ES2248121T3 - Sistema para termociclacion de fluidos en cartuchos. - Google Patents
Sistema para termociclacion de fluidos en cartuchos.Info
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Abstract
Un cartucho para dirigir la ciclación térmica de fluidos, que comprende a) una pared sustancialmente plana y conductora del calor, b) una pared transparente a la luz que está dispuesta sustancialmente vertical a dicha pared conductora de calor c) un canal de entrada (10) para proporcionar al cartucho de fluido d) un canal de salida (11) para dejar escapar el fluido o gas del cartucho e) una cavidad que conecta el canal de entrada y el canal de salida - en donde dicha cavidad se adapta por una protusión (5) en forma de nariz proyectada hacia dicha cavidad entre el canal de entrada (10) y el canal de salida (11) de manera que la longitud L de la cavidad entre dicho canal de entrada (10) y dicho canal de salida (11) es mayor que la distancia D geométrica entre el canal de entrada (10) y el canal de salida (11). - en donde las paredes (7, 7¿, 7¿¿, 7¿¿¿) de dicha cavidad adyacente al canal de entrada (10) y el canal de salida forman un canal de 100-150ºC con el canal de entrada (10) y el canal de salida (11), y - en donde dicha cavidad tiene una amplitud máxima DL, max y un profundidad Dv en donde el cociente de DL, max y Dv está en el rango de 1 a 10.
Description
Sistema para termociclación de fluidos en
cartuchos.
Esta invención está dirigida a un sistema para
termociclación de fluidos en cartuchos para conseguir una
amplificación y detección de secuencias de ácido nucleico. Un
aspecto específico de la presente invención es que la amplificación
y la monitorización del proceso de amplificación pueden realizarse
simultáneamente sin cambiar la posición del cartucho. Otro aspecto
de esta invención es el llenado completo y sin burbujas de los
cartuchos con fluidos para termociclar. La monitorización del
proceso de amplificación puede utilizarse para cuantificar la
concentración inicial de un ácido nucleico diana.
Un aparato para realizar amplificaciones de ácido
nucleico en cartuchos de reacción es conocido a partir de la Patente
Estadounidense 5.567.617. Esta patente se refiere a una invención
para la amplificación de ácido nucleico en una cubeta flexible. Para
la amplificación esta cubeta se coloca en un calentador con un
elemento fino de calentamiento con una ventana central que
proporciona un pasadizo óptico. Tal realización posee el
inconveniente que el calentamiento y la detección compiten por el
espacio libre en la dirección lateral de la cubeta de reacción. Otro
problema del sistema usado en la Patente Estadounidense 5.567.617 es
la naturaleza flexible de la cubeta con sus canales de fluido. Deben
tomarse medidas para asegurar que la comunicación de fluidos dentro
de la cubeta, no esté obstruida cuando la cubeta se sitúe en el
calentador.
La presente invención está dirigida a un sistema
de termociclación similar al sistema descrito en la Patente
Estadounidense 5.567.617 pero con la ventaja añadida que la
eficiencia de calentamiento no está limitada por el espacio libre
necesario para la detección. Otra ventaja en comparación con la
Patente Estadounidense 5.567.617 es que la constricción de los
pasadizos de fluido en el cartucho no es crítica.
El documento WO 98/38487 describe un ensamblaje
con una manga térmica para controlar la temperatura dentro de una
cámara de fluido. El ensamblaje además comprende una óptica para
interrogar el contenido de la cámara mientras ésta está situada en
la manga térmica.
La cámara presentada no obstante está diseñada
para recibir fluido mediante un puerto de fluidos situado en la
parte superior de la cámara que rellena desde abajo. Rellenar de
esta manera la cámara no es crítico si el diámetro interno es lo
suficientemente largo para permitir entrar el fluido sin producir
burbujas de aire. La reducción del diámetro, sin embargo, es
deseable reducirlo por la distancia interna entre las paredes
controladas por temperatura para permitir la suficiente tasa de
calentamiento y enfriamiento del fluido.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un sistema para la termociclación rápida de fluidos en
cartuchos con monitorización óptica en línea. Una meta particular es
alcanzar tasas de calentamiento y enfriamiento mientras se evita el
estorbo de las medidas ópticas mediante burbujas contenidas en el
fluido.
Esta meta se alcanza mediante un sistema con una
unidad termocicladora, una fuente luminosa, un detector de luz, una
unidad abastecedora de fluidos, y un cartucho como se define en la
reivindicación 1 en que la termociclación así como la detección
pueden realizarse mientras el cartucho permanece sin cambios en su
posición. Tal sistema permite la termociclación con monitorización
óptica en línea. La monitorización en línea indica monitorización
óptica mientras el ciclo de temperaturas se está realizando. Además
el cartucho posee un diámetro interno suficientemente pequeño entre
las paredes controladas por temperatura para permitir un mejor
control de temperatura del fluido en el cartucho. El llenado del
cartucho se realiza preferentemente mediante un proceso de
flujo.
El cartucho de la presente invención posee la
forma de una placa delgada. Las dos paredes largas opuestas se usan
para transferir el calor y una o dos paredes más sustancialmente
verticales a las otras se utilizan para transmitir luz que se
detectará fuera del cartucho. Este diseño del cartucho asegura que
la ruta óptica y la ruta para el intercambio de calor están
separados espacialmente para que la detección y la transferencia de
calor no compitan por el espacio. El grosor del cartucho está
preferiblemente en el rango de 2,5 a 5 mm y el área de cada pared
para la transferencia de calor está preferiblemente en el rango de
0,1 a 4 cm^{2}. Tal cartucho puede estar hecho de un cuerpo con
una pared de fondo y paredes circundantes y el cuerpo cerrado
mediante una pared superior para formar un cartucho cerrado con una
cámara de reacción dentro. Una realización preferida del cartucho es
que éste tenga un marco que proporciona las paredes laterales del
cartucho y que está cerrado por una pared encima y otra debajo. Es
particularmente preferido que las paredes superior e inferior sean
hojas con un grosor inferior a 200 \mum. Un cartucho de acuerdo
con la presente invención puede tener un espesor uniforme pero es
preferido no obstante cuando las paredes superior e inferior
conductoras de calor forman un ángulo de 3 a 8 grados una respecto a
la otra. Tal cartucho en forma de cuña posee la ventaja que
proporciona una transferencia de calor eficiente y fácil manejo
cuando se usa en conexión con una unidad termocicladora con una
sección receptora de esta forma en cuña.
Los cartuchos de la presente invención pueden
estar hechos de plástico transparente. Preferiblemente un marco con
forma anular con un espesor de pared de 0,3 - 4 mm se proporciona
para formar las paredes laterales del cartucho. El marco puede estar
hecho por ejemplo por moldeado por inyección de polímeros como
polietileno o polipropileno. El marco está cerrado por hojas
formando las paredes superior e inferior mediante sellado térmico.
Los procesos para sellar una hoja de polímero en tal marco son bien
conocidos en el campo y por lo tanto no serán discutidos en detalle.
Los procesos de sellado térmico están pej, descritos en Polymere
Werkstoffe: 3er volumen, Editor: Hans Batzer. \hbox{Stuttgart;}
New York: Thieme. Bd.2. Technologie 1, 1984, páginas
206-212; Kunstsoffverarbeitung; Editor: Otto
Schwartz et al.; 4ª edición revisada Würzburg: Vogel, 1988,
páginas 193-206 y Kunstsoff-folien:
Herstellung, Eigenschaften, Anwendung; Editor: Joachim Nentwig.
München, Wien: hanser, 1994, páginas 88-93. Hojas
metalizadas multicapa también pueden emplearse para sellar en el
marco.
Quedará claro a continuación, en referencia al
proceso de llenado, el cartucho se hará de materiales con alta
tensión superficial o la tensión superficial de las paredes internas
puede ser potenciada. Tal potenciamiento de la tensión superficial
puede realizarse mediante el tratamiento adecuado de cubrimiento con
óxido o plasma. El valor limitante de la tensión superficial
permitiendo el llenado libre de burbujas, no obstante, depende de la
tensión superficial del fluido.
Tal como se menciona es ventajoso emplear
cartuchos con un diámetro interno pequeño entre las paredes
controladas por calor del cartucho. Se ha visto que un diámetro
inferior a 5mm aproximadamente permite un control de temperatura
exacto y así tasas altas de enfriamiento y calentamiento.
Deberá saberse que el interior del cartucho puede
tener canales de fluido, así como protusiones y recovecos. Además el
lenguaje utilizado "cartucho cerrado" no excluye canales de
fluido cruzando las paredes del cartucho que se usan para llevar
fluidos dentro y fuera del cartucho.
La unidad termocicladora de la presente invención
comprende una sección calentadora para establecer un contacto
térmico con las paredes conductoras de calor del cartucho. La
sección calentadora preferiblemente comprende al menos una placa que
se pone en contacto de forma mecánica con la pared conductora de
calor del cartucho y la placa en sí calentada y enfriada cuando sea
necesario por el proceso de termociclación. Este calentamiento y
enfriamiento puede realizarse pej. mediante elementos Peltier,
poniendo en contacto la placa con fluidos fríos y calientes o
calentando con un calentador reostato y enfriando mediante bombeo de
aire en la placa. Los procedimientos y aparatos para realizar la
termociclación mediante contacto térmico con placas son bien
conocidos en el campo.
Se entenderá, no obstante, que otros dispositivos
para calentar y enfriar los cartuchos puede utilizarse sin salir del
alcance de la invención. Sólo es necesario que cualquier dispositivo
utilizado para calentar y enfriar los cartuchos, sea capaz de
alcanzar y mantener las temperaturas involucradas y alcanzar la
temperatura deseada según el perfil de tiempo. Así, para propósitos
de amplificación de ácido nucleico, tal dispositivo será capaz de
ciclar la temperatura de la reacción de amplificación entre la
temperatura desnaturalizante T_{1} (que puede estar en un rango de
alrededor de 80-105ºC y preferiblemente
90-100ºC) y una temperatura de hibridación/extensión
T_{2} (que puede estar en un rango de alrededor de
30-90ºC y preferiblemente 50-70ºC)
donde T_{1} >T_{2} como es sabido por los expertos en la
materia.
Para alcanzar un contacto térmico suficiente
entre el cartucho y la sección de calentamiento, se pueden
proporcionar medios que presionen una o dos placas contra el
cartucho. Tales medios están pej. descritos en US 5.567.617. En el
contexto de la presente invención, se prefiere no obstante emplear
una unidad calentadora con una sección receptora de un receptáculo
con forma de cuña. La sección receptora puede estar formada por dos
paredes que están inclinadas una respecto a la otra. Un cartucho con
forma de cuña puede situarse simplemente en tal sección receptora en
forma de cuña y se alcanza automáticamente suficiente contacto
térmico entre las paredes de la sección receptora y las paredes
conductoras de calor del cartucho mediante contacto mecánico en la
que las paredes respectivas vienen cuando el cartucho se para en la
sección receptora.
La unidad termocicladora comprende además una
unidad conductora que conduce el calentamiento y enfriamiento
oportuno de la sección calentadora. Tal unidad conductora se
describe en PE B 0 236 069 que se incorpora aquí por referencia. La
presente invención no necesita una unidad conductora diferente a la
descrita en PE B 0 236 069 pero los perfiles de tiempo y temperatura
y la cantidad de calor intercambiado con el cartucho debe adaptarse
a las necesidades específicas.
La presente invención involucra amplificación de
ácidos nucleicos y la detección, monitorización y cuantificación de
los productos de amplificación. Para facilitar el entendimiento de
la recogida de datos de la amplificación y el sistema de procesado
de la presente invención, deberá discutirse primero un resumen de
procesos de amplificación de ácidos nucleicos especialmente
adecuados para usar en conjunto con la invención.
Aquellos entendidos reconocerán que la presente
invención requiere amplificación de la forma dúplex del ácido
nucleico. Existen métodos bien conocidos para amplificar ácidos
nucleicos. Los medios para la amplificación no son críticos y esta
invención trabajará con cualquier método donde los dobletes de
ácidos nucleicos sean generados. Los diferentes métodos se revisan
en Bio/Technology 8:290-293, Abril 1990. Incluyen,
pero no se limitan a PCR, LCR, Q\beta y 3SR. Aunque Q\beta y 3SR
no incluyen termociclación, el resultado de sus amplificaciones
puede monitorizarse mediante la distribución de detección de
fluorescencia discutido a continuación y analizado de acuerdo con
los principios de la presente invención. Cada método se describe
brevemente a continuación.
La amplificación de DNA involucra los ciclos de
repetición de calentamiento para desnaturalizar el DNA, hibridando
dos cebadores polinucleótidos a secuencias que flanquean el segmento
de DNA a ser amplificado, y extendiendo los cebadores hibridados con
una polimerasa de DNA. Los cebadores hibridan con las cadenas
opuestas de la secuencia diana y están orientados de tal forma que
la síntesis de DNA por la polimerasa procede a través de las
regiones entre los cebadores, cada ciclo sucesivo esencialmente
dobla la cantidad de DNA sintetizado en el ciclo anterior. Esto
resulta en la acumulación exponencial del fragmento diana
específico, en una tasa aproximada de 2^{n} por ciclo, donde n es
el número de ciclos. Una revisión completa de esta tecnología puede
encontrarse en PCR Technology- Principles and Applications. Ed.
Erlich H.A. Stockton Press, New York 1989. La polimerasa Taq de DNA
es preferida cuando se usa la PCR junto con la presente invención
aunque este no es un aspecto esencial de la invención.
La reacción en cadena de la ligasa está descrita
en la Solicitud de Patente Internacional WO 89/09835. El proceso
implica el uso de una ligasa para unir segmentos de oligonucleótido
que hibridan con el ácido nucleico diana. La reacción en cadena de
la ligasa (LCR) resulta en la amplificación de una molécula diana
original y puede proporcionar millones de copias de producto de DNA.
Consecuentemente, la LCR resulta en un incremento neto en el DNA de
doble cadena. Los siguientes métodos de detección son aplicables al
LCR, así como a la PCR. La LCR normalmente requiere algunos medios
para detectar el producto de DNA como una sonda de oligonucleótido.
Cuando se utiliza en conjunto con los métodos descritos para la
detección de productos de amplificación, tales medios no son
necesarios, y el resultado de la LCR es inmediatamente
detectable.
Otro esquema de amplificación, replicasa
Q-beta, explota el uso de la replicasa del
bacteriófago de RNA Q\beta. En este esquema de amplificación, un
genoma de bacteriófago recombinante modificado con una secuencia
específica para la secuencia diana está inicialmente ligado al ácido
nucleico a ser probado. El posterior enriquecimiento de los dobletes
formados entre la sonda de bacteriófago y el ácido nucleico en una
muestra, se añade la replicasa Q\beta, que sobre el reconocimiento
del genoma recombinante retenido, comienza marcando un gran número
de copias. El sistema Q\beta no requiere secuencias cebadoras y no
hay paso de desnaturalización por calor a diferencia de los sistemas
de amplificación PCR y LCR. Se puede encontrar una revisión de este
sistema de amplificación en la Solicitud de Patente Internacional WO
87/06270 y en Lizardi et al., 1988 Bio/Technology 6:
1197-1202.
El sistema 3SR es una variación de un sistema de
amplificación basado en la transcripción in vitro. Un sistema
de amplificación basado en la transcripción (TAS) implica el uso de
cebadores que codifican una secuencia promotora así como una
secuencia complementaria a la cadena diana para generar copias de
DNA de una cadena diana y la producción de copias de RNA a partir de
las copias de DNA con una polimerasa de RNA. Ver pej. Ejemplo 9B de
la Patente Estadounidense No. 4.638.202 y la Solicitud de Patente
Europea EP-A-0310.229. El sistema
3SR es un sistema que utiliza tres enzimas para llevar a cabo una
replicación isotérmica de los ácidos nucleicos diana.
El sistema comienza con una diana de RNA de
cadena sencilla a la que se une un cebador de DNA del RNA de T7. Se
forma un cDNA mediante la extensión del cebador con la transcriptasa
inversa, y el tratamiento con RNAsaH libera el cDNA del
heterodúplex. Un segundo cebador se une al cDNA y se forma un cDNA
de doble cadena por tratamiento con transcriptasa inversa. Uno (o
los dos) cebadores codifica un promotor, pej. el promotor de la
polimerasa de RNA de T7, por lo que el cDNA de doble cadena es un
molde de transcripción para la polimerasa de RNA.
Los cDNAs competentes de transcripción
proporcionan copias antisentido de RNA de la diana original. Los
transcritos son convertidos entonces por la transcriptasa inversa a
cDNA de doble cadena que contiene promotores de doble cadena,
opcionalmente en ambos extremos en una orientación invertida
repetida. Estos DNAs pueden proporcionar RNAs, que pueden reentrar
en el ciclo. Una descripción más detallada del sistema 3SR puede
encontrarse en Guatelli et al., 1990, proc, Natl. Acad. Sci.
USA 87:1874-1878, y Solicitud de Patente Europea
EP-A-0 329 822.
De acuerdo con la presente invención, la
amplificación de ácidos nucleicos está monitorizada por la detección
de la fluorescencia emitida cuando una tinción fluorescente como una
tinción fluorescente intercalante, proporcionada en la mezcla de
reacción, se une con el ácido nucleico de doble cadena durante cada
fase de hibridación/extensión hasta que la mezcla se cicla entre dos
temperaturas (ciclo térmico). Un aumento de la fluorescencia indica
una amplificación positiva del ácido nucleico diana. Los agentes
intercalantes adecuados o tinciones incluyen, pero no se limitan a
bromuro de etidio, bromuro de propidio, proflavina, naranja de
acridina, acriflavina, fluorcumarina, elipticina, daunomicina,
cloroquina, distamicina D, cromomicina, homidio, mitramicina,
polipiridilos de rutenio, antramicina, bromuro de metidio,
trihidrocloruro de
2-[2-(4-hidroxifenil)-6-bencimidazol-6-(1-metil-4-piperazina)bencimidazol
y similares.
Fluoróforos y cromóforos de unión al DNA
descritos en el campo que son adecuados para el uso en el ensayo de
la nucleasa de 5' a 3' publicados en la Patente Estadounidense No.
5.210.015 también son útiles en la presente invención. Se escogen
tales fluoróforos y apantalladores adecuados del donador que el
espectro de emisión del fluoróforo donador se superpone con el
espectro de absorción del apantallador. Idealmente, los fluoróforos
deberían tener un desplazamiento de Stokes alto (una gran diferencia
entre la longitud de onda para la máxima absorción y la longitud de
onda para la máxima emisión) para minimizar la interferencia
mediante luz dispersa de excitación.
Marcadores adecuados que son bien conocidos en el
campo incluyen, pero no se limitan a, fluorosceina y derivados tales
como FAM, HEX, TET, y JOE; rodamina y derivados tales como rojo
Texas, ROX, y TAMRA; amarillo Lucifer, y derivados de coumarina
tales como
7-Me2N-cumarin-4-acetato,
7OH-4-CH_{3}cumarin-3-acetato
(AMCA). FAM, HEX, TET, JOE, ROX, y TAMRA son comercializados por
Perkin Elmer, Applied Biosystems Division (Foster City, CA).
TEX-as Red y otros compuestos adecuados son
comercializados por Molecular Probes (Eugene, OR). Ejemplos de
compuestos quimioluminiscentes y bioluminiscentes que pueden ser
adecuados para usarse como donadores de energía incluido luminol
(aminoftal-hidrazida) y derivados y Luciferasas.
La óptica de un sistema de acuerdo con la
presente invención comprende una fuente luminosa y un detector de
luz. Las medidas de dispersión pueden realizarse con la absorción
del sistema o con el fluido del cartucho. Sin embargo se prefiere
usar este sistema para medidas fluorescentes donde la luz se
transmite en el interior del cartucho para iniciar la emisión de la
fluorescencia que se detecta mediante el detector de luz. La fuente
luminosa puede comprender fuentes de luz
semi-conductoras así como lámparas de halógeno u
otras realizaciones. En el espíritu de la presente invención la luz
se transmite en el cartucho a través de una segunda pared
transparente de luz del cartucho que está sustancialmente
perpendicular a la pared para la transferencia de calor. Debido a la
forma plana del cartucho de la segunda pared transparente de luz
tiene una amplitud de solamente 0,5 a 5 mm en una dimensión. Por
esto se prefiere emplear una óptica en forma de haz que coopera con
la fuente luminosa para introducir luz a través de esta pequeña
ventana. Tal óptica en forma de haz puede incluir aperturas, lentes
y fibra óptica. Para las medidas de fluorescencia es necesario
estimular tinciones fluorescentes con luz de una longitud de onda
dentro del espectro de absorción de la tinción. Normalmente se desea
suprimir la radiación antecedente causada por emisión de luz de
otras fuentes que la de la tinción fluorescente. En varias
realizaciones es más deseable realizar medidas fluorescentes con dos
o más tinciones con el mismo volumen de reacción. En estos casos es
necesario restringir la amplitud de la banda de la luz para la
iluminación. Esto se puede hacer usando fuentes de luz que tienen
una amplitud de banda estrecha como por ejemplo la de LED o usando
fuentes de luz que tengan un amplitud de banda ancha en conexión con
filtros adecuados.
Un sistema de la presente invención comprende
además uno o más detectores de luz para detectar la luz emergente
del interior del cartucho a través de la segunda pared transparente
de luz. Detectores de luz adecuados son detectores semiconductores
como fotodiodos o fotomultiplicadores. Como se acaba de mencionar se
desea suprimir señales antecedentes y la detección de las mismas
debería estar limitada a la banda de emisión de la tinción
fluorescente para ser detectado. Esto se puede conseguir mediante
filtros de longitud de onda o por separación espectral de la luz con
un espectrofotómetro. En la presente invención se prefiere detectar
dos o más tinciones fluorescentes en el mismo cartucho por detección
separada de la radiación fluorescente emitida de los marcadores.
Ventajosamente los marcadores también son estimulados separadamente
con fuentes de luz adecuadas.
El detector de luz de la presente invención puede
cooperar con las maneras de dirigir la luz como fibra óptica,
sistemas de lentes y más.
El cartucho de la presente invención se usa como
una cavidad de termociclación para fluidos y en consecuencia tiene
una entrada para proporcionar fluido al cartucho. El cartucho tiene
una salida para vaciar el fluido del cartucho. Sin embargo, se
prefiere en algunos modos de uso tener un cartucho desechable. Este
cartucho puede deshacerse junto con su contenido después de usarse.
La entrada y la salida son preferiblemente canales a través del
cuerpo o a través del marco del cartucho. Como ya se ha mencionado
el cuerpo o el marco mayormente están hechos incompresibles de
manera que los canales de los fluidos no se obstruyen cuando la
presión se aplica al cartucho con el fin de conseguir un contacto
térmico con la unidad calentadora. Un sistema de acuerdo con la
presente invención comprende una unidad que proporciona fluido
acoplada al interior del cartucho. Tal unidad que proporciona fluido
debe ser una unidad pipeteadora o un canal interno de fluido del
sistema desde el cual se presiona al fluido para entrar en el
cartucho. El sistema opcionalmente comprende una unidad receptora de
fluido que está acoplada mediante una salida del cartucho para
recibir fluido de éste. Tal unidad receptora de fluido es necesaria
si el cartucho tiene que ser vaciado o si diferentes fluidos deben
ser procesados dentro del mismo cartucho. En realizaciones
preferidas el cartucho sin embargo se deshecha junto con el fluido
después de un solo uso. Tales realizaciones no necesitan una unidad
receptora de fluido sino una salida para que salga el gas cuando el
cartucho se llene con fluido.
Los cartuchos de acuerdo con la presente
invención preferiblemente se llenan por el llamado llenado por
flujo. Llenar por flujo significa que el fluido se introduce por una
entrada y llena el espacio interior del cartucho directamente
adyacente a la entrada. La introducción de más líquido de forma
continuada aumenta el espacio llenado hasta que se consigue el grado
deseado de llenado. En este proceso el bolo fluido nunca se libera
desde la entrada durante el llenado como es el caso para el llenado
de arriba a abajo como se describe en WO 98/38487. Para permitir el
proceso de llenado por flujo la geometría de la entrada del
cartucho, respectivamente el canal que conecta la entrada y la
salida es importante. Para termociclar en cartuchos se desea tener
un gran área de contacto del fluido con las paredes térmicamente
controladas. La dimensión del canal que controla el área de contacto
se denotará D_{L} (diámetro lateral) y la distancia interna entre
las paredes termalmente controladas D_{v} (diámetro vertical).
Cuánto más alto sea el cociente D_{L}/D_{v} más eficiente es el
control de calor así como el riesgo que durante el llenado aparezcan
burbujas. Se ha mostrado que los cocientes óptimos D_{L}/D_{v}
están en el rango de 1 a 10.
Teniendo presente que el riesgo de formación de
burbujas incrementa con el incremento del diámetro lateral el
cociente debería ser calculado empleando el diámetro vertical más
largo (D_{v, \ máx.}) del canal, en donde el diámetro se mide
verticalmente en la dirección del flujo.
Otros factores como la tensión superficial (de
pared y fluido), viscosidad del fluido, fuerzas de capilaridad e
índice de llenado también influirán en el proceso de llenado. Dicho
canal de fluidos, sin embargo no tiene necesariamente una única
forma en cada sección. Se ha mostrado la ventaja de emplear un canal
curvado de manera que la longitud L del canal sea más larga que la
distancia geométrica D entre la entrada y la salida. Tal diseño
puede ser eficientemente generado por una protusión que se proyecta
hacia el interior del cartucho como se muestra en la figura 1.
El cartucho también puede tener un espacio para
recibir gases que se liberan durante el calentamiento del fluido.
Este espacio queda en una sección del cartucho que no hace
interferencia con la medida óptica.
\newpage
La presente invención además se describe con más
detalle en consideración con las siguientes figuras:
Figura 1: Vista superior del cartucho
parcialmente lleno con fluido.
Fluido 2: Vista superior del cartucho con fuentes
luminosas y detector.
Figura 3: Módulo de fuente luminosa
Figura 4: Diagrama del trazado del rayo con
cartucho con una ventana oblicua.
Figura 5: Señal de fluorescencia durante la
termociclación.
Figura 6: Sistema para termociclación en un
cartucho con un termociclador de bloque metálico, que integra
fuentes luminosas y detector de luz.
Figura 7: Sistema para termociclar con el
cartucho en forma de cuña.
Figura 8: Proceso de llenado de cartucho mostrado
en la figura 1.
La figura 1 muestra la vista superior de un
cartucho (1) para la termociclación de fluidos. El cartucho tiene un
cuerpo (3) con una cavidad (2) interior. El cuerpo del cartucho se
ha fundido a partir de un bloque sólido de polipropileno. En la
región de la cavidad se eliminó material hasta que se consigue una
superficie de celda de 200 \mum de grosor. (en la producción en
serie del cartucho se puede producir más eficientemente por
inyección en molde.) En el bloque de polipropileno también se ha
fundido una entrada (10) para recibir fluido y una salida (11) para
ventilar el aire de la cavidad durante el llenado. El cuerpo del
cartucho mostrado en la figura 1 se ha cerrado soldando una hoja
precintada de 40 \mum de espesor sobre el cuerpo del cartucho. La
Figura 1 muestra una forma referida de la cavidad (2) con una
protusión (5) en forma de nariz dirigida hacia la cavidad. La
protusión (5) asegura que la cavidad puede ser llenada completamente
con fluido sin incluir burbujas de aire.
La protusión modifica la geometría del cartucho
de tal manera que el diámetro D_{L \ máx}. se reduce así como el
cociente D_{L \ máx}/D_{V} (D_{V} es la distancia entre las
paredes de calor controlada; esto es, el espesor del fluido en el
cartucho). En el montaje experimental mostrado D_{L \ máx} fue 4.0
mm y D_{V} fue 1.5 mm resultando en un cociente de 2.7.
El tamaño de protusión (5) tiene que estar
adaptado a esta situación específica y depende del espesor de la
cavidad, viscosidad del líquido, tensión superficial de la pared
superior e inferior del cartucho así como el tamaño y la forma de la
cavidad. Se ha encontrado que el efecto de la protusión es evitar un
atajo fluídico entre la entrada y la salida. En este espíritu la
protusión dirige el fluido en una ruta (L) que es más larga que la
distancia más corta (D) entre la entrada y la salida. En la Figura 1
se han mostrado muchas rutas del fluido mediante líneas punteadas.
Se ha encontrado que es ventajoso que el cociente de la L más corta
dividida por D sea dos o más. La Figura 1 además muestra una
realización preferida con respecto a la localización de la entrada y
la salida en el mismo lateral del cartucho. Con esta distribución es
posible localizar conexiones de fluido en el mismo lateral del
cartucho y conectarse a un aparato más sencillo. Un dispositivo de
entrada y salida en el mismo lateral también es ventajoso en que
este lateral puede ser localizado al revés en el sistema durante el
proceso de llenado, ciclación y medida. Mediante esta distribución
las burbujas de aire restantes ocasionalmente en la cavidad o que
son creadas durante el calentamiento del cartucho pueden ser
eliminadas a través del puerto de entrada o de salida. La figura 1
también muestra una forma ventajosa de la entrada y la salida de la
cavidad adyacente. Como se puede ver, las paredes (7, 7', 7'', 7''')
forman un ángulo entre la entrada y la salida de aproximadamente
130º. Un rango preferido de este ángulo es 100-150º
que se ha mostrado para evitar lugares vacíos cuando la cavidad se
llena con fluido. Un aspecto más de la presente invención que puede
estar en la Figura 1 son las ventanas oblicuas (4, 4'). La luz se
irradia en la cavidad perpendicular a las superficies (8, 8') de la
cavidad y se detecta mediante el detector mostrado esquemáticamente
(20). La luz irradiante está siendo refractada por las superficies
oblicuas (4, 4') en dirección hacia el detector. Debido a esta
distribución la generación de luz fluorescente puede estar dirigida
a una porción central de la cavidad que está cerca del detector con
el fin de incrementar la sensibilidad de la medida.
La Figura 2 muestra una ilustración esquemática
de un cartucho en combinación con fuentes luminosas (30, 30', 30'',
30''') y un detector (20). Como se puede ver el punto focal de las
fuentes luminosas se disponen en el centro de la cavidad y los
puntos focales son mayormente coincidentes. El detector (20) se
dispone bajo la ventana de detección del cartucho para detectar la
luz fluorescente del centro de la cavidad. Con el montaje de la
Figura 2 es posible monitorizar la fluorescencia de cuatro tinciones
fluorescentes diferentes. Cada una de las fuentes luminosas se
escoge para estimular específicamente una de las tinciones
fluorescentes. Para la subsiguiente activación de las fuentes
luminosas la cantidad de cada tinción fluorescente puede ser
monitorizada por detección de radiación fluorescente con el
detector.
La Figura 3 muestra un módulo de fuente luminosa
que puede ser ventajosamente usado con la presente invención. El
módulo de la fuente luminosa comprende una fuente luminosa
semiconductora (31), un filtro de selección de longitud de onda (32)
y un monitor óptico de salida de potencia (33). El monitor de salida
de potencia comprende un divisor de rayos (33a) para extraer una
porción de la luz a partir de la ruta de luz y un detector (33b)
para detectar la luz extraída. La cantidad de luz detectada se usa
para llevar la corriente aplicada a la fuente luminosa
semiconductora para generar una salida constante y específica. El
módulo de la fuente luminosa de la figura 3 además comprende un
moldeador de rayos (34) en forma de una lente. Ventajosamente la
superficie emisora de luz de la fuente semiconductora de luz se
refleja por las lentes hacia el centro del cartucho.
La Figura 4 muestra un trazado de rayo de un
sistema que emplea un cartucho con una ventana oblicua. Como se
puede ver la luz generada por la fuente luminosa (30) se refleja por
una lente en forma de pelota (35) sobre una ventana oblicua (4) del
cartucho. Debido a este alineamiento la luz se refracta en dirección
del detector (20).
La Figura 5 representa un diagrama de
fluorescencia frente al tiempo que se midió con el sistema de
acuerdo con la presente invención. La abscisa muestra el número de
la medida y la ordenada muestra la intensidad de fluorescencia en
unidades arbitrarias. Las medidas se realizaron después de cada
desnaturalización, ciclo de elongación de la reacción en cadena de
la polimerasa. Un cartucho (1) como se muestra en las Figuras 1 y 6
se han introducido y fijado en un recipiente como se muestra en la
Figura 6. El soporte con el cartucho se ha integrado en una unidad
termocicladora. La óptica de iluminación óptica formadora de rayo
único y la óptica de detección han sido utilizadas para la medida
cuantitativa de fluorescencia. Luego se ha realizado la PCR (control
HCV con Mastermix, 5 x 10^{3} copias iniciales) con el siguiente
protocolo: 120 ciclos, temperatura de desnaturalización T_{denat}
= 94ºC, temperatura de hibridación T_{anneal} = 60ºC, tiempo de
conexión de temperatura t_{ramp} aproximadamente 20s, meseta de
temperatura t_{plateau} aprox. 26s, tiempo total del proceso
t_{tot} aprox. 3 h. La señal de fluorescencia medida
experimentalmente vs. el número de medidas se representa en la Fig.
5 (línea sólida). Para comparar, la señal de fluorescencia de una
amplificación en un recipiente se ha medido con el mismo protocolo
de PCR. El resultado también se muestra en la Fig. 5 (línea
punteada). La señal de fluorescencia disminuida del cartucho (aprox.
Factor 2) es un resultado de la óptica formadora de rayos usada para
la medida. Esta óptica introduce una pérdida de potencia de
iluminación aproximadamente del 30%.
La Figura 6 muestra un cartucho de la presente
invención en la cavidad de un bloque metálico para termociclar.
Dentro del bloque metálico están integradas fuentes luminosas y un
detector de luz. Para termociclar el cierre (41) puede ser
atornillado en el bloque metálico (40) para conseguir un contacto
térmico óptimo entre el cartucho y el bloque metálico. El bloque
metálico por sí mismo se proporciona con elementos Peltier para
calentar y enfriar.
La Figura 7 muestra un sistema ventajoso de
acuerdo con la presente invención. El cartucho mostrado es una
realización en forma de cuña que presenta un gran espesor al lado de
la entrada y la salida. El sistema se proporciona con una unidad
receptora en forma de cuña que comprende elementos de Peltier (40')
formando un ángulo uno respecto al otro para recibir el cartucho en
forma de cuña. Con esta realización es posible conseguir un contacto
térmico intenso entre el cartucho y la unidad calentadora mediante
la inserción simple del cartucho entre los elementos Peltier (40').
Esta figura muestra que la ruta óptica y la ruta para el intercambio
de calor están espacialmente separadas para que la detección y la
transferencia de calor no compita por el espacio.
La Figura 8 muestra el llenado del cartucho de la
figura 1 con fluido. El fluido se introduce a través de la entrada
(10) y llena la región del cartucho directamente adyacente a la
entrada (dibujo a). La introducción de más fluido agranda la región
de llenado como se puede ver en las Figuras 8b) y c). Este proceso
de llenado por flujo proporciona un llenado libre de burbujas del
cartucho.
Claims (22)
1. Un cartucho para dirigir la ciclación térmica
de fluidos, que comprende
- a)
- una pared sustancialmente plana y conductora del calor,
- b)
- una pared transparente a la luz que está dispuesta sustancialmente ertical a dicha pared conductora de calor
- c)
- un canal de entrada (10) para proporcionar al cartucho de fluido
- d)
- un canal de salida (11) para dejar escapar el fluido o gas del cartucho
- e)
- una cavidad que conecta el canal de entrada y el canal de salida
- en donde dicha cavidad se adapta por una
protusión (5) en forma de nariz proyectada hacia dicha cavidad entre
el canal de entrada (10) y el canal de salida (11) de manera que la
longitud L de la cavidad entre dicho canal de entrada (10) y dicho
canal de salida (11) es mayor que la distancia D geométrica entre el
canal de entrada (10) y el canal de salida (11).
- en donde las paredes (7, 7', 7'', 7''') de
dicha cavidad adyacente al canal de entrada (10) y el canal de
salida forman un canal de 100-150ºC con el canal de
entrada (10) y el canal de salida (11), y
- en donde dicha cavidad tiene una amplitud
máxima D_{L, \ max} y un profundidad D_{v} en donde el cociente
de D_{L, \ max} y D_{v} está en el rango de 1 a 10.
2. El cartucho de acuerdo con la reivindicación
1, que tiene dos paredes conductoras de calor opuestas.
3. El cartucho de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, en donde la pared conductora de calor es una hoja con un
espesor de menos de 200 \mum.
4. El cartucho de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, que tiene dos paredes opuestas de las que al menos una es una
pared conductora de calor y que forman un ángulo de 3 a 8º con
respecto una a la otra.
5. El cartucho de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la pared transparente comprende una primera sección para
transmitir luz en el cartucho y una segunda sección para transmitir
la luz emergente desde el cartucho.
6. El cartucho de acuerdo con la reivindicación
1, que está hecho a partir de un cuerpo que tiene al menos una
obertura que está dosificada por una hoja conductora de calor.
7. El cartucho de acuerdo con la reivindicación
1, que está hecho a partir del marco que se cierra por dos hojas
opuestas.
8. El cartucho de acuerdo con la reivindicación 1
que tiene un espesor de 0,5 a 5 mm.
9. El cartucho de acuerdo con la reivindicación
8, en donde la profundidad D_{v} (diámetro vertical) de la cavidad
está en el rango de 0,5 a 5 mm.
10. El sistema para termociclar fluidos en
cartuchos que comprende
- a)
- un cartucho de acuerdo con la reivindicación 1,
- b)
- una unidad termocicladora en contacto térmico con dicha pared conductora de calor de dicho cartucho (1),
- c)
- una fuente luminosa (30) para transmitir la luz en el interior de dicho cartucho a través de dicha pared transparente de luz de dicho cartucho dicha pared transparente que se coloca sustancialmente perpendicular a dicha pared conductora de calor,
- d)
- un detector de luz (20) para detectar la luz emergente del interior del cartucho a través de la segunda pared,
- e)
- un fluido que proporciona una unidad acoplada a un canal de entrada del cartucho para proporcionar el cartucho con fluido por llenado mediante fluido.
11. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10, en donde el cartucho tiene un cuerpo que comprende la pared
transparente y que tiene al menos una obertura que está sellada por
una hoja que proporciona dicha pared conductora de calor.
\newpage
12. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
11, en donde el cuerpo es un marco que está sellado por dos hojas
que proporcionan las paredes conductoras de calor.
13. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10 para dirigir medidas de fluorescencia en donde el detector de luz
detecta la luz fluorescente que emerge del cartucho.
14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10, en donde la unidad termocicladora comprende al menos una placa
(40) en el contacto térmico con la pared conductora de calor del
cartucho.
15. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10, en donde el cartucho está en forma de cuña y la unidad
termocicladora que comprende una sección receptora en forma de cuña
para recibir dicho cartucho en forma de cuña.
16. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
15, en donde las paredes opuestas que forman el cartucho en forma de
cuña comprenden paredes que tienen un ángulo de 3 a 8º una respecto
a la otra.
17. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10, en donde dicha pared transparente comprende una primera sección
a través de la que la luz pasa a partir de la fuente luminosa en el
cartucho y una segunda sección a través de la que la luz pasa a
partir del interior del cartucho cobre el detector de luz.
18. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
17, en donde dicha primera sección se marca con respecto al eje del
rayo de luz de manera que la luz se refracta hacia la segunda
sección de dicha pared transparente.
19. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10 o 14, en donde dicha unidad termocicladora comprende una placa
(40) en contacto térmico con dicha pared conductora de calor del
cartucho y que ejerce presión sobre dicha pared.
20. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
10 o 19, en donde la profundidad D_{v} (diámetro vertical) de la
cavidad está en el rango de 0,5 a 5 mm.
21. Un método para termociclar fluidos empleando
un sistema de acuerdo con la reivindicación 10, con los pasos
- -
- llenar el cartucho por el proceso por flujo evitando burbujas en una sección de medida del cartucho.
- -
- ciclación térmica del fluido en el cartucho.
- -
- transmitir luz dentro del cartucho.
- -
- detectar luz que emerge el cartucho.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21
adicionalmente monitorizando la luz que emerge el cartucho para
controlar la amplificación de ácidos nucleicos durante la ciclación
térmica.
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