JP2009537152A - 温度サイクルシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年5月17日に出願の米国仮特許出願第60/801178号、2006年7月22日出願の同第60/832492号、2006年12月6日出願の同第60/873084号、および2006年12月6日出願の同第60/873172号の利益を主張し、これらの出願は、参照によって本明細書に組み込まれている。
本明細書で言及する全ての刊行物および特許出願は、参照により、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが、特異的かつ個別に参照により組み込まれていると示されるかのように、本明細書に組み込まれる。
液体金属または熱伝導性の流体等の液体組成物を、加熱ブロックのための加熱および冷却の媒体として使用すると、固体金属製の加熱ブロックより、均一な熱の伝達ならびに加熱および冷却の迅速なサイクルを得る。液体金属製の加熱ブロックを温度サイクラーとして使用する実施形態では、迅速な加熱の立ち上げおよび優れた温度均一性によって、従来の温度サイクラーを使用する場合より、DNAポリメラーゼによるエラー率が低い(図7〜9)。これは、PCR試料が準最適の温度で過ごす時間が短縮したことによる。さらに、増強された温度均一性によって、長い増幅、SNPの同定および配列決定反応の間のエラー率も低下する。
一実施形態では、温度サイクラー本体(101;105)は、ファン(103;153)および取り外し可能な加熱ブロックアセンブリまたは交換型ブロック(105;155)を含む(図1)。交換型ブロック(105;155)は、滑りレール(113;163)上で交換型加熱ブロックを場合により滑らせることによって、温度サイクラー本体(103;153)内に挿入またはそこから取り外される。交換型ブロック(105;155)が、温度サイクラー本体(103;153)内に挿入されたら、温度サイクラー(115;165)のドアを閉じることができる。交換型加熱ブロック(105;155)は、液体組成物容器(111;161)および加熱シンク(107;157)を含み、キャップで覆われた試料(109;159)を場合により含む。一実施形態では、交換型加熱ブロック(図2)は、ウエルを有するレセプタクルを含み、このレセプタクルは、液体組成物を密閉し、その結果、試料槽は、液体(金属、金属合金または金属スラリー)とは接触しない。別の実施形態では、交換型ブロック(105;155)は、ウエル(307;407)を有するレセプタクルのバリアを含み、このレセプタクルのバリアは、液体組成物容器のハウジング(311;411)に対して密閉され、この密閉は、液密であり、ガスケット(309;409)を場合により含んでよい(図3および4)。さらに、液体組成物容器のハウジング(311;411)は、基板(313;413)に対して密閉され、この基板は、金属製プレート(銅またはアルミニウム等)であってよく、この密閉は、液密であり、ガスケット(312;412)を場合により含んでよい。基板(313;413)は、次いで、ペルチェ素子(315;415)に熱的に連結しており、液体組成物を加熱および冷却し、次いで、加熱シンク(417)に連結している。熱分散器(銅、アルミニウム、または高い熱伝導率を有するその他の金属もしくは金属合金)が、基板(313;413)とペルチェ素子(315;415)との間に場合により差し挟まれる。いくつかの実施形態では、交換型ブロック(105;155)は、ねじ(301;401)等の留め具によって一緒に保持される。一実施形態では、交換型ブロックは、第1ピース、例として、48個のウエル(307;407)を有するレセプタクルを含み、この第1ピースは、第2ピース、例として、これらに限定されないが、試料プレート(305;405)単一の試料槽または一連の試料槽などの、試料槽によって占有され、この第2ピース内に、第3ピース、例として、透明なキャッププレート(303;403)、すなわち、単一のキャップまたは一連のキャップが挿入される。一実施形態では、透明なキャッププレート(303;403)、すなわち、単一のキャップまたは一連のキャップは、光ガイド等の突出部を場合により含む。
本発明の別の態様では、温度サイクラーは、サンドイッチ型の液体組成物の加熱ブロックを含む(図5)。ある実施形態では、サンドイッチ型加熱ブロックは、加熱および冷却のペルチェ素子(503;553;573)に熱的に連結している液体組成物容器(501;551;571)を含み、次いで、この素子は、加熱シンク(505;555;575)に熱的に連結しており、側面にあるファン(507;557)に場合により連結している。この実施形態では、液体組成物容器(501;551;571)は、毛細管(581)等、試料槽(559;579)のための開口を含む。一実施形態では、試料槽は、液体組成物と間接的に接触している。代替の実施形態では、試料は、液体組成物から、熱伝導性の変形可能な管によって物理的に分離されている。一実施形態では、加熱シンクは、加熱シンクの放射表面を増加させるための管またはファンを含む。別の実施形態では、試料槽(559;579)のための開口は、ゴム製またはプラスチック製のOリングを含み、このOリングは、液体組成物内に開口を通して置かれた試料槽の周囲に密閉を形成するために、および試料槽を加熱ブロックから引き出す際に試料槽に付着する場合がある液体組成物を拭き取るために、作用する。サンドイッチ型加熱ブロックの実施形態は、少なくとも1個の試料槽、例として、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、192または384個の試料槽のための開口を含むことができる。
代替の実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、連続PCR温度サイクラー中で使用することができる。連続PCR温度サイクラーは、高感度PCRまたはハイスループットPCRが望まれる場合に使用することができる。空気、血液、水またはその他の媒体を、高感度PCRアッセイで連続的に試料採取する必要がある多くの状況が存在する。このアッセイは、インフルエンザ、細菌性病原体および多数のウイルス性または細菌性の病原体を含む、多様な生物学的混入物質を探すために使用することができる。連続PCRによって、PCRをヒトとの相互作用の必要性なしに自動的に実行することが可能になる。また、連続的に試料採取するPCRシステムは、建物、飛行機、バスおよびその他の車両のHVACシステムにおける早期警告システムとしても役立つことができ、血液、水およびその他の汚染される可能性のある源をモニターする場合においても使用することができる。
代替の実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、異なる温度を、加熱ブロックの異なるゾーンで維持することができるように設計される。これによって、勾配PCRの間等、異なるゾーン中のウエル中に位置する異なる試料槽を、異なる温度で同時にサイクルすることが可能になる。一実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、2個以上のゾーン、例として、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24個のゾーンにわたり、温度勾配を維持することができる。ある実施形態では、加熱ブロックは、各温度ゾーンに1個または複数の試料槽ウエル、例として、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24個のウエルを有するレセプタクルを含む。一実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックにわたり、0.1℃から20℃を超過する温度勾配を達成することができる。
液体金属または熱伝導性の流体を含有する液体組成物の加熱ブロックは、固体金属製の加熱ブロックと比較して、より均一な温度をブロックにわたり維持する。固体製の加熱ブロックは、ブロックにわたって、および試料間の変動の両方で、温度の顕著な変動を示す(Schoderら、J.Clin.Micro Biol.2005,43 2724−2728)。従来の固体金属製の温度サイクラーの場合、加熱装置中の任意の所与の点における温度のばらつきが、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックの場合より大きい。+/−3.3℃の大きなばらつきが、従来の温度サイクラーを用いた場合に観察されているが、一方、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックを用いた場合の最も大きなばらつきは、はるかに小さい。一実施形態では、加熱ブロックは、0.1ワット/メートル−ケルビン(W/m*K)超の熱伝達係数、例として、これらに限定されないが、0.25W/M*K、0.5W/M*K、0.75W/M*K、1W/M*K、1.5W/M*K、2W/M*K、2.5W/M*K、3W/M*K、3.5W/M*K、4W/M*K、4.5W/M*K、5W/M*K、5.5W/M*K、6W/M*K、6.5W/M*K、7W/M*K、7.5W/M*K、8W/M*K、8.5W/M*K、9W/M*K、9.5W/M*K、10W/M*K、11W/M*K、12W/M*K、13W/M*K、14W/M*K、15W/M*K、16W/M*K、17W/M*K、18W/M*K、19W/M*K、20W/M*K、21W/M*K、22W/M*K、23W/M*K、24W/M*K、25W/M*K、26W/M*K、27W/M*K、28W/M*K、29W/M*K、30W/M*K、32W/M*K、35W/M*K、37W/M*K、40W/M*K、42W/M*K、45W/M*K、47W/M*K、50W/M*K、55W/M*K、60W/M*K、65W/M*K、70W/M*K、75W/M*K、80W/M*K、85W/M*Kを含む、0.25W/M*K〜85W/M*Kの熱伝達係数を有する液体金属を含む。
PCRが実施される温度で液体である熱伝導性の材料によって、いずれの形状の試料槽も温度制御材料内に浸すこと、および熱の伝達のために良好な熱的接触を維持することが可能になる。したがって、組成物は、少なくとも、プライマーアニーリングと二本鎖の解離との間の範囲において液体であることが好ましい。プライマーアニーリングは、典型的には、約55℃で起こるが、約70℃の高さで、または約45℃の低さで起こり得る。二本鎖の解離は、典型的には、94℃で起こるが、長さおよびアンプリコン中のグアニン−シトシンの塩基対の割合(GC含有量)等の要因に左右されて、より低い温度でも起こり得る。したがって、一実施形態では、液体組成物は、70℃以下の融点(すなわち、固体から液体に変化する温度)を有する。代替の実施形態では、液体組成物は、60℃以下の融点を有する。代替の実施形態では、液体組成物は、50℃以下の融点を有する。さらに別の実施形態では、液体組成物は、40℃以下の融点を有する。
一実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体が受け取る光のうちの実質的に全てを反射する液体金属または熱伝導性の流体が使用される。別の実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体は、試料槽中の分子を励起して、シグナルを検出することができる光学的アセンブリに接続している温度サイクラーの加熱ブロック中の成分である。試料槽は、加熱ブロックの液体金属または熱伝導性の流体の中に直接浸漬しても、または液体金属もしくは熱伝導性の流体から、熱伝導性であるレセプタクルによって分離してもよい。レセプタクルを含む実施形態では、レセプタクルは、実質的に透明な材料または反射性の材料を用いて製造することができる。これらの実施形態では、液体金属もしくは熱伝導性の流体、または反射性の試料槽の表面が、それが受け取った光のうちの実質的に全てを反射して戻し、次いで、それを、これらに限定されないが、CCD装置、CMOS装置、LED装置、PN型フォトダイオード、PIN型フォトダイオードまたは光電池を含む、光検出装置によって検出することができる。さらに、透明なレセプタクルが使用される実施形態では、レセプタクルと同一のプラスチックからなるか、またはレセプタクルと類似する屈折率を有する透明な材料から製造された透明な試料槽を使用することができる。
「試料槽」という用語は、多様な形状および構成の反応槽を包含する。ある実施形態では、試料槽は、PCR反応混合物、逆転写反応混合物、リアルタイムPCR反応混合物、または加熱、冷却もしくは安定した均一な温度を必要とする任意のその他の反応混合物等の反応混合物を含有するよう使用することができる。一実施形態では、試料槽は、形状が円形または管状の槽である。代替の実施形態では、試料槽は、形状が楕円形の槽である。別の実施形態では、試料槽は、形状が長方形または正方形の槽である。任意の先行する実施形態は、先細の、丸められた、または平坦な、下部をさらに用いることもできる。さらに別の実施形態では、試料槽は、視界を遮るものがないガラス製の毛細管またはコートされた毛細管等の毛細管であり、ここで、コーティング(例えば、金属)が内部反射率を増加させる。追加の実施形態では、試料槽は、ガラス製のスライド等のスライドである。別の実施形態では、試料槽は、下部で密閉される。一実施形態では、試料槽は、液体金属または熱伝導性の流体等の液体組成物の付着を軽減するように、テフロン(登録商標)またはシラン等の抗付着性のコーティングで、少なくとも外部がコートされる。別の実施形態では、試料槽は、フッ素化ポリマーまたはBSA等、アンプリコンが、試料槽の壁に貼り付くのを阻止するための材料で、少なくとも内部がコートされる。
一般に、PCR温度サイクルの間の蒸発を予防するために試料槽の上部を覆うのが望ましい。これは、試料槽の上部に、鉱油等の非反応性の液体を層状に重ねた後、試料槽を密閉する(毛細管を熱により密閉する等)ことによって、または試料槽をキャップで閉鎖することによって達成することができる。
液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、当業者に知られている多様な技法を使用することによって加熱および冷却することができる。一実施形態では、加熱ブロックの加熱成分は、ペルチェ素子、抵抗加熱器および放射加熱器から選択される。一実施形態では、加熱ブロックの冷却成分は、ペルチェ素子、加熱シンク、冷却装置、蒸発冷却器、加熱パイプ、加熱ポンプおよび相変化物質から選択される。一実施形態では、加熱要素は、管を加熱ブロック内に延長することによって提供することができる。熱いまたは冷たい流体を送り込むことができる管を取り付けることができる。いくつかの代替の実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックには、周辺効果を阻止するために、加熱および/もしくは冷却用のコイル、または電気的な抵抗加熱器を取り付けることができる。別の実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、ペルチェ効果の熱電素子に熱的に連結することができる。
一実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、複数ゾーンの加熱器等の加熱成分とバイアス冷却システムとに、熱的に連結している。一実施形態では、バイアス冷却システムは、加熱ブロックの基部または側面につながっているバイアス冷却通路を通る、冷やした冷却剤の小さな一定の流れを提供する。これによって、加熱ブロックから一定の少量の熱損失が生じ、これは、複数ゾーンの加熱器によって埋め合わせられる。加熱器は、インキュベーション区分のための試料ブロックに熱的に連結しており、この区分では、試料ブロックの温度は、決まった値に維持される。バイアス冷却流によって生じる一定の少量の熱損失によって、制御システムが、上方および下方の両方で釣り合うように、温度を少しずつ制御することが可能になる。これは、温度制御システムは、ブロック温度のエラーを矯正するために、加熱および冷却の両方を、制御された、予測可能な小さな速度で行うことが可能であることを意味する。複数ゾーンの加熱器は、CPUによって制御することができる。
ペルチェ素子(Peltier deviceまたはPeltier element)は、熱電(TE)モジュールとしてもまた知られており、加熱ポンプとして機能する、小型の固体の状態の素子である。典型的なペルチェユニットは、厚さが数ミリメートル、縦横が数ミリメートルから数センチメートルの正方形である。これは、2枚のセラミック製のプレートによって形成され、小さなテルル化ビスマス(Bi2Te3)の立方体(カップル)のアレイがその間に差し挟まれている。DC電流を適用すると、熱が、素子の一方から他方へ動き、そこで、その熱は、加熱シンクによって取り出すことができる。「冷たい」側は、マイクロプロセッサまたは光検出器等の電子デバイスを冷却するために使用することができる。電流を逆転させると、素子は、熱が動く方向を変える。ペルチェ素子は、可動部がなく、冷媒を必要とせず、騒音も振動も発生させず、小型であり、寿命が長く、緻密な温度制御が可能である。温度制御は、温度センサーフィードバック(サーミスタまたは固体の状態のセンサー等)と閉ループ制御回路とを使用することによって提供することができ、これは、一般目的のプログラム可能なコンピュータを利用することができる。
いくつかの実施形態では、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、ヒンジで動く蓋等の蓋を場合により包含する温度サイクラーの一部である。種々の実施形態では、蓋は、ブロックに、種々の手段(例えば、クリップ、ばね、ねじ等)によって留めることができる。一実施形態では、蓋は、密閉した試料槽を、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックのレセプタクル中に位置を決めて固定するために閉鎖および押し付けを行うデバイスを含有する。代替の実施形態では、蓋は、試料槽を、蓋が閉じた時に密閉することができる。蓋は、ばねによって保持される圧力プレートを有する場合があり、これは、各試料槽を、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックのレセプタクルのウエル内に規定された力で押し付ける。蓋は、キャップ形状の蓋を有する試料槽を保持するためのくぼみおよび/または試料槽と同軸上で、圧力プレート中にピペット操作のための針を貫通させるための開口部をさらに含んでもよい。ばね要素は、波形の座金を含んでよい。一実施形態では、安全リングが、ヒンジで動く蓋を開けた際に、圧力プレートが落ちるのを阻止する。
本発明の種々の態様では、本発明の装置は、反応(例えば、リアルタイムPCR)を含む試料槽中の検出可能な標識を測定する手段を提供するように構成される。本発明の装置の種々の実施形態は、検出のための光学機器と完全に適合し、それによって、迅速な核酸の増幅/検出を行うことができる。PCRまたは関連の過程の間に、均一な温度、迅速な温度および増加したシグナルの反射性を提供することによって、本発明の温度サイクラーは、より正確な増幅、検出および測定を可能にする。したがって、1つの利点は、本発明の温度サイクラーを用いれば、より安価な光学的アセンブリを利用し、それでも、同等に正確なまたはより正確なリアルタイムの測定結果を得ることができる点である。したがって、本発明の温度サイクラーによって、迅速で、正確な、および信頼できるDNAの増幅および検出が、より安価な光学機器および従来の光学的アセンブリを用いて可能となる。
種々の実施形態では、制御アセンブリは、本発明の温度サイクラーに動作可能に連結している。そのような制御アセンブリは、例えば、本発明の装置、方法および/またはシステムの何らかの態様を動作させるために機能する、コンピュータが実行可能なロジックを含むプログラム可能なコンピュータを含む。例えば、制御アセンブリは、モーター、ファン、加熱成分、撹拌棒、連続フロー装置および光学的アセンブリのスイッチを入れたり/切ったりすることができる。制御アセンブリは、自動的に、試料を処理する、複数のPCRサイクルを運転する、測定値を得る、測定値をデータにデジタル化する、データをチャート/グラフおよび報告書に変換するようにプログラムすることができる。
液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックを含む温度サイクラーは、とりわけ、疾患の診断、薬物スクリーニング、個人の遺伝子型同定、系統学的な分類、環境監視、親子鑑定および法鑑定のために使用することができる。さらに、核酸を、実験のために何らの供給源から、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックを使用して得ることができる。例えば、試験試料は、生物学的なおよび/または環境からの試料であることができる。生物学的試料は、ヒト、その他の動物、または植物、体液、固形組織試料、組織培養物もしくはそれに由来する細胞およびその子孫、これらの供給源のうちの任意のものから調製した切片もしくは塗抹、または標的核酸を含有することが疑われる、任意のその他の試料に由来することができる。典型的な生物学的試料は、これらに限定されないが、血液、尿、脊髄液、脳脊髄液、滑液、アンモニア性液、精液および唾液を含む、体液である。その他の型の生物学的試料は、食品の生産物および材料、例として、野菜、乳製品、肉、肉の副産物および廃棄物を包含することができる。環境からの試料は、これらに限定されないが、土壌、水、下水、化粧品試料、農業試料、工業試料、エアフィルターからの試料および空調からの試料を含む、環境物質に由来する。
逆転写PCRは、オリゴdTプライマーまたはランダムオリゴマー(ランダムなヘキサマーもしくはオクタマー等)を使用して、mRNAがcDNAに逆転写酵素(モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)転写酵素、またはそれらの変異体等)によってコピーされる過程を指す。リアルタイムPCRでは、典型的には、エンドグリコシダーゼH(endo H)活性を有する逆転写酵素が使用される。これは、DNAの第2の鎖が形成されるのを可能にするmRNAを除去する。逆転写は、典型的には、PCR前の単一工程として起こす。一実施形態では、RT反応は、液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロック中で、RNA試料、逆転写酵素、必要な緩衝液および成分を、約37℃で約1時間インキュベートし、その後、約45℃で約15分インキュベートし、さらに、約95℃でインキュベートすることによって実施される。次いで、cDNA産物を、取り出し、PCRのための鋳型として使用する。代替の実施形態では、RT工程の後に、例えば、1工程PCRプロトコールにおけるPCR工程が続く。この実施形態では、反応成分の全てが、RT工程およびPCR工程のために試料槽中に存在する。しかし、DNAポリメラーゼの活性は、95℃で5〜10分にわたる長期間のインキュベーションによって活性化されるまで遮断されている。一実施形態では、DNAポリメラーゼの活性は、95℃でのインキュベーション工程の間に恒久的に不活性化される阻止抗体の存在によって遮断されている。
分子生物学においては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(QRT−PCR)または動態学的ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれ、所与のDNA分子の特異的な部分を同時に定量かつ増幅するために使用される。これは、特異的な配列が、試料中に存在するか否かを、さらに、特異的な配列が存在する場合には、試料中のコピー数を決定するために使用される。これは、それ自体がポリメラーゼ連鎖反応の改変形態である、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)のリアルタイムの変形形態である。
種々の適用例では、本発明の装置は、感染性物質または病原性物質の検出等、in vitroでの診断のために使用することができる。一実施形態では、PCRが、種々のそのような物質を検出するために、本発明の装置を使用して実施される。それらの物質は、任意の病原体であることができ、これらに限定されないが、細菌、酵母、真菌、ウイルス、真核細胞の寄生体等;インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、A、B、C、D、E型等の肝炎ウイルス、HIV、エンテロウイルス、パピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはエプスタイン・バーウイルスを含む感染性物質;マイコバクテリウム属、連鎖球菌属、サルモネラ属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、ナイセリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属または大腸菌を含む細菌を包含する。当業者には、何らかの感染性物質を検出するための使用に向けて、本発明の装置へのPCR、配列決定反応および関連の過程の適合が容易であることが明らかであろう。
ステンレス鋼製のPCR反応試料槽が、その中でポリメラーゼ連鎖反応を遂行するのに適切な槽であることが実証されている。最初の試験のために使用する槽を、ステンレス鋼製の管から製造し、最終的な外径は、0.061インチであった。2インチの長さの試料槽の一端を、ステンレス鋼製の圧入プラグを用いて閉鎖した。
液体金属または熱伝導性の流体の加熱ブロックは、リアルタイムPCR反応に非常に適している。これは、液体金属または熱伝導性の流体の迅速な温度の立ち上げ、温度の均一性および反射性による。
Claims (89)
- PCRを実施する方法であって:
a)PCRを試料槽中で実施し、PCRの経過を指し示すシグナルを試料槽中で発生させるステップであって、実質的に全ての前記シグナルが、反射して前記試料槽中に戻り、実質的に全てのシグナルが前記試料槽の別の場所から検出されるステップ;および
b)試料槽の別の場所から放出されたシグナルを測定するステップ;
を含む方法。 - シグナルを、複数のPCRサイクルにわたりリアルタイムで測定するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 試料槽が、シグナルを透過する壁を含み、壁の少なくとも一部が、液体組成物に当たった実質的に全てのシグナルを反射する液体組成物中に浸漬されている、請求項2に記載の方法。
- 液体組成物が、金属または金属合金を含む、請求項3に記載の方法。
- シグナルが、標識または色素によって発生する、請求項3に記載の方法。
- 前記試料槽が、前記試料槽中の実質的に全ての前記シグナルを反射する材料を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料槽が、金属からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記試料槽が、反射性材料を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料槽が、前記液体組成物からレセプタクルによって分離されている、請求項2に記載の方法。
- PCRを実施する方法であって:
a)反応混合物中の標的ヌクレオチド配列のPCRを、
(i)プライマー伸長と二本鎖解離の間およびプライマーアニーリングとプライマー伸長の間の温度変化の速度が、1秒あたり10.5℃超であり、
(ii)前記PCRが、0.5℃未満の試料槽内の温度の変動を含む試料槽を含む、加熱ブロック中で遂行される
条件下で実施するステップ;ならびに
b)標的ヌクレオチド配列の増幅をリアルタイムでモニターするステップ;
を含む方法。 - 前記加熱ブロックが、液体組成物を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記加熱ブロック中の2つ以上のウエル間で測定した場合、0.5℃未満の温度の変動をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記の温度の変動が、前記加熱ブロック中の2つ以上のウエル間で測定した場合、0.01℃である、請求項12に記載の方法。
- 前記加熱ブロックが、交換型ブロックである、請求項10に記載の方法。
- 温度変化の速度が、
(1)反応混合物を含有する試料槽を、少なくとも0.1W/M*Kの熱伝達係数を有する液体組成物と熱的に接触させること(ここで、液体組成物の温度が、反応混合物の温度を制御する)
によって生じる、請求項10に記載の方法。 - 液体組成物の運動を引き起こすことによって、温度の均一性を維持するステップを含む、請求項15に記載の方法。
- PCRを実施する方法であって:試料温度を1秒あたり5℃超ずつ調節する温度サイクラー中でPCRを遂行するステップを含み;前記の温度サイクラーの温度が、液密に密閉されている加熱ブロック中の液体組成物によって調整され;前記液体組成物は、少なくとも0.1W/M*Kの熱伝達係数を含む方法。
- 前記温度サイクラーが、1秒あたり少なくとも約10℃の立ち上げ速度を提供する、請求項17に記載の方法。
- 前記温度サイクラーが、少なくとも約0.01から0.1℃のウエル間および試料の温度均一性を提供する、請求項17に記載の方法。
- 前記加熱ブロックが、前記加熱ブロック中の2つ以上のウエル間で測定した場合、0.01℃の温度の変動を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記液体組成物が、加熱ブロック内に含有される、請求項18に記載の方法。
- 前記加熱ブロックが、交換型ブロックである、請求項20に記載の方法。
- PCRを実施する方法であって、増幅を少なくとも3のシグナル指数でリアルタイムで検出することができるように、試料温度を十分に調節する温度サイクラー中で、PCRを遂行するステップを含み、前記検出は、非特異的な核酸標識を介し、前記温度サイクラーは、試料温度を1秒あたり10℃超調節する方法。
- リアルタイムPCRを実施するための方法であって:
a)反応混合物中の標的ヌクレオチド配列のPCR反応を、反応混合物中での、プライマー伸長と二本鎖解離の間およびプライマーアニーリングとプライマー伸長の間の温度変化の速度が、1秒あたり少なくとも15℃である条件下で実施するステップであって、前記PCR反応が、少なくとも0.1W/m*Kの熱伝達係数を有する液体組成物と熱的に接触しているステップ;ならびに
b)PCRを、リアルタイムでモニターするステップ;
を含む方法。 - モニターするステップが:
a)PCRを試料槽中で実施し、PCRの経過を指し示すシグナルを試料槽中で発生させるステップであって、シグナルは、試料槽の実質的に別の場所から放出されるステップ;および
b)試料槽の別の場所から放出されたシグナルを測定するステップ;
を含む、請求項に記載の方法。 - 反応混合物中の温度上昇の速度が、1秒あたり少なくとも40°である、請求項に記載の方法。
- 前記温度変化が、ペルチェ素子によって調整される、請求項に記載の方法。
- リアルタイムPCRを実施するための方法であって:
a)PCR反応混合物の温度を、二本鎖の解離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のための温度間で、複数のサイクルにわたりサイクルさせるステップであって、各サイクルは、5秒以下であり;前記温度は、温度サイクラー中に密閉されている液体組成物によって調節されるステップ;
b)試料槽中のPCRの経過を、複数のサイクルにわたりリアルタイムでモニターするステップ;
を含む方法。 - ステップ(a)の前に、
1)PCR反応混合物を含有する試料槽の閉鎖端部を、60℃超で液体であり、かつ少なくとも0.1ワット/メートル−ケルビン度の熱伝達係数を有する液体組成物と熱的に接触させるステップであってそれによって、液体組成物の温度が、PCR反応混合物の温度を制御するステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。 - 液体組成物が、試料槽内部の実質的に全ての光を反射する、請求項28に記載の方法。
- モニターするステップが、試料槽の上部または下部から放出されたシグナルを測定することによって実施される、請求項30に記載の方法。
- 各サイクルが、3秒以下である、請求項28に記載の方法。
- 前記試料槽が、反射性表面を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記試料槽が、キャップでさらに覆われる、請求項29に記載の方法。
- 前記キャップが前記液体組成物から熱を吸収すること、または前記キャップを前記液体組成物が冷却することができる、請求項34に記載の方法。
- リアルタイムPCRを遂行するための方法であって、PCR試料槽と熱的に接触している液体組成物を含む温度サイクラーを提供するステップであって;前記液体組成物は、温度を調節し、したがって、試料槽中の反応温度を調整し、ここで、検出可能なシグナルが、前記試料槽から放出されるステップと;前記シグナルを、発光体および光学的検出器を含む光学的アセンブリを介して検出するステップと含む方法。
- 前記光学的アセンブリが、ピン型フォトダイオードCCD撮像装置、CMOS撮像装置、線スキャナ、フォトダイオード、フォトトランジスタ、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記試料槽が、キャップでさらに覆われる、請求項36に記載の方法。
- 前記キャップが前記液体組成物から熱を吸収すること、または前記キャップを前記液体組成物が冷却することができる、請求項39に記載の方法。
- a)60℃超で液体であり、かつ少なくとも0.1ワット/メートル−ケルビン度の熱伝導率を有する液体組成物を含有する容器を含む温度制御アセンブリであって、前記容器は、少なくとも1つの開口部を有し、各開口部が、試料槽の閉鎖端部を受けるように適合され、ここで、開口部内に受けられた試料槽は、液体組成物と熱的に接触しており、それによって、液体組成物の温度が、試料槽中の液体試料の温度を制御し、かつここで、液体組成物は、試料槽内部の実質的に全ての光を反射することができる温度制御アセンブリ;
b)試料槽内部の前記光を、前記試料槽上の別の場所から検出することができる光学的アセンブリ;ならびに
c)液体組成物の温度および光学的アセンブリの動作を制御する制御アセンブリ;
を含む装置。 - 液体組成物が、ガリウム、ガリウム−インジウム合金、またはガリウム、インジウム、ロジウム、銀、亜鉛、スズもしくは第一スズを含む合金を含む、請求項40に記載の装置。
- 温度制御器が、ペルチェ素子を含む、請求項40に記載の装置。
- 温度制御器が、液体組成物と熱的に接触している抵抗線を含む、請求項40に記載の装置。
- 温度制御器が、PCRに適した、二本鎖の解離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のための温度間で、液体組成物の温度をサイクルさせるための手段を含む、請求項40に記載の装置。
- 温度サイクラーが、液体組成物中に流れを循環させるための手段をさらに含む、請求項40に記載の装置。
- 光学的アセンブリが、発光体および光学的検出器を含む、請求項40に記載の装置。
- 試薬を試料槽に添加するための手段を含む試料調製ステーション
をさらに含む、請求項40に記載の装置。 - 試料槽を開口部内に動かすための手段をさらに含む、請求項40に記載の装置。
- 温度サイクラー、光学的アセンブリおよび試料調製ステーションを制御するデジタルコンピュータをさらに含む、請求項47に記載の装置。
- リアルタイムPCRを実施するためのシステムであって:
a)液体組成物、および試料槽を係合して前記槽を組成物と熱的に接触させるための手段を含む温度サイクラー;ならびに
b)発光体と、光を係合試料槽内に導いて係合試料槽から放出された光を検出する光学的検出器とを含む光学的アセンブリ;
を含むシステム。 - 前記液体組成物が、金属または金属合金を含む、請求項50に記載のシステム。
- 前記液体組成物が、ガリウムを含む、請求項50に記載のシステム。
- 放出された前記シグナルが、前記試料槽の取り外し可能なキャップからである、請求項50に記載のシステム。
- 前記液体組成物が、前記試料槽からレセプタクルによって分離されている、請求項50に記載のシステム。
- 前記レセプタクルが、透明または半透明である、請求項54に記載のシステム。
- ペルチェ素子を含む、請求項50に記載のシステム。
- 前記温度サイクラーが、ファンおよび撹拌棒に動作可能に接続しているモーターをさらに含む、請求項56に記載のシステム。
- 前記のファンおよび撹拌棒が、前記モーターに同軸上で接続している、請求項57に記載のシステム。
- 前記温度サイクラーが、前記液体組成物の温度調整のための抵抗線をさらに含む、請求項50に記載のシステム。
- 前記液体組成物が、閉鎖バリア中に密閉され、前記バリアは、その中に前記試料槽が置かれるレセプタクルを有する表面を含む、請求項50に記載のシステム。
- 前記液体組成物が、前記試料槽と直接接触する、請求項50に記載のシステム。
- 前記光学的アセンブリが、PIN型フォトダイオード、CCD撮像装置、CMOS撮像装置、線スキャナ、フォトダイオード、フォトトランジスタ、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードを含む、請求項50に記載のシステム。
- a)加熱シンク;
b)加熱シンクと熱的に接触している加熱成分;
c)上部表面および下部表面を有する壁を含むバリアであって、下部表面は前記加熱成分に対して密閉され、密閉されたバリアおよび前記加熱成分は液体組成物を含有する容器を形成するバリア;
d)バリアの上部表面に対して密閉され、複数のウエルを含む第1ピースであって、ウエルは容器内に延ぶ第1ピース;
e)それぞれが開口端部を有する、複数の試料槽を含む第2ピースであって、試料槽はウエル内に取り外し可能に挿入される第2ピース;
f)複数の突出部を含む第3ピースであって、突出部は試料槽の開口端部内に取り外し可能に挿入される第3ピース;
を含む装置。 - 前記液体組成物が、60℃超で液体であり、かつ少なくとも0.1M/W/Kの熱伝達係数を有する金属を含む、請求項63に記載の装置。
- 前記液体金属が、体積を約0.1から6.0%増加させることができる、請求項63に記載の装置。
- 前記の可能な温度上昇が、10.5℃/秒超である、請求項63に記載の装置。
- e)中の前記ウエルが、柔軟性を有するように適合し、その結果、前記ウエルは、f)中の前記試料槽と熱的または光学的な接触を形成することができる、請求項63に記載の装置。
- 前記適合が、前記ウエルにおける幾何学的な形状および/または変形可能な材料を利用することを含む、請求項67に記載の装置。
- 前記の幾何学的な形状が、多角形、楕円形または円形である、請求項68に記載の装置。
- 前記ウエルが、前記液体組成物中に、初期レベルまで浸漬される、請求項63に記載の装置。
- 前記突出部が、前記初期レベルの上まで、前記初期レベルまで、または前記初期レベルの下まで延びる、請求項70に記載の装置。
- 前記第3ピースが前記液体組成物から熱を吸収すること、または前記第3ピースを前記液体組成物が冷却することができる、請求項63に記載の装置。
- 第1ピースのウエルが透明かつ柔軟であり、第2ピースの試料槽が透明であり、それによって、前記ウエル上の増加した圧力が、前記容器中の前記液体を、前記試料槽中の試料と熱的および光学的に接触させる、請求項63に記載の装置。
- 第3ピースの突出部が、透明である、請求項63に記載の装置。
- バリアが、熱分散器および第1ピースのそれぞれに対して、ガスケットを介して密閉される、請求項63に記載の装置。
- 前記の第1ピースまたは第2ピースが、反射性表面を含む、請求項61に記載の装置。
- バリアが、熱分散器および第1ピースのそれぞれに対して、留め具で密閉される、請求項63に記載の装置。
- 前記加熱成分と接触している熱分散器をさらに含む、請求項63に記載の装置。
- 前記加熱成分が、ペルチェ素子、ワイヤー素子、またはその組合せである、請求項63に記載の装置。
- 第2加熱成分をさらに含み、前記バリアが、前記加熱成分と前記第2加熱成分との間に配置される、請求項63に記載の装置。
- 前記の複数のウエルが、4、8、16、32、48、96、196、384または1536個のウエルを含む、請求項63または69に記載の装置。
- ファンと撹拌棒とをさらに含み、前記のファンおよび撹拌棒は、場合により、単一のモーターに動作可能に接続している、請求項63または69に記載の装置。
- 電池によって電力供給される、請求項82に記載の装置。
- 前記ファンが、前記装置に動作可能に接続している制御器成分によって、自動的にスイッチが入ったり、切れたりする、請求項82に記載の装置。
- 金属製熱分散器をさらに含む、請求項63に記載の装置。
- 前記分散器が、銅を含む、請求項85に記載の装置。
- 前記加熱成分が、勾配PCRのために構成される、請求項63に記載の装置。
- 試料調製モジュールと;前記試料中の温度を調節するための液体組成物を含む温度サイクラーと;前記試料からの放出シグナルを検出するための光学的アセンブリとを含む、連続フローPCRシステム。
- 試料採取器と廃棄物回収部とをさらに含む、請求項88に記載のシステム。
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