JPH0630776A - Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置 - Google Patents
Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置Info
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- JPH0630776A JPH0630776A JP18511892A JP18511892A JPH0630776A JP H0630776 A JPH0630776 A JP H0630776A JP 18511892 A JP18511892 A JP 18511892A JP 18511892 A JP18511892 A JP 18511892A JP H0630776 A JPH0630776 A JP H0630776A
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- dna
- reaction tube
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Abstract
(57)【要約】
〔構成〕ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマー
ＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液を移動相として、例
えば94℃、55℃、及び73℃に調節された加熱部が外部に
設けられた反応管内を移動させる工程を含むＰＣＲ反応
方法を用いたＤＮＡ増幅方法及び該方法に使用するＤＮ
Ａ増幅装置。 〔効果〕極めて正確な加熱時間でＰＣＲ法行うことがで
き、加熱時間の遅れによる酵素の失活もなく、増幅効率
が低下することがない。蒸発防止用のオイルを使用する
必要もなく、多数の試料を用いて同時に増幅反応を行な
うことができるので有用である。
ＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液を移動相として、例
えば94℃、55℃、及び73℃に調節された加熱部が外部に
設けられた反応管内を移動させる工程を含むＰＣＲ反応
方法を用いたＤＮＡ増幅方法及び該方法に使用するＤＮ
Ａ増幅装置。 〔効果〕極めて正確な加熱時間でＰＣＲ法行うことがで
き、加熱時間の遅れによる酵素の失活もなく、増幅効率
が低下することがない。蒸発防止用のオイルを使用する
必要もなく、多数の試料を用いて同時に増幅反応を行な
うことができるので有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微量の遺伝子ＤＮＡを
効率よく増幅するポリメラーゼ連鎖反応法を用いたＤＮ
Ａ増幅方法に関する。さらに詳しくはＤＮＡポリメラー
ゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含
む反応液を移動相として反応管内を移動させるＤＮＡ増
幅方法及び該方法に使用する装置に関する。
効率よく増幅するポリメラーゼ連鎖反応法を用いたＤＮ
Ａ増幅方法に関する。さらに詳しくはＤＮＡポリメラー
ゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含
む反応液を移動相として反応管内を移動させるＤＮＡ増
幅方法及び該方法に使用する装置に関する。
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】微量な
ＤＮＡを効率的に増幅する方法として、ポリメラーゼ連
鎖反応法(polymerase chain reaction, ＰＣＲ法) が知
られている（米国特許第 4,683,202号明細書）。この方
法は、目的のＤＮＡを熱変性し、得られた１本鎖のＤＮ
Ａに２種類のプライマーをアニーリングし、その後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを作用させて２本鎖ＤＮＡを合成し、
さらにこの２本鎖ＤＮＡを熱変性して１本鎖ＤＮＡを得
た後に、プライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラ
ーゼによる相補的ＤＮＡの合成というサイクルを繰り返
すことにより、指数関数的に目的ＤＮＡを増幅させるこ
とができる方法である。ＰＣＲ法は、一般的には約94℃
で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程、プライマーを約55℃
でアニーリングする工程、及び耐熱性のＤＮＡポリメラ
ーゼを使用して約72℃で相補鎖の複製を行う工程を含む
サイクルを繰り返すことにより行われる。従って、各工
程における温度及び反応時間の管理が重要である。
ＤＮＡを効率的に増幅する方法として、ポリメラーゼ連
鎖反応法(polymerase chain reaction, ＰＣＲ法) が知
られている（米国特許第 4,683,202号明細書）。この方
法は、目的のＤＮＡを熱変性し、得られた１本鎖のＤＮ
Ａに２種類のプライマーをアニーリングし、その後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを作用させて２本鎖ＤＮＡを合成し、
さらにこの２本鎖ＤＮＡを熱変性して１本鎖ＤＮＡを得
た後に、プライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラ
ーゼによる相補的ＤＮＡの合成というサイクルを繰り返
すことにより、指数関数的に目的ＤＮＡを増幅させるこ
とができる方法である。ＰＣＲ法は、一般的には約94℃
で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程、プライマーを約55℃
でアニーリングする工程、及び耐熱性のＤＮＡポリメラ
ーゼを使用して約72℃で相補鎖の複製を行う工程を含む
サイクルを繰り返すことにより行われる。従って、各工
程における温度及び反応時間の管理が重要である。
【０００２】ＰＣＲ法を自動的に行う装置として、反応
混合物を含むエッペンドルフ型サンプルチューブをアル
ミ製のブロックに設けられたウェルに挿入し、該アルミ
ブロックの温度をヒーターと冷却器を用いて変化させる
ことにより反応を行う装置が知られている(DNA Thermal
Cycler, Perkin-Elmer Cetus Instruments)。この装置
では、ヒートブロックとサンプルチューブの間の熱伝導
を促進するために、ウェルとサンプルチューブにより形
成される間隙にオイルを充填する等の工夫が施されてい
る。しかし、この手段によっても、ヒートブロックの温
度を変化させ始めてからサンプルチューブ内の反応液の
温度が目的温度に到達するまでに１０ないし３０秒程度
の遅れがあった。このため、この様な時間的遅れによっ
て変性過程（約94℃）の反応時間が延長され、酵素の失
活を招き、その結果増幅効率が低下してしまう問題があ
った。また、反応液の温度を水の沸点近くまで上昇させ
るため、水分の蒸発やサンプルチューブの蓋の内側での
水滴が形成されるので、これを防止するために、サンプ
ルチューブ内の反応液表面に蒸発防止用のオイルを積層
しておく必要があった。さらに、多数の試料を用いて増
幅反応を行なう場合には、各試料を別々のサンプルチュ
ーブに調製して反応させる必要があり、操作が煩雑であ
った。また、サンプルチューブを固定したバケットを３
つの異なる温度に設定された恒温槽に対して次々に機械
的に浸漬せしめるＰＣＲ装置が知られている(ThermalSe
quencer, Iwaki)。しかし、この反応装置は大がかりで
あるという欠点があった。
混合物を含むエッペンドルフ型サンプルチューブをアル
ミ製のブロックに設けられたウェルに挿入し、該アルミ
ブロックの温度をヒーターと冷却器を用いて変化させる
ことにより反応を行う装置が知られている(DNA Thermal
Cycler, Perkin-Elmer Cetus Instruments)。この装置
では、ヒートブロックとサンプルチューブの間の熱伝導
を促進するために、ウェルとサンプルチューブにより形
成される間隙にオイルを充填する等の工夫が施されてい
る。しかし、この手段によっても、ヒートブロックの温
度を変化させ始めてからサンプルチューブ内の反応液の
温度が目的温度に到達するまでに１０ないし３０秒程度
の遅れがあった。このため、この様な時間的遅れによっ
て変性過程（約94℃）の反応時間が延長され、酵素の失
活を招き、その結果増幅効率が低下してしまう問題があ
った。また、反応液の温度を水の沸点近くまで上昇させ
るため、水分の蒸発やサンプルチューブの蓋の内側での
水滴が形成されるので、これを防止するために、サンプ
ルチューブ内の反応液表面に蒸発防止用のオイルを積層
しておく必要があった。さらに、多数の試料を用いて増
幅反応を行なう場合には、各試料を別々のサンプルチュ
ーブに調製して反応させる必要があり、操作が煩雑であ
った。また、サンプルチューブを固定したバケットを３
つの異なる温度に設定された恒温槽に対して次々に機械
的に浸漬せしめるＰＣＲ装置が知られている(ThermalSe
quencer, Iwaki)。しかし、この反応装置は大がかりで
あるという欠点があった。
【０００３】従って本発明は、上記の欠点のないポリメ
ラーゼ連鎖反応方法を用いたＤＮＡ増幅方法及び該方法
に使用する装置を提供することを目的とするものであ
る。
ラーゼ連鎖反応方法を用いたＤＮＡ増幅方法及び該方法
に使用する装置を提供することを目的とするものであ
る。
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく鋭意努力した結果、ポリメラーゼ連鎖反応
反応を行うにあたり、ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮ
Ａ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液を移
動相として用い、外部に加熱部が設けられた反応管内を
移動させることにより、該反応液の反応温度及び反応時
間を厳密に調節することができ、効率よくポリメラーゼ
連鎖反応反応を行うことができることを見出し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰ
を含む反応液を移動相として外部に加熱部が設けられた
反応管内を移動させる工程を含むＰＣＲ反応方法を用い
たＤＮＡ増幅方法及び該方法に使用する装置を提供する
ものである。
を解決すべく鋭意努力した結果、ポリメラーゼ連鎖反応
反応を行うにあたり、ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮ
Ａ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液を移
動相として用い、外部に加熱部が設けられた反応管内を
移動させることにより、該反応液の反応温度及び反応時
間を厳密に調節することができ、効率よくポリメラーゼ
連鎖反応反応を行うことができることを見出し、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰ
を含む反応液を移動相として外部に加熱部が設けられた
反応管内を移動させる工程を含むＰＣＲ反応方法を用い
たＤＮＡ増幅方法及び該方法に使用する装置を提供する
ものである。
【０００４】本発明の方法に使用される反応液には、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及
びｄＮＴＰが含まれる。鋳型ＤＮＡは増幅の目的となる
ＤＮＡであり、天然型または非天然型のいずれのＤＮＡ
であってもよい。鋳型ＤＮＡは、当業者に自明の方法に
より、例えば細胞からSDSIプロテアーゼＫ処理により調
製される。また、コロニーから直接抽出したＤＮＡを用
いることもできる。通常、鋳型ＤＮＡは約0.01〜100PM
、好ましくは0.1 〜10PMの濃度で使用すればよい。Ｄ
ＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡ増幅に使用されるＤ
ＮＡポリメラーゼとして当業者に自明ないかなるＤＮＡ
ポリメラーゼを使用してもよい。本発明の方法に好適に
使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性のＤＮ
Ａポリメラーゼを挙げることができる。例えば、耐熱酵
素の Tth(thermus thermophilus)ポリメラーゼ、Taq(th
ermus aquaticus)ポリメラーゼ等を使用することが好ま
しい。これらのＤＮＡポリメラーゼは、通常10〜40U/m
l、好ましくは20U/mlの濃度で使用される。
ＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及
びｄＮＴＰが含まれる。鋳型ＤＮＡは増幅の目的となる
ＤＮＡであり、天然型または非天然型のいずれのＤＮＡ
であってもよい。鋳型ＤＮＡは、当業者に自明の方法に
より、例えば細胞からSDSIプロテアーゼＫ処理により調
製される。また、コロニーから直接抽出したＤＮＡを用
いることもできる。通常、鋳型ＤＮＡは約0.01〜100PM
、好ましくは0.1 〜10PMの濃度で使用すればよい。Ｄ
ＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡ増幅に使用されるＤ
ＮＡポリメラーゼとして当業者に自明ないかなるＤＮＡ
ポリメラーゼを使用してもよい。本発明の方法に好適に
使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性のＤＮ
Ａポリメラーゼを挙げることができる。例えば、耐熱酵
素の Tth(thermus thermophilus)ポリメラーゼ、Taq(th
ermus aquaticus)ポリメラーゼ等を使用することが好ま
しい。これらのＤＮＡポリメラーゼは、通常10〜40U/m
l、好ましくは20U/mlの濃度で使用される。
【０００５】プライマーＤＮＡとしては、ＤＮＡ増幅法
に使用できるプライマーＤＮＡとして当業者に自明なも
のを使用すればよいが、例えば、20-mer程度の合成ＤＮ
Ａを使用することができる。プライマーＤＮＡは、例え
ば、約 100〜1,000 nM、好ましくは 200〜500 nMの濃度
で使用すればよい。プライマーＤＮＡは、ＤＮＡ自動合
成機を用ることにより必要に応じて当業者が容易に製造
できる。上記のＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーＤＮ
Ａは、本発明の方法を行うにあたり、増幅効率を最大に
すべく選択されることが好ましいが、このような選択は
当業者によれば容易になされることである。また、本明
細書において、ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、及びｄＣＴＰの任意の割合の混合物であると定義さ
れるが、これら４種のヌクレオチドトリリン酸の等量混
合物を使用することが好ましい。例えば、反応液中に４
種のヌクレオチドトリリン酸が10〜100 μM の濃度で含
有されることが好ましい。さらに、本発明の方法に使用
される反応液は、以上の成分のほかに緩衝剤を含むこと
が好ましい。ＰＣＲ法に用いられるＤＮＡポリメラーゼ
は、一般に反応に使用される緩衝液の種類によって増幅
効率が異なるので、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類
に応じて、好適な緩衝剤を選択することが好ましい。Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及
びｄＮＴＰの配合割合、及び緩衝剤の濃度は、目的に応
じて適宜調整すればよいが、このような調整は当業者に
より容易になされるものである。
に使用できるプライマーＤＮＡとして当業者に自明なも
のを使用すればよいが、例えば、20-mer程度の合成ＤＮ
Ａを使用することができる。プライマーＤＮＡは、例え
ば、約 100〜1,000 nM、好ましくは 200〜500 nMの濃度
で使用すればよい。プライマーＤＮＡは、ＤＮＡ自動合
成機を用ることにより必要に応じて当業者が容易に製造
できる。上記のＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーＤＮ
Ａは、本発明の方法を行うにあたり、増幅効率を最大に
すべく選択されることが好ましいが、このような選択は
当業者によれば容易になされることである。また、本明
細書において、ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、及びｄＣＴＰの任意の割合の混合物であると定義さ
れるが、これら４種のヌクレオチドトリリン酸の等量混
合物を使用することが好ましい。例えば、反応液中に４
種のヌクレオチドトリリン酸が10〜100 μM の濃度で含
有されることが好ましい。さらに、本発明の方法に使用
される反応液は、以上の成分のほかに緩衝剤を含むこと
が好ましい。ＰＣＲ法に用いられるＤＮＡポリメラーゼ
は、一般に反応に使用される緩衝液の種類によって増幅
効率が異なるので、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類
に応じて、好適な緩衝剤を選択することが好ましい。Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、及
びｄＮＴＰの配合割合、及び緩衝剤の濃度は、目的に応
じて適宜調整すればよいが、このような調整は当業者に
より容易になされるものである。
【０００６】本発明の方法は、上記の反応液中でＰＣＲ
反応を行うにあたり、この反応液を移動相として用い、
外部に加熱が設けられた反応管内を移動させることを特
徴とするＤＮＡ増幅方法である。本発明の方法に使用す
る反応管としては、反応管の内部で行われるＰＣＲ反応
に影響を与えない部材により形成されたものならば、い
かなるものを使用してもよい。例えば、テフロン、ポリ
エチレン、ガラス、ステンレス等により形成された反応
管を挙げることができる。反応管の内径は、0.02〜1 m
m、好ましくは0.05〜0.5 mmとすればよい。反応管の内
径は、一回に処理される反応液の容量に応じて適宜選択
すればよく、微小径の反応管を使用すれば微量のＤＮＡ
増幅反応を行うことができる。例えば、超微量の反応を
行う場合には、ガラスキャピラリーを反応管として使用
することができる。反応管の肉厚は、反応管の外側に設
置された加熱部から反応管内部の反応液への熱伝導が著
しく低下しない限り、いかなるものでもよい。従って、
反応管の外径は使用される部材の種類により異なるが、
一般には、0.1 〜2 mm、好ましくは0.2 〜1.5 mmとすれ
ばよい。テフロン製反応管を使用する場合には、好まし
くは内径0.3 〜0.7 mm、外径1.0 〜1.8 mm、特に好まし
くは内径0.５mm、外径1.５mmの反応管を使用すればよ
い。
反応を行うにあたり、この反応液を移動相として用い、
外部に加熱が設けられた反応管内を移動させることを特
徴とするＤＮＡ増幅方法である。本発明の方法に使用す
る反応管としては、反応管の内部で行われるＰＣＲ反応
に影響を与えない部材により形成されたものならば、い
かなるものを使用してもよい。例えば、テフロン、ポリ
エチレン、ガラス、ステンレス等により形成された反応
管を挙げることができる。反応管の内径は、0.02〜1 m
m、好ましくは0.05〜0.5 mmとすればよい。反応管の内
径は、一回に処理される反応液の容量に応じて適宜選択
すればよく、微小径の反応管を使用すれば微量のＤＮＡ
増幅反応を行うことができる。例えば、超微量の反応を
行う場合には、ガラスキャピラリーを反応管として使用
することができる。反応管の肉厚は、反応管の外側に設
置された加熱部から反応管内部の反応液への熱伝導が著
しく低下しない限り、いかなるものでもよい。従って、
反応管の外径は使用される部材の種類により異なるが、
一般には、0.1 〜2 mm、好ましくは0.2 〜1.5 mmとすれ
ばよい。テフロン製反応管を使用する場合には、好まし
くは内径0.3 〜0.7 mm、外径1.0 〜1.8 mm、特に好まし
くは内径0.５mm、外径1.５mmの反応管を使用すればよ
い。
【０００７】該反応管内で上記の反応液を移動させるに
は、所定量の反応液を反応管内に導入した後に、空気、
窒素ガス、アルゴンガス等の気体流体、蒸留水や緩衝液
等の液体流体を反応管内に連続的に導入すればよい。該
流体を連続的に導入するにあたり、ペリスタポンプ、高
速液体クロマトグラフィー用ポンプ等が好適に使用され
る。反応液を反応管に導入するには、例えば高速液体ク
ロマトグラフィー用インジェクターを用いて、マイクロ
シリンジ等により行えばよい。また、反応管内で複数の
異なる反応液を連続的に処理する場合には、所定量の反
応液を反応管内に導入した後に、空気、窒素ガス、アル
ゴンガス等の気体流体やオイル等を導入し、さらに所定
量の反応液を導入すればよい。この操作を繰り返すこと
により、複数の反応液を混じり合わないように反応管内
を搬送させることができ、異なる成分を含む反応液を同
時に処理することができる。図１を参照しつつ、反応管
内での反応液の搬送状態を説明すると、反応液の導入に
先立って、ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマ
ーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含まない緩衝液（フローバッ
ファー）を反応管内に導入し、その後に少量の空気と所
定量の反応液を交互に三回繰り返して反応管に導入し、
最後にフローバッファーを連続的に反応管内に導入し
て、反応管内で反応液を移動させる。
は、所定量の反応液を反応管内に導入した後に、空気、
窒素ガス、アルゴンガス等の気体流体、蒸留水や緩衝液
等の液体流体を反応管内に連続的に導入すればよい。該
流体を連続的に導入するにあたり、ペリスタポンプ、高
速液体クロマトグラフィー用ポンプ等が好適に使用され
る。反応液を反応管に導入するには、例えば高速液体ク
ロマトグラフィー用インジェクターを用いて、マイクロ
シリンジ等により行えばよい。また、反応管内で複数の
異なる反応液を連続的に処理する場合には、所定量の反
応液を反応管内に導入した後に、空気、窒素ガス、アル
ゴンガス等の気体流体やオイル等を導入し、さらに所定
量の反応液を導入すればよい。この操作を繰り返すこと
により、複数の反応液を混じり合わないように反応管内
を搬送させることができ、異なる成分を含む反応液を同
時に処理することができる。図１を参照しつつ、反応管
内での反応液の搬送状態を説明すると、反応液の導入に
先立って、ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プライマ
ーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含まない緩衝液（フローバッ
ファー）を反応管内に導入し、その後に少量の空気と所
定量の反応液を交互に三回繰り返して反応管に導入し、
最後にフローバッファーを連続的に反応管内に導入し
て、反応管内で反応液を移動させる。
【０００８】本発明の方法では、上記の様に反応管内で
反応液を移動させるに際して、反応管の外側に設けられ
た加熱部により、反応管内を移動する反応液の温度を調
節する。一般にＰＣＲ法は、通常約94℃で２本鎖ＤＮＡ
を解離させる工程（変性）、プライマーを約55℃でアニ
ーリングする工程（アニーリング）、及び耐熱性のＤＮ
Ａポリメラーゼを使用して約72℃で相補鎖の複製を行う
工程（伸長）を含むサイクルを基本単位として行われ
る。このため、本発明の方法においては、好ましくは、
反応管の外側にそれぞれ上記３種の温度に調節された変
性工程用加熱部（94℃）、アニーリング工程用加熱部
（55℃）、及び伸長工程用加熱部（72℃）を順次設け、
反応管内を移動する反応液が上記３種の異なる温度で所
定時間加温されるようにすればよい。反応管の材質によ
っては熱伝導率が十分でない場合があるので、このよう
な場合には反応管の外側に設けられた加熱部の温度を反
応液温度よりも若干高めに設定すればよい。通常、反応
液は反応管内を一定速度で移動するように搬送されるの
で、反応管に設けられた加熱部の長さに応じて加熱時間
を調節することができる。また、加熱部の長さを一定に
しておいて反応液の移動速度を変化させて加熱時間を調
節してもよい。加熱部の長さ及び反応液の移動速度の両
者を変化させて加熱時間を調節してもよい。
反応液を移動させるに際して、反応管の外側に設けられ
た加熱部により、反応管内を移動する反応液の温度を調
節する。一般にＰＣＲ法は、通常約94℃で２本鎖ＤＮＡ
を解離させる工程（変性）、プライマーを約55℃でアニ
ーリングする工程（アニーリング）、及び耐熱性のＤＮ
Ａポリメラーゼを使用して約72℃で相補鎖の複製を行う
工程（伸長）を含むサイクルを基本単位として行われ
る。このため、本発明の方法においては、好ましくは、
反応管の外側にそれぞれ上記３種の温度に調節された変
性工程用加熱部（94℃）、アニーリング工程用加熱部
（55℃）、及び伸長工程用加熱部（72℃）を順次設け、
反応管内を移動する反応液が上記３種の異なる温度で所
定時間加温されるようにすればよい。反応管の材質によ
っては熱伝導率が十分でない場合があるので、このよう
な場合には反応管の外側に設けられた加熱部の温度を反
応液温度よりも若干高めに設定すればよい。通常、反応
液は反応管内を一定速度で移動するように搬送されるの
で、反応管に設けられた加熱部の長さに応じて加熱時間
を調節することができる。また、加熱部の長さを一定に
しておいて反応液の移動速度を変化させて加熱時間を調
節してもよい。加熱部の長さ及び反応液の移動速度の両
者を変化させて加熱時間を調節してもよい。
【０００９】図１を参照しつつ説明すると、本発明の方
法は、例えば変性工程を94℃で１分30秒、アニーリング
工程を55℃で２分、及び伸長工程を72℃で３分行う場合
に、反応管の外側に設けられた94℃、55℃、及び72℃の
加熱部の長さを３：４：６に調節して、一定速度で反応
液を搬送することにより行うことができる。反応管の外
側に設けられる加熱部としては、一定の温度を反応管に
供給できるものであればいかなるものを使用してもよい
が、例えばヒートブロック、恒温槽、加熱空気等が好適
に使用される。例えば恒温槽を使用する場合には、94
℃、55℃、及び72℃に設定された３種の恒温槽を使用
し、恒温槽内の温水またはオイル等に所定の長さの反応
管を浸漬すればよい。ＰＣＲ法は、上記の変性工程、ア
ニーリング工程、及び伸長工程を基本サイクルとし、通
常、このサイクルを25〜35回繰り返すことにより行われ
る。図１に示す直線型の反応装置を使用する場合には、
94℃、55℃、及び72℃の加熱部を繰り返し設けて必要な
サイクル数の加熱処理を行えばよい。多数のサイクルを
繰り返す場合には、反応管を例えば螺旋型に加工して、
変性工程用加熱部、アニーリング工程用加熱部、及び伸
長工程用加熱部を繰り返し通過させることにより、効率
よく増幅を行うことができる。例えば加熱部として恒温
槽を使用する場合には、たとえば図２に示されるような
螺旋型に加工された反応管を、反応回数に対応する数だ
け３種類の恒温槽に繰り返し浸漬すればよい。反応管の
末端に例えばフラクションコレクターを設けることによ
り、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを含む反応液を効率
よく回収することができる。また、反応管の途中に例え
ば紫外線検出器等の検出部を設けて増幅過程をモニター
してもよい。
法は、例えば変性工程を94℃で１分30秒、アニーリング
工程を55℃で２分、及び伸長工程を72℃で３分行う場合
に、反応管の外側に設けられた94℃、55℃、及び72℃の
加熱部の長さを３：４：６に調節して、一定速度で反応
液を搬送することにより行うことができる。反応管の外
側に設けられる加熱部としては、一定の温度を反応管に
供給できるものであればいかなるものを使用してもよい
が、例えばヒートブロック、恒温槽、加熱空気等が好適
に使用される。例えば恒温槽を使用する場合には、94
℃、55℃、及び72℃に設定された３種の恒温槽を使用
し、恒温槽内の温水またはオイル等に所定の長さの反応
管を浸漬すればよい。ＰＣＲ法は、上記の変性工程、ア
ニーリング工程、及び伸長工程を基本サイクルとし、通
常、このサイクルを25〜35回繰り返すことにより行われ
る。図１に示す直線型の反応装置を使用する場合には、
94℃、55℃、及び72℃の加熱部を繰り返し設けて必要な
サイクル数の加熱処理を行えばよい。多数のサイクルを
繰り返す場合には、反応管を例えば螺旋型に加工して、
変性工程用加熱部、アニーリング工程用加熱部、及び伸
長工程用加熱部を繰り返し通過させることにより、効率
よく増幅を行うことができる。例えば加熱部として恒温
槽を使用する場合には、たとえば図２に示されるような
螺旋型に加工された反応管を、反応回数に対応する数だ
け３種類の恒温槽に繰り返し浸漬すればよい。反応管の
末端に例えばフラクションコレクターを設けることによ
り、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを含む反応液を効率
よく回収することができる。また、反応管の途中に例え
ば紫外線検出器等の検出部を設けて増幅過程をモニター
してもよい。
【００１０】本発明の別の態様によれば、本発明のＤＮ
Ａ増幅方法を行うためのＤＮＡ増幅装置が提供される。
本発明の装置は、内部でＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮ
Ａ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液が移
動させるための反応管１、該反応管の外側に設けられた
加熱部２、該反応液を該反応管内で移動させるための動
力部３を備えたＤＮＡ増幅装置であり、さらに好ましく
は、該装置はバッファータンク６、反応液導入部４、及
び反応液回収部５が設けられた装置である。反応管及び
加熱部としては上記のものを使用することができ、動力
部としては、例えばHPLCポンプ等を使用すればよい。反
応液導入部としては、例えばHPLC用のインジェクター等
を、反応液回収部にはフラクションコレクター等を使用
すればよい。本発明の装置の１例を図２に示すが、本発
明の装置はこの装置に限定されることはない。
Ａ増幅方法を行うためのＤＮＡ増幅装置が提供される。
本発明の装置は、内部でＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮ
Ａ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液が移
動させるための反応管１、該反応管の外側に設けられた
加熱部２、該反応液を該反応管内で移動させるための動
力部３を備えたＤＮＡ増幅装置であり、さらに好ましく
は、該装置はバッファータンク６、反応液導入部４、及
び反応液回収部５が設けられた装置である。反応管及び
加熱部としては上記のものを使用することができ、動力
部としては、例えばHPLCポンプ等を使用すればよい。反
応液導入部としては、例えばHPLC用のインジェクター等
を、反応液回収部にはフラクションコレクター等を使用
すればよい。本発明の装置の１例を図２に示すが、本発
明の装置はこの装置に限定されることはない。
【００１１】
【発明の効果】本発明の方法によれば、極めて正確な加
熱時間でＰＣＲ法行うことができ、効率よくＤＮＡ増幅
を行うことができる。本発明の方法では、加熱時間の遅
れによる酵素の失活もなく、増幅効率が低下することが
ない。また、水分の蒸発やサンプルチューブの蓋の内側
での水滴形成がないので、蒸発防止用のオイルを使用す
る必要もない。さらに、多数の試料を用いて同時に増幅
反応を行なうことができるので有用である。
熱時間でＰＣＲ法行うことができ、効率よくＤＮＡ増幅
を行うことができる。本発明の方法では、加熱時間の遅
れによる酵素の失活もなく、増幅効率が低下することが
ない。また、水分の蒸発やサンプルチューブの蓋の内側
での水滴形成がないので、蒸発防止用のオイルを使用す
る必要もない。さらに、多数の試料を用いて同時に増幅
反応を行なうことができるので有用である。
【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるこ
とはない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるこ
とはない。
【００１２】図２に示される装置を使用して本発明の方
法を実施した。反応管１としてテフロン反応管（内径0.
５mm、外形1.５mm）を使用し、加熱部２として94℃、55
℃、及び73℃に調節された温水を満たした恒温槽を用い
た。サーモスタットとして各恒温槽にタイテックサーモ
ミンダーを使用した。反応管１の末端は動力部３に接続
されており、動力部から加熱部に至る反応管の途中には
反応液導入部４が設けられている。フローバッファーは
バッファータンク６から供給されている。本実施例で
は、動力部３として日本分光製のHPLCポンプBIP-１、反
応液導入部４としてレオダイン製HPLC用インジェクター
を使用した。反応管１は、加熱部２において94℃の温水
に150 mm、55℃の温水に200 mm、73℃の温水に300 mmの
長さで順次浸漬されており、さらに72℃の温水を出た反
応管１は再度94℃、55℃、及び73℃の温水に同じ長さで
順次浸漬されるように螺旋型に加工されている。94℃の
恒温槽は２本鎖ＤＮＡを解離させるための槽であり、55
℃の恒温槽は１本鎖に解離したＤＮＡにプライマーＤＮ
Ａをアニーリングするための槽であり、73℃の槽はプラ
イマーＤＮＡが結合したＤＮＡから第２鎖の複製を行わ
せる槽である。反応管及び反応管の内部の反応液も同一
の温度に保持されている。反応管１は全体で22巻きの螺
旋を形成しており、反応管１の内部を移動する反応液
は、94℃→55℃→73℃の温度サイクルで22回繰り返し処
理される。73℃の加熱部２を出た反応管１は反応液回収
部５としてフラクションコレクターに接続されており、
ここで反応液の回収が行われる。
法を実施した。反応管１としてテフロン反応管（内径0.
５mm、外形1.５mm）を使用し、加熱部２として94℃、55
℃、及び73℃に調節された温水を満たした恒温槽を用い
た。サーモスタットとして各恒温槽にタイテックサーモ
ミンダーを使用した。反応管１の末端は動力部３に接続
されており、動力部から加熱部に至る反応管の途中には
反応液導入部４が設けられている。フローバッファーは
バッファータンク６から供給されている。本実施例で
は、動力部３として日本分光製のHPLCポンプBIP-１、反
応液導入部４としてレオダイン製HPLC用インジェクター
を使用した。反応管１は、加熱部２において94℃の温水
に150 mm、55℃の温水に200 mm、73℃の温水に300 mmの
長さで順次浸漬されており、さらに72℃の温水を出た反
応管１は再度94℃、55℃、及び73℃の温水に同じ長さで
順次浸漬されるように螺旋型に加工されている。94℃の
恒温槽は２本鎖ＤＮＡを解離させるための槽であり、55
℃の恒温槽は１本鎖に解離したＤＮＡにプライマーＤＮ
Ａをアニーリングするための槽であり、73℃の槽はプラ
イマーＤＮＡが結合したＤＮＡから第２鎖の複製を行わ
せる槽である。反応管及び反応管の内部の反応液も同一
の温度に保持されている。反応管１は全体で22巻きの螺
旋を形成しており、反応管１の内部を移動する反応液
は、94℃→55℃→73℃の温度サイクルで22回繰り返し処
理される。73℃の加熱部２を出た反応管１は反応液回収
部５としてフラクションコレクターに接続されており、
ここで反応液の回収が行われる。
【００１３】上記の装置を使用して、フローバッファー
を反応管１の内部に注入した。フローバッファーの流量
及び加熱部の温度を安定させた後に、マイクロシリンジ
を用いて空気５μl を反応液導入部４から注入した。そ
の後反応液５μl 及び空気５μl を順次注入し、さらに
再度フローバッファーを連続的に注入して反応液を加熱
部に移動させた。反応液及びバッファー組成は以下の表
１に示す通りである。加熱処理後の反応液をフラクショ
ンコレクターで分画して、１％アガロースゲル電気泳動
で生成物を確認した。
を反応管１の内部に注入した。フローバッファーの流量
及び加熱部の温度を安定させた後に、マイクロシリンジ
を用いて空気５μl を反応液導入部４から注入した。そ
の後反応液５μl 及び空気５μl を順次注入し、さらに
再度フローバッファーを連続的に注入して反応液を加熱
部に移動させた。反応液及びバッファー組成は以下の表
１に示す通りである。加熱処理後の反応液をフラクショ
ンコレクターで分画して、１％アガロースゲル電気泳動
で生成物を確認した。
【表１】 Tth ポリメラーゼ： フローバッファー : 67 mM Tris ・塩酸（pH 8.8)/16.6 mM (NH4)2SO4/ 6.7 mM MgCl2 反応バッファー : 67 mM Tris ・塩酸（pH 8.8)/16.6 mM (NH4)2SO4/ 6.7 mM MgCl2/10 mM 2-ME/0.2 mM dNTPs Taq ポリメラーゼ： フローバッファー : 10 mM Tris ・塩酸（pH 8.3)/50 mM KCl/ 2 mM MgCl2 反応バッファー : 10 mM Tris ・塩酸（pH 8.3)/50 mM KCl/ 2 mM MgCl2/0.2 mM dNTPs プライマーＤＮＡ(ABI DNA合成機で合成後、OPC カートリッジで精製) ： UN-24 : 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' UNR-24 : 5'-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3' 鋳型ＤＮＡ： pNF-1 : 1.2 kb PCR プロダクト pUCtDHFR : 0.7 kb PCR プロダクト pBluescript KS+ : 0.23 kb PCR プロダクト
【００１４】試験例１ 鋳型ＤＮＡとして20 ng/μl(10 nM)のpNF-1 を用い、２
種類のＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明の方法を実施
した。結果を表２に示す。表中、＋の数は増幅の程度を
示し、＋の数が多いほど、増幅の程度が高いことを示
す。
種類のＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明の方法を実施
した。結果を表２に示す。表中、＋の数は増幅の程度を
示し、＋の数が多いほど、増幅の程度が高いことを示
す。
【表２】 No. ポリメラーゼ 流速 線速度 処理時間 増幅度 μl/min. mm/min. 94 ℃−55℃−73℃ 例1 Tth 20 102 1'30"- 2' - 3' ＋＋＋ 例2 Taq 20 102 1'30"- 2' - 3' ＋＋ 例3 Tth 40 204 45" - 1'- 1'30" ＋＋例4 Tth 60 306 30" - 40" - 1' ＋
【００１５】試験例２ 鋳型ＤＮＡとしてpNF-1 を用い（0.5% Triton X-100 で
100 ℃、５分間処理したもの）、鋳型ＤＮＡの濃度を変
化させて本発明の方法を実施した。ポリメラーゼとして
Tthポリメラーゼを用い、流速 40 μl/min.、線速度 2
04 mm/min.、処理時間(94 ℃−55℃−73℃) 45" - 1'-
1'30" とした。比較例としてシータス社のサーマルサイ
クラーを用いて同様の実験を行った。結果を表３に示
す。
100 ℃、５分間処理したもの）、鋳型ＤＮＡの濃度を変
化させて本発明の方法を実施した。ポリメラーゼとして
Tthポリメラーゼを用い、流速 40 μl/min.、線速度 2
04 mm/min.、処理時間(94 ℃−55℃−73℃) 45" - 1'-
1'30" とした。比較例としてシータス社のサーマルサイ
クラーを用いて同様の実験を行った。結果を表３に示
す。
【表３】 No. 鋳型ＤＮＡ濃度 増幅度 ng/μl 例5 1 ＋＋＋ 例6 0.1 ＋ 比較例1 0.02 ＋ 比較例2 0.2 ＋ 比較例3 0.4 ＋＋ 比較例4 1.0 ＋＋＋比較例5 2.0 ＋＋＋ 試験例３ 鋳型ＤＮＡとして 1 ng/μl のpNF-1 (1.2 kbpフラグメ
ント) 、pBluescriptKS+ (0.23 kbp フラグメント) 、
及び pUCtDHFR(0.7 kbp フラグメント) を用いて、連続
処理を行った。pNF-1 を含む反応液５μl 、pBluescrip
t KS+ を含む反応液５μl 、及び pUCtDHFR を含む反応
液５μl を１０分間隔でインジェクトした。各反応液間
は空気で分離した。ＤＮＡポリメラーゼとして Tthポリ
メラーゼを用い、流速40μl/min.、線速度 204 mm/mi
n.、処理時間(94 ℃−55℃−73℃)45" - 1'- 1'30" と
した。その結果、各ＰＣＲにおけるクロスコンタミネー
ションはほとんどなく、良好な増幅が可能であった。
ント) 、pBluescriptKS+ (0.23 kbp フラグメント) 、
及び pUCtDHFR(0.7 kbp フラグメント) を用いて、連続
処理を行った。pNF-1 を含む反応液５μl 、pBluescrip
t KS+ を含む反応液５μl 、及び pUCtDHFR を含む反応
液５μl を１０分間隔でインジェクトした。各反応液間
は空気で分離した。ＤＮＡポリメラーゼとして Tthポリ
メラーゼを用い、流速40μl/min.、線速度 204 mm/mi
n.、処理時間(94 ℃−55℃−73℃)45" - 1'- 1'30" と
した。その結果、各ＰＣＲにおけるクロスコンタミネー
ションはほとんどなく、良好な増幅が可能であった。
【図１】本発明の方法を実施するためのＤＮＡ増幅装置
の概念図である。
の概念図である。
【図２】本発明の方法を実施するためのＤＮＡ増幅装置
を示す図である。
を示す図である。
１ 反応管 ２ 加熱部 ３ 動力部 ４ 反応液導入部 ５ 反応液回収部 ６ バッファータンク
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 養王田 正文 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 遠藤 勲 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内
Claims (6)
- 【請求項１】 ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プラ
イマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液を移動相とし
て外部に加熱部が設けられた反応管内を移動させる工程
を含むＰＣＲ反応を用いたＤＮＡ増幅方法。 - 【請求項２】 該加熱部が異なる温度に調節された複数
の加熱部を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 約94℃、約55℃、及び約73℃に調節され
た３種の加熱部を含む請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該反応液を一定速度で反応管内を移動さ
せる請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、プラ
イマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含む反応液を内部で移動
させるための反応管、該反応管の外側に設けられた加熱
部、該反応液を移動させるための動力部を備えたＤＮＡ
増幅装置。 - 【請求項６】 さらに、バッファータンク、反応液導入
部、及び反応液回収部が設けられた請求項５記載の装
置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18511892A JPH0630776A (ja) | 1992-07-13 | 1992-07-13 | Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18511892A JPH0630776A (ja) | 1992-07-13 | 1992-07-13 | Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0630776A true JPH0630776A (ja) | 1994-02-08 |
Family
ID=16165185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18511892A Pending JPH0630776A (ja) | 1992-07-13 | 1992-07-13 | Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630776A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5897842A (en) * | 1996-05-01 | 1999-04-27 | Visible Genetics Inc. | Method and apparatus for thermal cycling and for automated sample preparation with thermal cycling |
| WO2000067893A1 (fr) * | 1999-05-10 | 2000-11-16 | Toyo Kohan Co., Ltd. | Reacteur chimique |
| WO2005005594A1 (ja) * | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Taiyo Yuden Co., Ltd. | 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 |
| JP2008125459A (ja) * | 2006-11-22 | 2008-06-05 | National Agriculture & Food Research Organization | 温度感作実験用金属製微量試験管及びそれを用いた微量液体試料中の微生物の加熱殺菌実験方法 |
| JP2009148232A (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Canon Inc | 核酸増幅装置 |
| CN114480098A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-13 | 吉林正业生物制品股份有限公司 | 一种便携式鸡滑液囊支原体检测装置及其方法 |
-
1992
- 1992-07-13 JP JP18511892A patent/JPH0630776A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5897842A (en) * | 1996-05-01 | 1999-04-27 | Visible Genetics Inc. | Method and apparatus for thermal cycling and for automated sample preparation with thermal cycling |
| WO2000067893A1 (fr) * | 1999-05-10 | 2000-11-16 | Toyo Kohan Co., Ltd. | Reacteur chimique |
| WO2005005594A1 (ja) * | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Taiyo Yuden Co., Ltd. | 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 |
| CN100434502C (zh) * | 2003-07-11 | 2008-11-19 | 太阳诱电株式会社 | 核酸扩增装置及核酸扩增方法 |
| JP2008125459A (ja) * | 2006-11-22 | 2008-06-05 | National Agriculture & Food Research Organization | 温度感作実験用金属製微量試験管及びそれを用いた微量液体試料中の微生物の加熱殺菌実験方法 |
| JP2009148232A (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Canon Inc | 核酸増幅装置 |
| US8623637B2 (en) | 2007-12-21 | 2014-01-07 | Canon Kabushiki Kaisha | Nucleic acid amplification apparatus and thermal cycler |
| CN114480098A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-13 | 吉林正业生物制品股份有限公司 | 一种便携式鸡滑液囊支原体检测装置及其方法 |
| CN114480098B (zh) * | 2022-02-15 | 2023-10-03 | 吉林正业生物制品股份有限公司 | 一种便携式鸡滑液囊支原体检测装置及其方法 |
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