JPH03262499A - ポリヌクレオチド検出方法およびｐｃｒ反応装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の微量ポリヌクレオチドを
検出するポリヌクレオチド検出方法に関するものである
。より詳しくは、混合物中に僅かに存在する目的ポリヌ
クレオチドを、或いは長鎖ポリヌクレオチド中に存在す
る目的ポリヌクレオチドを、密閉系内で選択的に増幅し
検出する方法に関する。

また本発明は、このポリヌクレオチド検出方法に好適な
ＰＣＲ反応装置に関する。

（発明の背景） 近年、分子生物学の進歩により遺伝子レベルでの解析が
進み、血球や生体組織中のＤＮＡやＲＮＡなどのポリヌ
クレオチドを調べることによりウィルス感染の有無や、
感染症、ＡＩＤＳ、肝炎等のＤＮＡ診断や、遺伝子病等
の診断が行なわれようとしてきている。

例えばＡ、　Ｉ　Ｄ　Ｓ感染の場合、ＡＩＤＳウィルス
に対する抗体が増加しない潜伏期では、従来の抗体検出
による診断では感染の有無を判定できなかったが、感染
リンパ球中のＲＮＡ又はゲノム中に潜り込んだＤＮＡを
検出できれば、潜伏期であっても感染の有無を判定でき
る。

しかし、一般にＤＮＡやＲＮＡなとは生体試料中に極く
僅かにしか存在しないため、これらを増幅しないと検出
ができない。

このような微量ＤＮＡやＲＮＡを効率的に増幅する方法
として米国特許第４，６８３，２０２号に記載されてい
る、いわゆるＰ　ＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉ
ｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が知られている。この方法は、
目的ＤＮＡにプライマーを加えてＤＮＡポリメラーゼで
２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを解離させ、
得られた１本鎖ＤＮＡを鋳型にして再び２本鎖ＤＮＡを
合成する、というサイクルを繰返す。１サイクルでＤＮ
Ａ合成の鋳型が２倍になるから、以降サイクルごとに指
数関数的に目的ＤＮＡが増幅する。このときのプライマ
ーとして目的ＤＮＡの各相補鎖の５゛末端側と結合する
２つのオリゴヌクレオチドを用いるので、両プライマー
間で挟まれる領域のＤＮＡが選択的に増幅されるといつ
ちのである。２本鎖ＤＮＡは高温（約９０℃）で解離し
室温で再結合するという性質があるので、ＰＣＲ反応は
温度を高温にしたり低温にしたりすることを繰返すだけ
で連続的に短時間に行なうことができる。

しかし、増幅されたＤＮＡの検出は、反応溶液をゲル電
気泳動にかけたり、遠心などにより反応溶液からＤＮＡ
長鎖を得てそのＤＮＡ配列を解析することにより行なっ
ていた。このように、目的ＤＮＡの増幅が短時間ででき
ても、その後の解析に時間がかかり面倒であるという不
都合があった。またこのような検出方法は、ルーティン
化が要請される臨床診断で望まれるような自動化装置に
適しない。

また上記のＰＣＲ反応は、微量ＤＮＡを選択的に増幅す
るものであるため、反応操作中に外界から他の検体が混
入すると、誤って他の検体中のＤＮＡを増幅することに
なる。従って、このような混入がない反応系が望ましい
。

さらにまた、このようなＰＣＲ反応を効率よく行なうこ
とができる反応装置が望まれている。

（発明の目的） 本発明はこのような事情に鑑みなされたちのであり、微
量ポリヌクレオチドを容易かつ短時間に誤ることなく検
出でき、しかも自動化に適したポリヌクレオチドの検出
方法を提供することを第１の目的とする。

また本発明は、このポリヌクレオチド検出方法の実施に
適したＰＣＲ反応装置を提供することを第２の目的とす
る。

（発明の構成） このような本発明の第１の目的は、以下のステップより
なることを特徴とするポリヌクレオチド検出方法： （ａ）以下のものを含む反応混合物を密閉容器に入れる
ステップ： ■被検ポリヌクレオチド、 ■被検ポリヌクレオチドのそれぞれ異なる部位に結合可
能な２つのプライマー ■ｄＮＴＰ、 ■耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び ■沈降性担体と被検ポリヌクレオチドプローブとの結合
物、 （ｂｌ昇温による二重鎖ポリヌクレオチドの解離、降温
によるポリヌクレオチドとプライマーとの再結合及びポ
リヌクレオチド合成の各ステップを繰返すことにより被
検ポリヌクレオチドを増幅させるステップ、 （Ｃ）密閉容器内に沈降した前記沈降性担体と被検ポリ
ヌクレオチドプローブとの結合物に結合した被検ポリヌ
クレオチドＤＮＡを検出するステップ、 により達成される。

また本発明の第２の目的は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
存在下、目的ポリペプチド、プライマー及びｄＮＴＰを
含む反応液中で、目的ポリヌクレオチドを複製するＰＣ
Ｒ反応装置において、（ａ）２本鎖ポリヌクレオチドの
解離させる第１の恒温槽と、 （ｂ）一本鎖ポリヌクレオチドにプライマーを結合させ
る第２の恒温槽と、 （ｃ）前記第１．２の恒温槽と同一円周上に配設され、
ポリヌクレオチド第２鎖の複製を行なわせる第３の恒温
槽と、 （ｄ）　これら３つの恒温槽の中心に設けられた支持塔
と、 ｔｅｌ支持塔上部に揺動可能に枢支され、かつその先端
部に前記反応液を入れた密閉容器を装着可能とした取付
部を有するアーム部材と、（ｆ＋前記アーム部材先端を
前記第１．２．３の各恒温槽の位置に順次位置させる回
動手段と、（ｇ）前記第１．２．３の各恒温槽に前記ア
ーム先端部を水没させる揺動手段とを、 備えることを特徴とするＰＣＲ反応装置により達成され
る。

すなわち本発明は、ＰＣＲて増幅したポリヌクレオチド
を予め沈降性担体に結合させておいたプローブに結合さ
せて、反応容器内に沈降した担体上のポリヌクレオチド
を検出する。これにより反応系を密閉系とすることがで
き、この密閉系内でポリヌクレオチドの増幅と、増幅し
たポリヌクレオチドの検出とを併せて行なうようにした
ちのである。

増幅ポリヌクレオチドを検出するためには、その構成ｄ
ＮＴＰあるいはプライマーに予め放射性同位元素或いは
蛍光色素、酵素等の標識物質で標識しておき、沈降性担
体にこれらの標識が存在するかどうかを判定すればよい
。ポリヌクレオチドが増幅されていれば、密閉容器下部
に沈降した担体から検出される標識量は、遊離の浮遊標
識量よりも多く局在する。従って、標識物質が容器上部
の上清から容器下部の沈降担体まで一様に分布する場合
には、陰性、即ち、被検ポリヌクレオチドが検体中に存
在しなかったものと判定できる。標織物質が容器上部の
上清よりも容器下部の沈降担体に多く分布する場合には
、陽性、即ち、被検ポリヌクレオチドが検体中に存在す
るものと判定できる。標識物質の分布測定に１次元スキ
ャナーを用いることにより、本発明の方法は容易に自動
化することができる。

また第２の発明は、ＰＣＲ反応溶液を入れた密閉容器を
、２本鎖ポリヌクレオチドの解離、プライマー再結合、
ポリヌクレオチド第２鎖の複製を順次行なわせるように
、各温度の恒温槽に浸漬するようにして、効率的にかつ
自動的にＰＣＲを行なうようにしたものである。

ポリヌクレオチド 本発明の検出方法により検出できるポリヌクレオチドは
、ＤＮＡのみならずＲＮＡも含まれる。

密閉容器に入れるポリヌクレオチドは細菌や酵母などの
微生物由来のもの、動物や植物などの高等生物由来のも
のでもよい。血球、リンパ球、生体組織などから常法に
より抽出したＤＮＡ、ＲＮＡを使用できる。また天然の
ＤＮＡやＲＮＡに限られず、クローン化したＤＮＡやＲ
ＮＡて６よい。

これらは２本鎖のものに限られず１本鎖ＤＮＡでもよい
。またＤＮＡ−ＲＮＡ複合体でもよい。いずれにしても
、被検ポリヌクレオチドはそれに結合する２つのプライ
マーとプローブを作成できる程度に、核酸配列が解った
ものが対象となる。

検出対象としてのポリヌクレオチドは純化されたもので
もよいし、他のポリヌクレオチドの混合物に混在するも
のでもよい。また長いポリヌクレオチド（例えばゲノム
）中の一部が検出対象であってもよい。

プライマー プライマーは、ポリヌクレオチドに結合し、これに相補
的な第２鎖の合成開始点を与えるものである。目的ポリ
ヌクレオチドの両端領域に対応する２つのオリゴヌクレ
オチドをそれぞれプライマーとして用いる。相補鎖の合
成は鋳型となるポリヌクレオチドの５°末端側から３゛
末端方向に進行するから、一方のプライマーは目的ポリ
ヌクレオチドの５°末端付近の領域に結合するオリゴヌ
クレオチドを用いる。他方のプライマーは相補鎖の５°
末端側付近の領域に結合するオリゴヌクレオチド、即ち
目的ポリヌクレオチドの３°末端付近領域に相当するオ
リゴヌクレオチドである。

プライマーは、化学合成により作られたものを用いる。

その長さは、通常１５〜２５ヌクレオチドのものが好ま
しい。

反応系に添加するプライマーの量は、被検ポリヌクレオ
チドに対し大過剰となる量にする。通常モル比で１００
０倍以上とするのが好ましい。

ｄＮＴＰ ｄＮＴＰはＤＮＡ合成の材料となる４つのデオキシリボ
ヌクレオシド３リン酸の総称であり具体的には、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰの４つの混合物であ
る。その量は互いに等量とするのが好ましい。各ヌクレ
オチドの量は、目的ポリヌクレオチドの量、長さ、プラ
イマーの量などの反応条件により異なるが、少くともプ
ライマーより大過剰にする。

ｄＮＴＰ、４つのヌクレオチドのうち少くとち１種類、
或いはプライマーの少くとも一方には予め標識物質で標
識しておくことが望ましい。標識物質は、反応終了後、
沈降性担体に結合したポリヌクレオチドが密閉反応容器
外部から検出可能なものであればよく、例えば、放射性
同位元素や蛍光物質などが挙げられる。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ 本発明では、二重鎖ポリヌクレオチドの一重鎖ポリヌク
レオチドへの解離を熱変性により行なう。従って用いる
ＤＮＡポリメラーゼは熱変性時の温度（通常６５−９０
℃位）で失活しない程度の耐熱性が要求される。このよ
うなりＮＡポポリラーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓＹＴＩ株由来のＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼがある。

またこのポリメラーゼ遺伝子を改変したものをクローニ
ングした大腸菌より精製した組換ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼでもよい。その他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには
、Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ、　４５．６４４−６５１（１
９８０）に記載されたものがある。

火罠笠里共 水不溶性で反応溶液よりも高比重の高分子担体を用いる
。反応容器を静置した場合、又は軽く遠心した場合に沈
降する程度の比重を有すればよい。また反応溶液中の試
薬と反応せず、ＰＣＲ時の高温（約９０’Ｃ）でち安定
な化合物であって、後記するプローブと結合可能な官能
基を有することが必要となる。このような沈降性担体と
しては、セファロース（商品名）などのアガロースビー
ズや、セファデックス（商品名）などのデキストランビ
ーズが使用できる。

ポリヌクレオチドプローブ プローブは、被検ポリヌクレオチドの一部の領域と結合
可能なオリゴヌクレオチドであり、通常１５〜２５ヌク
レオチド程度の長さでよい。プローブの結合部位は、前
述の２つのブライマ一対応領域とは異なる部位が好まし
く、これら２つのブライマ一対応領域に挾まれた領域に
適当な箇所から選ばれる。

このプローブは化学合成により作られたちのを用いる。

プローブと担体の結合は、公知技術により行なうことが
でき、例えばアガロースビーズを担体に用いる場合には
、アガロースをＢｒＣＮで活性化して、プローブを結合
させる。

乙り皇ヱ１立 密閉反応容器は、反応後の１次元スキャンが容易なよう
に小径の円筒状のちが好ましい。本反応は非常に微量の
反応溶液で行なうことができるから、アクリル製又はポ
リカーボネート製のキャピラリーやマイクロピペットの
チップなどを反応容器として用いることができる。

この反応容器に、適当量の被検ポリヌクレオチド、過剰
量の２つのプライマー、標識ｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ、沈降性担体に結合したプローブ、緩衝液そ
の他適当な添加剤を含む反応溶液を入れ、密封する。

初めに反応容器を１〜４分間、９０〜９５°Ｃに加温し
て、反応溶液中の二本鎖を一本鎖に解離させる。その後
室温に冷却して、一本鎖ポリヌクレオチドにプライマー
を結合させる。プライマー結合に続いて、プライマーの
延伸即ち第二鎖の複製を行なわせる。耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼとしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる場合
には、９４℃、１分で二重鎖の解離、３７℃、２分でプ
ライマーの再結合、７２°Ｃ１３分で第２鎖の複製を行
なう。このサイクルを２０〜３０回繰返すことにより、
被検ポリヌクレオチドを検出可能なまてに増幅すること
ができる。最終的に反応液を室温に戻すと、増幅したポ
リヌクレオチドは担体上のプローブに結合した状態にあ
り、反応容器を静置或いは必要に応じて軽い遠心を行な
えば、反応容器下部に沈降して局在することになる。

この後、その上部の反応液中の標識量と、容器下部の担
体上の標識量の分布を外部から測定する。

上記ＰＣＲ反応による被検ポリヌクレオチドの増幅は、
次のようなＰＣＲ反応装置を用いることにより効率よく
行なうことができる。

第１図はそのＰＣＲ反応装置の平面図、第２図はそのＩ
Ｉ　−ＩＩ線方向から見た側面説明図である。

これらの図に示すように、第１の恒温槽１０、第２の恒
温槽１２、第３の恒温槽１４は、支持塔１６を取り囲む
ように同一円周上に配設されている。支持培土６の下部
には回動手段としてのモータ１８が取付けられ、支持塔
１６は回動自在となっている。また支持塔１６の上部に
は、シーソー状のアーム部材２０が揺動自在に枢支され
ている。アーム２０の先端には、ＰＣＲ反応溶液を収容
する密閉容器２２を装着する取付部２４が設けられ、ア
ーム２０の揺動により、アーム２０の先端である取付部
２４は恒温槽１０．１２、または１４に水没する。なお
２６はアーム２０を揺動するための揺動手段であり、モ
ータにより構成される。この揺動手段は、支持塔１６の
下部に設けたエアシリンダなどで動作されるブツシュロ
ッドで構成してもよい。また支持塔１６の回転に伴ない
、アーム２０を揺動させるクランク機構によるものでも
よい。

第１恒温槽１０は、２本鎖ポリヌクレオチドを解離させ
るための槽であり、例えば９４°Ｃに設定される。第２
恒温槽１２は、第１恒温槽により１本鎖に解離したポリ
ヌクレオチドにプライマーを再結合させるための槽であ
り、例えば３７℃に設定される。第３恒温槽は、第２恒
温槽でプライマーが結合したポリヌクレオチドからポリ
ヌクレオチド第２鎖の複製を行なわせるための槽であり
、例えば７２℃に設定される。いずれの恒温槽も、サー
モスタットにより一定温度に維持され、またマグネテイ
ックスターラ或いは水流ポンプなどにより撹拌され、Ｐ
ＣＲ反応溶液を入れた密閉容器への熱制御効率を高めて
いる。

この反応装置では、キャピラリーなどの反応容器２２を
多数束ねて取付部２４に取付け、まず第１恒温槽１０に
浸漬する。この恒温槽１０で２重鎖ポリヌクレオチドを
解離させたのち、アーム先端部２４を上方に引揚げ、次
の第２恒温槽１２に移し浸漬する。このアーム先端部を
引揚げる際に反応容器２２は転倒されるから、内部の反
応溶液は良く撹拌されることになる。第２恒温槽でプラ
イマー再結合をさせたら、同様にして、第３恒温槽へ反
応容器を移し浸漬する。この第３恒温槽で、ポリヌクレ
オチド第２鎖の複製が行なわれる。以上を１サイクルと
し、再び第１．２．３恒温槽に反応容器を順次浸漬して
次のポリヌクレオチド複製サイクルを行なう。

サイクル数は不図示の制御装置によりカウントされ、予
め設定された必要回数、例えば３０回行なった後に、運
転が停止される。

以上の操作により、目的（被検）ポリヌクレオチドを効
率よく、自動的に増幅することができる。

（実験例） Ｔ細胞抗原レセプター遺伝子を被検ポリヌクレオチドと
して以下の実験を行なった。

！扶班ユ マウスＡＫＲ系由来のＴ細胞リンホーマより、ＲＮＡを
グアニジン法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
。

ＵＳＡ、　８４．５８８３　（１９８７））により抽出
した。抽出ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースで分画し、ポ
リＡＲＮＡを濃縮した。

得られたポリＡＲＮＡを鋳型にして、以下の反応条件に
よりｃＤＮＡを得た。

（反応条件） ボ’）ＡＲＮＡ　　　　　　　　　　２０ｕｇプライマ
ー＃２　　　　　　　５０ＬＬｇ（５°ＣＴＴＧＴＣＣ
ＴＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＣ）ｄＡＴＰ　　　　　　
　　　　５００ｕＭｄＣＴＰ　　　　　　　　　　５０
（ＩｕＭｄＧＴＰ　　　　　　　　　　５００ＬＬＭＴ
ＴＰ　　　　　　　　　　５００ｕＭ逆転写酵素（ＥＲ
Ｌ社製）１万　ｕ／ｍｌＴｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ８，３
１５０ｍＭＫＣ２７５ｍＭ Ｍｇ　Ｃ１２３ｍＭ ジチオスレイトール　　　　ｌ０ｍＭ 反応溶液全量　　　　　　　１ｏｏＬＬ！２４２℃、２
時間 反応終了後、フェノール／クロロホルム抽出して、アル
コール沈澱後、水（２０μＣ）に溶解してｃＤＮＡ溶液
とした。

罠狡立ユ 得られたｃＤＮＡを用いて、以下の反応溶液によりＰ　
ＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）を行なった。

ｃＤＮＡ　　　　　　　　　上記反応量の半分プライマ
ー＃　１　　　　　　５００　ｎｇ（５°ＡＴＧＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣ）プライマー＃　２　
　　　　　５００　ｎｇｆ５　’　ＣＴＴＧＴＣＣＴＣ
ＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＣ）ｄＡＴＰ　　　　　　　　
　　２００ＬＬＭｄＣＴＰ　　　　　　　　　　２００
ＬＬＭｄＧＴＰ　　　　　　　　　　２００ＬＬＭＴＴ
Ｐ　　　　　　　　　　２００μＭＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ　　　２．５　ｕ（バーキンエルマーシータス社
製） Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｆｐＨ８，３）　　　　　　１０　ｍ
ＭＫＣ１２５０ｍＭ Ｍｇ　Ｃ１ｇ　　　　　　　　　１．５　ｍＭゼラチン
　　　　　　　　　０．０１　　％（Ｗ／Ｖ）反応溶液
全量　　　　　　　１００μ℃反応容器として、容量２
００μ℃（ｌ、２φ×１４０ｍｍ）ガラス製キャピラリ
ーをシリコナイズ処理したものを用いた。反応溶液を入
れ、溶封・密閉したキャピラリーを１分半、沸騰水中に
漬けた。この後、３７℃の水浴に２分間、７２°Ｃの温
浴に３分間、９４℃の温浴に１分間、インキュベートし
た。このサイクルを３０回繰返した後、内容物を取り出
し、１％アガロース電気泳動で解析した。

泳動パターンより、ポリヌクレオチドが増幅されている
ことを確認した。これにより、キャビラノーのような細
径の容器でｔＰｃＲを行なうことが出来ることが確認で
きた。

丈見△ユ 担体としてセファロースＣＬ−２Ｅ　（ファルマシア社
製）を用いた。これに下記の一本領合成オノゴヌクレオ
チドを結合させた。

プローブＡ （ＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＣＡＴＴＣＴＩ　Ｘ
　２（ＰＣＲ産物の一方の鎖と相補的） プローブＢ （ＣＡＧＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴ）　Ｘ
　２申＊ホ （プローブＡとは＊中本の箇所が異なる、ＰＣＲ産物と
非相補的） 担体とプローブＡ、Ｂの結合は、ＣＮＢｒを用いるＡｒ
ｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　５４，４１１−４１８　（１９７５）
に記載の方法により行なった。

Ｘ見出１ 実験例３で得た担体・プローブ結合物２ｏｕＩ２を加え
、ｄｃＴＰとしてｃｒ−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（約１００．
０００　ｃｐｍ　）を用いた他は、実施例２と同じ条件
でＰＣＲを行なった。

反応終了後、９０℃、３分間で、−重鎖にした後、徐々
に３７℃まで温度を下げ、担体ビーズの沈澱を確認した
。この後、キャピラリーからビーズと溶液を別々に取り
出し、放射能を測定した。

プローブＡを用いた場合には、溶液部の放射能は４０、
０００ｃｐｍであり、ビーズ部の放射能は４５．０００
ｃｐｍであった。一方、プローブＢを用いた場合には、
溶液部、ビーズ部の放射能はそれぞれ８５．０００ｃｐ
ｍ　、　５．０００ｃｐｍであった。このように、ＰＣ
Ｒ産物と非相補的なプローブＢを用いた場合には、担体
上に目的ポリヌクレオチドは検出できないが、ＰＣＲ産
物の一方の鎖と相補的なプローブＡを用いることにより
目的ポリヌクレオチドのＰＣＲ産物を検出できることが
確認できた。

罠秩班亙 実験例３のプローブＡを結合したセファロースを用いて
、実験例１で得たｃＤＮＡについてＰＣＲを行なった。

ｃＤＮＡ　　　　　　　　　　　ｌｏμｆｆプライマー
＃１　　　　　　　１ｕＭ （５°ＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＣ丁ＣＣＴＣ）
プライマー＃２　　　　　　　１　ＬＬＭ（５°ＣＴＴ
ＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＣ）ｄＡ、ＴＰ　
　　　　　　　　　２００μＭｄＧＴＰ　　　　　　　
　　　２００ＬＬＭＴ　Ｔ　Ｐ　　　　　　　　　　２
００μＭａ−３２Ｐ−ｄＣＴＰ　（１００，ＤＯｃｐｍ
）　　２００　ｕＭＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　　　２
．５ｕ（パーキンエルマーシークス社製） セファロース・プローブＡ結合物 ２０μｇ／ｍ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）　　　　　　５０　ｍ
ＭＫＣｆｆ　　　　　　　　　　　　５０ｍＭＭｇＣ１
□　　　　　　　　　１．５ｍＭゼラチン　　　　　　
　　　０．Ｏｌ　　％（Ｗ／Ｖ）反応溶液全量　　　　
　　　１００μ℃上記組成からなる反応液をアクリル製
キャピラリー（φ１．４　ｍｍＸ　１１０　ｍｍ　）に
入れ密閉した後、実験例２と同じ温度条件とサイクルで
ＰＣＲを行なわせた。

反応終了後、セファロースビーズをキャピラリー内で沈
澱させ、ＡＭＢ　Ｉ　Ｓ社のベータ・スキャニング・シ
ステムによりラジオクロマトスキャンを行なった。その
結果、ビーズ沈澱部に高い放射能が検出できた。すなわ
ち、被検ｃＤＮＡひいては実験例１で得たｍ　ＲＮ　Ａ
は、プローブＡに結合するＴ細胞抗原レセプター遺伝子
であることが確認できた。

（発明の効果） 以上のように第１の発明は、ＰＣＨの反応系に沈降性担
体・被検ポリヌクレオチドプローブを共存させた。この
ため、ＰＣＨにより増幅された被検ポリヌクレオチドが
容器内の沈澱部に局在するかどうかにより、検体中に被
検ポリヌクレオチドが存在したかどうかが面倒な操作な
しで判定できる。従って、微量ポリヌクレオチドの検出
が容易かつ短時間に行なえる。また反応系をＰＣＨのと
きから検出まで全て密閉系で行なうことができるから、
他の検体の混入による検出の誤りがない。

また−度反応溶液を溶液に入れて、反応後、増幅ポリヌ
クレオチドを反応容器の外部から検出するものであるか
ら、自動化装置に適用するのが容易である。

また第２の発明によれば、ＰＣＲ反応を効率よく、自動
的に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるＰＣＲ反応装置の一実施例の平面
図、第２図はそのＩＩ　−ＩＩ線方向から見た側面説明
図である。 ｌＯ・・・第１恒温槽、１２・・・第２恒温槽、１４・
・・第３恒温槽、２０・・・アーム、２２・・・ＰＣＲ
反応容器。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下のステップよりなることを特徴とするポリヌ
   クレオチド検出方法。 （ａ）以下のものを含む反応混合物を密閉容器に入れる
   ステップ： ［１］被検ポリヌクレオチド、 ［２］被検ポリヌクレオチドのそれぞれ異なる部位に結
   合可能な２つのプライマー、 ［３］ｄＮＴＰ、 ［４］耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び ［５］沈降性担体と被検ポリヌクレオチドプローブとの
   結合物、 （ｂ）昇温による二重鎖ポリヌクレオチドの解離、降温
   によるポリヌクレオチドとプライマーとの再結合及びポ
   リヌクレオチド合成の各ステップを繰返すことにより被
   検ポリヌクレオチドを増増幅させるステップ、 （ｃ）密閉容器内に沈降した前記沈降性担体と被検ポリ
   ヌクレオチドプローブとの結合物に結合した被検ポリヌ
   クレオチドＤＮＡを検出するステップ。
2. （２）前記ｄＮＴＰが放射性同位元素で標識されている
   ことを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド検出
   方法。
3. （３）沈降性担体・結合物の放射能と、遊離のｄＮＴＰ
   の放射能との間の分布を測定することにより、被検ポリ
   ヌクレオチドの存在を確認することを特徴とする請求項
   ２記載のポリヌクレオチド検出方法。
4. （４）前記プライマーの少くとも一方が放射性同位元素
   で標識されていることを特徴とする請求項１記載のポリ
   ヌクレオチド検出方法。
5. （５）沈降性担体・結合物の放射能と、遊離のプライマ
   ーの放射能との間の分布を測定することにより、被検ポ
   リヌクレオチドの存在を確認することを特徴とする請求
   項４記載のポリヌクレオチド検出方法。
6. （６）前記密閉容器がキャピラリーであることを特徴と
   する請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド
   検出方法。
7. （７）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下、目的ポリペプ
   チド、プライマー及びｄＮＴＰを含む反応液中で、目的
   ポリヌクレオチドを複製するＰＣＲ反応装置において、 （ａ）２本鎖ポリヌクレオチドの解離させる第１の恒温
   槽と、 （ｂ）一本鎖ポリヌクレオチドにプライマーを結合させ
   る第２の恒温槽と、 （ｃ）前記第１、２の恒温槽と同一円周上に配設され、
   ポリヌクレオチド第２鎖の複製を行なわせる第３の恒温
   槽と、 （ｄ）これら３つの恒温槽の中心に設けられた支持塔と
   、 （ｅ）支持塔上部に揺動可能に枢支され、かつその先端
   部に前記反応液を入れた密閉容器を装着可能とした取付
   部を有するアーム部材と、 （ｆ）前記アーム部材先端を前記第１、２、３の各恒温
   槽の位置に順次位置させる回動手段と、（ｇ）前記第１
   、２、３の各恒温槽に前記アーム先端部を水没させる揺
   動手段とを、 備えることを特徴とするＰＣＲ反応装置。