JP2972685B2

JP2972685B2 - 核酸の検出法

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Publication number: JP2972685B2
Application number: JP9355194A
Authority: JP
Inventors: 根明男山
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-06-28
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 1999-11-08
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: JPH10179199A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は核酸の検出法に関する。さらに詳しくは、検出
しようとする目的核酸と相補的な一本鎖核酸を固定担体
に固定し、これと、標識した試料中の目的核酸とをハイ
ブリダイゼーションさせることによって目的核酸を検出
する方法であり、迅速で機械化が容易な方法である。

【０００２】背景技術核酸の特異的塩基配列を検出するための基本的なハイブ
リダイゼーション法としては、担体に吸着した核酸と溶
液中の核酸とをハイブリダイズする固‐液ハイブリダイ
ゼーション法や溶液中の核酸同士をハイブリダイズする
液‐液ハイブリダイゼーション法がある〔Anal. Bioche
m., 169, 1-25 (1988)〕。現在まで、核酸の検出をより
簡易、迅速および高感度にするために上記方法について
種々改良が行われている〔Anal. Biochem., 169, 1-25
(1988)〕。

【０００３】その中で、核酸の検出操作の自動化を目的
とし、もともと抗体分野で使われているマイクロプレー
トを利用する方法が考案されている（特開昭第６１−２
１９４００号公報）。この方法においては、試料中の二
本鎖核酸を変性して一本鎖とし、その一本鎖を互いに相
補鎖の存在する状況下でマイクロプレートに非特異的吸
着により固定化している。それゆえ、固定中に二本鎖に
もどるもの、あるいは固定後に二本鎖を形成するものが
あり、実際のハイブリダイゼーションにおいてハイブリ
ダイズ可能なものは固定化されたＤＮＡよりかなり少い
と考えられる。また、元来このような固定法ではＤＮＡ
の吸着量が比較的少く、実際に応用するには検出感度の
点で不十分である。

【０００４】また、サンドイッチハイブリダイゼーショ
ンの捕獲用プローブとして、ポリチミジル酸をマイクロ
プレートに固定する方法が考案されている〔Molecular
andCellular Probes, 3, 189-207 (1989)〕。この方法
は、光反応において他の核酸塩基より反応性の高いチミ
ジル酸のポリマーを固定することにより、４種の塩基が
混じっている場合より吸着量が圧倒的に多い点で有利と
言える。しかしながら、この方法の応用は、ポリアデニ
ル酸を捕獲するサンドイッチハイブリダイゼーションに
限られており、サンドイッチハイブリダイゼーション固
有の性質である操作性の煩雑さおよび系の複雑さによる
感度の低下をまぬがれることはできない。

【０００５】一方、近年開発された核酸の増幅法は特定
の微量の遺伝子を短時間に１０万倍以上にも増やすこと
のできる画期的な方法である（ＰＣＲ法：特開昭第６１
−２７４６９７号公報）。そして、この方法により増幅
された核酸を利用してヒト遺伝子の点突然変異を比較的
簡単に検出する方法が考案されている〔Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA, 86, 6230-6234 (1989)〕。この方法はリ
バースドットハイブリダイゼーションと名付けられてお
り、検出しようとする塩基配列に相補的なオリゴヌクレ
オチドを化学合成し、それにポリチミジル酸を酵素反応
により付加して、ナイロンメンブランに固定化しやすい
ように工夫している。この方法はオリゴヌクレオチドを
効率よくナイロンメンブランに固定する方法としてはす
ぐれているが、ナイロンメンブランを使う方法自体が検
出操作の機械化に向いていない事や、固定化プローブの
調製が大量の調製に向いていないなどの欠点がある。

【０００６】上記方法は、それぞれに固有の長所がある
が、同時に欠点もあり、未だ満足のいく簡易、迅速、高
感度を実現する方法は開発されていない。

【０００７】

【発明の概要】本発明者は、今般、目的核酸と相補的な
配列を含んだ一本鎖核酸を固定しかつその一本鎖核酸を
その核酸に対する相補鎖が存在しない状態においた固相
担体を用いることによって、目的核酸を簡易かつ迅速
に、高感度で検出可能なことを見出だし、本発明を完成
した。従って本発明は、目的核酸を簡易かつ迅速に、高
感度で検出可能な方法を提供することを目的としてい
る。また本発明は、機械化が容易な目的核酸の検出法を
提供することを目的としている。

【０００８】本発明による核酸の検出法は、下記の工程
（イ）〜（ニ）からなるものである。核酸の検出法であ
って、（イ）検出すべき目的核酸を標識化する工程
と、（ロ）前記目的核酸と特異的にハイブリダイズ可
能な配列を５〜２００コピー含んでなる一本鎖核酸をマ
イクロタイターウエルに非特異的結合によって固定化
し、該一本鎖核酸に対する相補鎖が存在しない状態にお
く工程と、（ハ）工程（イ）で標識した目的核酸と、
工程（ロ）で固定化された一本鎖核酸とをハイブリダイ
ゼーション反応させる工程と、（ニ）工程（ハ）と同
時にまたはその後、目的核酸に存在する標識を利用し
て、目的核酸を検出する工程とを含んでなる。本発明に
よる核酸の検出法によれば、目的核酸を特異的にかつ高
感度で効率良く検出可能であり、また、検出作業の迅速
化、簡易化さらには機械化が可能となる。

【０００９】

【発明の具体的説明】目的核酸本発明でいう「検出すべき目的核酸」とは、検出しよう
とする特異な塩基配列を含むものであって、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡいずれであってもよい。本発明を適用し得るこのよ
うな核酸は、細菌、ウイルスおよび高等動植物などあら
ゆる生命体から調製することができる。また、上記核酸
は、本発明による検出法を適用する場合、精製されてい
てもされていなくてもよい。また、本発明による核酸の
検出法にあっては、前記した生命体から得られた核酸の
みならず、その核酸を後記するような方法によって増幅
し、この検体由来の核酸に相当する合成核酸あるいはこ
の核酸と相補的な合成核酸を検出すべき核酸として用い
てもよい。従って、本発明において目的核酸とは、検出
すべき検体由来の核酸に加えて、この検体由来の検出す
べき核酸に相当する合成核酸、さらにはその核酸と相補
的な合成核酸をも含む意味に用いることとする。

【００１０】核酸の検出法工程（イ）：目的核酸の標識工程本発明による核酸の検出法においては、まず、検出しよ
うとする目的核酸を標識化する。標識化の方法として
は、例えば、目的核酸に標識物を直接導入する方法、
標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用し
て目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な
核酸を合成する方法、標識化された単位核酸の存在
下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸
に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成
する方法などが具体例としてあげられる。

【００１１】の目的核酸に標識物を直接導入する方法
としては、目的核酸に光反応でビオチン誘導体を導入し
酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法〔Nu
cleic Acids Res., 13, 745 (1985)〕、目的核酸をスル
ホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出する方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3466-3470 (198
4)〕などが、操作の簡便性、迅速性の点から好ましい。

【００１２】一方、前記およびの方法としては、特
定の核酸配列を増幅する方法〔BIO/TECHNOLOGY, 8, 291
(1990) 〕を利用することができる。これらの方法は目
的核酸を増幅するという点で特に注目されているが、そ
れのみならず、比較的簡単に目的核酸に相当する合成核
酸あるいは目的核酸と相補的な合成核酸を標識化できる
点でも利用価値が高い。例えば、ＰＣＲ法〔Science, 2
30, 1350-1354 (1985)〕にあっては、標識したプライマ
ーを利用するか、あるいは、標識したモノヌクレオチド
トリリン酸を利用することにより、標識された伸長生成
物または増幅生成物を得ることができる。また、Ｑβレ
プリカーゼを利用する増幅法〔BIO/TECHNOLOGY, 6, 119
7 (1988)〕にあっては、同様に標識したモノヌクレオチ
ドトリリン酸を利用することによって標識された伸長生
成物または増幅生成物を得ることができる。また、前述
した以外の核酸増幅法においても、伸長反応または増幅
反応によって取り込まれるモノヌクレオチドトリリン酸
やオリゴヌクレオチドを標識しておくことによって伸長
生成物または増幅生成物を標識することができる。特に
の方法が本発明にあっては好ましい。

【００１３】ここで使用する標識物質とは、ハイブリダ
イゼーション操作後にこの物質を検出し得るものである
ならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易
性、保存性、廃棄処理等から、また本発明の効果を最も
よく享有するものとして、非放射性の標識物質が好まし
い。

【００１４】非放射性の標識物質としては、例えばビオ
チン、２，４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等
のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例え
ば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメ
チルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキ
サスレッド等〕、４‐フルオロ‐７‐ニトロベンゾフラ
ン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいは
アクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらによ
りオリゴヌクレオチドを標識する場合は、いずれも公知
手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０
９９号各公報参照）により、標識化を行うことができ
る。また、ヌクレオチド三リン酸を標識する場合は公知
手段〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045 (1983)
、特開昭６３−１５２３６４公報〕に準じて行うか、
市販品を利用することができる。

【００１５】工程（ロ）：一本鎖核酸の固定化本工程は、目的核酸と特異的にハイブリダイズ可能な配
列を含む一本鎖核酸を固相担体に固定化し、その結果こ
の固定した一本鎖核酸を、その一本鎖核酸に対する相補
鎖が存在しない状態におく工程である。

【００１６】本発明における一本鎖核酸としては、一本
鎖核酸がＤＮＡである場合、たとえば二本鎖核酸を変性
して相補分離したものを用いることができる〔Nucleic
Acids Res., 13, 5457-5468 (1985)〕。また、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて合成したものを鋳型と分離したもの
でもよい〔Anal. Biochem., 162, 130-136 (1987) 〕。
さらに、検出しようとする遺伝子を組み込んだＭ１３フ
ァージより得られる一本鎖核酸、あるいは、ファージと
プラスミドの複合ベクター（例えばｐＵＣ１１８、ｐＢ
ＳＭ１３^＋、ＰＵＣｆ１等）より得られる一本鎖核酸を
利用することもできる〔Methods in Enzymology, 153,
3-34(1987)〕。また、一本鎖核酸がＲＮＡの場合、天然
由来のＲＮＡのみならず、ＲＮＡポリメラーゼなどを利
用して試験管内で合成したものでもよい。なお、これら
の一本鎖核酸中に含まれる目的核酸と特異的にハイブリ
ダイズ可能な配列以外の塩基配列が、ハイブリダイゼー
ション反応に不都合な場合には、Messing らの方法〔Me
thods in Enzymology, 101，part C, 20 (1983) 〕に従
って、その部分を除くことができる。

【００１７】本発明による別の態様によれば、固定され
る一本鎖核酸として、その中に目的核酸とハイブリダイ
ズ可能な配列を複数有しているものを用いるのが好まし
い。固定化される一本鎖核酸中に目的核酸とハイブリダ
イズ可能な配列が多く存在していれば、ハイブリダイゼ
ーションの時間を短縮するすることができ、遺伝子の迅
速な検出を行うことができるからである。

【００１８】目的核酸とハイブリダイズ可能な配列が複
数存在する一本鎖核酸としては、例えば前記ファージＤ
ＮＡあるいはファージとプラスミドの複合ベクターに、
目的核酸とハイブリダイズ可能な配列を複数コピー導入
し、それから得られる一本鎖核酸を利用するのが好まし
い。特に、上記目的核酸とハイブリダイズ可能な配列を
５〜２００コピー導入したベクターから得られる一本鎖
核酸を用いるのが好ましい。

【００１９】また、ハイブリダイゼーションによって試
料中の塩基配列の点変異等の検出を行う場合には、目的
核酸とハイブリダイズ可能な配列は比較的短い方が好ま
しい。

【００２０】一般的に、これらの一本鎖核酸を担体に固
定するには後記するような方法によるが、固定化方法に
よっては高い固定化効率を望めない場合がある。しかし
そのような場合であっても、目的核酸とハイブリダイズ
可能な配列を複数個含む一本鎖核酸を用いて固定化すれ
ば、目的核酸とハイブリダイズ可能な配列を比較的多く
固定化することができる点で有利である。

【００２１】また、一般に目的核酸とハイブリダイズ可
能な配列からなるオリゴヌクレオチドを担体に結合させ
た場合、担体への固定に関与した部分は、自由度がなく
なるためハイブリダイゼーションに関与できなくなり、
ハイブリダイゼーション効率が溶液中に比べて低下する
とことが知られている。しかし、上記一本鎖調製用ベク
ターを用いて調製した一本鎖核酸を使用した場合、担体
への固定に関与していないハイブリダイズ可能な単位配
列が多数存在すると考えられ、固定化によるハイブリダ
イゼーション効率の低下も少ないと考えられ、有利であ
る。

【００２２】ただし、伸長反応あるいは増幅反応を利用
して標識化し、その標識化生成物を検出する場合、固定
化する一本鎖核酸は、伸長反応または増幅反応に利用し
たプライマーと相同性の低いものが好ましい。例えば、
前述のＰＣＲ法においては、遺伝子増幅に用いるプライ
マーは増幅反応終了後も未反応のまま溶液中に存在する
場合が多く、このプライマーと一本鎖核酸がハイブリダ
イゼーションしないように一本鎖核酸の配列を選定する
ことが必要である。そのような注意は他の遺伝子増幅法
においても同様である。

【００２３】これらの一本鎖核酸を固定化する担体とし
ては、核酸が非特異的に吸着しうるもの、あるいは、官
能基が導入できその官能基と核酸との間で共有結合でき
るものであればいずれの材質のものも、また、いずれの
形状のものも利用可能である。その具体例としては、い
わゆるポリマー製のマイクロプレート、チューブ、ビー
ズ形状のものがあげられる。特にマイクロプレートを用
いるのが、その機械化の容易性から好ましい。

【００２４】前記した一本鎖核酸をこれらの担体に固定
化する方法としは、まず化学結合法が挙げられる〔Nucl
eic Acids Res., 15, 5373-5390 (1987)〕。化学結合に
よって核酸を固定化する方法の具体例としては、アミノ
基を導入した担体と核酸をグルタルアルデヒドのような
架橋剤を用いて両者を結合させる方法が挙げられる。ま
た、核酸に官能基（例えばトランスアミネーション反応
により１級のアミノ基）を導入し、適当な架橋剤を用い
て担体上に導入された官能基と結合させることも有効で
ある。

【００２５】また、吸着などの非特異的結合によって核
酸を直接担体に固定することもできる。特に担体がマイ
クロプレートである場合は、紫外線照射またはＭｇＣｌ
_２の添加により吸着効率をあげることが可能である（特
開昭６１−２１９４００号公報）。さらに、核酸とタン
パク質を適当な方法によって化学結合あるいは非特異的
に吸着させ、そのタンパク質と担体との非特異的吸着を
利用して固定化する方法なども有効である。

【００２６】以上のようにして一本鎖核酸を固定担体に
固定化し、それによってこの一本鎖核酸に対する相補鎖
が存在しない状態が実現される。

【００２７】工程（ハ）：ハイブリダイゼーション反応本工程は、工程（イ）で標識した目的核酸と、工程
（ロ）で固定化された一本鎖核酸とをハイブリダイゼー
ション反応させる工程である。

【００２８】ハイブリダイゼーション反応の条件は、目
的核酸および担体に固定化された一本鎖核酸の組み合わ
せに応じて適宜選択、決定されてよい。例えば、本工程
でのハイブリダイゼーション反応は、基本的には、従来
の膜を用いるハイブリダイゼーションと同様に行なうこ
とができる〔B. D. Hames and S. J. Higgins, Nucleic
Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Pre
ss (1985) 〕。

【００２９】ある種の担体ではハイブリダイゼーション
の条件によって核酸との非特異的吸着が弱い場合がある
が、そのような場合には、プレハイブリダイゼーション
反応の操作を省くことができる。また、同じ理由からハ
イブリダイゼーションの溶液組成も簡素化されてよい。
さらに、長時間ハイブリダイゼーション反応を行なうと
固定化した一本鎖核酸が遊離する場合もあるので、ハイ
ブリダイゼーション反応の時間はできるだけ短縮できる
ような条件が好ましい。

【００３０】ハイブリダイゼーション反応後の洗浄操作
も従来法とほぼ同様に行なうことができる。この場合、
操作の簡略性を考えると、出来るだけ室温で過剰の試薬
などが除ける条件が好ましい。

【００３１】ただし、点変異の検出を行う場合は、洗浄
条件を注意深く検討しなければならない。また、そのよ
うな場合、相補的な部分の塩基組成によらないでその長
さのみに依存するような条件〔Nucleic Acids Res., 1
6, 4637-4650 (1988)〕を利用するのもよい。

【００３２】工程（ニ）：検出工程本工程は、工程（ハ）と同時にまたはその後、目的核酸
に存在する標識を利用して、目的核酸を検出する工程で
ある。

【００３３】本工程における検出操作は、目的核酸に存
在する標識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよ
い。

【００３４】ここで、目的核酸に存在する標識が直接検
出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオ
アイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標
識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは
標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸か
ら切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に
応じた方法によって検出操作を行なう。また、標識が間
接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例え
ばビオチン，ハプテンなどの特異的結合反応のリガンド
である場合、一般的にそれらの検出に用いられているよ
うに、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する
反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジ
ンまたは抗体）を使用して検出操作を行う。なお、これ
らの受容体は、工程（ハ）であらかじめ添加しておいて
もよく、この場合、検出工程の一部、すなわちリガンド
と受容体の特異的結合反応は、工程（ハ）と同時に行う
ことができ、全工程を更に簡単にできる。

【００３５】

【実施例】

［実験例］本発明を以下の実験例によって更に詳細
に説明するが、本発明はこれらの実験例に限定されるも
のではない。なお、以下の実験例における遺伝子工学的
手法は、マニアティスらのモレキュラークロニング第２
版〔Cold Spring Harbar Laboratory Press (1989)〕に
従って行った。また、オリゴヌクレオチドはアプライド
バイオシステム社の自動合成機モデル３８１Ａを用いて
行い、一般的手法〔Oligonucleotide Synthesis, IRLPr
ess (1984) 〕により、脱保護および精製して使用し
た。また、ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、オリゴ
ヌクレオチド合成の最後にアミノリンクII（商標）（ア
プライドバイオシステム社製）を付加してアミノ基を導
入し、米国特許第４，８４９，３３６号公報に記載の方
法に従ってビオチンコハク酸イミドエステルと反応して
得た。

【００３６】実験例１固定化用一本鎖ＤＮＡの調製直鎖状の一本鎖ＤＮＡを得るためにMessing らの方法
〔Methods in Enzymology, 101, Part C, 20 (1983) 〕
の変法を利用した。つまり、図１に示す化学合成ＤＮＡ
フラグメントをプラスミドｐＢＳＭ１３^＋（ストラタジ
ーン社製）のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII 切断部位の間に
挿入し、プラスミドｐＵＰＰＯ１を得た。次に、このプ
ラスミドのＨｉｎｃII切断部位に、ヒトパピローマウィ
ルス１６の遺伝子のＥ６とＥ７を含む１．８キロベース
の断片を挿入してプラスミドｐＵＰＰＨＰ１６を得た。
得られたプラスミドで大腸菌ＮＭ５２２を形質転換し、
ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を用いて、常法に従っ
て、一本鎖ＤＮＡを調製した〔Methods in Enzymology,
153, 3-34 (1987) 〕。さらに、得られた一本鎖ＤＮＡ
を直鎖状にするために、制限酵素ＥｃｏＲＩあるいはＢ
ａｍＨＩで切断した。

【００３７】実験例２一本鎖ＤＮＡのプレートへの固定実験例１で得られた一本鎖ＤＮＡを、１０mM Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ pH７．６、１mM ＥＤＴＡ溶液で１００ng／
μｌの濃度とし、これに４倍容のＨ_２Ｏと５倍容の固定
化バッファー（１．５ＭＮａＣｌ、０．３ＭＴｒｉ
ｓ・ＨＣｌ pH８．０、０．３ＭＭｇＣｌ2 ）を加え
て混和し、マイクロプレート（Dynatech社、Immulon 2
、removawell strips 、No. 011-010-6302）に１ウェ
ルあたり１００μｌずつ加えた。プレートはふたをして
３７℃で１６時間放置した。その後、液を除き、３７℃
で３０分間風乾後、ストラタリンカー（商標）２４００
（ストラタジーン社製）を用い、５００，０００μＪの
光照射を行った。光照射後、洗浄バッファー（１ＭＮ
ａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ_２、０．１ＭＴｒｉｓ・ＨＣ
ｌ pH９．３、０．１％ Tween ２０：２００μｌ）で
３回洗浄した。プレートをビニールバックに入れてシー
ルし、４℃で保存した。

【００３８】実験例３プレート中でのハイブリダイゼーションと検出実験例２で得たヒトパピローマウィルス１６遺伝子を含
む一本鎖ＮＤＡを固定したプレートに、ハイブリダイゼ
ーション溶液（５×ＳＳＣ、５×Denhardt's溶液、０．
２％ＳＤＳ、２００μｇ／ml、サケ精子ＤＮＡ：１００
μｌ／ウェル）を加え、更にプローブとして上記ヒトパ
ピローマウィルス１６の遺伝子の一部に相補的なビオチ
ン標識オリゴヌクレオチド（Ｂｉｏ−ＡＴＴＧＴＡＡＴ
ＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＧ、２０ng／ウェル）を加え、
５５℃で３０分間保温した。ハイブリダイゼーション溶
液を除き、２×ＳＳＣ（２００μｌ／ウェル）で３回洗
浄した。これに、ストレプトアビジン‐アルカリフォス
ファターゼ溶液（ＢＲＬ社のストレプトアビジン‐アル
カリフォスファターゼを０．１ＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ
pH７．５、０．３ＭＮａＣｌ、２mMＭｇＣｌ_２、０．
０５％（v/v) Triton X-100 で1/1000に希釈：１００μ
ｌ／ウェル）を加え、２３℃で１０分間振とうした。反
応液を除き、洗浄液（０．１ＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ pH
７．５、０．３ＭＮａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ_２、０．
０５％(v/v) Triton X-100：２００μｌ／ウェル）で３
回洗浄した。洗浄後、ｐ‐ニトロフェニルリン酸溶液
（１ＭジエタノールアミンpH９．８、０．５mM ＭｇＣ
ｌ_２：４mg／ml：１００μｌ／ウェル）を加えて２３℃
で１時間反応し、４０５nmで吸光度を測定した。その結
果は、第１表に示される通りである。

【００３９】第１表吸光度（405nm) ヒトパピローマ遺伝子を含む１．３４一本鎖ＤＮＡを固定したプレートヒトパピローマ遺伝子を含まない０．１３一本鎖ＤＮＡを固定したプレートＤＮＡを固定していないプレート０．１３第１表中の数値は、４０５nmの吸光度で基質によるバッ
クグランドを差し引いた値である。

【００４０】実験例４ＤＮＡのプレートへの固定化に及ぼすＵＶ照射の影響実験例１で得られたプラスミドｐＵＰＰＨＰ１６及びそ
れから得られる一本鎖ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断して
直鎖状としたものをそれぞれ実験例２と同様にしてプレ
ートに固定した。ただし２本鎖ＤＮＡを固定する場合
は、固定化バッファーと混和する前に加熱変性した。そ
の後、実験例２と同様にＵＶ照射を行ったものと、行わ
なかったものの２種類のプレートを作製した。以上のプ
レートを使用し、実験例３と同様にＢｉｏ−ＡＴＴＧＴ
ＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＧを用いてプレートのハ
イブリダイゼーション能を調べた。結果は第２表に示さ
れる通りである。

【００４１】第２表ＵＶ照射ＵＶ照射なし２本鎖ＤＮＡ０．５１０．４８一本鎖ＤＮＡ１．５８０．５６第２表中の数値は、４０５nmの吸光度で基質によるバッ
クグランドを差し引いた値である。

【００４２】実験例５一本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡのプレート固定化後のハイ
ブリダイゼーション能の比較一本鎖ＤＮＡと、２本鎖ＤＮＡを変性したものとのプレ
ート固定化後のハイブリダイゼーション能を比較した。
一本鎖ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡは実験例４とほぼ同様に
して調製した。ただし、一本鎖ＤＮＡは環状のまま固定
した。実験例２に従って、１ウェル当り、１μｇ、１０
０ｎｇ、１０ngのＤＮＡを加えて固定化した。実験例３
で示した方法に従ってＢｉｏ−ＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧ
ＣＴＣＴＧＴＣＣＧをプローブとして各々のプレートの
ハイブリダイゼーション能を調べた。その結果は、図２
に示される通りである（４０５nmでの吸光度の測定は、
マイクロプレートリーダーで行った）。

【００４３】実験例６遺伝子増幅法による標識とその生成物の検出ならびに点
突然変異の検出ヒトβ‐グロビン遺伝子の検出を行うためにコドン２番
目から１１番目に対応する遺伝子を化学合成し、プラス
ミドｐＵＣｆ１のＨｉｎｃII部位に挿入した（図３）。
なお、正常な遺伝子（βＡ）とβ‐サラセミアの原因で
ある点突然変異遺伝子（βＳ）の両方について同様の操
作を行った。得られたクローンのうちセンス鎖の一本鎖
ＤＮＡが得られるものを選び、一本鎖ＤＮＡを調製し
た。得られた一本鎖ＤＮＡは実験例２に従ってプレート
に環状のまま固定した。

【００４４】つぎに、遺伝子増幅反応を行った。反応は
Cetus 社のGeneAmp （商標）を使用し、そのプロトコー
ルに従った。プライマーは５′ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣとビオチン標識したＢｉｏ‐ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣを用い、テンプレートとしてはβ‐グロビン遺伝子のＰ
ｓｔＩ消化により得られる４．４キロベース断片〔Hemo
globin, 13, 657-670 (1989)〕を使用した。

【００４５】遺伝子増幅後、反応液の一部をとり、熱変
性したのち実験例３と同様にしてハイブリダイゼーショ
ン検出を行った。結果は第３表に示される通りである
（測定値はマイクロプレートリーダーによる値であ
る）。

【００４６】第３表吸光度（405nm) βＡを固定したプレート０．４３２ βＳを固定したプレート０．２８８ β‐グロビンを含まない０．０３７ DNA を固定したプレート

【００４７】実験例７オリゴヌクレオチドの繰り返しを含む一本鎖ＤＮＡの調
製ヒトパピローマウイルス１６のＥ７遺伝子の一部を化学
合成し、図４に示す方法でその単位配列の繰り返しを含
む一本鎖ＤＮＡを調製した。

【００４８】まず、図４に示すようなオリゴヌクレオチ
ド２種を化学合成し、その５’末端をポリヌクレオチド
リン酸化酵素とＡＴＰを用いてリン酸化した。次にこの
２種のオリゴヌクレオチドを混合して二本鎖を形成し、
この二本鎖のフラグメント同士をＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて結合させ、その後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
のＫｌｅｎｏｗ断片と４種のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸を用いて平滑末端とした。反応生成物を６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、２７０塩基対に相当
する部分を切りとってＤＮＡを回収した。

【００４９】次に、プラスミドｐＵＣ−Ｓｆｉ×２（特
開平２−１９０１９４号公報）を制限酵素ＢａｍＨＩで
切断し、アルカリホスファターゼで５’末端のリン酸を
除去したものを調製した。これと、先にポリアクリルア
ミドゲルから回収したＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合し、それを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換
した。目的のクローンをプラスミド中のアンピシリン耐
性選択マーカーにによって選択し、得られたプラスミド
ｐＵＣ−Ｓｆｉ２７×を制限酵素ＳｆｉＩで切断し、電
気泳動を用いて該配列の繰り返しを含む部分を精製、回
収した。さらに、この断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て自己結合させ、プラスミドｐＵＣ１１９Ｓ〔ｐＵＣ１
１９のＢａｍＨＩ切断部位にＳｆｉＩリンカー（ＮＥＢ
社：＃１１３８）を挿入したもの〕の制限酵素ＳｆｉＩ
部位に挿入した。この自己結合の程度によって単位配列
の数が異なるクローンが得られる。本実験では、挿入さ
れた単位配列の数が、９、１４、６４、１６５のクロー
ンが得られた。

【００５０】実験例８オリゴヌクレオチドを繰り返し挿入したプローブの効果実験例７で得られたクローンならびに別途調製した単位
配列を１個持つクローンのそれぞれから、実験例１と同
様にして一本鎖のＤＮＡを調製し、実験例２と同様にし
てマイクロプレートに固定した。

【００５１】つぎに、以下に示すビオチン標識した２種
のプライマーＢｉｏ−ＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＢｉｏ−ＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＧを用い、パピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）のＥ７
遺伝子を含むプラスミドを鋳型として以下のように遺伝
子増幅反応を行った。

【００５２】プラスミドｐＵＰＰＨＰ１６（実施例１参
照）１０ngとプライマー各１００ngに、シータス社のGe
neAmp （商標）の試薬をプロトコールに従って加え、反
応液全量を１００μl とした。反応液をパーキンエルマ
ーシータス社のサーマルサイクラーで９５℃で５分間加
熱してＤＮＡを変性させた後、これにAmpliTaq（商標）
２．５単位を加え、７２℃で６０秒、９４℃で３０秒、
５０℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返した。

【００５３】この反応液の一部（水で１０倍希釈したも
の５μｌ）を熱変性し、実験例３に示す方法と同様の条
件で、先に用意した、一本鎖ＤＮＡを固定したマイクロ
プレートを用いてハイブリダイゼーションを行い、吸光
度を測定した。

【００５４】得られた結果は図５に示される通りであ
る。この図から明らかなように、単位配列が６４個ある
いは１６５個の場合、単位配列が１個の場合に比べてお
よそ２０倍の感度であった。

【００５５】実験例９迅速簡易なヒトパピローマウイルス１６遺伝子の検出本法におけるハイブリダイゼーションをより簡易化する
ために、ハイブリダイゼーション溶液組成、ハイブリダ
イゼーション温度および発色時間の検討を行い、以下に
示すような簡易化した条件でヒトパピローマウイルス１
６遺伝子の検出を行った。

【００５６】陽性の試料としてカスキー細胞から抽出し
たＤＮＡ１０ng、陰性の試料としてヒト末梢血から抽出
したＤＮＡ１０ngを鋳型として実験例８と同様にしてＰ
ＣＲ法により遺伝子増幅を行った。得られた反応液を、
実験例８で調製した単位オリゴヌクレオチドの繰り返し
が１の一本鎖ＤＮＡと繰り返しが６４の一本鎖ＤＮＡを
固定化したマイクロプレートにそれぞれ加え、ハイブリ
ダイゼーションを行った。すなわち、一本鎖ＤＮＡを固
定したプレートにハイブリダイゼーション溶液（５×Ｓ
ＳＣ、０．２％ＳＤＳ）１００μｌと上記ＰＣＲ反応液
５μｌを加え、３７℃で３０分間ハイブリダイゼーショ
ンを行った後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し
て、洗浄液（２×ＳＳＣ）２００μｌで３回洗浄した。

【００５７】これに、ストレプトアビジン‐アルカリフ
ォスファターゼ溶液（ＢＲＬ社のストレプトアビジン‐
アルカリフォスファターゼを０．１ＭＴｒｉｓ‐ＨＣ
ｌpH７．５、０．３ＭＮａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ_２、
０．０５％（v/v) TritonX-100 で1/1000に希釈：１０
０μｌ／ウェル）を加え、２３℃で１０分間振とうし
た。反応液を除き、洗浄液（０．１ＭＴｒｉｓ‐ＨＣ
ｌ pH７．５、０．３ＭＮａＣｌ、２mM ＭｇＣ
ｌ_２、０．０５％(v/v) Triton X-100：２００μｌ／ウ
ェル）で３回洗浄した。洗浄後、ｐ‐ニトロフェニルリ
ン酸溶液（１ＭジエタノールアミンpH９．８、０．５mM
ＭｇＣｌ_２：４mg／ml：１００μｌ／ウェル）を加え
て２３℃で２０分間反応し、４０５nmで吸光度を測定し
た。その結果は、第４表に示される通りである。この表
から明らかなように、操作法を簡易化しても単位配列が
６４挿入されたもので、有意に陽性と陰性を区別するこ
とが出来た。

【００５８】第４表＼プレート単位オリゴヌクレオチド単位オリゴヌクレオチド試料＼１６４陽性試料０．０４０．７３（Caski 細胞由来）陰性試料０．０００．０２（正常人由来）＊数値は４０５mmの吸光度で基質によるバックグラウンドを差し引いたものである。

【００５９】実験例１０ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の変異の検出下記の２種のビオチン標識したプライマー〔ＧＬＰＤＲ
Ｂ１：ＨＬＡ−ＤＲＢのアミノ酸１７番目から２３番目
に相当、ＧＡＭＰＤＲＢ１：ＨＬＡ−ＤＲＢのアミノ酸
８７番目から９４番目に相当、J. Exp. Med., 169, 226
3-2267 (1989)〕Ｂｉｏ−ＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＢｉｏ−ＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ
Ｃを用いて、実験例８に示した方法と同様にして、ヒト末
梢血より抽出したＤＮＡ１μｇを鋳型としてＰＣＲによ
り遺伝子増幅を行った。また、図６に示すような単位配
列（プローブ１，２および３）を、実験例７に示した方
法と同様にして繰り返し結合し、プレートに固定した。
プローブ１は遺伝子型ＤＲ４に完全に相補的であり、プ
ローブ２は遺伝子型ＤＲ４／ＤW １０およびＤＲW １３
に完全に相補的である（図６）。また、プローブ３は全
ての遺伝子型に共通するものである。プローブ１および
プローブ２は単位オリゴヌクレオチドが５０、プローブ
３については単位オリゴヌクレオチドが１０のものを使
用した。

【００６０】遺伝子増幅の反応サイクルは、９４℃で３
０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒を３０回繰り返
した。得られた反応液５μｌを、実験例３と同様にし
て、プローブ１、プローブ２およびプローブ３を固定し
たプレートに加えてハイブリダイゼーション検出を行っ
た。ただし、ハイブリダイゼーションは６０℃で１時
間、発色は２３℃で１時間行った。

【００６１】結果は第５表に示される通りである。プロ
ーブ１、プローブ２はともに、配列に高い相同性がある
とされる型に高い吸光度を示しており、この結果から本
発明がＨＬＡ遺伝子のタイピングに有効であることが示
された。

【００６２】第５表試料遺伝子型プローブ１プローブ２プローブ３１ＤＲ４／Ｄｗ１５，ＤＲ９７．５＊０．１２１０．１＊２ＤＲ４／Ｄｗ１５１３．７＊０．１８９．０＊３ＤＲｗ１３，ＤＲｗ１４０．３５６．６＊１７．８＊４ＤＲ９，ＤＲｗ１３１．５１．５＊１０．０＊５ＤＲｗ８／Ｄｗ８．３，ＤＲ９６．９０．１７１２．１＊６ＤＲｗ１４０．３７０．１９１８．０＊７ＤＲ２０．６７１．１０１５．３＊＊：プローブが完全に相補的であると推定されるもの。＊＊：数値は４０５mmの吸光度で基質によるバックグラウンドを差し引いたものであり、また吸光度２以上の場合には希釈して測定した値を原液の値に換算した。

【００６３】

【配列表】

【００６４】配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴５′末端のＡにスペーサーを介してビオチンが結合して
いる配列 ATTGTAATGG GCTCTGTCCG 20

【００６５】配列番号：２配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACACAACTGT GTGTTCACTA GC 22

【００６６】配列番号：３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴５′末端のＣにスペーサーを介してビオチンが結合して
いる配列 CAACTTCATC CACGTTCACC 20

【００６７】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴５′末端のＧにスペーサーを介してビオチンが結合して
いる配列 GCAACCAGCG ACAACTGATC 20

【００６８】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴５′末端のＴにスペーサーを介してビオチンが結合して
いる配列 TTCTTCAATG GGACGGAGCG 20

【００６９】配列番号：６配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴５′末端のＧにスペーサーを介してビオチンが結合して
いる配列 GCCGCTGCAC TGTGAAGCTCG TC 22

【００７０】配列番号：７配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CAGCTGAATT CGGATCCGTC GACGGATCCG AATTCAGCTG 40

【００７１】配列番号：８配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCTGCCGTT 30

【００７２】配列番号：９配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CACCTGACTC CTGTGGAGAA GTCTGCCGTT 30

【００７３】配列番号：１０配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGGTATGAGC AATTAAATGA CAGCTCA 27

【００７４】配列番号：１１配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACCTTGAGCT GTCATTTAAT TGCTCAT 27

【００７５】配列番号：１２配列の長さ：３００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト（Homo sapiens）配列の特徴ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＲ遺伝子の一部配列 GGGGACACCC GACCACGTTT CTTGTGGCAG CTTAAGTTTG AATGTCATTT CTTCAATGGG 60 ACGGAGCGGG TGCGGTTGCT GGAAAGATGC ATCTATAACC AAGAGGAGTC CGTGCGCTTC 120 GACAGCGACG TGGGGGAGTA CCGGGCGGTG ACGGAGCTGG CGCGGCCTGA TGCCGAGTAC 180 TGGAACAGCC AGAAGGACCT CCTGGAGCAG AGGCGGGCCG CGGTGGACAC CTACTGCAGA 240 CACAACTACG GGGTTGGTGA GAGCTTCACA GTGCAGCGGC GAGTTGAGCC TAAGGTGACT 300

【００７６】配列番号：１３配列の長さ：３００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト（Homo sapiens）配列の特徴ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＲ遺伝子の一部配列 GGGGACACCC GACCACGTTT CTTGGAGCAG GTTAAACATG AGTGTCATTT CTTCAACGGG 60 ACGGAGCGGG TGCGGTTCCT GGACAGATAC TTCTATCACC AAGAGGAGTA CGTGCGCTTC 120 GACAGCGACG TGGGGGAGTA CCGGGCGGTG ACGGAGCTGG CGCGGCCTGA TGCCGAGTAC 180 TGGAACAGCC AGAAGGACCT CCTGGAGCAG AAGCGGGCCG CGGTGGACAC CTACTGCAGA 240 CACAACTACG GGGTTGGTGA GAGCTTCACA GTGCAGCGGC GAGTCTATCC TGAGGTGACT 300

【００７７】配列番号：１４配列の長さ：３００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト（Homo sapiens）配列の特徴ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＲ遺伝子の一部配列 GGGGACACCC GACCACGTTT CTTGGAGCAG GTTAAACATG AGTGTCATTT CTTCAACGGG 60 ACGGAGCGGG TGCGGTTCCT GGACAGATAC TTCTATCACC AAGAGGAGTA CGTGCGCTTC 120 GACAGCGACG TGGGGGAGTA CCGGGCGGTG ACGGAGCTGG CGCGGCCTGA TGCCGAGTAC 180 TGGAACAGCC AGAAGGACAT CCTGGAAGAC GAGCGGGCCG CGGTGGACAC CTACTGCAGA 240 CACAACTACG GGGTTGTGGA GAGCTTCACA GTGCAGCGGC GANNNNNNNN NNNNNNNNNN 300

【００７８】配列番号：１５配列の長さ：３００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト（Homo sapiens）配列の特徴ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＲ遺伝子の一部配列 GGGGACACCA GACCACGTTT CTTGGAGTAC TCTACGTCTG AGTGTCATTT CTTCAATGGG 60 ACGGAGCGGG TGCGGTTCCT GGACAGATAC TTCCATAACC AGGAGGAGAA CGTGCGCTTC 120 GACAGCGACG TGGGGGAGTT CCGGGCGGTG ACGGAGCTGG CGCGGCCTGA TGCCGAGTAC TGGAACAGCC AGAAGGACAT CCTGGAAGAC GAGCGGGCCG CGGTGGACAC CTACTGCAGA CACAACTACG GGGTTGTGGA GAGCTTCACA GTGCAGCGGC GAGTCCATCC TAAGGTGACT

【００７９】配列番号：１６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TACTTCTATC ACCAAGAGAA 20

【００８０】配列番号：１７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GAAGACGAGC GGGCCGCG 18

【００８１】配列番号：１８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TGCAGACACA ACTACGGG 18

【図面の簡単な説明】

【図１】直鎖状一本鎖ＤＮＡ調製のための改良ベクター
の構築法ならびにその一本鎖ＤＮＡの調製法を示した図
である。

【図２】マイクロプレートに固定した一本鎖ＤＮＡと二
本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率の比較結果を
示した図である。

【図３】β‐サラセミアの点突然変異検出における固定
化一本鎖ＤＮＡ調製用ベクターへの挿入塩基配列を示し
た図である。

【図４】ヒトパピローマウイルス１６遺伝子に相補的な
単位配列を繰り返し含んだプラスミドベクターの調製法
を示したものである。

【図５】固定化したプローブの単位配列の数と感度の関
係を示す図である。

【図６】ＨＬＡ−ＤＢ遺伝子のそれぞれの型の配列なら
びに本発明で使用したプローブの配列を示すものであ
る。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸の検出法であって、（イ）検出すべき目的核酸を標識化する工程と、（ロ）前記目的核酸と特異的にハイブリダイズ可能な
配列を５〜２００コピー含んでなる一本鎖核酸を、マイ
クロタイターウエルに非特異的結合によって固定化し、
該一本鎖核酸に対する相補鎖が存在しない状態におく工
程と、（ハ）工程（イ）で標識した目的核酸と、工程（ロ）
で固定化された一本鎖核酸とをハイブリダイゼーション
反応させる工程と、（ニ）工程（ハ）と同時にまたはその後、目的核酸に
存在する標識を利用して、目的核酸を検出する工程とを
含んでなる、方法。
【請求項２】工程（イ）で標識される目的核酸が、検体
由来の核酸に相当する合成核酸または検体由来の核酸と
相補的な合成核酸である、請求項１記載の核酸の検出
法。
【請求項３】前記一本鎖核酸がファージベクターまたは
ファージとプラスミドとの複合ベクターにより調製され
たものである、請求項１または２に記載の核酸の検出
法。