CN113046426A - 通用基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制PCR反应体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性1‑3min，获得扩增产物，吸弃上清液，加入探针，降温到56‑60℃，杂交3‑5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、Extaq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种通用基因检测方法。
背景技术
基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子作检测，分析其所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。基因检测常用的技术包括qPCR技术和基因芯片技术。其中qPCR技术包括：SYBRGREEN染料法和Taqman探针法。基因芯片技术的一般策略是将探针(Capture Probe)固定在固相载体(芯片)表面。然后将待检测的核酸加入到芯片上，通过变性和退火使要检测的靶基因与探针进行特异性杂交，使探针特异性的捕获到靶基因。然后在体系中加入检测探针(Detection probe)，检测探针与靶基因进行杂交。一般检测探针是一端被标记了的寡核苷酸序列，标记的方式可以有很多种，可以用酶标记，可以用金标记然后硝酸银染色，也可以用荧光素标记。由于基因芯片技术本身的灵敏度比较低，在大多数情况下需要首先对样品中的靶基因进行扩增，扩增的手段可以选择PCR， NASBA，LAMP等核酸扩增技术。扩增完成之后再进行基因芯片的杂交检测。
qPCR技术的缺点在于，PCR的过程中会产生大量的靶基因扩增产物，这些产物没有被固定在固相载体上，很容易形成气溶胶。对整个检测的操作环境构成污染。所以进行临床样品的PCR检测必须在标准的PCR检测实验室中方可进行。标准的PCR检测实验室建设有强制性的要求，投资成本大，不适合基层医疗单位。并且这种方法的具体实施过程比较复杂，耗费时间，不利于设计成POCT的检测方式。
此外，qPCR技术和基因芯片技术的信号显示策略都是间接的，对于PCR技术及来说，信号显示的方式有两种，一种是SYBRGREEN染料，这是一种与DNA双链的小沟结合的荧光染料，PCR扩增过程中形成的双链会结合SYBRGREEN染料，染料与DNA双链结合后发出荧光用于检测。对于基因芯片检测技术来说，信号的采集一般是通过探针上标记的材料来实现的，就像上文提到的，对探针上标记的金颗粒进行银染，或者加入标记在探针上的酶的底物进行显色反应，或者检测连接在探针上的荧光素。所有这些检测手段在实际操作过程中都会导致检测步骤的繁琐，同时可能会导致灵敏度降低，或者出现假阳性以及假阴性的现象，不会准确的反应目的基因或扩增产物的真实情况。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种通用基因检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面，提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制PCR反应体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性1-3min，获得扩增产物，吸弃上清液，加入探针，降温到56-60℃，杂交3-5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、taq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。
优选地，对所述探针一端或两端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。优选地，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过荧光素标记。
优选地，所述扩增产物包含引物序列和延伸序列，所述探针的序列跨越引物序列和延伸序列。
优选地，所述探针的序列的中间碱基是特异位点。
优选地，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。
所述引物中加入通用核苷酸序列，是为了使特异性核苷酸序列有充分的空间与DNA 样品结合。
优选地，所述通用核苷酸序列选自黄瓜的DNA片段。
优选地，所述引物的5’端添加有标签序列，以便对引物的5’端进行标记和检测。
优选地，所述引物的5’端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
优选地，所述固相载体选自磁性颗粒、微球、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
本发明实施例利用磁性颗粒作为固相载体，利用磁力架与磁性颗粒之间的磁力，实现杂交产物的快速处理，操作简单，便于实现自动化。
优选地，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶或别藻青蛋白中的一种或多种。
本发明第二方面，提供一种基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包含固定引物、PCR缓冲液、dNTP、Extaq酶、去离子水和探针，所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端的核苷酸序列经过标记。
优选地，对所述探针一端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。
优选地，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。
优选地，所述引物的5’端添加有标签序列，以便对引物的5’端进行标记。
优选地，所述引物的5’端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
优选地，所述固相载体选自磁性颗粒、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所述引物以单链的形式固定在固相载体上，漂洗后加入荧光标记的探针与固相载体上的单链进行杂交，洗涤多余探针之后直接进行荧光值的判读，大大简化检测步骤，同时能提高灵敏度，避免出现假阳性以及假阴性的现象，能够准确的反应靶基因或扩增产物的真实情况。
本发明所述通用基因检测方法适用于所有基于引物单链扩增和探针检测的基因特性检测和分析，能显著提升检测环境，大幅度减少检测时间，在医疗机构、科研院所等场合具有较大的应用价值。
具体实施例
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
试剂耗材：
PCR缓冲液，采购自康为世纪生物科技有限公司，产品编号为：CW0680M。
Extaq酶，采购自康为世纪生物科技有限公司，产品编号为：CW0680M。
羧基磁性颗粒，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：PB0001。
dATP，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：PC2301。
dCTP，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：PC2303。
dGTP，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：PC2304。
dTTP，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：PC2302。
偶联缓冲液，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：PB0001。
淬灭缓冲液，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：PB0001。
储存缓冲液，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：PB0001。
本发明实施例提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配置PCR反应体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性3min，获得扩增产物，吸弃上清液，加入探针，降温到56-60℃，杂交5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、Extaq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。
在一些实施例中，对所述探针一端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。
在一些实施例中，所述扩增产物包含引物序列和延伸序列，所述探针的序列跨越引物序列和延伸序列。
在一些实施例中，所述探针的序列的中间碱基是特异位点。
在一些实施例中，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。所述引物中加入通用核苷酸序列，可以使特异性核苷酸序列有充分的空间与DNA样品结合。
在一些实施例中，所述通用核苷酸序列选自黄瓜的DNA片段。
在一些实施例中，所述引物的5’端添加有标签序列，以便对引物的5’端进行标记和检测。
在一些实施例中，所述引物的5’端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
在一些实施例中，所述固相载体选自磁性颗粒、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
在一些实施例中，所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
在一些实施例中，按照体积份数，所述PCR反应体系包括：固定引物5份、PCR缓冲液10份、dATP 0.5份、dCTP 0.5份、dGTP 0.5份和dTTP 0.5份、Extaq酶0.5份、浓度为50ng/ul的DNA样本1份和去离子水1.5份。
在一些实施例中，所述PCR反应程序包含以下步骤：取两个PCR反应管，分别将所述PCR反应体系加入所述PCR反应管，在PCR仪上于95℃预加热3分钟，使DNA样本充分变性，然后进入扩增循环，在每一个循环中，先于95℃保持15s，使DNA样本变性，然后将温度降到60℃，保持30s，使引物与DNA样本充分退火；在72℃保持30s，完成5个循环后，在72℃在保持60s，获得反应产物。
在一些实施例中，所述处理杂交产物的过程包括：
1)将杂交产物置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液；
2)加入500ul去离子水，轻轻震荡，漂洗磁性颗粒，然后置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液，重复本步骤三次，将磁性颗粒悬浮在20ul去离子水中。
关于磁力架的具体结构，参见：李兴旺等“具有吸液功能的磁力架”，CN206232701U；魏宏泉等“磁力架”，CN206244805U；武彦峰等“磁力架”， CN206345848U；孙相鑫等“生物分子提取装置”，CN206477001U。这些出版物各自的全部内容以引用的方式并入本文。
本发明实施例利用磁性颗粒作为固相载体，利用磁力架与磁性颗粒之间的磁力，实现杂交产物的快速处理，操作简单，便于实现自动化。
在一些实施例中，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶或别藻青蛋白中的一种或多种。
在本发明其他优选实施例中，提供一种基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包含固定引物、PCR缓冲液、dNTP、Extaq酶、去离子水和探针，所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。
在一些实施例中，对所述探针一端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。
在一些实施例中，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。
在一些实施例中，所述引物的5’端添加有标签序列，以便对引物的5’端进行标记。
在一些实施例中，所述引物的5’端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
在一些实施例中，所述固相载体选自磁性颗粒、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
在一些实施例中，所述固定引物的制备方法包括以下步骤：
(1)取羧基磁性颗粒0.5mg，用PBS缓冲液洗涤2次，加入1mlPBS缓冲液振荡重悬后，加入10mg EDC和10mg NHS活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，使用PBS缓冲液洗涤 3次，获得活化羧基磁性颗粒；
(2)向所述活化羧基磁性颗粒中加入偶联缓冲液80ul，浓度为50nmol的引物100ul，在室温下震荡孵育2小时，获得产物；
(3)向所述产物中加入500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清；
(4)重复步骤(3)三次；
(5)加入100ul储存缓冲液，获得固定引物，4℃保存备用。
在一些实施例中，所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
在一些实施例中，按照体积份数，所述PCR反应体系包括：固定引物5份、PCR缓冲液2份、dATP 0.5份、dCTP 0.5份、dGTP 0.5份和dTTP 0.5份、Extaq酶0.5份、浓度为 50ng/ul的DNA样本1份和去离子水9.5份。
在一些实施例中，所述PCR反应程序包含以下步骤：在PCR仪上于95℃预加热3 分钟，使DNA样本充分变性，然后进入扩增循环，在每一个循环中，先于95℃保持15s，使DNA样本变性，然后将温度降到60℃，保持30s，使引物与DNA样本充分退火；在72℃保持30s，完成5个循环后，在72℃在保持60s，获得反应产物。
在一些实施例中，所述处理杂交产物的过程包括：
1)将杂交产物置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液；
2)加入500ul去离子水，轻轻震荡，漂洗磁性颗粒，然后置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液，重复本步骤三次，将磁性颗粒悬浮在20ul去离子水中。
关于磁力架的具体结构，参见：李兴旺等“具有吸液功能的磁力架”，CN206232701U；魏宏泉等“磁力架”，CN206244805U；武彦峰等“磁力架”， CN206345848U；孙相鑫等“生物分子提取装置”，CN206477001U。这些出版物各自的全部内容以引用的方式并入本文。
本发明实施例利用磁性颗粒作为固相载体，利用磁力架与磁性颗粒之间的磁力，实现杂交产物的快速处理，操作简单，便于实现自动化。
本发明其他优选实施例中，还提供上述的基因检测试剂盒在耳聋基因1555位点检测中的应用。
实施例1
本实施例以耳聋基因1555位点检测为例，对本发明所述的通用基因检测方法进行进一步详细说明。
本实施例提供一种耳聋基因1555位点检测方法，包括以下步骤：
1)取固定引物5ul、PCR缓冲液2ul、dATP 0.5ul、dCTP 0.5ul、dGTP 0.5ul和dTTP0.5ul、 Extaq酶0.5ul和去离子水9.5ul，加入PCR反应管中，获得PCR反应体系；所述固定引物由羧基磁性颗粒与引物结合而成；
2)取浓度为50ng/ul的DNA样本1ul，加入所述PCR反应体系中，将所述PCR反应体系在PCR仪上于95℃预加热1-3分钟，执行单链PCR过程，使固定引物与DNA样本特异性结合，退火，使引物沿DNA模板延伸；
3)将温度升高至95℃，使DNA双链变性漂洗，获得链接在磁珠上的固定单链产物；
4)吸弃上清液后，向所述扩增产物中加入探针，降温到56-60℃，使所述探针与所述扩增产物杂交3-5min，获得杂交产物，所述杂交产物中的探针序列跨越所述扩增产物引物序列和延伸序列；
5)处理杂交产物，漂洗，去除未结合的探针；
6)检测杂交产物的荧光值，判定检测结果。
本实施例所述引物的序列为：
1555-W：5’-gccgaccgccgattctgc GCATTTATATAGAGGAGA-3’
或1555-M：5’-gccgaccgccgattctgc GCATTTATATAGAGGAGG-3’。
序列gccgaccgccgattctgc为通用核苷酸序列；序列GCATTTATATAGAGGAGA或GCATTTATATAGAGGAGG为特异性核苷酸序列，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合，所述引物中加入通用核苷酸序列，可以使特异性核苷酸序列有充分的空间与DNA样品结合。本实施例所述引物的 5’端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
本实施例所述固定引物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取羧基磁性颗粒0.5mg，用PBS缓冲液洗涤2次，加入1mlPBS缓冲液振荡重悬后，加入10mg EDC和10mg NHS活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，使用PBS缓冲液洗涤 3次，获得活化羧基磁性颗粒；
(2)向所述活化羧基磁性颗粒中加入偶联缓冲液80ul，浓度为50nmol/ml引物100ul，在室温下震荡孵育2小时，获得产物；
(3)向所述产物中加入500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清；
(4)重复步骤(3)三次；
(5)加入100ul储存缓冲液，获得固定引物，4℃保存备用。
本实施例所述探针为单链探针，所述探针的一端的核苷酸序列经过荧光素标记；所述扩增产物包含引物序列和延伸序列，所述探针的序列跨越引物序列和延伸序列，探针的序列的中间碱基是特异位点，所述特异位点起到第二次的特异识别作用，因此具有更高的准确性。
在本发明其他优选实施例中，所述探针的两端的核苷酸序列均经过荧光素标记，进一步增强了检测信号，检测准确度更高。
本实施例处理杂交产物的步骤包括：
将所述杂交产物置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液；
加入500ul去离子水，轻轻震荡，漂洗磁性颗粒，然后置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液，重复本步骤三次，将磁性颗粒悬浮在20ul去离子水中。
本实施例利用磁性颗粒作为固相载体，利用磁力架与磁性颗粒之间的磁力，实现杂交产物的快速处理，操作简单，便于实现自动化。
尽管以上对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出多种形式的变化，这些均属于本发明保护之列。
Claims (7)
1.通用基因检测方法，该方法适用于基于引物单链扩增的基因特性检测，其特征在于，所述方法包括以下步骤：配制PCR反应体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性1-3min，吸弃上清液，加入探针，降温到56-60℃，杂交2-5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、Extaq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。
2.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，对所述探针一端或两端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。
3.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，所述扩增产物包含引物序列和延伸序列，所述探针的序列跨越引物序列和延伸序列。
4.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。
5.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，所述引物的5’端添加有标签序列。
6.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，所述引物的5’端经过氨基修饰。
7.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，所述固相载体选自磁性颗粒、微球、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210629 |