temperatur innerhalb einer Flüssigkeitskammer. Der Aufbau umfasst weiter eine Optik zum Abfragen des Kammerinhalts, während die Kammer in der Thermomanschette platziert ist.
Jedoch ist die offenbarte Kammer ausgelegt, Flüssigkeit durch Bodenfüllung über eine Flüssigkeitsöffnung am oberen Ende der Kammer aufzunehmen. Das Füllen einer solchen Kammer ist unkritisch, falls der innere Durchmesser groß genug ist, das Eintreten von Flüssigkeit ohne den Einschluss von Luftblasen zu erlauben. Jedoch ist die Verminderung des Durchmessers wünschenswert, um die innere Entfernung zwischen den temperaturgeregelten Wänden zu reduzieren, um genügende Aufheiz- und Abkühlungsgeschwindigkeiten der Flüssigkeit zu erlauben.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein System zur schnellen Durchführung von Thermozyklen von Flüssigkeiten in Kassetten mit optischer online Überwachung. Es ist ein besonderes Ziel, schnelle Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten zu erreichen, während die Störung von optischen Messungen durch in der Flüssigkeit eingeschlossene Blasen vermieden wird.
Das Ziel wird erreicht mit einer Thermozykler-Einheit, einer Lichtquelle, einem Lichtdetektor, einer Flüssigkeitsbereitstellungseinheit und einer Kassette, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, in der Thermozyklen wie auch die Detektion durchgeführt werden kann, während die Kassette in ihrer Position unverändert bleibt. Ein solches System erlaubt die Durchführung von Thermozyklen mit optischer online Überwachung. Online Überwachung bedeutet optische Überwachung während der Durchführung von Temperaturzyklen. Des Weiteren weist die Kassette einen genügend kleinen inneren Durchmesser zwischen den temperaturgeregelten Wänden auf, um eine enge Temperatursteuerung von in der Kassette befindlicher Flüssigkeit zu erlauben. Die Befüllung der Kassette wird vorteilhafterweise durch einen Durchflussprozess erreicht.
Die Kassette der vorliegenden Erfindung weist die Form einer dünnen Platte auf. Die beiden gegenüberliegenden Wände werden für den Wärmetransfer verwendet, und eine oder mehrere Wände, die im wesentlichen vertikal dazu sind, werden verwendet, um Licht in die Kassette hinein zu übertragen und zu detektierendes Licht aus der Kassette heraus zu übertragen. Dieser Kassettenaufbau stellt sicher, dass der optische Weg und der Weg zum Wärmeaustausch räumlich getrennt sind, so dass die Detektion und die Wärmeübertragung sich den Platz nicht streitig machen. Die Dicke der Kassette liegt bevorzugt im Bereich von 2,5–5 mm, und die Fläche jeder Wand für die Wärmeübertragung liegt bevorzugt im Bereich von 0,1–4 cm². Eine solche Kassette kann aus einem Körper gemacht sein, der eine untere Wand und aufrechtstehende Seitenwände aufweist, wobei der Körper durch eine obere Wand geschlossen wird, um eine geschlossene Kassette mit einer Reaktionskammer darin zu bilden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Kassette ist jedoch aus einem Rahmen gemacht, der die Seitenwände der Kassette bereitstellt, und der durch eine untere und eine obere Wand geschlossen wird. Es wird besonders bevorzugt, wenn die oberen und unteren Wände Folien mit einer Dicke von weniger als 200 μm sind. Eine Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine einheitliche Dicke haben, jedoch wird es bevorzugt, wenn die Wärme leitenden oberen und unteren Wände einen Winkel von 3 bis 8 Grad relativ zueinander bilden. Eine solche keilförmige Kassette weist den Vorteil auf, dass sie eine effiziente Wärmeübertragung und einfache Handhabung bereitstellt, wenn sie in Verbindung mit einer Thermozykler-Einheit verwendet wird, die einen Aufnahmebereich einer jeweiligen Keilform hat.
Kassetten der vorliegenden Erfindung können aus transparentem Plastik gemacht werden. Bevorzugt wird ein ringförmiger Rahmen mit einer Wanddicke von 0,3–4 mm bereitgestellt, um die Seitenwände der Kassette zu bilden. Der Rahmen kann z.B. durch Spritzguss aus Polymeren, wie z.B. Polyethylen oder Polypropylen hergestellt werden. Der Rahmen wird durch Folien, die die oberen und unteren Wände bilden, durch Heißsiegeln verschlossen. Prozesse zum Versiegeln einer Polymerfolie auf einem solchen Rahmen sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden daher hier nicht im Detail besprochen. Heißsiegelprozesse werden z.B. beschrieben in: Polymere Werkstoffe: 3. Band, Herausgeber: Hans Batzer. Stuttgart; New York: Thieme. Bd. 2. Technologie 1,1984, Seiten 206–212; Kunststoffverarbeitung; Herausgeber: Otto Schwarz u. a.; 4. überarbeitete Ausgabe Würzburg: Vogel, 1988, Seiten 193–206 und Kunststoff-Folien: Herstellung, Eigenschaften, Anwendung; Herausgeber: Joachim Nentwig. München, Wien: Hanser, 1994, Seiten 88–93. Metallisierte Mehrschichtfolien können ebenfalls zur Versiegelung auf dem Rahmen eingesetzt werden.
Wie unten in Verbindung mit dem Befüllungsprozess deutlicher werden wird, wird die Kassette aus Materialien gemacht, die eine hohe Oberflächenspannung aufweisen, oder die Oberflächenspannung der inneren Wände kann gesteigert werden. Eine solche Steigerung der Oberflächenspannung kann durch geeignete Oxidbeschichtung oder Plasmabehandlung der Oberfläche erreicht werden. Der beschränkende Oberflächenspannungswert, der die blasenfreie Befüllung ermöglicht, hängt jedoch von der Oberflächenspannung der Flüssigkeit ab.
Wie erwähnt, ist es vorteilhaft, Kassetten mit einem kleinen inneren Durchmesser zwischen den wärmegeregelten Wänden der Kassette einzusetzen. Es hat sich gezeigt, dass ein Durchmesser unterhalb von ungefähr 5 mm eine enge Temperatursteuerung und somit hohe Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten erlaubt.
Es sollte beachtet werden, dass das innere der Kassette Flüssigkeitskanäle haben kann, ebenso wie Vorsprünge und Aussparungen. Des weiteren schließt die verwendete Formulierung „verschlossene Kassette" nicht aus, dass Flüssigkeitskanäle, die benutzt werden, um Flüssigkeiten in die oder aus der Kassette zu bringen, die Wände der Kassette durchdringen.
Die Thermozykier-Einheit der vorliegenden Erfindung umfasst einen Heizabschnitt, um einen thermischen Kontakt mit den Wärme leitenden Wänden der Kassette herzustellen. Der Heizabschnitt umfasst bevorzugt mindestens eine Platte, die in mechanischen Kontakt mit der Wärme leitenden Wand der Kassette gebracht wird und wobei die Platte selbst aufgeheizt und abgekühlt wird, wie für den Thermozyklenprozess notwendig. Dieses Aufheizen und Kühlen kann z.B. durch ein Peltier-Element erfolgen, dadurch, dass die Platte in Kontakt mit heißen und kalten Flüssigkeiten gebracht wird, oder durch Erhitzen mit einem Widerstandheizer und Kühlen durch das Blasen von Luft auf die Platte. Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von Thermozyklen durch thermischen Kontakt mit Platten sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Es sollte jedoch verstanden werden, dass andere Geräte zum Aufheizen und Abkühlen der Kassetten verwendet werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Es ist nur nötig dass, welches Gerät auch immer zum Aufheizen und Abkühlen der Kassetten verwendet wird, es in der Lage ist, die erforderlichen Temperaturen zu erreichen und aufrecht zu erhalten, und das gewünschte Temperatur-Zeit-Profil zu erreichen. Somit sollte zum Zwecke der Amplifikation von Nukleinsäuren ein solches Gerät in der Lage sein, einen Zyklus der Temperatur der Amplifikationsreaktionsmischung durchzuführen zwischen einer denaturierenden Temperatur T₁ (die in dem Bereich von ungefähr 80–105°C und bevorzugt 90–100°C liegen kann) und einer Annealing/Extensions-Temperatur T₂, die in dem Bereich von ungefähr 30–90°C und bevorzugt 50–70°C liegen kann), wobei T₁ > T₂ wie den Fachleuten bekannt ist.
Um einen genügenden thermischen Kontakt zwischen der Kassette und dem Heizabschnitt zu erreichen, können Mittel bereitgestellt werden, die eine oder zwei Platten gegen die Kassette pressen. Solche Mittel werden z.B. in US 5 567 617 beschrieben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird es jedoch bevorzugt, eine Heizeinheit einzusetzen, die einen Aufnahmebereich einer keilförmigen Ausnehmung aufweist. Der Aufnahmebereich kann durch zwei Wände gebildet werden, die zueinander geneigt sind. Eine keilförmige Kassette kann in einem solchen keilförmigen Aufnahmebereich einfach platziert werden, und genügender thermischer Kontakt zwischen den Wänden des Aufnahmebereichs und den Wärme leitenden Wänden der Kassette wird automatisch durch mechanischen Kontakt erreicht, in den die jeweiligen Wände kommen, wenn die Kassette in den Aufnahmebereich hinunterläuft.
Die Thermozykler-Einheit umfasst des Weiteren eine Steuereinheit, die die rechtzeitige Aufheizung und Abkühlung des Heizabschnittes steuert. Eine solche Steuereinheit wird zum Beispiel in EP B 0 236 069 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme umfasst wird. Die vorliegende Erfindung benötigt keine andere Steuereinheit als die, die in EP B 0 236 069 beschrieben wird, jedoch müssen das Timing, die Temperaturprofile und die Wärmemenge, die mit der Kassette ausgetauscht werden, auf die speziellen Bedürfnisse angepasst werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Amplifikation von Nukleinsäure und die Detektierung, Überwachung und Quantifizierung von Amplifikationsprodukten. Um das Verständnis des Amplifikationsdatenerfassungs- und -verarbeitungssystem der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, wird zunächst eine Zusammenfassung von Amplifikationsprozessen von Nukleinsäuren, die besonders geeignet sind für die Verwendung in Verbindung mit der Erfindung erörtert.
Fachleute werden erkennen, dass die vorliegende Erfindung die Amplifikation der Duplexform der Nukleinsäure benötigt. Es gibt wohlbekannte Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren. Die Mittel zur Amplifikation sind nicht kritisch, und diese Erfindung wird mit jedem Verfahren funktionieren, in dem Nukleinsäure-Duplexe erzeugt werden. Die verschiedenen Verfahren werden besprochen in: Bio/Technology8: 290–293, April 1990. Sie umfassen PCR, LCR, Qß und 3SR, sind aber nicht darauf beschränkt. Obschon 3SR und Qß nicht die Durchführung von thermischen Zyklen umfassen, können die Ergebnisse ihrer Amplifikationen mit der unten erörterten Fluoreszenzdetektionsanordnung überwacht und gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Jedes Verfahren wird unten kurz beschrieben.
PCR-Amplifikation von DNA umfasst wiederholte Zyklen der Hitzedenaturierung der DNA, Anlagern von zwei Oligonukleotid-Primern an Sequenzen, die das zu amplifizierende DNA-Fragment flankieren, und das Verlängern der angelagerten Primer mit DNA-Polymerase. Die Primer hybridisieren zu eingegengesetzten Strängen der Zielsequenz und sind so orientiert, dass die DNA- Synthese durch die Polymerase über die Bereiche zwischen den Primern verläuft, wobei jeder aufeinanderfolgende Zyklus die Menge an DNA, die in dem vorhergehenden Zyklus synthetisiert wurde, im wesentlichen verdoppelt. Dieses resultiert in der exponentiellen Akkumulation des spezifischen Zielfragments mit einer Rate von ungefähr 2ⁿ pro Zyklus, wobei n die Anzahl der Zyklen ist. Eine vollständige Besprechung dieser Technologie kann man in PCR Technology – Principles and Applications, Hrsg. Erlich H. A., Stockton Press, New York 1989 finden, Taq-DNA-Polymerase wird bevorzugt, wenn PCR in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, obschon dies nicht ein wesentlicher Aspekt der Erfindung ist.
Die Ligase-Kettenreaktion wird in der internationalen Patentanmeldung WO 89/09835 beschrieben. Der Vorgang umfasst die Verwendung von Ligase zur Verbindung von Oligonukleotid-Segmenten, die sich an die Zielnukleinsäure anlagern. Ligase-Kettenreaktion (LCR) resultiert in der Amplifikation eines ursprünglichen Zielmoleküls und kann Millionen von Kopien von produzierter DNA bereitstellen. Demzufolge resultiert die LCR in einem Nettozuwachs an Doppelstrang-DNA. Die vorliegenden Detektionsmethoden können auf LCR ebenso wie auf PCR angewendet werden, LCR benötigt typischerweise irgendein Mittel zum Detektieren der produzierten DNA, wie etwa eine Oligonukleotid-Sonde. Solche Mittel sind unnötig, wenn Sie in Verbindung mit den offenbarten Verfahren zur Detektion von Amplifikationsprodukten verwendet werden, und das LCR-Resultat ist direkt detektierbar.
Ein weiteres Amplifikationsschema, Q-beta Replicase, nutzt die Verwendung der Replicase der RNA Bakteriophage Qß. Bei diesem Amplifikationsschema wird ein modifiziertes rekombinantes Bakteriophagen-Genom mit einer Sequenz, die spezifisch für die zu erzielende Sequenz ist, anfangs an die zu testende Nukleinsäure ligiert. Nach der Anreicherung der zwischen der Bakteriophagensonde und der Nukleinsäure in einer Probe gebildeten Duplexe wird Qß-Replicase beigemengt, die, nachdem sie das zurückgehaltene rekombinante Genom erkannt hat, beginnt, eine große Anzahl von Kopien anzufertigen. Das Qß-System erfordert keine Primersequenzen, und es gibt keinen Hitzedenaturierungsschritt, wie bei den PCR- und LCR-Amplifikationssystemen. Die Reaktion findet bei einer Temperatur statt, typischerweise 37°C. Die bevorzugte Vorlage ist ein Substrat für die Qß-Replicase, midvariant-1 RNA. Eine sehr große Zunahme an Vorlagen wird durch die Verwendung dieses Systems erreicht. Eine Besprechung dieses Amplifikationssystems kann man in der internationalen Patenanmeldung WO 87/06270 und in Lizardi u. a., 1988, Bio/Technology 6: 1197–1202 finden.
Das 3SR System ist eine Variante eines auf In-Vitro-Transkription basierenden Amplifikationsystems, Ein auf Transkription basierendes Amplifikationssystem (TAS) umfasst die Verwendung von Primern, die eine Promotorsequenz codieren, wie auch eine zu dem Zielstrang komplementäre Sequenz, um DNA-Kopien eines Zielstranges und die Produktion von RNA-Kopien aus den DNA -Kopien mit einer RNA-Polymerase zu erzeugen.
Siehe z.B. Beispiel 9B des U. S. Patentes Nr. 4,683,202 und die Europäische Patent Anmeldung EP-A-0 310 229. Das 3SR System ist ein System, das drei Enzyme verwendet, um eine isotherme Replikation von Zielnukleinsäuren durchzuführen.
Das System beginnt mit einem Ziel von einzelsträngiger RNA, an die ein T7 RNA-DNA-Primer gebunden wird. Durch die Verlängerung des Primers mit reverser Transkriptase wird eine cDNA gebildet, und eine RNAseH-Behandlung befreit die cDNA aus der Heteroduplex. Ein zweiter Primer wird an die cDNA gebunden und eine doppelsträngige cDNA wird durch eine Behandlung mit reverser Transkriptase gebildet. Einer (oder beide) der Primer codiert einen Promotor, z.B. den Promotor für T7 RNA-Polymerase, so dass die doppelsträngige cDNA eine Transkriptionsvorlage für RNA-Polymerase ist.
Transkriptionsfähige cDNAs ergeben antisense-RNA-Kopien des ursprünglichen Ziels. Die Transkripte werden dann durch die reverse Transkriptase in doppelsträngige cDNA umgewandelt, die doppelsträngige Promotoren enthält, wahlweise auf beiden Enden in einer invertierten Wiederholungsorientierung. Diese DNAs können RNAs ergeben, die wieder in den Zyklus eintreten können. Eine vollständigere Beschreibung des 3SR-Systems kann in Guatell u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878, und der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 329 822 gefunden werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, wird die Nukleinsäureamplifikation durch das Detektieren von Fluoreszenz überwacht, die emittiert wird, wenn ein fluoreszierender Farbstoff, wie etwa ein interkalierender fluoreszierender Farbstoff, der in der Reaktionsmischung bereitgestellt wird, sich mit der doppelsträngigen Nukleinsäure während jeder Annealing/Extension-Phase verbindet, während die Mischung einem Zyklus zwischen zwei Temperaturen unterzogen wird. Ein Anstieg der Fluoreszenz weist auf eine positive Amplifikation der Zielnukleinsäure hin. Geeignete interkalierende Mittel oder Farbstoffe umfassen Ethidiumbromid, Propidiumbromid, Proflavin, Acridinorange, Acriflavine. Fluorcoumarin, Ellipticine, Daunomycin, Chloroquin, Distamycin D, Chromomycin, Homidium, Mithramycin, Rutheniumpolypyridyle, Anthramycin, Methidiumbromid,2-[2-(4-hydroxyphenyl)-6-benzimidazol-6-(1-methyl4-piperazye)benzimidazoltrihydrochlorid und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Fluorophore und DNA-bindende Chromophore, die im Stand der Technik beschrieben werden, sind geeignet zum Gebrauch in dem im US-Patent 5,210,015 offenbarten 5' bis 3' Nuklease-Assay, und sind ebenso nützlich bei der vorliegenden Erfindung. Geeignete Spenderfluorophoren und Quencher werden so ausgewählt, dass das Emissionsspektrum des Spenderfluorophors mit dem Absorptionsspektrum des Quenchers überlappt. Idealerweise sollten die Fluorophoren eine hohe Stokes-Verschiebung aufweisen (einen großen Unterschied zwischen der Wellenlänge für die maximale Absorption und der Wellenlänge für die maximale Emission), um die Interferenz durch gestreutes Anregungslicht zu minimieren.
Geeignete Marker, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, umfassen Fluoroscein und Derivate wie etwa FAM, HEX, TET, und JOE; Rhodamin und Derivate wie etwa Texas Red, ROX, und TAMRA; Lucifer Yellow, und Cumarinderivate wie etwa 7-Me2N-cumarin-4-acetat, 7OH-4-CH3-cumarin-3-acetat, und 7-NH2-4-CH3cumarin3-acetat (AMCA), sind aber nicht darauf beschränkt. FAM, HEX, TET, JOE, ROX, und TAMRA werden durch PerkinElmer, Applied Biosystems Division (Foster City, CA) vertrieben. TEX-as Red und viele andere geeignete Verbindungen werden durch Molecular Probes (Eugene, OR) vertrieben. Beispiele von chemolumineszierenden und biolumineszierenden Verbindungen, die für die Verwendung als Energiespender geeignet sein können, umfassen Luminol (Aminophthalhydrazid) und Derivate, und Luziferasen.
Die Optik eines Systems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Lichtquelle und einen Lichtdetektor. Mit dem System können Absorptions- oder Streuungsmessungen mit der Flüssigkeit innerhalb der Kassette durchgeführt werden. Es wird jedoch bevorzugt, dieses System für Fluoreszenzmessungen zu verwenden, wobei Licht in das Innere der Kassette gesendet wird, um Fluoreszenzemission zu initiieren, die durch den Lichtdetektor detektiert wird. Die Lichtquelle kann Halbleiterlichtquellen, wie etwa Halogenleuchten oder andere Ausführungsformen umfassen. Im Geiste der Erfindung wird das Licht in die Kassette durch eine zweite, für Licht transparent Wand der Kassette, die im Wesentlichen senkrecht zu der Wand für die Wärmeübertragung ist, übertragen. Wegen der flachen Form der Kassette hat die zweite, für Licht transparente Wand eine Breite von nur 0,5 bis 5 mm in einer Dimension. Es wird daher bevorzugt, mit der Lichtquelle kooperierende Strahlformungsoptiken einzusetzen, um Licht durch dieses begrenzte Fenster zu führen. Solche Strahlformungsoptiken können Blenden, Linsen und Faseroptiken umfassen. Für Fluoreszenzmessungen ist es notwendig, fluoreszierende Farbstoffe mit Licht einer Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums des Farbstoffs zu stimulieren. Es wird normalerweise gewünscht, Hintergrundstrahlung zu unterdrücken, die durch Lichtemission anderer Quellen als dem fluoreszierenden Farbstoff verursacht wird. In vielen Ausführungsformen ist es des Weiteren erwünscht, Fluoreszenzmessungen mit zwei oder mehr Farbstoffen innerhalb desselben Reaktionsvolumens durchzuführen. In diesen Fällen ist es notwendig, die Bandbreite des Lichts für die Beleuchtung zu begrenzen. Dies kann geschehen, indem man Lichtquellen verwendet, die eine niedrige Bandbreite aufweisen, wie z.B. LEDs, oder, indem man Lichtquellen mit einer hohen Bandbreite in Verbindung mit geeigneten Filtern verwendet.
Ein System der vorliegenden Erfindung umfasst ferner einen oder mehrere Lichtdetektoren zum Detektieren von Licht, das aus dem Inneren der Kassette durch die zweite, für Licht transparente Wand heraustritt. Geeignete Lichtdetektoren sind Halbleiterdetektoren wie etwa Photodioden oder Photomultiplier. Hie bereits erwähnt, ist es erwünscht, Hintergrundsignale zu unterdrücken, und daher sollte das Detektieren auf das Emissionsband des zu detektierenden fluoreszierenden Farbstoffs begrenzt sein. Dies kann durch Wellenlängenfilter oder spektrale Trennung des Lichts mit einem Spektrometer erreicht werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, zwei oder mehr fluoreszierende Farbstoffe innerhalb derselben Kassette durch separates Detektieren der emittierten Fluoreszenzstrahlung von den Farbstoffen zu detektieren. Vorteilhaft werden die Farbstoffe auch separat mit geeigneten Lichtquellen stimuliert.
Der Lichtdetektor der vorliegenden Erfindung kann mit Licht richtenden Mitteln wie etwa Faseroptiken, Linsensystemen und so weiter zusammenarbeiten.
Die Kassette der vorliegenden Erfindung wird als ein Hohlraum zur Durchführung von Thermozyklen für Flüssigkeiten verwendet und weist daher einen Einlass auf, um die Kassette mit Flüssigkeit zu versorgen. Die Kassette weist einen Auslass auf, um Flüssigkeit aus der Kassette abzulassen. Es wird jedoch bei manchen Verwendungsarten bevorzugt, eine Wegwerfkassette zu haben. Eine solche Kassette kann zusammen mit ihrem Inhalt nach der Verwendung weggeworfen werden. Der Einlass und der Auslass sind bevorzugt Kanäle durch den Körper oder durch den Rahmen der Kassette. Wie bereits erwähnt, sind Körper und Rahmen zumeist inkompressibel gemacht, so dass die Kanäle nicht blockiert werden, wenn auf die Kassette Druck ausgeübt wird, um einen thermischen Kontakt mit der Erhitzungseinheit zu erreichen. Ein System gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Flüssigkeitsbereitstellungseinheit, die an den Einlass der Kassette gekoppelt ist. Eine solche Flüssigkeitsbereitstellungseinheit kann eine Pipettiereinheit oder ein interner Flüssigkeitskanal sein, von dem Flüssigkeit in die Kassette gepresst wird. Das System umfasst optional eine Flüssigkeitsaufnahmeeinheit, die an einen Auslass der Kassette gekoppelt ist, um Flüssigkeit aus der Kassette aufzunehmen. Eine solche Flüssigkeitsaufnahmeeinheit ist notwendig, wenn die Kassette geleert werden muss, oder falls verschiedene Flüssigkeiten innerhalb der Kassette verarbeitet werden müssen. In bevorzugten Ausführungsformen wird jedoch die Kassette zusammen mit der darin befindlichen Flüssigkeit nach einer einzigen Benutzung weggeworfen. Solche Ausführungsformen benötigen keine Flüssigkeitsaufnahmeeinheit, sondern nur einen Auslass, um Gas abzulassen, wenn die Kassette mit Flüssigkeit gefüllt wird.
Kassetten gemäß der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt mit der sogenannten Durchflussbefüllung gefüllt. Durchflussbefüllung bedeutet, dass die Flüssigkeit durch einen Einfluss eingeführt wird und den Innenraum der Kassette, der unmittelbar zum Einlass benachbart ist, füllt. Das Einführen von weiterer Flüssigkeit vergrößert kontinuierlich den gefüllten Raum, bis ein erwünschter Befüllungsgrad erreicht ist. Bei diesem Prozess wird der Flüssigkeitsbolus nie während der Befüllung von dem Einlass gelöst, wie es der Fall bei der Befüllung vom Boden nach oben, wie in WO 98/38487 beschrieben, ist. Um einen Durchflussbefüllungsprozess zu erlauben, ist die innere Geometrie beziehungsweise der Kanalverbindungseinlass und -auslass wichtig. Für Kassetten zur Durchführung von Thermozyklen ist es wünschenswert, eine große Kontaktfläche der Flüssigkeit mit den thermisch geregelten Wänden zu haben. Die Dimension des Kanals, der die Kontaktfläche regelt, wird mit D_L (lateraler Durchmesser) bezeichnet, und die interne Entfernung zwischen den thermisch geregelten Wänden wird mit D_V (vertikaler Durchmesser) bezeichnet. Je größer der Quotient D_L/D_V ist, desto effizienter ist die Wärmesteuerung ebenso, wie die Gefahr, dass während der Befüllung Blasen eingeschlossen werden. Es hat sich gezeigt, dass optimale Quotienten D_L/D_V im Bereich von 1 bis 10 liegen.
Unter Berücksichtigung dessen, dass die Gefahr von Blasenbildung mit zunehmendem lateralem Durchmesser zunimmt, sollte der Quotient berechnet werden, indem der größte vertikale Durchmesser (D_V, max) des Kanals verwendet wird, wobei der Durchmesser vertikal zur Flussrichtung gemessen wird.
Andere Faktoren, wie etwa Oberflächenspannung (von Wand und Flüssigkeit), Viskosität der Flüssigkeit, Kapillarkräfte und Befüllungsgeschwindigkeit werden den Befüllungsprozess ebenfalls beeinflussen. Der genannte Flüssigkeitskanal weist jedoch nicht notwendigerweise eine einzigartige Form an jedem Abschnitt auf. Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, einen kurvenförmigen Kanal einzusetzen, so dass die Länge L des Kanals größer ist als die geometrische Distanz D zwischen dem Einlass und dem Auslass. Ein solcher Aufbau kann effizient durch einen Vorsprung, der, wie in 1 gezeigt, in das Innere der Kassette vorragt, erzeugt werden.
Die Kassette kann ebenso einen Raum zur Aufnahme von Gasen, die bei der Erwärmung der Flüssigkeit freigesetzt werden, aufweisen. Dieser Raum ist in einem Abschnitt der Kassette angeordnet, der die optische Messung nicht behindert.
Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren detaillierter beschrieben.
1: Kassette in einer Draufsicht, teilweise mit Flüssigkeit gefüllt
2: Kassette in einer Draufsicht mit Lichtquellen und Detektor
3: Lichtquellenmodul
4: Raytracediagramm mit Kassette, die ein schäges Fenster aufweist
5: Fluoreszenzsignal während der Durchführung eines Thermozyklus
6: System zur Durchführung von Thermozyklen in einer Kassette innerhalb eines Blockthermozyklers aus Metall, wobei man Lichtquellen und Lichtdetektor integriert.
7: System zur Durchführung von Thermozyklen mit einer keilförmigen Kassette
8: Befüllungsprozess der in 1 gezeigten Kassette.
1 zeigt eine Kassette (1) zur Durchführung von Thermozyklen von Flüssigkeiten in einer Draufsicht. Die Kassette weist einen Körper (3) mit einem Hohlraum (2) darin auf. Der Kassettenkörper wurde aus einem festen Polypropylenblock geschmolzen. Im Bereich des Hohlraums wurde Material entfernt, bis ein Zellenboden mit einer Dicke von 200 μm erreicht wurde. (In der Serienproduktion kann die Kassette durch Spritzguss effizienter produziert werden). In den Propylenblock wurden ebenso ein Einlass (10) zur Flüssigkeitsaufnahmen und ein Auslass (11) zum Abzug von Luft aus dem Hohlraum während der Befüllung geschmolzen. Der Körper der in 1 gezeigten Kassette wurde geschlossen, indem eine Versiegelungsfolie von 40 μm Dicke auf den Kassettenkörper geschweißt wurde. 1 zeigt eine bevorzugte Form des Hohlraums (2) mit einem Vorsprung (5) in Form einer Nase, die in den Hohlraum hineinreicht. Der Vorsprung (5) stellt sicher, dass der Hohlraum vollständig mit Flüssigkeit ohne den Einschluss von Blasen gefüllt werden kann.
Der Vorsprung modifiziert die Geometrie der Kassette so, dass der größte laterale Durchmesser D_L,max ebenso wie der Quotient D_L,max/D_V verringert wird (D_V ist die Entfernung zwischen den wärmeregulierten Wänden, d.h. die Dicke der Flüssigkeit in der Kassette). In dem gezeigten Versuchsaufbau betrug D_L,max 4,0 mm und D_V 1,5 mm, was einen Quotienten von 2,7 ergab.
Die Größe des Vorsprungs (5) muss an diese spezifische Situation angepasst werden und hängt von der Dicke des Hohlraums, der Viskosität der Flüssigkeit, der Oberflächenspannung der oberen und unteren Wand der Kassette, sowie der Größe und Form des Hohlraums ab. Es wurde herausgefunden, dass es die Wirkung des Vorsprungs ist, eine Flüssigkeitsabkürzung zwischen Einlass und Auslass zu vermeiden, in diesem Sinne leitet der Vorsprung die Flüssigkeit auf einen Pfad (L), der länger ist als die kürzeste Distanz (D) zwischen dem Einlass und dem Auslass. In 1 wurden mehrere Flüssigkeitspfade durch punktierte Linien gezeigt. Es wurde herausgefunden, dass es vorteilhaft ist, wenn der Quotient des kürzesten L dividiert durch D zwei oder mehr beträgt. 1 zeigt weiterhin eine bevorzugte Ausführungsform hinsichtlich des Ortes des Einlasses und des Auslasses auf derselben Seite der Kassette. Mit dieser Anordnung ist es möglich, Flüssigkeitsverbindungen auf derselben Seite anzuordnen und die Verbindung zu einem Gerät einfacher zu machen. Eine Anordnung von Einlass und Auslass auf derselben Seite ist ebenso vorteilhaft dadurch, dass diese Seite innerhalb des Systems während des Befüllens, des Zyklus und der Messung nach oben gerichtet befindet. Durch diese Anordnung können Luftblasen, die gelegentlich in dem Hohlraum verbleiben, oder die während der Erwärmung der Kassette erzeugt werden, durch die Einlass- oder die Auslassöffnung entfernt werden. 1 zeigt ebenfalls eine vorteilhafte Form des Hohlraums neben dem Einlass und dem Auslass. Wie ersichtlich, bilden die Wände (7, 7', 7'', 7''') einen Winkel mit dem Einlass und dem Auslass von ungefähr 130°. Ein bevorzugter Bereich dieses Winkels ist 100°–150°, der gezeigt hat, dass er leere Stellen verhindert, wenn der Hohlraum mit Flüssigkeit gefüllt wird. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die in 1 gesehen werden kann, sind die schrägen Fenster (4, 4'). Licht wird in den Hohlraum senkrecht zu den Oberflächen (8, 8') des Hohlraums eingestrahlt, und wird durch den schematisch gezeigten Detektor (20) detektiert. Das einstrahlende Licht wird durch die schrägen Oberflächen (4, 4') in einer Richtung zum Detektor hin gebrochen. Aufgrund dieser Anordnung kann die Erzeugung des fluoreszierenden Lichtes auf einen zentralen Teil dieses Hohlraums gelenkt werden, der näher am Detektor ist, um die Messempfindlichkeit zu steigern.
Die 2 zeigt eine schematische Zeichnung einer Kassette in Kombination mit Lichtquellen (30, 30', 30'', 30''') und einem Detektor (20). Wie ersichtlich ist der Brennpunkt der Lichtquellen in dem Zentrum des Hohlraums angeordnet, und die Brennpunkte sind zum größten Teil zusammenfallend. Der Detektor (20) ist unterhalb des Detektionsfensters der Kassette angeordnet, um fluoreszierendes Licht aus dem Zentrum des Hohlraums zu detektieren. Im Aufbau von 2 ist es möglich, die Fluoreszenz von vier verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen zu überwachen. Jede der Lichtquellen ist ausgewählt, um spezifische einen der fluoreszierenden Farbstoffe zu stimulieren. Durch die nachfolgende Aktivierung der Lichtquellen kann die Menge von jedem fluoreszierenden Farbstoff durch Detektieren der Fluoreszenzstrahlung mit dem Detektor überwacht werden.
3 zeigt ein Lichtquellenmodul, das vorteilhafterweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Das Lichtquellenmodul umfasst eine Halbleiterlichtquelle (31), ein Wellenlängenselektionsfilter (32) und ein Überwachungsgerät (33) für die optische Ausgangsleistung. Das Überwachungsgerät für die optische Ausgangsleistung umfasst einen Strahlenteiler (33a), um einen Teil des Lichts aus dem Lichtweg zu extrahieren, und einen Detektor (33b), um das extrahierte Licht zu detektieren. Die Menge des detektierten Lichtes wird zur Steuerung des an die Halbleiterlichtquelle angelegten Stroms verwendet, um eine konstante und spezifische Ausgabe zu erzeugen. Das Lichtquellenmodul aus 3 umfasst weiterhin einen Strahlformer (34) in Form einer Linse. Vorteühafterweise wird die Licht emittierende Oberfläche der Halbleiterlichtquelle durch die Linse in das Zentrum der Kassette abgebildet.
4 zeigt ein Raytrace eines Systems, das eine Kassette mit einem schrägen Fenster einsetzt. Wie ersichtlich, wird das von der Lichtquelle (30) erzeugte Licht durch eine kugelförmige Linse (35) auf ein schräges Fenster (4) der Kassette abgebildet. Aufgrund dieser Anordnung wird das licht in Richtung des Detektors (20) gebrochen.
5 zeigt ein Fluoreszenz-Zeit-Diagramm, das mit dem System gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen wurde. Die Abszisse zeigt die Anzahl der Messung und die Ordinate zeigt die Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten. Messungen wurden nach jedem Denaturierungs-Elongationszyklus der Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Eine wie in 1 und 6 gezeigte Kassette (1) wurde eingeführt und in einem Halter fixiert, wie in 6 gezeigt. Der Halter mit der Kassette war in einer Thermozykler-Einheit integriert worden. Beleuchtungsoptiken mit einfachen Strahlformungsoptiken wurden für quantitative Fluoreszenzmessung verwendet. PCR-Läufe (HCV-Kontrolle mit Mastermix, 5 × 10³ Anfangskopien) mit dem folgenden Protokoll wurden dann durchgeführt. 120 Zyklen, Denaturierungstemperatur T_denat = 94°C, Annealingtemperatur T_anneal = 60°C, Temperaturrampenzeit t_ramp ca. 20 s, Temperatur Plateau t_plateau ca. 26 s, Gesamtprozessdauer t_tot ca. 3 h. Das experimentell gemessene Fluoreszenzsignal über die Anzahl der Messungen ist in 5 aufgetragen (durchgängige Linie). Zum Vergleich wurde das Fluoreszenzsignal einer Amplifikation in einem Gefäß mit demselben PCR-Protokoll gemessen. Das Ergebnis wird ebenfalls in 5 gezeigt (gepunktete Linie). Das verminderte Fluoreszenzsignal der Kassette (ungefähr Faktor 2) ist ein Ergebnis der Strahl formenden Optik, die für die Messung verwendet wurden. Diese Optik führt einen Beleuchtungsleistungsverlust von ungefähr 30% ein.
6 zeigt eine Kassette der vorliegenden Erfindung in dem Hohlraum eines Metallblocks zum Durchführen von Thermozyklen. Innerhalb des Metallblocks gibt es integrierte Lichtquellen und einen Lichtdetektor. Zum Durchführen von Thermozyklen kann der Verschluss (41) auf den Metallblock (40) geschraubt werden, um so einen optimalen thermischen Kontakt zwischen der Kassette und dem Metallblock zu erreichen. Der Metallblock selbst ist mit Pettier-Elementen zum Erhitzen und Abkühlen versehen.
7 zeigt ein vorteilhaftes System gemäß der vorliegenden Erfindung. Die gezeigte Kassette ist eine keilförmige Ausführungsform, die eine größere Dicke auf der Seite des Einlasses und Auslasses aufweist. Das System ist mit einer keilförmigen Aufnahmeeinheit versehen, die Pettier-Elemente (40') umfasst, die einen Winkel zueinander bilden, um die keilförmige Kassette aufzunehmen. Mit dieser Ausführungsform ist es möglich, einen intensiven thermischen Kontakt zwischen den Kassetten und der Heizeinheit zu erreichen, indem einfach die Kassette zwischen die Pettier-Elemente (40') eingesetzt wird. Dieser Kassettenaufbau zeigt dass der optische Weg und der Weg zum Wärmeaustausch räumlich getrennt sind, so dass die Detektion und die Wärmeübertragung sich den Platz nicht streitig machen.
8 zeigt die Befüllung der Kassette aus 1 mit Flüssigkeit. Flüssigkeit wird durch den Einlass (10) eingefüllt und füllt den Kassettenbereich, der direkt neben dem Einlass liegt (Bild a). Die weitere Einführung von Flüssigkeit vergrößert den gefüllten Bereich, wie in den 8b) und c) zu sehen ist. Dieser Durchflussbefüllungsprozess stellt eine blasenfreie Befüllung der Kassette bereit.

Claims

Kassette zur Durchführung von Thermozyklen von Flüssigkeiten, umfassend a. eine im Wesentlichen flache und Wärme leitende Wand, b. eine für Licht transparente Wand, die im Wesentlichen vertikal zur genannten Wärme leitenden Wand angeordnet ist, c. ein Einlasskanal (10) zur Versorgung der Kassette mit Flüssigkeit d. ein Auslasskanal (11) für den Abfluss von Flüssigkeit oder Gas aus der Kassette e. einen Hohlraum, der den Einlasskanal und den Auslasskanal verbindet – wobei der genannte Hohlraum durch einen Vorsprung (5) in der Form einer Nase, der in den genannten Hohlraum zwischen dem Einlasskanal (10) und dem Auslasskanal (11) reicht, so angepasst ist, dass die Länge L des Hohlraums zwischen dem genannten Einlasskanal (10) und dem genannten Auslasskanal (11) größer ist, als der kürzeste geometrische Abstand D zwischen Einlasskanal (10) und Auslasskanal (11), – wobei die Wände (7, 7', 7'', 7''') des genannten Hohlraums, die an den Einlasskanal (10) und den Auslasskanal angrenzen, einen Winkel von 100–150° mit dem Einlasskanal (10) und dem Auslasskanal (11) bilden, und – wobei der genannte Hohlraum eine maximale Breite D_L,max und eine Tiefe D_V aufweist, wobei der Quotient aus D_L,max und D_V im Bereich 1 bis 10 liegt.
Kassette gemäß Anspruch 1, mit zwei gegenüberliegenden, Wärme leitenden Wänden.
Kassette gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Wärme leitende Wand eine Folie mit einer Dicke von weniger als 200 μm ist.
Kassette gemäß Anspruch 1 oder 2, mit zwei gegenüberliegenden Wänden, von denen wenigstens eine eine Wärme leitende Wand ist und die einen Winkel von 3 bis 8° zueinander einnehmen.
Kassette gemäß Anspruch 1, wobei die für Licht transparente Wand einen ersten Abschnitt für das Übertragen von Licht in die Kassette und einen zweiten Abschnitt für das Übertragen von aus der Kassette austretendem Licht aufweist.
Kassette gemäß Anspruch 1, die aus einem Körper mit wenigstens einer Öffnung, die durch eine Wärme leitende Folie verschlossen ist, hergestellt ist.
Kassette gemäß Anspruch 1, die aus einem Rahmen, der mit zwei gegenüberliegenden Folien verschlossen ist, hergestellt ist.
Kassette gemäß Anspruch 1 mit einer Dicke von 0,5 bis 5 mm.
Kassette gemäß Anspruch 8, wobei die Tiefe D_V (vertikaler Durchmesser) des Hohlraums im Bereich 0,5 bis 5 mm liegt.
System zur Durchführung von Thermozyklen von Flüssigkeiten in Patronen, umfassend: a. eine Kassette gemäß Anspruch 1, b. eine Thermozykler-Einheit, die in thermischem Kontakt mit der genannten, Wärme leitenden Wand der genannten Kassette (1) steht, c. eine Lichtquelle (30) für die Übertragung von Licht durch die genannte für Licht transparente Wand der Kassette in das Innere der genannten Kassette, wobei die genannte transparente Wand im Wesentlichen rechtwinklig zur genannten, Wärme leitenden Wand angeordnet ist, d. einen Lichtdetektor (20) zur Detektion von Licht, das aus dem Innern der Kassette durch die genannte, zweite Wand austritt, e. eine Flüssigkeit bereitstellende Einheit, die mit einem Einlasskanal der Patrone verbunden ist, um die Kassette mit Flüssigkeit durch Durchflussbefüllung zu versorgen.
System gemäß Anspruch 10, wobei die Kassette einen Körper hat, der die für Licht transparente Wand umfasst und der wenigstens eine Öffnung aufweist, die mit einer Folie versiegelt ist, die die genannte, Wärme leitende Wand bereitstellt.
System gemäß Anspruch 11, wobei der Körper ein Rahmen ist, der mit zwei Folien, die die Wärme leitenden Wände bereitstellen, versiegelt ist.
System gemäß Anspruch 10 für die Durchführung von Fluoreszenzmessungen, wobei der Lichtdetektor aus der Kassette austretendes Fluoreszenzlicht detektiert.
System gemäß Anspruch 10, wobei die Thermozykler-Einheit wenigstens eine Platte (40) aufweist, die in thermischem Kontakt mit der Wärme leitenden Wand der Kassette steht.
System gemäß Anspruch 10, wobei die Kassette keilförmig ist und wobei die Thermozykler-Einheit einen keilförmigen Aufnahmebereich zur Aufnahme der genannten, keilförmigen Patrone aufweist.
System gemäß Anspruch 15, wobei die gegenüberstehenden Wände, die die keilförmige Kassette bilden, Wände mit einem Winkel von 3 bis 8° von einer zu anderen aufweisen.
System gemäß Anspruch 10, wobei die genannte für Licht transparente Wand einen ersten Abschnitt, den Licht von der Lichtquelle in die Kassette passiert, und einen zweiten Abschnitt, den Licht vom Innern der Kassette auf den Lichtdetektor passiert, aufweist.
System gemäß Anspruch 17, wobei der genannte erste Abschnitt bezüglich der Beleuchtungsstrahlachse geneigt ist, so dass das Licht in Richtung des zweiten Abschnitts der genannten transparenten Wand gebrochen wird.
System gemäß Anspruch 10 oder 14, wobei die genannte Thermozykler-Einheit eine Platte (40) aufweist, die in thermischem Kontakt mit der genannten, Wärme leitenden Wand der Kassette steht und welche Druck auf die genannte Wand ausübt.
System gemäß Anspruch 10 oder 19, wobei die Tiefe D_V (vertikaler Durchmesser) des Hohlraums im Bereich 0,5 bis 5 mm liegt.
Verfahren zur Durchführung von Thermozyklen von Flüssigkeiten, welches ein System gemäß Anspruch 10 anwendet, mit den Schritten: – Befüllen der Kassette in einem Durchflussvorgang bei Vermeidung von Blasen in einem Messbereich der Kassette, – Durchführung von Thermozyklen der Flüssigkeit in der Kassette – Senden von Licht in die Kassette – Detektieren von Licht, das aus der Kassette austritt.
Verfahren gemäß Anspruch 21, bei dem zusätzlich das Licht, das aus der Kassette austritt, überwacht wird, um die Amplifikation von Nukleinsäuren in der Flüssigkeit während der Durchführung von Thermozyklen zu überwachen.