BR112018068139B1

BR112018068139B1 - Sistema de detecção de produto e amplificação de reação em cadeia da polimerase (pcr) e método de detecção de produto e amplificação de pcr mediada por luz

Info

Publication number: BR112018068139B1
Application number: BR112018068139-3A
Authority: BR
Inventors: Ronald L. Biro; Beau Hunt
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2022-12-06
Also published as: WO2017156126A1; CN108778511A; BR112018068139A2; EP3426399B1; MX2018010108A; US11369965B2; SG11201805166PA; CA3009080C; US20180361379A1; CA3009080A1; EP3426399A1; ES2871861T3

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM SISTEMA DE DETECÇÃO DE PRODUTO E AMPLIFICAÇÃO DE PCR. O SISTEMA UTILIZA UM SUBSISTEMA DE AQUECIMENTO FOTÔNICO UNIFORME E DIRETO PARA MEDIAR A AMPLIFICAÇÃO DE PCR DE ALTO RENDIMENTO DE REAÇÃO EM REAÇÃO, DETECTÁVEL POR UM SUBSISTEMA DE DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA. TAMBÉM É REVELADO O MONITORAMENTO DE TEMPERATURA DE REAÇÃO EM REAÇÃO PARA REGULAÇÃO TÉRMICA DE RETROALIMENTAÇÃO DINÂMICA. TAMBÉM SÃO REVELADOS MÉTODOS PARA USAR OS MESMOS.

Description

CAMPO

[001] Esta revelação refere-se a um de sistema de detecção de produto e amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) mediada por luz e de alto rendimento, e métodos de uso do mesmo. O sistema permite o aquecimento fotônico rápido e uniforme de reação em reação de uma matriz oleosa aquosa e combina monitoramento de temperatura e detecção de produto de PCR em um sistema de alto rendimento integrado.

ANTECEDENTES

[002] A amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica fundamental para a biologia molecular. A análise de ácido nucleico por PCR exige preparação de amostra, amplificação e análise de produto. Embora essas etapas sejam normalmente realizadas sequencialmente, a amplificação e a análise podem ocorrer simultaneamente. Corantes de DNA ou sondas fluorescentes podem ser adicionados à mistura de PCR antes da amplificação e usados para analisar produtos de PCR durante a amplificação. A análise de amostra ocorre ao mesmo tempo que a amplificação no mesmo tubo no mesmo instrumento. Essa abordagem combinada diminui a manuseio de amostra, poupa tempo e reduz em grandes proporções o risco de contaminação de produto para reações subsequentes, visto que não há necessidade de remover as amostras de seus recipientes fechados para análise adicional. O conceito de combinação de amplificação com a análise de produto se tornou conhecido como PCR "em tempo real”. Consulte, por exemplo, a Patente n° US 6.174.670.

[003] Ao mesmo tempo, o processamento de amostras de polinucleotídeo em ensaios de PCR de alto rendimento apresenta inúmeras importantes desvantagens. Os mesmos incluem o tamanho de volume que resulta em alto custo de reagente, alto custo de consumíveis e protocolos e processos trabalhosos que são altamente susceptíveis à contaminação. Alguns desses problemas podem ser resolvidos encapsulando uma gotícula aquosa, que contém os reagentes de reação PCR, amostra de polinucleotídeo, primers e sondas, em um ou mais óleos não miscíveis. A geração dessas matrizes oleosas aquosas diminui o tamanho de volume e o risco de contaminação. A formação de matrizes oleosas aquosas foi descrita na literatura de patente, por exemplo, na Patente n° US 8.465.707.

[004] Sistemas disponíveis que empregam zonas de temperatura constante para submeter as matrizes oleosas aquosas ao termociclo de PCR mostraram problemas significativos no fornecimento de temperaturas de aquecimento uniformes, e podem sofrer com a lenta transferência de calor de uma fonte de aquecimento relativamente distante das amostras. Outros sistemas que usam rios em fluxo de óleo carreador para transportar as matrizes oleosas aquosas através do sistema mostram problemas significativos com o controle da taxa de fluxo e a profundidade do óleo carreador. Outros métodos usam chips à base de PCR de alto rendimento miniaturizados que incorporam um aquecedor e/ou sensor de temperatura dentro do substrato. Contudo, essa técnica exige projeto e fabricação complexos dos chips.

[005] Dessa forma, existe uma necessidade de sistemas e métodos para amplificar por PCR amostras que são de alto rendimento, reduz o custo, fornece maior flexibilidade de análise, reduz o tempo de resposta e aprimora a qualidade dos dados.

BREVE SUMÁRIO

[006] Um aspecto da revelação se refere a um sistema de detecção de produto e amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) que compreende um subsistema de montagem que inclui uma pluralidade de vasos e um ou mais membros de dispensação de líquido configurados para montar uma coleção de matrizes oleosas aquosas, em que cada matriz oleosa aquosa compreende: 1) uma mistura de reação aquosa que compreende um volume de amostra de polinucleotídeo e reagentes; e 2) um ou dois óleos não miscíveis selecionados dentre o grupo que consiste em um óleo de encapsulação, um óleo carreador e tanto um óleo de encapsulação como um óleo carreador. Como tal, componentes da mistura de reação aquosa não se misturam com o um ou dois óleos não miscíveis. Nessa modalidade, cada matriz oleosa aquosa é dispensada pelo um ou mais membros de dispensação de líquido em um vaso para amplificação de PCR e detecção de produto.

[007] O sistema também compreende uma pluralidade de posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura e posições de detecção de produto de PCR. Além disso, o sistema inclui um subsistema de aquecimento fotônico acionado por luz de reação em reação que compreende uma pluralidade de fontes de radiação eletromagnética, em que cada vaso está em comunicação óptica com uma fonte de radiação eletromagnética quando esse vaso está em uma posição de aquecimento, e a fonte de radiação eletromagnética emite radiação eletromagnética para aquele vaso; um subsistema de monitoramento de temperatura de reação em reação que compreende uma pluralidade de dispositivos de detecção térmica, em que cada vaso corresponde a um dispositivo de termodetecção quando esse vaso está em uma posição de monitoramento de temperatura, e em que o dispositivo de detecção é configurado para fornecer um sinal de medição dependente da temperatura da matriz oleosa aquosa quando o vaso está na posição de monitoramento de temperatura; um subsistema de controle de fonte de luz e retroalimentação de temperatura de microcontrolador conectado de modo comunicativo tanto ao subsistema de aquecimento fotônico como ao subsistema de monitoramento de temperatura, em que o subsistema de controle de fonte de luz e retroalimentação de temperatura de microcontrolador é configurado para regular a entrada de energia necessária para controle de saída e duração da energia eletromagnética emitida pela fonte de radiação eletromagnética através de um ciclo de temperaturas de reação; e um subsistema de detecção de fluorescência. Adicionalmente, o subsistema de detecção de fluorescência compreende: i) uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência; ii) um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência; iii) uma pluralidade de primeiros membros ópticos em comunicação óptica com a uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência, em que cada primeiro membro óptico é configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência que tem um primeiro comprimento de onda espectral da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência para um dos ditos vasos contendo a matriz oleosa aquosa quando o vaso está em uma posição de detecção de produto de PCR, em que o volume da mistura de reação aquosa compreende um primeiro reagente que tem a capacidade de excitação pela luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral quando o primeiro reagente hibridiza à amostra de polinucleotídeo, e em que cada primeiro membro óptico é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para a luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência; e iv) um mecanismo de resfriamento ativo ou passivo na posição de detecção de produto de PCR, em que cada um dos vasos na posição de detecção de produto de PCR é resfriado.

[008] Também é fornecido um sistema de controle mecânico e eletrônico conectado de modo comunicativo a um dispositivo de posicionamento e ao subsistema de montagem, em que o sistema de controle mecânico e eletrônico faz com que o subsistema de montagem monte as matrizes oleosas aquosas na pluralidade de vasos, e em que o sistema de controle mecânico e eletrônico faz com que o dispositivo de posicionamento mova a pluralidade de vasos do subsistema de montagem para cada uma dentre as posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura e posições de detecção de produto de PCR.

[009] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de detecção de produto e amplificação de PCR mediada por luz que utiliza o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR. Nesse aspecto, o método compreende montar uma coleção de matrizes oleosas aquosas pela aspiração do um ou mais óleos não miscíveis, em que a etapa de aspiração compreende: (i) aspirar o óleo de encapsulação de uma entrada de óleo de encapsulação; (ii) aspirar o óleo carreador de uma entrada de óleo carreador; ou (iii) aspirar o óleo de encapsulação de uma entrada de óleo de encapsulação e aspirar o óleo carreador de uma entrada de óleo carreador. O método também inclui aspirar um volume de amostra de polinucleotídeo de uma entrada de amostra de polinucleotídeo; aspirar um volume de reagentes de uma entrada de mistura de reagente de PCR; dispensar o volume de amostra de polinucleotídeo, o volume de reagentes, e o um ou mais óleos não miscíveis na pluralidade de vasos, em que o volume de amostra de polinucleotídeo e o volume de reagentes formam uma mistura de reação aquosa, e em que componentes da mistura de reação aquosa não se misturam com o um ou mais óleos não miscíveis; em que as etapas 1), 2) e 3) são realizadas em qualquer ordem ou simultaneamente, e em que as etapas 1), 2) e 3) são realizadas antes da etapa 4). O método também compreende aquecer uniformemente cada volume da matriz oleosa aquosa, em que o aquecimento compreende: 1) posicionar a fonte de radiação eletromagnética em comunicação óptica com cada vaso contendo a matriz oleosa aquosa; 2) aquecer o volume da matriz oleosa aquosa até alcançar uma temperatura na faixa de cerca de 50 °C a cerca de 65 °C; 3) aquecer adicionalmente o volume da matriz oleosa aquosa até alcançar uma temperatura na faixa de cerca de 65 °C a cerca de 75 °C; e 4) aquecer adicionalmente o volume da matriz oleosa aquosa até alcançar uma temperatura na faixa de cerca de 90 °C a cerca de 99 °C. Nessa modalidade, uma etapa adicional no método compreende resfriar cada matriz oleosa aquosa por meio do posicionamento de cada um dos vasos nas proximidades do mecanismo de resfriamento até que a matriz oleosa aquosa alcance uma temperatura na faixa de cerca de 55 °C a cerca de 65 °C.

[0010] Etapas adicionais incluem medir a emissão de fluorescência de cada vaso contendo a matriz oleosa aquosa, em que a medição compreende: 1) posicionar um primeiro membro óptico em comunicação óptica com cada vaso contendo a matriz oleosa aquosa, em que cada primeiro membro óptico é configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência que tem um primeiro comprimento de onda espectral da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência para um dos ditos vasos contendo a matriz oleosa aquosa quando o vaso está em uma posição de detecção de produto de PCR, em que o volume da mistura de reação aquosa compreende um primeiro reagente que tem a capacidade de excitação pela luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral quando o primeiro reagente hibridiza à amostra de polinucleotídeo, e em que cada primeiro membro óptico é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência; e 2) medir o sinal produzido pelo um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência de pelo menos uma mistura de reação aquosa. Em um aspecto particular, as etapas de aquecimento, resfriamento e medição da fluorescência são repetidas por um número predeterminado de ciclos adicionais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 apresenta uma vista em corte transversal de uma modalidade de uma matriz oleosa aquosa de dois óleos.

[0012] A Figura 2 apresenta uma vista em corte transversal que ilustra uma configuração exemplificadora em que a fonte de radiação eletromagnética e pelo menos um detector estão situados na mesma posição no topo de um vaso.

[0013] A Figura 3 apresenta uma vista em corte transversal que ilustra uma configuração exemplificadora em que a fonte de radiação eletromagnética e pelo menos um detector estão situados na mesma posição, em que a fonte de radiação eletromagnética está posicionada no fundo de um vaso e pelo menos um detector está posicionado no topo do vaso.

[0014] A Figura 4A apresenta uma vista lateral de um dispositivo de correia exemplificador.

[0015] A Figura 4B apresenta uma vista de topo de um dispositivo de correia exemplificador.

[0016] A Figura 5 apresenta uma vista em corte transversal de uma modalidade exemplificadora que ilustra uma configuração em que a fonte de radiação eletromagnética e pelo menos um detector estão em posições diferentes.

[0017] A Figura 6A apresenta uma vista frontal de um subsistema de aquecimento fotônico exemplificador.

[0018] A Figura 6B apresenta uma vista lateral de um subsistema de aquecimento fotônico exemplificador.

[0019] A Figura 6C apresenta uma vista de topo de um subsistema de aquecimento fotônico exemplificador.

[0020] A Figura 7 apresenta uma vista lateral de uma modalidade de um subsistema de aquecimento fotônico e uma correia em movimento.

[0021] A Figura 8 apresenta uma vista lateral de uma modalidade do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR.

[0022] A Figura 9 apresenta uma vista lateral de uma modalidade do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR.

[0023] A Figura 10 apresenta uma vista lateral de uma modalidade do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR.

[0024] A Figura 11 apresenta um diagrama de blocos do sistema mecânico, eletrônico e de controle de software.

[0025] A Figura 12 mostra a potência de saída e temperatura registrada de uma matriz oleosa aquosa fotoaquecida. O gráfico de topo mostra a temperatura ao longo do tempo. O eixo y representa graus Celsius, e o eixo x representa tempo em segundos. O gráfico de fundo mostra potência de LED ao longo do tempo. O eixo y representa potência de LED em modulação de largura de pulso percentual (PWM), e o eixo x representa tempo em segundos. PMW é uma medida do percentual do tempo por segundo que a potência está ligada, como produzido por uma série de pulsos de potência durante o segundo. A frequência de pulso pode ser ajustável, enquanto que o comprimento de pulso é ajustável dependente da energia total necessária por segundo.

[0026] A Figura 13 mostra os componentes de um poço em uma modalidade da invenção.

[0027] A Figura 14 mostra a estrutura de uma placa de múltiplos poços e LEDs montados sobre superfície em uma modalidade da invenção.

[0028] A Figura 15 mostra um circuito eletrônico para alimentar LEDs em uma modalidade da invenção.

[0029] A Figura 16 mostra um esquema para uma placa de circuito impresso para controle independente de 96 LEDs em uma modalidade da invenção.

[0030] A Figura 17 mostra a fluorescência observada de 16 poços de reação após 40 ciclos de PCR com o uso de uma modalidade da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] As revelações no presente documento serão descritas mais completamente doravante com referência aos desenhos anexos, em que algumas, porém não todas as modalidades possíveis são mostradas. De fato, as revelações podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas às modalidades apresentadas no presente documento; em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que esta invenção satisfaça os requisitos legais aplicáveis.

[0032] Muitas modificações e outras modalidades reveladas no presente documento virão à mente de um versado na técnica a qual pertencem os dispositivos, sistemas e métodos revelados tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições acima expostas e os desenhos associados. Portanto, deve-se entender que as invenções não devem ser limitadas às modalidades específicas reveladas e que modificações e outras modalidades são concebidas como estando incluídas dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados no presente documento, os mesmos são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não com propósitos de limitação.

[0033] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos peritos na técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes são aqui incorporados a título de referência, tal como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[0034] Deve-se entender também que a terminologia usada no presente documento se destina a descrever somente aspectos específicos e não pretende ser limitativa. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "compreende" deve ser interpretado como especificando a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes estabelecidos como referência, mas não impedindo a presença ou a adição de um ou mais recursos, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos dos mesmos. Dessa forma, por exemplo, o volume de mistura de reação aquosa que compreende um par de primers de ácido nucleico pode ter dois ou mais pares de primers de ácido nucleico. Além disso, o termo “compreendendo” destina-se a incluir modalidades englobadas pelos termos “que consiste essencialmente em” e “que consiste em”. Similarmente, o termo “que consiste essencialmente em” destina-se a incluir modalidades englobadas pelo termo “que consiste em”.

[0035] A menos que sejam definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual as composições e os métodos revelados pertencem. Neste relatório descritivo e nas reivindicações a seguir, será feita referência a diversos termos que serão definidos no presente documento.

[0036] O termo "cerca de" se refere à variação no valor numérico de uma medida, por exemplo, temperatura, comprimento, largura, altura, comprimento de onda, etc., devido a típicas taxas de erro do dispositivo usado para obter essa medida. Em uma modalidade, o termo "cerca de" significa dentro de 5% do valor numérico relatado.

[0037] São fornecidos no presente documento sistemas e métodos para amplificação e detecção de produto de reação em cadeia da polimerase (PCR) mediada por luz nos quais o aquecimento uniforme direto é aplicado a um volume de mistura de reação aquosa que compreende uma amostra de polinucleotídeo e reagentes, primers e sondas de PCR. De preferência, o volume de mistura de reação aquosa é posicionado em (isto é, encapsulado) um óleo não miscível e, em algumas modalidades, adicionalmente posicionado sobre uma superfície livre de um segundo óleo não miscível. Em modalidades particulares, o volume de mistura de reação aquosa não se mistura com os óleos não miscíveis, e a combinação do volume de mistura de reação aquosa com um óleo não miscível ou dois óleos não miscíveis formará uma disposição referida no presente documento como uma "matriz oleosa aquosa montada" ou "matriz oleosa aquosa" (consulte a Figura 1). A matriz oleosa aquosa permite o aquecimento eficiente de volumes de mistura de reação aquosa muito pequenos sem ocasionar a evaporação de água. Volumes de mistura de reação aquosa adequados para uso com os presentes métodos e sistemas podem ser menores que 10 μl ou menos e, em alguns casos, um volume de mistura de reação aquosa menor que 5 nl podem ser usados. Além disso, a adição de um ou dois óleos não miscíveis fornece uma barreira contra contaminação que permite o reuso de pratos de microtitulação e outros vasos recipientes com pouco risco de contaminação cruzada de polinucleotídeo entre experimentos.

[0038] Em aspectos particulares, o aquecimento mediado por luz é aplicado diretamente ao volume de mistura de reação aquosa, à matriz oleosa aquosa ou ao vaso contendo a matriz oleosa aquosa, com o uso de uma pluralidade de fontes de energia que emitem radiação eletromagnética em um processo às vezes referido no presente documento como "aquecimento fotônico". Fontes de energia adequadas incluem lâmpadas de halogênio, lasers e outros dispositivos emissores de luz. Em uma modalidade particular, o aquecimento uniforme é aplicado diretamente ao volume de mistura de reação aquosa com o uso de uma pluralidade de fontes de energia que emitem luz infravermelha que tem um comprimento de onda espectral de cerca de 1.300 nm a cerca de 2.200 nm. A luz infravermelha nessa faixa de comprimentos de onda é altamente absorvida pelas moléculas de água no volume de mistura de reação aquosa e faz com que a temperatura do volume de reação de mistura de reação aquosa aumente rapidamente. Em outra modalidade, o aquecimento direto e uniforme é realizado com o uso de conversão de luz em calor fototérmica plasmônica através de acoplamento fóton-elétron-fóton (consulte Ho Son et al., 2015, Light: Science Appl. 4:e280, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Em tal modalidade, a luz ultravioleta ou visível que tem um comprimento de onda espectral de cerca de 100 nm a cerca de 500 nm é diretamente aplicada a um metal excitável plasmônico, como um fino filme de ouro, que, por sua vez, conduz calor para a matriz oleosa aquosa e/ou o volume de mistura de reação aquosa. Dessa forma, os presentes sistemas e métodos permitem um aquecimento eficiente e uniforme de grandes números de reações de PCR com volumes aquosos muito pequenos, conservando assim a energia, material biológico e reagentes de PCR.

[0039] É fornecido no presente documento um sistema parcial ou completamente automatizado e controlado, e métodos para uso do mesmo. Em um aspecto particular, o sistema compreende múltiplos subsistemas integrados que realizam uma ou mais funções para executar amplificação de PCR de amostras de DNA e a detecção dos produtos de PCR resultantes. Em tais aspectos, o sistema compreende um subsistema de montagem para dispensar as matrizes oleosas aquosas em vasos ou recipientes adequados para processamento de PCR; um subsistema de aquecimento acionado por luz, ou fotônico, de reação em reação que compreende múltiplas fontes de luz configuradas para emitir radiação eletromagnética para vasos individuais; um subsistema de monitoramento de temperatura de reação em reação configurado para monitor a temperatura da matriz oleosa aquosa e/ou o volume de mistura de reação aquosa em cada vaso; um subsistema de retroalimentação de temperatura (por exemplo, através de um microcontrolador) que controla a saída de energia de cada fonte de aquecimento acionada por luz individual em resposta a leituras de temperatura de cada vaso individual; um subsistema de detecção de fluorescência configurado para detectar a emissão de luz de fluorescência produzida pelos produtos de PCR; e um sistema mecânico, eletrônico e de controle de software configurado para controlar o sistema de montagem e mover os vasos contendo as matrizes oleosas aquosas através das várias estações de vaso e subsistemas do sistema através de um dispositivo de posicionamento, como em uma correia em movimento compreendida de depressões ou poços que servem como os vasos. O subsistema de retroalimentação de temperatura e o sistema mecânico, eletrônico e de controle de software são, às vezes, coletivamente referidos no presente documento como o "sistema de controle". Em algumas modalidades, o presente sistema pode incluir um sistema de gerenciamento de informações laboratoriais (LIMS) para rastrear os vasos, dados de amostra de polinucleotídeo, dados de reagentes de PCR e para converter dados de fluorescência em informações genéticas.

Montagem das matrizes oleosas aquosas

[0040] Em certos aspectos, o presente sistema inclui um subsistema de montagem ou estação de manuseio de fluido para dispersar os volumes de mistura de reação aquosa e óleos não miscíveis nos vasos que serão movidos do subsistema de montagem para os subsistemas de aquecimento fotônico, monitoramento de temperatura e detecção de fluorescência. Em uma modalidade, uma amostra biológica que compreende ácidos nucleicos isolados (por exemplo, DNA genômico, cDNA e mRNA) é analisada no presente sistema e métodos. Em algumas modalidades, a amostra compreende DNA genômico isolado extraído de, por exemplo, tecido biológico, com o uso de qualquer técnica adequada de extração conhecida na técnica e é misturado por adição com reagentes de PCR que incluem uma ou mais sondas de ácido nucleico projetadas para especificamente hibridizar a uma sequência-alvo de DNA. Por exemplo, pode ser desejado determinar a presença de um alelo polimórfico particular. Em tais aspectos, sondas específicas de alelo podem ser usadas para detectar a presença do alelo particular do polimorfismo, em que cada sonda específica de alelo especificamente hibridiza a um dos alelos polimórficos sob condições estringentes de hibridização. Tipicamente, esse método de detecção pode compreender isolar o DNA genômico, amplificar o DNA genômico que abrange o lócus polimórfico e detectar o alelo polimórfico amplificado. PCR, RT-PCR e LCR são métodos comuns de amplificação e amplificação-detecção para amplificar os ácidos nucleicos de interesse. Detalhes relacionados a esse uso desses e de outros métodos de amplificação são bem conhecidos na técnica, e podem ser encontrados em uma variedade de textos padrão e inúmeras referências, como Mullis et al. (1987) Patente n° US 4.683.202; Arnheim & Levinson (1990) C&EN 36 a 47; Kwoh et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1.173; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1.874; Lomell et al. (1989) J Clin Chem 35:1.826; Landegren et al. (1988) Science 241:1.077 a 1.080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291 a 294; Wu & Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; e Sooknanan & Malek (1995) Biotechnology 13:563 a 564.

[0041] Em certas modalidades, cada volume de mistura de reação aquosa inclui uma amostra de polinucleotídeo e uma mistura de reagente de PCR. Em tais modalidades, os reagentes de PCR incluirão uma ou mais sondas de ácido nucleico e um ou mais primers de ácido nucleico. Em modalidades preferenciais, a mistura de reagente de PCR inclui pelo menos duas sondas de ácido nucleico diferentes projetadas que especificamente hibridizam a diferentes alelos polimórficos, isto é, sondas projetadas para especificamente hibridizar a sequências contendo diferente alelos. Adicionalmente, sondas de ácido nucleico específicas de alelo podem ser conjugadas ou covalentemente ligadas a diferentes marcadores detectáveis que têm a capacidade de se distinguirem com o uso de técnicas de detecção disponíveis na técnica. Marcadores detectáveis adequados para uso com sondas de ácido nucleico incluem, por exemplo, qualquer composição detectável por dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência. As estratégias de marcação para a marcação de ácidos nucleicos e suas estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, por exemplo, em Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sexta Edição, por Molecular Probes, Inc. (Eugene Oreg.); ou Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Oitava Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Em uma modalidade preferencial, reagentes (por exemplo, sondas de ácido nucleico) são fornecidos, em que cada reagente é covalentemente ligado a um fluoróforo.

[0042] Em modalidades preferenciais, os marcadores detectáveis também podem incluir pares de repórter-supressor, como são empregados em sondas Molecular Beacon e TAQMAN®. O repórter pode ser um corante orgânico fluorescente modificado com um grupo de ligação adequado para ligação ao oligonucleotídeo, tal como ao carbono 3’ terminal ou ao carbono 5’ terminal. O supressor também pode ser um corante orgânico, que pode ou não ser fluorescente. Em geral, se o supressor é fluorescente ou simplesmente libera a energia transferida do repórter por decaimento não radiativo, a banda de absorção do supressor deve, pelo menos substancialmente, sobrepor a banda de emissão fluorescente do repórter de forma a otimizar a supressão. Os supressores não fluorescentes ou supressores escuros funcionam normalmente absorvendo energia a partir de repórteres excitados, mas não liberam a energia radiativamente.

[0043] A seleção de pares de repórter e supressor adequados para determinadas sondas pode ser realizada de acordo com técnicas conhecidas. Supressores fluorescentes e escuros e as suas propriedades ópticas relevantes a partir das quais os pares de repórter e supressor exemplificativos podem ser selecionados são listados e descritos, por exemplo, em Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a ed., Academic Press, Nova Iorque, 1971, o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência. Exemplos de repórteres e supressores modificantes para ligação covalente através de grupos reativos comuns que podem ser adicionados a um oligonucleotídeo na presente invenção podem ser encontrados, por exemplo, em Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Oitava Edição da Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência.

[0044] Exemplos adequados de repórteres, como fluoróforos, podem ser selecionados de corantes como verde SYBR, 5- carboxifluoresceína (5-FAM™ disponível junto à Applied Biosystems de Foster City, Califórnia, EUA), 6- carboxifluoresceína (6-FAM), tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET), 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxifluoresceína, hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), 6-carboxi-2',4,7,7‘- tetraclorofluoresceína (6-TET™ disponível junto à Applied Biosystems), carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4',5'-dicloro- 2',7'-dimetoxifluoresceína (6-JOE™ disponível junto à Applied Biosystems), produtos de corante VIC™ disponíveis junto à Molecular Probes, Inc., produtos de corante NED™ disponíveis junto à disponível junto à Applied Biosystems, e similares. Exemplos adequados de supressores podem ser selecionados a partir de 6-carboxi-tetrametil-rodamina, ácido 4-(4- dimetilaminofenilazo) benzoico (DABYL), tetrametilrodamina (TAMRA), BHQ-0™, BHQ-1™, BHQ-2™ e BHQ-3™, cada um dos quais está disponível da Biosearch Technologies, Inc. de Novato, Calif., QSY-7™, QSY-9™, QSY—21™ e QSY-35™, cada um dos quais está disponível da Molecular Probes, Inc., e similares.

[0045] Em certos aspectos, a mistura de reação aquosa é posicionada em um óleo não miscível, como um óleo de encapsulação ou óleo carreador. Deve-se entender que o volume de reação aquoso terá uma densidade que é diferente do óleo de encapsulação e/ou do óleo carreador. Em uma modalidade, a mistura de reação aquosa e um óleo de encapsulação são dispersos em um vaso, em que a mistura de reação aquosa terá uma faixa de densidade nos valores de cerca de 900 kg/m3 a cerca de 1.200 kg/m3 (por exemplo, uma solução à base de água de amostra de DNA isolado e reagentes de PCR que têm uma densidade total de aproximadamente 1.000 kg/m3), enquanto que o óleo de encapsulação terá uma faixa de densidade dentro dos valores de cerca de 700 kg/m3 a cerca de 990 kg/m3, desde que as densidades da mistura de reação aquosa e do líquido de encapsulação não se sobreponham. Um líquido de encapsulação adequado inclui, sem limitação, fenilmetilpolisiloxano (óleo de silicone) que tem uma densidade de aproximadamente 920 kg/m3. Em outra modalidade, o volume de mistura de reação aquosa e um óleo carreador são dispersos em um vaso, em que o volume de mistura de reação aquosa terá uma faixa de densidade dentro dos valores de cerca de 900 kg/m3 a cerca de 1.200 kg/m3 (por exemplo, uma solução à base de água de amostra de DNA isolado e reagentes de PCR que têm uma densidade total de aproximadamente 1.000 kg/m3), enquanto que o óleo carreador terá uma faixa de densidade dentro dos valores de cerca de 1.300 kg/m3 a cerca de 2.000 kg/m3. Em algumas modalidades, o óleo carreador é um óleo fluorocarbonado (por exemplo, Fluorinert™ FC-40) que tem uma densidade de aproximadamente 1.900 kg/m3 ou um óleo de amina perfluorinada. Em ainda outra modalidade, a mistura de reação aquosa é posicionada em um óleo de encapsulação não miscível (por exemplo, um óleo de silicone com uma densidade ligeiramente maior que ou igual à água, mas menor que o óleo carreador) e adicionalmente posicionada em uma superfície livre de um óleo carreador mutuamente miscível (por exemplo, Fluorinert™ FC-40). Em uma modalidade preferencial, a mistura de reação aquosa compreende uma solução aquosa de polinucleotídeos de amostra e reagentes de PCR que têm uma densidade entre aquela do óleo carreador e do óleo de encapsulação. Densidades adequadas para os fluidos se situam dentro dos valores de cerca de 1.300 kg/m3 a cerca de 2.000 kg/m3 para o óleo carreador, cerca de 700 kg/m3 a cerca de 990 kg/m3 para o óleo de encapsulação, e cerca de 900 kg/m3 a cerca de 1.200 kg/m3 para a mistura de reação aquosa. Óleos portadores adequados incluem, sem limitação, Fluorinert FC-40™, Fluorinert FC-70™, Fluoridrop 40™, Fluoridrop 7500™, Krytox GLP- 100™, Krytox GLP-104™ e Krytox GLP-105™. As densidades de óleos portadores adequados para uso com os presentes sistemas e métodos podem variar dependendo da formulação e da temperatura, mas são geralmente entre 1.700 kg/m3 e 1.900 kg/m3. Óleos de encapsulação adequados são frequentemente óleos de silicone puro (polidimetilsiloxano [PDMS]) e incluem, sem limitação, Óleo de Silicone SigmaAldrich (5,10,100 ou 1000 cSt), Clearco PSF- 20cSt™, Dow Corning 200™, Xiameter PMX-200™, GE SF96™, Shin-Etsu KF-96™, MicroLubrol MLT8™ e SuperLube 56104™. As densidades de óleos de encapsulação adequados para uso com os presentes sistemas e métodos podem variar dependendo da formulação e da temperatura, mas são geralmente entre 700 kg/m3 e 1100 kg/m3.

[0046] Em certas modalidades, a amostra e o óleo de encapsulação e/ou óleo carreador serão dispensados em um vaso ou poço de volume adequado (por exemplo, tendo um diâmetro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mm, ou mais), como em um tubo de PCR ou placa de microtitulação padrão de tira de tubo (por exemplo, placa de microtitulação de 96, 192 e 384 poços), ou tiras de polímero contínuo Array Tape® e similares fabricados de vidro ou plástico. Em tal disposição, volumes de mistura de reação aquosa muito pequenos podem ser aquecidos sem evaporação significativa das moléculas de água e sem a necessidade de uma tampa, cobertura ou outro material para cobrir a abertura do vaso ou poço. Com menores volumes de mistura de reação aquosa, a energia necessária para aplicar a quantidade de calor necessária para realizar a amplificação de PCR da amostra de polinucleotídeo pode ser diminuída. Enquanto volumes de mistura de reação aquosa maiores que 10 μl podem ser usados com os presentes sistemas e métodos, volumes aquosos adequados para uso com os presentes sistemas e métodos podem ser menores que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 μl, ou menos. Tais pequenos volumes de mistura de reação aquosa podem ser dispersos nos vasos da presente revelação através de dispositivos padrão de micropipetagem. Além disso, volumes de mistura de reação aquosa menores que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6 e 5 nl podem ser dispersos nos vasos da presente revelação com o uso de injeção de gotícula acústica, como aquele descrito em Ellson et al. (2003) JALA 8:29 a 34, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0047] Conforme mostrado na Figura 1, as diferentes densidades dos fluidos permitirão a formação de uma matriz oleosa aquosa exemplificadora. Na Figura 1, um vaso 101 contém uma matriz oleosa aquosa que inclui um óleo carreador (por exemplo, um óleo fluorocarbonado) 102, um óleo de encapsulação (por exemplo, um óleo de silicone) e um volume de mistura de reação aquosa 104 (por exemplo, um volume aquoso contendo polinucleotídeos isolados, primers, sondas e outros reagentes de PCR). Conforme mostrado na mesma, o volume de mistura de reação aquosa 104 é posicionado no óleo de encapsulação 103. Além disso, o óleo de encapsulação misturado em mistura de reação aquosa é posicionado em uma superfície livre de óleo carreador 102. Como resultado da formação de matriz oleosa aquosa, o volume de mistura de reação aquosa 104 é centralizado no vaso 101. O óleo carreador 102 e o óleo de encapsulação 103 evitam a evaporação de moléculas de água no volume de mistura de reação aquosa 104, mesmo quando um pequeno volume de mistura de reação aquosa (por exemplo, menor ou igual a 10 μl) é submetido a aquecimento direto. A configuração de matriz oleosa aquosa também evita contaminação do vaso 101 visto que não é provável que a mistura de reação aquosa contendo, por exemplo, ácidos nucleicos, entre em contato com as paredes do vaso 101 devido às propriedades do óleo carreador 102 e do óleo de encapsulação 103 e às tensões de superfície envolvidas. Em uma modalidade preferencial, toda a matriz oleosa aquosa pode ser aspirada do vaso 101 permitindo assim o reuso do vaso 101 com pouco risco de contaminação cruzada. Visto que a matriz oleosa aquosa centraliza o volume de mistura de reação aquosa 104, a capacidade de facilitar manipulações físicas e de observar o volume de mistura de reação aquosa 104 para propósitos como detecção de fluorescência é enormemente aprimorada.

[0048] Em outra modalidade, um aditivo de polissorbato é adicionado ao óleo de encapsulação. Em tal modalidade, o aditivo de polissorbato tem um número de equilíbrio hidrofílico- lipofílico na faixa de 2 a 8. Aditivos de polissorbato exemplificadores adequados para uso nos presentes sistemas e métodos, incluem, sem limitação, SPAN® 80, SPAN® 65 e TWEEN® 20 (polissorbato-20). Esses aditivos no óleo de encapsulação se encontram na faixa de cerca de 0,001% a cerca de 10% da mistura.

[0049] Como apontado acima, o óleo de encapsulação e/ou óleo carreador da presente revelação permite o uso de volumes de mistura de reação aquosa muito pequenos (por exemplo, menores que ou iguais a 10 μl). Como resultado, o calor pode ser aplicado sob a forma de radiação eletromagnética para rápida e uniformemente aumentar a temperatura do volume de mistura de reação aquosa sem exigir grandes entradas de energia. Por exemplo, a energia necessária para aumentar a temperatura de um volume de 1 μl de água exige apenas miliWatts (mW) de saída de laser.

[0050] Também são fornecidos no presente documento membros de descarga de fluido (por exemplo, micropipetadores, injetores de gotícula acústica) configurados para descarregar ou dispensar o volume de mistura de reação aquosa e o um ou dois óleos não miscíveis em um vaso ou poço para amplificação de PCR. Em uma modalidade preferencial, é fornecido um subsistema de montagem em que um ou mais membros de descarga de fluido são completamente automatizados e programados para dispensar o volume desejado de líquidos. A pipetagem automatizada e outros sistemas de manuseio de líquido similares são bem conhecidos na técnica e realizam transferências programadas de líquido entre coleções pré- selecionadas de recipientes ou vasos. Em algumas modalidades, o subsistema de montagem compreende um ou mais membros de descarga de líquido para dispensar um ou mais dentre o volume de mistura de reação aquosa, o óleo de encapsulação e o óleo carreador nos vasos. Em uma modalidade, uma coleção de matrizes oleosas aquosas se encontra na faixa de 2 a 1.000 matrizes oleosas aquosas, ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312, 324, 336, 348, 260, 372, 384, 396, 408, 420, 432, 444, 456, 458, 460, 472, 484, 496, 508, 520, 532, etc.) são montadas em vasos para amplificação de PCR e detecção. Para manuseio de líquido de alto rendimento, pode ser desejável configurar o sistema para montar e processar os vasos com o uso de padrões de configuração internacionais que compreendem carregar e processar os vasos contendo as matrizes oleosas aquosas em fileiras de 12, contudo, os presentes sistemas e métodos podem ser prontamente adaptados para acomodar outras configurações desejadas (por exemplo, fileiras de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 19, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais vasos). Em algumas modalidades, um ou mais dos membros de descarga de líquido compreendem uma cabeça de pipetagem (por exemplo, uma cabeça de pipetagem de múltiplos canais ou de canal único) para transferência de líquido. Em algumas modalidades, uma ou mais cabeças de pipetagem são colocadas em um sistema de eixo geométrico automatizado baseado em servomotores ou motores de passo, em que a uma ou mais cabeças de pipetagem podem ser posicionadas em recipientes contendo fluidos de entrada para aspirar os fluidos e, então, posicionadas em vasos para dispensar os fluidos de entrada retirados nos vasos. Os membros de descarga de líquido podem ser configurados para dispensar volume de líquidos ou equipados com pontas descartáveis para dispensação de canal único ou de múltiplos canais de líquidos.

[0051] Em uma modalidade particular, um conjunto de membros de descarga de líquido é configurado para aspirar um óleo de encapsulação de um recipiente de entrada de encapsulação e, então, automaticamente posicionado em uma fileira de vasos, em que o conjunto de membros de descarga de líquido dispensa o óleo de encapsulação nos vasos. Em outra modalidade, um conjunto de membros de descarga de líquido é configurado para aspirar um óleo carreador de um recipiente de entrada de portador e, então, automaticamente posicionado em uma fileira de vasos, em que o conjunto de membros de descarga de líquido dispensa o óleo carreador nos vasos. Em ainda outra modalidade, um conjunto de membros de descarga de líquido é configurado para aspirar uma amostra de polinucleotídeo (por exemplo, amostra de DNA de interesse) de um recipiente de entrada de amostra e, então, automaticamente posicionado em uma fileira de vasos, em que o conjunto de membros de descarga de líquido dispensa a amostra de polinucleotídeo nos vasos. Em ainda outras modalidades, um conjunto de membros de descarga de líquido é configurado para aspirar um volume de reagentes de PCR (por exemplo, sais, tampões, enzimas, dNTPs) de um recipiente de entrada de reagente de PCR e, então, automaticamente posicionado em uma fileira de vasos para dispensar os reagentes nos poços. Em tais modalidades, primers de amplificação adequados e sondas de ácido nucleico específicas de alelo também podem ser incluídos na entrada de reagente de PCR. Em outras, outro conjunto de membros de descarga de líquido é configurado para aspirar e dispensar os primers e sondas. Deve-se compreender que os componentes do volume de mistura de reação aquosa (isto é, amostra de polinucleotídeo, primers, sondas e reagentes de PCR) podem ser pré-misturados, aspirados e dispensados pelos mesmos membros de descarga de líquido ou por membros diferentes e em qualquer ordem. Além disso, a amostra de polinucleotídeo pode ser pré-misturada com os primers, sondas e reagente de PCR e, então, aspirada pelos membros de descarga de líquido para dispensar em um ou mais vasos. Alternativamente, os membros de descarga de líquido podem ser configurados para dispensar as amostras de polinucleotídeo e primers/sondas/reagentes de PCR separadamente. O subsistema de montagem da presente revelação pode ser programado para montar as matrizes oleosas aquosas em qualquer ordem e para qualquer combinação de amostras de polinucleotídeo e primer/sondas/reagentes de PCR, por exemplo, para amplificação de PCR e detecção em uma ou mais amostras de polinucleotídeos com o uso de um ou mais conjuntos distintos de combinações de primer/sonda. Adaptar pipetagem automatizada e outros sistemas de manuseio de líquido a um local de trabalho para inúmeras operações de montagem de líquido programáveis é bem conhecido pelo versado na técnica, e tais sistemas de manuseio de líquido estão disponíveis junto ao fabricante de equipamento original (OEM), produto comercial e fornecedores de automatização/integração incluindo, sem limitação, 3Dispense, Accel Biotech, Inc., Agilent Technologies, Inc., Apricot Designs, AsysTek, Aurora Biomed, Beckman Coulter, Biohit (Sartorius), BioNex Solutions, BioTek, CyBio (Analytic Jena), Dispendix, Dynamic Devices, FluidX, Formulatrix, Gilson, Hamilton, HTZ, Hudson Robotics, Integra Biosciences, Kawator, Labcyte, Nanoscreen, Perkin Elmer, Rainin, Scineon, Seyonic, Synchron, Tecan, Xantus, Xiril (SIAS) e Zinsser North America.

[0052] Em uma modalidade particular, primers, sondas e reagentes de PCR são otimizados para a detecção de um marcador polimórfico particular e combinados em uma entrada única. Em tal modalidade, quatro conjuntos de membros de descarga de líquido são dispostos de modo que o óleo carreador e o óleo de encapsulação são dispensados em batelada em uma fileira de vasos, seguido pela dispensação das amostras de polinucleotídeo e, então, dos reagentes de PCR necessários para uma detecção de marcador particular (consulte, por exemplo, a Figura 9). Embora um ou dois óleos não miscíveis, amostra de polinucleotídeo volume, primers, sondas e reagentes de PCR possam ser dispensados nos vasos em qualquer ordem, é preferencial dispensar o um ou mais óleos não miscíveis nos vasos antes de dispensar os polinucleotídeos para evitar a contaminação dos vasos. Em algumas modalidades, múltiplos conjuntos de membros de descarga são configurados para corresponder ao número de vasos em uma fileira, por exemplo, membros de descarga de líquido configurados com 12 pontas de pipetagem a um espaçamento igual àquele dos vasos em cada fileira.

[0053] Vasos adequados usados para conter as matrizes oleosas aquosas incluem, sem limitação, placas de microtitulação de 96 poços com volumes funcionais na faixa de cerca de 15 μl a cerca de 100 μl e diâmetros de cerca de 3 mm a cerca de 6 mm, placas de microtitulação de 384 poços com volumes na faixa de cerca de 2 μl a cerca de 40 μl e diâmetros de cerca de 2 mm a cerca de 4 mm, Array Tape® de 384 poços ou 1.536 poços com volumes de vaso na faixa de cerca de 0,5 μl a cerca de 2 μl e diâmetros de cerca de 0,5 mm a cerca de 3 mm, ou uma correia ou corrente de poço ondulada em um conjunto de pista com volumes de vaso na faixa de cerca de 1 μl a cerca de 20 μl e diâmetros de cerca de 0,5 mm a cerca de 4 mm (consulte as Figuras 4A e 4B), e similares. É preferencial que os vasos para uso no presente documento sejam transparentes e fabricados de plástico ou vidro.

Subsistema de aquecimento fotônico

[0054] Em certos aspectos da revelação, o aquecimento mediado por luz de reação em reação, ou aquecimento fotônico, é aplicado a cada vaso e/ou diretamente a cada volume de mistura de reação aquosa para aumentar a temperatura do volume de mistura de reação aquosa de acordo com a temporização e temperaturas necessárias para um ciclo de temperatura de PCR particular, entende-se que o termo "de reação em reação" se refere à aplicação de radiação eletromagnética (e medição de temperatura) a cada volume de mistura de reação aquosa e/ou matriz oleosa aquosa individual em oposição a um sistema que utiliza zonas de temperatura ou aquecimento fotônico constante de múltiplas reações simultaneamente por uma única fonte de luz sob controle único. É bem conhecido na técnica que a amplificação de PCR de DNA de filamento duplos exige uma desnaturação inicial do DNA ("começo quente") seguido de múltiplos ciclos de recozimento, alongamento e desnaturação. Temperaturas adequadas para a etapa de desnaturação estão na faixa de temperatura de cerca de 90 °C a cerca de 99 °C, por exemplo, cerca de 90 °C, 91 °C, 92 °C, 93 °C, 94 °C, 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C ou 99 °C. De preferência, a temperatura de desnaturação é de cerca de 95 °C. Após a desnaturação do DNA, a temperatura é diminuída, por exemplo, através de um dissipador de calor ou da aplicação de ar frio, para uma temperatura de recozimento otimizada para a hibridização dos primers e sondas etiquetadas ao filamento-alvo de polinucleotídeo. Em uma modalidade preferencial, as sondas são covalentemente ligadas a um fluoróforo que tem a capacidade de excitação por radiação eletromagnética que tem um certo comprimento de onda espectral. A temperatura de recozimento é tipicamente otimizada com base no comprimento e na composição de ácido nucleico dos primers e/ou sondas com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado da equação de Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267 a 284 (1984): Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) 40,41 (% de GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % de GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade; dessa forma, as condições de hibridização de Tm podem ser ajustadas para hibridizar a sequências da identidade desejada. Por exemplo, se são buscadas sequências com >90% de identidade, a Tm pode ser diminuída 10° C. Em geral, condições estringentes são selecionadas em cerca de 5 °C menos que a Tm para a sequência específica e seu complemente a uma força iônica e pH definidos.

[0055] Temperaturas adequadas para a etapa de recozimento estão na faixa de temperatura de cerca de 50 °C a cerca de 70 °C, por exemplo, cerca de 50 °C, 51 °C, 52 °C, 53 °C, 54 °C, 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C ou 70 °C. De preferência, a temperatura de recozimento está na faixa de cerca de 50 °C a cerca de 65 °C. Com mais preferência, a temperatura de recozimento está na faixa de cerca de 55 °C a cerca de 65 °C. Após os primers e sondas terem sido recozidos para sua sequência- alvo de polinucleotídeo, a temperatura é aumentada para permitir o alongamento de novos filamentos de polinucleotídeo dos primers hibridizados. Temperaturas adequadas para a etapa de alongamento estão na faixa de cerca de 65 °C a cerca de 75 °C, por exemplo, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C, 70 °C, 71 °C, 72 °C, 73 °C, 74 °C ou 75 °C. De preferência, a etapa de alongamento é executada a cerca de 70 °C. Após uma etapa de desnaturação inicial (isto é, um "começo quente"), os sistemas e métodos da presente revelação compreendem uma pluralidade de ciclos de temperatura de PCR, na faixa de 2 a 60, ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou mais ciclos, em que cada ciclo de temperatura de PCR compreende uma etapa de recozimento, uma etapa de alongamento e uma etapa de desnaturação. Após cada ciclo de temperatura de PCR, a temperatura de cada matriz oleosa aquosa é resfriada para uma faixa de temperatura de cerca de 55 °C a cerca de 65 °C, por exemplo, 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C ou 65 °C, antes de começar a próxima etapa de recozimento. As matrizes oleosas aquosas podem ser resfriadas por um mecanismo de resfriamento ativo ou passivo, como um dissipador de calor e metal passivo, correntes de ar de circulação ativa, correntes de ar de circulação passiva, um dispositivo de Peltier, um líquido de circulação ou qualquer combinação dos mesmos.

[0056] É um aspecto dessa revelação fornecer volumes de mistura de reação aquosa pequenos o suficiente (por exemplo, 10 μl ou menos) para permitir aquecimento eficiente e direto através de uma fonte de radiação eletromagnética de modo que apenas poucos segundos sejam necessários para alcançar as temperaturas de recozimento, alongamento e desnaturação para cada ciclo. Em algumas modalidades, um ciclo de PCR exige a aplicação de radiação eletromagnética por um período de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 segundos ou menos.

[0057] Dependendo do tipo de radiação eletromagnética emitida, a radiação aquece o volume de mistura de reação aquosa por absorção térmica das moléculas de água no volume de mistura de reação aquosa ou pela absorção térmica de pigmentos de absorção de calor, corantes termocrômicos, materiais excitáveis por plasma, ou uma combinação dos mesmos. Deve-se compreender que os pigmentos de absorção de calor, corantes termocrômicos e/ou materiais excitáveis por plasma podem ser dispostos nas paredes do vaso ou dispersos no vaso e/ou no volume de mistura de reação aquosa. Fontes de radiação eletromagnética exemplificadoras adequadas para uso com os presentes sistemas e métodos incluem lasers, lâmpadas de halogênio, diodos de laser e diodos emissores de luz. A posição do vaso contendo a matriz oleosa aquosa, em que a radiação eletromagnética é aplicada por uma fonte de radiação eletromagnética, é, às vezes, referida no presente documento como uma "posição de aquecimento." Em algumas modalidades, a fonte de radiação eletromagnética emite radiação ultravioleta que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 100 nm a cerca de 350 nm. Em outras modalidades, a fonte de radiação eletromagnética emite luz visível que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 380 nm a cerca de 700 nm. Em uma modalidade preferencial, a fonte de radiação eletromagnética emite luz azul que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 350 nm a cerca de 500 nm. Em uma modalidade mais preferencial, a fonte de radiação eletromagnética emite luz azul que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 350 nm a cerca de 450 nm. Em uma modalidade ainda mais preferencial, a fonte de radiação eletromagnética emite luz azul que tem um comprimento de onda espectral de cerca de 450 nm. Em ainda outras modalidades, a fonte de radiação eletromagnética emite radiação infravermelha que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 1.200 nm a cerca de 2.200 nm. Em um aspecto preferencial, a fonte de radiação eletromagnética emite radiação infravermelha que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 1.450 nm a cerca de 1.600 nm (por exemplo, cerca de 1.550 nm). Dessa forma, uma fonte de radiação eletromagnética adequada para uso nos presentes sistemas e métodos terá um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 100 nm a cerca de 2.200 nm.

[0058] Em algumas modalidades, a fontes de radiação eletromagnética são diodos de laser. Diodos de laser são relativamente baratos, pequenos e seguros com uma vida útil muito longa. Diodos de laser de estado sólido adequados para uso com os presentes sistemas e métodos são similares àqueles encontrados em muitos dispositivos eletrônicos comuns como reprodutores de disco versátil digital e disco compacto ou em comunicação de fibra óptica. A saída de energia de tal diodo de laser pode ser focada em uma área muito pequena (por exemplo, através de uma lente de colimação), e diodos de laser estão comercialmente disponíveis em uma grande variedade de comprimentos de onda de saída espectral e potências. Além disso, a energia necessária para aumentar a temperatura de uma mistura de reação aquosa que tem um volume muito pequeno, por exemplo, aproximadamente 5 μl, 1 μl, ou menos, é muito pequena. Portanto, a saída de energia necessária para os diodos de laser adequados para uso com o presente sistema é muito baixa, por exemplo, de cerca de 10 mW a cerca de 500 mW, dependendo da massa térmica do vaso e do volume de matriz oleosa. Em um aspecto, uma fonte de radiação eletromagnética, por exemplo, um diodo de laser, é fornecida para emitir radiação infravermelha que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 1.200 nm a cerca de 2.200 nm para um vaso contendo uma matriz oleosa aquosa, em que um volume da mistura de reação aquosa compreende uma amostra de polinucleotídeo a ser analisada por genotipagem de PCR (por exemplo, para detecção de produto de PCR de estágio final ou detecção de produto de PCR em tempo real). Selecionando um comprimento de onda espectral que é preferencialmente absorvido pelas moléculas de água no volume de mistura de reação aquosa em vez de do óleo de encapsulação e/ou portador e/ou o material de vaso (por exemplo, vidro ou plástico), a saída de energia pode ser concentrada no volume de mistura de reação aquosa na matriz oleosa aquosa.

[0059] Em uma modalidade preferencial, o volume de mistura de reação aquosa é centralizado em uma matriz oleosa aquosa, e o comprimento de onda espectral da radiação infravermelha é de cerca de 1.550 nm. Em tais aspectos, um diodo de laser para emitir a radiação infravermelha pode ser posicionado acima do vaso ou abaixo do vaso. É conhecido na técnica que a radiação infravermelha é prontamente absorvida por moléculas de água. Portanto, a radiação infravermelha pode ser focada diretamente no volume de mistura de reação aquosa em que o calor é prontamente absorvido pelas moléculas de água nisso para aquecer diretamente a mistura de reação aquosa. Deve-se compreender que o diodo de laser é colocado nas proximidades do vaso a uma distância que pode variar dependendo de como a luz infravermelha é focada. Um diodo de laser exemplificador configurado para a emissão de radiação infravermelha compreenderá uma fonte de alimentação e uma lente opcional ou um colimador opcional para ajustar o foco do feixe infravermelho. Em algumas modalidades, o diodo de laser pode compreender uma ou mais fibras ópticas ou tubos de luz para fornecer uma via óptica para a radiação infravermelha e permitir a flexibilidade no posicionamento do diodo de laser em relação ao vaso. Para o aquecimento direto do volume de mistura de reação aquosa, o diodo de laser pode ser colocado a uma distância de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 cm, ou mais ou do topo do vaso ou do fundo do vaso, e a lente ou colimador pode ser usado para focar a radiação infravermelha no volume de mistura de reação aquosa. Para o aquecimento uniforme e eficiente da mistura de reação aquosa, o feixe infravermelho será focado de modo que o tamanho do feixe é aproximadamente equivalente ao tamanho do volume de mistura de reação aquosa.

[0060] O período de tempo necessário para aquecer a amostra para cada ciclo de PCR pode ser calculado com base no calor de água específico (isto é, 4,184 J/g °C) e na saída de potência usada para o laser e na taxa de dissipação de calor dos materiais e vasos. Por exemplo, dependendo da massa térmica total específica e das propriedades de dissipação de calor, um diodo de laser de 1.550 nm alimentado por 50 mW pode ser focado na mistura de reação aquosa que tem um volume de cerca de 1 μl. Dessa forma, a temperatura da mistura de reação aquosa, pode ser aquecida da temperatura ambiente, ou do ambiente, para cerca de 60 °C em aproximadamente 1 segundo, e, então, para cerca de 70 °C em mais 0,8 segundo e, então, para cerca de 95 °C em menos que 2 segundos. Portanto, um diodo de laser pode ser usado para emitir radiação infravermelha para aquecer o volume da mistura de reação aquosa através de um ciclo de temperatura de PCR em cerca de 3,3 segundos. Cada ciclo de temperatura de PCR individual pode ser realizado em um volume de mistura de reação aquosa com um diodo de laser. Contudo, com maiores volumes de mistura de reação aquosa (por exemplo, 5 μl) e um diodo de laser de emissão de luz infravermelha com o uso de uma baixa entrada de energia (por exemplo, cerca de 80 a cerca de 200 mW), ineficiências ocorrem na absorção de luz infravermelha por água e o calor conduzido no fluido de encapsulação e/ou fluido portador circundante e mesmo até nas paredes de vaso. Neste ponto, o calor que é conduzido para o óleo e vidro do volume de mistura de reação aquosa pode equilibrar a energia sendo colocada no volume de mistura de reação aquosa pelo diodo de laser e resulta na inibição da elevação de temperatura. Contudo, entende-se que é bem conhecido pelo versado na técnica otimizar o sistema para uso dependendo dos materiais selecionados para o fluido de encapsulação ou fluido portador, o volume da mistura de reação aquosa, e a saída de potência do laser. Por exemplo, o volume da mistura de reação aquosa pode ser reduzido em cerca de 2 vezes a cerca de 100 vezes, ou mais (por exemplo, 1.000 vezes através de uma transferência acústica), a potência do diodo de laser pode ser aumentada para transferir energia para o vaso a uma taxa maior que a taxa de perda, e/ou a absorção de energia de luz disponível para a conversão em calor pode ser aprimorada de modo que o calor seja conduzido até a taxa aumentada de volume de mistura de reação aquosa em comparação com a taxa de perda de calor. Em uma modalidade, a absorção térmica é aprimorada com o uso de corantes e partículas de absorção de calor, e/ou matrizes oleosas aquosas são usadas para permitir o uso de volumes menores de mistura de reação aquosa (por exemplo, menores que 5 μl).

[0061] É apresentada na Figura 2 uma configuração exemplificadora do presente sistema. Nessa modalidade, a fonte de radiação eletromagnética 201, por exemplo, um diodo de laser que emite radiação infravermelha, é posicionado no topo do vaso 101. A radiação eletromagnética é portada, ou conduzida, ao longo de uma trajetória óptica por uma fibra óptica ou tubo de luz 203 e focada no volume de mistura de reação aquosa 104 através de uma lente colimadora 204.

[0062] Em uma modalidade alternativa, uma fonte de radiação eletromagnética, por exemplo, diodo emissor de luz (LED), é fornecida para emitir luz azul que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 350 nm a cerca de 450 nm (ou luz ultravioleta ou violeta que tem um comprimento de onda espectral de cerca de 100 nm a cerca de 350 nm) para um vaso contendo uma matriz oleosa aquosa, em que o volume de mistura de reação aquosa compreende uma amostra de polinucleotídeo a ser analisada por genotipagem de PCR. Em uma modalidade preferencial, o volume de mistura de reação aquosa é posicionado em dois óleos não miscíveis, como a matriz oleosa aquosa exemplificadora apresentada na Figura 1. Em tal modalidade, um LED é posicionado em comunicação óptica com o vaso e emite radiação eletromagnética que tem um comprimento de onda espectral de cerca de 450 nm (isto é, luz azul). Em tais aspectos, um LED para emitir a luz azul pode ser posicionado acima do vaso ou no fundo do vaso. Embora moléculas de água não absorvam prontamente radiação de luz azul, o volume de mistura de reação aquosa pode ser uniformemente aquecido pela fonte de luz de LED com o uso de partículas excitáveis por plasma no volume de mistura de reação aquosa. Os materiais excitáveis por plasma que prontamente absorvem luz azul podem emitir calor por meio de um processo conhecido na técnica como conversão fototérmica de luz em calor através de acoplamento fóton-elétron-fônon. Partículas excitáveis por plasma adequadas para absorver radiação de luz azul são conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, partículas que compreendem ouro, prata, níquel, platina ou uma combinação dos mesmos. De preferência, o material excitável por plasma é ouro. O uso de ouro na PCR fotônica é descrito em detalhes em Ho Son et al. (2015), cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Alternativamente, paredes selecionadas dos vasos podem ser revestidas com material excitável por plasma (por exemplo, partículas de ouro) por eletrólise ou deposição de vapor. Em uma modalidade preferencial, um filme ou camada fina que compreende material excitável por plasma é disperso no vaso em ou próximo ao fundo do vaso de modo que o filme ou camada fina esteja dentro da matriz oleosa aquosa, mas dentro ou abaixo da mistura de reação aquosa (consulte, por exemplo, a Figura 3). Em uma modalidade mais preferencial, um filme ou camada fina de ouro é colocada dentro do vaso e no fundo do vaso de modo que o filme ou camada fina fique em contato próximo com a matriz oleosa aquosa e entre a mistura de reação aquosa e o fundo do vaso. Em alguns aspectos, um disco de Mylar que compreende a camada fina de ouro é colocado no vaso e no fundo do vaso. Em outros aspectos, um disco de folha de alumínio revestido com ouro é colocado no vaso no fundo do vaso. A espessura do filme ou camada fina de material excitável por plasma está na faixa de cerca de 10 nm a cerca de 100 nm, por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nm. Em outras modalidades, a espessura do filme ou camada fina de material excitável por plasma está na faixa de cerca de 50 nm a cerca de 500 nm, por exemplo, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm ou 500 nm. Filmes ou camadas mais espessas de material metálico, até cerca de 1 mm de espessura ou mais, podem absorver luz e converter a energia de luz em calor, mas a ressonância plasmônica de superfície é reduzida, o que reduz o aquecimento. Em outras modalidades, o material revestido com a camada fina de ouro (por exemplo, Mylar, vidro, folha de alumínio ou vários outros plásticos) pode constituir o fundo do vaso ou pode ser posicionado no fundo da parede de vaso. Em algumas modalidades, o LED é posicionado no topo ou no fundo do vaso e focado (por exemplo, por uma lente ou colimador) para emitir radiação de luz azul na camada de ouro para condução de calor para a gotícula aquosa.

[0063] Deve-se compreender que o LED é colocado nas proximidades do vaso a uma distância que pode variar dependendo de como a luz azul é focada. Um LED exemplificador configurado para a emissão de radiação de luz azul compreenderá uma fonte de alimentação e uma lente ou um colimador para ajustar o foco do feixe de luz. Em algumas modalidades, o LED pode compreender uma ou mais fibras ópticas ou tubos de luz para fornecer uma via óptica para o LED e permitir a flexibilidade no posicionamento do laser em relação ao vaso contendo a amostra. Em outras modalidades, o alojamento de LED tem um diâmetro físico menor que a distância entre os vasos de reação e é posicionado diretamente abaixo do vaso. Em tais modalidades, o pequeno LED será ligado à fonte de alimentação com o uso de conjunto de circuitos convencional, e o LED compreenderá um colimador para permitir a focalização de feixe. Para o aquecimento uniforme da gotícula aquosa, os LEDs da presente revelação podem ser colocados a uma distância de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 mm, ou mais ou do topo do vaso ou do fundo do vaso, e a lente ou colimador opcional pode ser usado para focar o feixe de luz em uma camada fina de material excitável por plasma, como ouro. Para o aquecimento uniforme e eficiente do volume de reação aquoso, o feixe de luz azul será focado no material excitável plasmônico de modo que o tamanho do feixe seja aproximadamente equivalente à área superficial do material excitável plasmônico. Em uma modalidade preferencial, um disco de Mylar que compreende uma camada fina de ouro (por exemplo, entre cerca de 10 nm e 0,2 mm de espessura) é colocado no vaso, e a radiação de luz azul emitida do LED é focada de modo que o tamanho do feixe seja aproximadamente equivalente ao tamanho do disco de Mylar ou de folha de alumínio e camada fina de ouro.

[0064] É apresentada na Figura 3 uma modalidade da revelação que compreende uma fonte de radiação eletromagnética para a emissão de luz visível (por exemplo, um LED que emite luz azul). Uma matriz oleosa aquosa que compreende um volume de mistura de reação aquosa 304 posicionado em um óleo de encapsulação 303 e um óleo carreador 302. Nessa modalidade exemplificadora, a fonte de radiação eletromagnética 309 (por exemplo, um LED que emite luz azul) é posicionada em comunicação óptica com o fundo do vaso 301 (por exemplo, um vaso de plástico transparente). Uma camada fina de material excitável plasmônico 306 é dispersa no vaso 301 de modo que o material excitável plasmônico seja posicionado no fundo de vaso 301 dentro ou em contato com o óleo carreador 302, mas abaixo do óleo de encapsulação 303 e do volume de mistura de reação aquosa 304. Conforme discutido no presente documento, o material excitável plasmônico pode ser ouro. Opcionalmente, uma camada de passivação 305 fabricada de qualquer material adequado usado na técnica (por exemplo, plástico, dimetilsiloxano ou dióxido de silício) é disposta sobre o material excitável plasmônico 306 para evitar que os componentes de reação PCR no volume de mistura de reação aquosa 304 reajam com o material excitável plasmônico 306. Contudo, a matriz oleosa aquosa cria separação entre o volume de mistura de reação aquosa 304 e o material excitável plasmônico 306 e diminui a probabilidade de os componentes de reação PCR reagir com o material excitável plasmônico. Dependendo do tamanho e proximidade do LED da superfície plasmônica, uma lente colimadora opcional 308 permite focar o feixe de luz (linha pontilhada) no material excitável plasmônico 306, que, então, converte a energia de luz em calor que é uniformemente conduzido para o volume de mistura de reação aquosa 304. Em algumas modalidades, um detector 307 é posicionado em comunicação óptica com o topo do vaso 301. O detector 307 pode compreender qualquer dispositivo de detecção adequado para a detecção de radiação térmica (por exemplo, radiação infravermelha de corpo negro) e/ou fluorescência emitida do volume de mistura de reação aquosa (linha pontilhada), conforme será discutido em mais detalhes em outro local no presente documento.

O Dispositivo de Posicionamento de Correia

[0065] Em certos aspectos, os presentes sistemas e métodos compreendem um dispositivo de posicionamento para mover discretamente os vasos (por exemplo, etapa por etapa em oposição ao movimento contínuo) contendo as matrizes oleosas aquosas através dos vários subsistemas e estações de vaso do sistema. Em uma modalidade, o dispositivo de posicionamento é uma correia em movimento compreendida de uma pluralidade vasos (por exemplo, poços ou depressões), em que os vasos irão conter as matrizes oleosas aquosas montadas. A correia pode ser construída de plástico flexível, polímeros termoplásticos (por exemplo, polipropileno, poliestireno ou policarbonato) ou outros materiais similares àqueles usados para Array Tape®. Em algumas modalidades, os vasos são estampados no material de correia para formar depressões. O volume de cada poço se encontra na faixa de 0,2 μl a cerca de 20 μl com um diâmetro de cada vaso na faixa de cerca de 0,5 mm a cerca de 4 mm dependendo dos parâmetros de modelo desejados. A correia, e os vasos na correia, podem ser fabricados de um material contínuo ou podem ser fabricados em pequenos segmentos, em que cada segmento compreende um conjunto configurado de vasos de reação, e onde os segmentos são fixados, ou acorrentados juntos, por meio de qualquer técnica adequada na técnica, para constituir a correia. Em tal modalidade, os segmentos podem ser trocados ou substituídos conforme necessário para simplificar a criação de configurações ideais para vários volumes de vasos e/ou para suportar manutenção e/ou reparo. Em uma modalidade preferencial, as correias serão unidas pelas as extremidades para formar uma estrutura de laço e irão operar através de uma pista motorizada conectada de modo comunicativo a um sistema de controle mecânico e eletrônico, que atuarão a correia para mover os vasos em etapas discretas do subsistema de montagem através de cada uma dentre as posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura, posições de detecção de produto de PCR. Em algumas modalidades, a correia moverá os vasos para um subsistema de descarte de refugo após a conclusão da amplificação de PCR e de ciclos de detecção de PCR. Cada atuação da correia é seguida por uma interrupção (por exemplo, movimento gradual) para posicionar cada fileira de vasos na estação de vaso apropriada. O termo "estação de vaso" conforme usado aqui se refere a um local físico particular de uma fileira ou arranjo de vasos no sistema.

[0066] Em algumas modalidades, estações de vaso compreendem: 1) montagem das matrizes oleosas aquosas através do subsistema de montagem; 2) uma posição de aquecimento através do subsistema de aquecimento fotônico; 3) uma posição de monitoramento de temperatura através do subsistema de monitoramento de temperatura; 4) uma posição de detecção de produto de PCR através do subsistema de detecção de fluorescência; e 5) opcionalmente, descarte de refugo através do subsistema de descarte de refugo. Em outras modalidades, estações de vaso compreendem: 1) montagem das matrizes oleosas aquosas através do subsistema de montagem; 2) uma posição de aquecimento através do subsistema de aquecimento fotônico, uma posição de monitoramento de temperatura através do subsistema de monitoramento de temperatura e uma posição de detecção de produto de PCR através do subsistema de detecção de fluorescência; e 3) opcionalmente, descarte de refugo através do subsistema de descarte de refugo. Em ainda outras modalidades, estações de vaso compreendem: 1) montagem das matrizes oleosas aquosas através do subsistema de montagem; 2) uma posição de aquecimento através do subsistema de aquecimento fotônico; 3) uma posição de monitoramento de temperatura através do subsistema de monitoramento de temperatura e uma posição de detecção de produto de PCR através do subsistema de detecção de fluorescência; e 4) opcionalmente, descarte de refugo através do subsistema de descarte de refugo. Em uma modalidade preferencial, estações de vaso compreendem: 1) montagem das matrizes oleosas aquosas através do subsistema de montagem; 2) uma posição de aquecimento através do subsistema de aquecimento fotônico e uma posição de monitoramento de temperatura através do subsistema de monitoramento de temperatura; 3) uma posição de detecção de produto de PCR através do subsistema de detecção de fluorescência; e 4) opcionalmente, descarte de refugo através do subsistema de descarte de refugo. Em ainda outras modalidades, estações de vaso de adição podem ser incluída no sistema, como estações de vaso que compreendem uma posição de resfriamento através de um dissipador de calor ativo ou passivo e uma posição de começo quente ou posições através de aquecimento fotônico.

[0067] São apresentadas nas Figuras 4A e 4B modalidades exemplificadoras de um modelo de correia adequado para uso com o presente sistema e métodos. Nessa modalidade, uma correia 402 é disposta em engrenagens de transmissão 401 em cada extremidade. Nessa modalidade, o sistema de controle mecânico e eletrônico irá ocasionar a rotação das engrenagens de transmissão 401 (indicado pela seta) para permitir que a correia mova cada fileira de vasos em etapas distintas através de cada estação de vaso. A correia 402 compreende uma pluralidade de vasos 404 adequados para conter uma matriz oleosa aquosa. Pode ser utilizada qualquer variação de espaçamento de vasos. Em uma modalidade preferencial, o espaçamento de vaso pode ser de cerca de 1 mm a cerca de 10 mm ou mais, por exemplo, 1 mm, 1,5 mm, 2 mm, 2,5 mm, 3 mm, 3,5 mm, 4 mm, 4,5 mm, 5 mm, 5,5 mm, 6 mm, 6,5 mm, 7 mm, 7,5 mm, 8 mm, 8,5 mm, 9 mm, 9,5 mm, 10 mm ou mais. Em uma modalidade mais preferencial, o espaçamento de vaso se encontra em uma faixa de cerca de 8 mm a cerca de 10 mm. Em uma modalidade mais preferencial, o espaçamento dos vasos é de cerca de 9 mm para se encaixar aos padrões internacionais para espaçamento de poço em placas de microtitulação e espaçamento de ponta padrão em pipetadores de múltiplas pontas. Em certos aspectos, a correia compreenderá fileiras de vasos, em que cada fileira incluirá qualquer número de vasos na faixa de 2 a 100 vasos, ou mais em cada fileira. Com mais preferência, o número de vasos em cada fileira é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 19, 10, 11, 13, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais vasos. É mostrada na Figura 4B a modalidade mais preferencial, em que cada fileira de vasos na correia 402 compreende 12 vasos. O tamanho e o formato de cada vaso podem ser projetados com base no volume de óleo de encapsulação de modo que o óleo de encapsulação seja substancialmente estacionário quando posicionado no óleo carreador, mantendo assim o volume de mistura de reação aquosa substancialmente centralizado no poço. Nessa modalidade, uma correia flexível 402 é disposta em engrenagens de transmissão 401 em cada extremidade. Nessa modalidade, o sistema de controle mecânico e eletrônico irá ocasionar a rotação das engrenagens de transmissão 401 (na direção da seta) para permitir que a correia mova cada fileira de vasos em etapas distintas através de cada estação de vaso.

[0068] Em algumas modalidades, os vasos da correia podem ser revestidos (por exemplo, através de eletrólise, deposição de vapor ou pintura por emulsão) com um material excitável plasmônico, como ouro. Em algumas modalidades, o material excitável plasmônico é inserido em cada vaso como um disco revestido de Mylar, folha de alumínio, ou outro portador de material fino adequado. Também é mostrado na Figura 4A uma pluralidade de metais dissipadores de calor passivos 403 para resfriar cada fileira de vasos quando em uma estação de vaso nas proximidades para um metal dissipador de calor passivo 403.

Subsistema de Monitoramento de Temperatura

[0069] Embora muitos sistemas de PCR adicionais compreendam zonas de temperatura constante para termociclo de PCR, os presentes sistemas e métodos fornece aquecimento direto e monitoramento de temperatura de cada vaso, permitindo a otimização e a regulação das condições de termociclo de PCR para cada vaso. Além disso, os presentes sistemas e métodos podem ser programados para executar uma pluralidade de diferentes condições de termociclo de PCR para amplificar e detectar produtos de PCR com o uso de uma pluralidade de diferentes amostras de polinucleotídeo com diferentes primers, sondas e reagentes de PCR. Visto que as temperaturas das matrizes oleosas aquosas nos vasos devem ser monitoradas para permitir que o presente sistema regule a quantidade de energia a fornecer dos lasers para mudar a temperatura do vaso para os valores desejados para termociclo de PCR eficiente, é fornecido no presente documento um subsistema de monitoramento de temperatura. Em algumas modalidades, o subsistema de monitoramento de temperatura coleta dados de temperatura de cada um dos vasos durante, simultaneamente ou após cada ciclo de temperatura de PCR que podem ser usados para auxiliar no controle de qualidade. Em outras modalidades, o subsistema de monitoramento de temperatura coleta dados de temperatura de cada um dos vasos durante cada ciclo de temperatura de PCR que podem ser usados para determinar uma temperatura de linha de base para otimização do próximo ciclo de aquecimento ou, alternativamente, para normalização de fluoróforos sensíveis à temperatura. Matrizes oleosas aquosas (ou volumes de mistura de reação aquosa) que não mudam a temperatura como esperado podem indicar dispensação incorreta de volume do subsistema de montagem ou mal funcionamento de instrumento. Em certas modalidades, as informações de medição de temperatura estão disponíveis a cada 15 segundos ou menos enquanto o sistema está em execução. Além disso, algumas modalidades do sistema incorporam funcionalidade de software que alerta à equipe de laboratório em relação a qualquer imprecisão de temperatura. Tal funcionalidade pode incluir, sem limitação, alertas baseados em temperaturas fora dos limites ajustados, falhas na detecção de mudanças esperadas de temperatura dentro de intervalos de tempo esperados durante o aquecimento fotônico, ou mudanças de temperatura que são erráticas ou variam de formas inesperadas. O software que fornece tal funcionalidade pode ser codificado de modo personalizado ou pode utilizar algoritmos pública ou comercialmente disponíveis. A posição do vaso contendo a matriz oleosa aquosa quando a temperatura ou informações térmicas são coletadas e monitorada é, às vezes, referida no presente documento como uma "posição de monitoramento de temperatura."

[0070] Em certos aspectos, o subsistema de monitoramento de temperatura compreende uma pluralidade de dispositivos de detecção térmica, em que cada um dos mesmos corresponde a um vaso contendo uma matriz oleosa aquosa. Dispositivos de termodetecção adequados são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, termistores de contato direto e/ou termopares, imageadores térmicos sem contato, sensores de termopilha distintos, arranjos de termopilha, outros sensores infravermelhos, ou fibras ópticas e/ou arranjos de fibra óptica em comunicação óptica com um dispositivo de captação de infravermelho térmico sem contato. Em algumas modalidades, o subsistema de monitoramento de temperatura compreende uma pluralidade de dispositivos de detecção térmica, por exemplo, termistores ou termopares, dispostos em cada um dos vasos contendo uma matriz oleosa aquosa e configurados para coletar e enviar dados de temperatura para o subsistema de monitoramento de temperatura através de comunicação sem fio ou conjunto de circuitos convencional. Em uma modalidade preferencial, o subsistema de monitoramento de temperatura compreende uma pluralidade de dispositivos de detecção térmica (por exemplo, fibras ópticas ou tubos de luz) em comunicação óptica com um dispositivo de captação de infravermelho térmico (por exemplo, câmera de imageamento térmico ou sensor de infravermelho). Em tal modalidade, cada dispositivo de termodetecção está em comunicação óptica com cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando o vaso está em uma posição de monitoramento de temperatura, e em que cada dispositivo de termodetecção é configurado para fornecer um sinal de medição que é dependente da intensidade de radiação infravermelha de corpo negro emitida pela matriz oleosa aquosa como uma indicação de temperatura. Adicionalmente, cada dispositivo de termodetecção pode ser configurado para fornecer uma trajetória de radiação térmica do volume da matriz oleosa aquosa (ou o volume de mistura de reação aquosa) para o dispositivo de captação de infravermelho térmico para a coleção de dados de temperatura. Em uma modalidade preferencial, os dispositivos de detecção térmica são fibras ópticas ou tubos de luz que não são dispersos nos vasos e não fazem contato físico com as matrizes oleosas aquosas. Em algumas modalidades, os dispositivos de detecção térmica, por exemplo, uma ou mais fibras ópticas, detectam radiação infravermelha de corpo negro emitida de cada matriz oleosa aquosa (ou volume de mistura de reação aquosa), que é, então, transportada através de um arranjo de fibra óptica para um dispositivo de captação de infravermelho térmico, como uma câmera sensível à luz infravermelha ou imageador térmico. O dispositivo de captação de infravermelho térmico então mede a intensidade de sinal de radiação infravermelha de corpo negro de cada vaso e converte a intensidade em temperatura. Em uma modalidade mais preferencial, a radiação de corpo negro de cada matriz oleosa aquosa é diretamente detectada por uma câmera sensível a infravermelho ou imageador térmico posicionado nas proximidades dos volumes de reação de modo que a radiação infravermelha de um ou mais volumes de reação seja simultaneamente capturada em uma única imagem da câmera ou imageador.

[0071] Em certos aspectos da presente revelação, uma medição de temperatura é tomada de cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando esse vaso está em uma posição de monitoramento de temperatura. Em algumas modalidades, a posição de monitoramento de temperatura é a mesma posição que a posição de aquecimento. Em outras palavras, os dispositivos de detecção térmica são posicionados no mesmo local (por exemplo, a mesma estação de vaso) que as fontes de radiação eletromagnética. Em tais modalidades, as fontes de radiação eletromagnética e os dispositivos de detecção térmica podem ser posicionados em diversas disposições adequadas. Em algumas modalidades, as fontes de radiação eletromagnética e os dispositivos de detecção térmica podem ser posicionados nas proximidades do topo dos vasos contendo as matrizes oleosas aquosas. É apresentada na Figura 2 uma modalidade do presente sistema em que uma fonte de radiação eletromagnética 201 (por exemplo, diodo de laser ou LED) e um detector 202 são posicionados acima do vaso 101. O detector 202 pode ser um dispositivo de captação de infravermelho térmico e/ou um dispositivo de detecção de fluorescência. Em algumas modalidades, o detector 202 é uma combinação do dispositivo de captação de infravermelho térmico e do subsistema de detecção de fluorescência. A radiação eletromagnética é emitida da fonte de radiação eletromagnética 201 para o volume de mistura de reação aquosa 104 (linha pontilhada) posicionado em uma matriz oleosa aquosa que compreende um óleo de encapsulação 103 e um óleo carreador 102. Nessa modalidade, a radiação eletromagnética, como a radiação infravermelha, é transportada, ou conduzida, ao longo de uma trajetória óptica por uma fibra óptica ou tubo de luz 203 e focada no volume de mistura de reação aquosa 104 através de uma lente colimadora 204. Conforme a temperatura aumenta, o volume de mistura de reação aquosa 104 emite radiação infravermelha de corpo negro (linha pontilhada) que é transportada para um dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 202 por uma fibra óptica 205. Em outras modalidades, a radiação infravermelha de corpo negro é transportada para um dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 202 através de um feixe de fibras ópticas e/ou um arranjo de fibra óptica. Contudo, se a fonte de radiação eletromagnética 201 emite radiação infravermelha, então a fonte de radiação eletromagnética 201 e o dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 202 não podem operar simultaneamente sem a interferência de detecção térmica. Em tal disposição, a fonte de radiação eletromagnética 201 precisa estar desligada enquanto o dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 202 está ligado. Medições de temperatura em tempo quase real ainda podem ser realizadas se o sistema é programado para "cintilar" a fonte de radiação eletromagnética 104 e o dispositivo de imageamento térmico do detector 202. A cintilação é bem conhecida na técnica e compreende uma será alternante rápida de pulsos curtos de radiação infravermelha seguidos de detecção térmica.

[0072] Em algumas modalidades, a posição de monitoramento de temperatura é a mesma posição, por exemplo, estação de vaso, que a posição de aquecimento, e as fontes de radiação eletromagnética são posicionadas próximo ao fundo do vaso contendo as matrizes oleosas aquosas enquanto os dispositivos de detecção térmica são posicionados no topo do vaso contendo as matrizes oleosas aquosas. É mostrada na Figura 3 uma configuração em que a fonte de radiação eletromagnética 309 é posicionada no fundo do vaso, e o detector 307 é posicionado no topo do vaso. Para monitoramento de temperatura, o detector 307 pode ser, por exemplo, um sensor de infravermelho ou uma fibra óptica (ou fibras ópticas) para fornecer uma trajetória de radiação térmica para um dispositivo de imageamento infravermelho térmico.

[0073] Em outras modalidades, a posição de monitoramento de temperatura está em uma posição diferente, por exemplo, estação de vaso, do que a posição de aquecimento. É mostrada na Figura 5 uma configuração em que uma fonte de radiação eletromagnética 501 é posicionada no topo do vaso 101 quando na posição de aquecimento. Nessa configuração, o vaso 101 é movido para um segundo local de vaso onde o detector 502 é posicionado no topo do vaso quando na posição de monitoramento de temperatura. O detector 502 pode ser um dispositivo de captação de infravermelho térmico ou um dispositivo de detecção de fluorescência. Em algumas modalidades, o detector 502 é uma combinação de um dispositivo de captação de infravermelho térmico e o subsistema de detecção de fluorescência. A radiação eletromagnética é emitida da fonte de radiação eletromagnética 501 para o volume de mistura de reação aquosa 104 (linha pontilhada) posicionado em uma matriz oleosa aquosa que compreende um óleo de encapsulação 103 e um óleo carreador 102. Nessa modalidade, a radiação eletromagnética, como a radiação infravermelha, é transportada ao longo de uma trajetória óptica por uma fibra óptica ou tubo de luz 503 e focada no volume de mistura de reação aquosa 104 através de uma lente colimadora 504. Após a etapa de aquecimento, o vaso 101 é movido por um dispositivo de posicionamento, por exemplo, um dispositivo motorizado de em uma pista, para a próxima estação de vaso onde um dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 502 mede a emissão de radiação infravermelha de corpo negro do volume de mistura de reação aquosa 104. Em algumas modalidades, a radiação infravermelha de corpo negro é transportada para a captação de infravermelho térmico do detector 502 através de uma fibra óptica e/ou arranjo de fibra óptica 505. Em outras modalidades, a radiação infravermelha de corpo negro é transportada para a captação de infravermelho térmico do detector 502 através de um feixe de fibras ópticas e/ou um arranjo de fibra óptica. Em ainda outras modalidades, a radiação infravermelha de corpo negro é detectada diretamente por um sensor de infravermelho sem contato ou câmera de imageamento térmico. Nessas disposições, as medições de temperatura não podem ser coletadas simultaneamente com a aplicação de aquecimento fotônico, mas podem ser usadas para determinar a temperatura de linha de base das matrizes oleosas aquosas entre ciclos de PCR de modo que o sistema possa ajustar a quantidade de saída de energia necessária para aquecer o volume de mistura de reação aquosa para o próximo ciclo de PCR, por exemplo, um microcontrolador. Alternativamente, as medições de temperatura podem ser usadas para normalizar a emissão de fluorescência de fluoróforos sensíveis à temperatura.

Subsistema de Detecção de Fluorescência

[0074] Em certos aspectos, os presentes sistemas e métodos compreendem um subsistema de detecção de fluorescência configurado para emitir e detectar luz de fluorescência para a detecção de uma ou mais sondas etiquetadas de fluoróforo que foram hibridizadas a uma amostra-alvo de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o subsistema de detecção de fluorescência compreende uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência, um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência, e uma pluralidade de um ou mais membros ópticos configurados para fornecer uma trajetória óptica para conduzir luz de excitação de fluorescência para cada vaso na posição de detecção de produto de PCR e para conduzir luz de emissão de fluorescência de cada vaso para o dispositivo de captação de emissão de luz de fluorescência (ou dispositivos). A trajetória óptica, ou conexão óptica, entre a fonte de luz de excitação de fluorescência (ou fontes) e o vaso correspondente pode compreender qualquer uma de uma variedade de disposições ópticas e pode incluir uma variedade de elementos ópticos de construção convencional. Exemplos não limitantes de dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência adequados para uso com os presentes sistemas e métodos incluem, por exemplo, câmeras de dispositivo de carga acoplada (CCD), câmeras de semicondutor de óxido de metal complementar (CMOS), fotomultiplicadores e arranjos de sensor. Além disso, qualquer fonte de luz de excitação de fluorescência adequada pode ser usada no subsistema de detecção de fluorescência e inclui, sem limitação, LEDs, diodos de laser, lasers de íon de argônio, lâmpadas de xênon e similares. A fonte de luz de excitação de fluorescência pode ser configurada para emitir luz de fluorescência que tem um comprimento de onda espectral adequado na faixa de cerca de 300 nm a cerca de 1.200 nm dependendo do fluoróforo particular ou fluoróforos usados na reação PCR. Fluoróforos e outras espécies excitáveis por fluorescência que têm um comprimento de onda de excitação/emissão particular são bem conhecidos e estão comercialmente disponíveis. Fluoróforos e corantes fluorescentes exemplificadores adequados para uso com o presente sistema e métodos são fornecidos na Tabela 1. Tabela 1. Lista não limitante de fluoróforos comumente usados.

[0075] A disposição particular dos elementos ópticos ao longo de cada trajetória óptica pode ser ajustada para fornecer qualquer razão razoável de espaçamento desejado para se adequar a considerações de modelo. Elementos ópticos adequados para guiar luz podem incluir pelo menos um dos seguintes: uma fibra óptica (ou fibras ópticas), um arranjo de fibra óptica, ou tubos de luz; uma lente, incluindo uma lente de condensação, uma lente objetiva, uma lente de Fresnel, uma lente de imageamento, uma lente positiva, uma lente de campo ou uma lente colimadora; um refletor, como um espelho ou um divisor de feixe; um filtro de excitação, como um filtro dicroico; e um filtro de emissões. Esses elementos ópticos e outros elementos ópticos úteis são bem conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. Métodos de montagem de tais elementos ópticos também são bem conhecidos na técnica. Em certas modalidades, a flexibilidade de uso de fibras ópticas permite muitas diferentes disposições do presente sistema. É fornecido no presente documento o subsistema de detecção de fluorescência configurado para monitoramento e medição contínua e periódica de fluorescência gerada por reação durante e/ou após os ciclos de temperatura de PCR realizados em cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa. A posição do vaso contendo a matriz oleosa aquosa onde a detecção de produto de PCR é monitorada e medida pelo subsistema de detecção de produto de PCR é, às vezes, referida no presente documento como uma "posição de detecção de produto de PCR."

[0076] Em algumas modalidades, a detecção de fluorescência ocorre no final dos ciclos de temperatura de PCR. Em uma modalidade preferencial, a detecção de produto de PCR ocorre em tempo real, em que a fluorescência é medida após cada ciclo de temperatura de PCR. Em algumas modalidades, o subsistema de detecção de fluorescência é configurado para detectar fluorescência de cada mistura de reação aquosa individual após cada ciclo de temperatura de PCR individual, e os dados coletados das medições de PCR podem ser analisados e classificados por algoritmos de software automatizados através de um sistema de gerenciamento de informações laboratoriais (LIMS).

[0077] Muitas configurações adequadas para o subsistema de detecção de fluorescência são adequadas para uso com o presente sistema e métodos. Em modalidades preferenciais, a mistura de reação aquosa compreende dias sondas de ácido nucleico distintas conjugadas a ou covalentemente ligadas a um fluoróforo que tem a capacidade de excitação por luz de excitação de fluorescência que tem um comprimento de onda espectral particular ou faixa de comprimentos de onda espectrais, em que cada sonda de ácido nucleico é projetada para especificamente hibridizar a uma sequência-alvo de ácido nucleico (por exemplo, polimorfismo) de uma amostra de polinucleotídeo. Em tais modalidades, uma primeira sonda de ácido nucleico compreende um primeiro fluoróforo que tem a capacidade de excitação por luz de excitação de fluorescência que tem um primeiro comprimento de onda espectral, e uma segunda sonda de ácido nucleico compreende um segundo fluoróforo que tem a capacidade de excitação por luz de excitação de fluorescência que tem um segundo comprimento de onda espectral. Deve-se compreender que o primeiro comprimento de onda espectral é um comprimento de onda diferente do segundo comprimento de onda espectral de modo que a presença da primeira sonda de ácido nucleico possa ser distinguida da presença da segunda sonda de ácido nucleico.

[0078] Em modalidades particulares, cada membro óptico compreende uma ou mais fibras ópticas que tem a capacidade de fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência e/ou luz de emissão de fluorescência entre o subsistema de detecção de fluorescência e o volume de mistura de reação aquosa em cada um dos vasos quando o vaso está na posição de detecção de produto de PCR. Em algumas modalidades, cada membro óptico compreende um feixe de fibras ópticas. Em outras modalidades, cada membro óptico compreende uma única fibra óptica que tem a capacidade de transportar toda a luz entre cada vaso e o subsistema de detecção de fluorescência. Por exemplo, a fluorescência excitação e a luz de emissão de fluorescência poderiam ser empilhadas em um único arranjo de elementos ópticos de fibra através de filtros de excitação e filtros de emissão sequenciais (por exemplo, blocos de filtro dicroico) com alimentações ópticas diagonais para direcionar as emissões de fluorescência para os dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência.

[0079] Em certas modalidades, cada membro óptico compreende um arranjo separado de fibra óptica para cada comprimento de onda de luz de fluorescência usado no sistema. Em tais modalidades, cada arranjo de fibra óptica para detecção de fluorescência contém uma fibra óptica individual em comunicação óptica com cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando o vaso está na posição de detecção de produto de PCR, em que cada fibra óptica individual compreende uma extremidade nas proximidades de um vaso contendo uma matriz oleosa aquosa e a outra extremidade em um arranjo disposto em feixe apertado ordenado com uma face plana apresentada para uma fonte de luz de excitação de fluorescência e um dispositivo de captação de emissão de luz de fluorescência. Um filtro de excitação (por exemplo, filtro dicroico similar àqueles usados em microscópios de epi-fluorescência) pode ser colocado na trajetória óptica entre a face de arranjo e a fonte de luz de excitação de fluorescência, e um filtro de emissão pode ser colocado na trajetória óptica entre a face de arranjo e o dispositivo de captação de luz de emissão de fluorescência. Em algumas modalidades, um filtro dicroico ou cubo de filtro compreende tanto o filtro de excitação como o filtro de emissão e é colocado na trajetória óptica entre a face de arranjo de fibra óptica e a fonte de luz de excitação de fluorescência e o dispositivo de captação de luz de emissão de fluorescência (consulte, por exemplo, a Figura 8). Em uma modalidade particular, o dispositivo de captação de luz de emissão de fluorescência é configurado para coletar uma imagem na face de arranjo de fibra óptica e medir a intensidade de sinal de cada fibra individual.

[0080] Em outra modalidade, o subsistema de detecção de fluorescência pode empregar uma fonte de luz de excitação de fluorescência que é fornecida por um laser (por exemplo, um laser de íon de argônio) para emitir luz de excitação de fluorescência que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 350 nm a cerca de 1.100 nm. Nessa modalidade, é usada uma pluralidade de membros ópticos, como fibras ópticas, em que cada fibra óptica está em comunicação óptica com o laser e inserida através de uma lente posicionada em cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando na posição de detecção de produto de PCR para fornecer uma trajetória óptica para a condução de luz para e do vaso. A luz de excitação de fluorescência é direcionada através das fibras ópticas para excitar os fluoróforos no volume de mistura de reação aquosa. Emissões do volume de mistura de reação aquosa são enviadas de volta através das fibras ópticas para um dispositivo de captação de luz de emissão de fluorescência. Sistemas de detecção de fluorescência similares estão comercialmente disponíveis, como os sistemas de detecção ABI PRISM® (Applied Biosystems). Nessa modalidade, o laser tem a capacidade de emitir luz de excitação de fluorescência que tem um ou mais comprimentos de onda espectrais para a detecção de uma ou mais sondas etiquetadas conjugadas ou covalentemente ligadas a diferentes fluoróforos que têm diferentes comprimentos de onda de excitação/emissão. Alternativamente, lasers separados podem ser usados, cada um emitindo uma luz de excitação de fluorescência que tem um diferente comprimento de onda espectral. Em algumas modalidades, uma única fibra óptica que corresponde a cada vaso pode ser usada para direcionar toda a luz de fluorescência para e de cada vaso quando na posição de detecção de produto de PCR (isto é, luz de fluorescência de excitação e emissão é empilhada sobre a única fibra). Em tais modalidades, filtros de luz de excitação sequenciais (por exemplo, blocos de filtro dicroico) com alimentações ópticas diagonais podem ser usados para direcionar as emissões de fluorescência para os dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência. Em outras modalidades, fibras ópticas separadas, que podem ser configuradas como um arranjo de fibra óptica, são usadas para fornecer uma trajetória óptica para cada comprimento de onda de excitação de fluorescência usado para detecção.

[0081] Em uma modalidade, o subsistema de detecção de fluorescência pode empregar uma pluralidade de LEDs ou diodos de laser para a emissão de luz de excitação de fluorescência. Visto que a pegada de um LED ou diodo de laser é muito pequena, múltiplos LEDs ou diodos de laser de diferentes comprimentos de onda poderiam ser integrados a um único pacote ou múltiplos LEDs/diodos de laser empacotados colocados muito próximos para excitar um único vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando na posição de detecção de produto de PCR. Em tal modalidade, os LEDs/diodos de laser podem ser posicionados em uma ou mais estações de vaso diretamente abaixo dos vasos quando os vasos estão na posição de detecção de produto de PCR. Sistemas de detecção de fluorescência que têm tal configuração também são encontrados na literatura de patente, por exemplo, Patente n° US 7.122.799, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Em outras modalidades, a luz de excitação de fluorescência gerada pelos LEDs/diodos de laser pode ser direcionada para os vasos por uma pluralidade de fibras ópticas, em que cada fibra óptica é inserida através de uma lente (por exemplo, lente colimadora) e posicionada no topo ou no fundo de um vaso quando o vaso está na posição de detecção de PCR.

[0082] Em outra modalidade, um subsistema de detecção de fluorescência pode empregar uma pluralidade de LEDs ou diodos de laser para a geração de luz de excitação de fluorescência, em que um ou mais arranjos de fibra óptica para detecção de fluorescência fornecem uma trajetória óptica para a luz de fluorescência de excitação e emissão. Em uma modalidade particular, o subsistema de detecção de fluorescência é configurado para monitorar e medir a fluorescência de duas sondas de ácido nucleico, em que cada uma é covalentemente ligada a um fluoróforo diferente (por exemplo, VIC ou FAM) . Em algumas modalidades, a luz de fluorescência de excitação e emissão adequada para excitação de ambas as sondas de ácido nucleico é empilhada em um único arranjo de fibras através de filtros sequenciais de excitação/emissão, por exemplo, blocos de filtro dicroico, com alimentação óptica diagonal para os dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência, por exemplo, sensores de imageamento de emissão ou câmeras de CCD. Alternativamente, são usados dois arranjos de fibra óptica, em que cada arranjo de fibra óptica fornece uma trajetória óptica para luz de fluorescência de excitação e emissão adequada para excitação de uma das sondas de ácido nucleico (consulte, por exemplo, a Figura 8). Em tal modalidade, cada arranjo de fibra óptica compreende uma pluralidade de fibras ópticas, em que cada fibra óptica está em comunicação óptica com um vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando o vaso está na posição de detecção de produto de PCR. Uma extremidade de cada fibra óptica individual pode ser posicionada sobre o topo do vaso ou o fundo do vaso dependendo dos requisitos particulares de modelo e espaço. A outra extremidade de cada fibra óptica individual é disposta em um arranjo de fibra óptica disposta em feixe apertado ordenado com uma face plana em comunicação óptica tanto com uma fonte de luz de excitação de fluorescência (por exemplo, um LED ou diodo de laser) como um dispositivo de captação de emissão de fluorescência (por exemplo, uma câmera de CCD monocromática). Um filtro de excitação e/ou emissão, como um filtro dicroico, pode ser colocado na trajetória óptica e em comunicação óptica com a face de arranjo de fibra óptica e com a fonte de luz de excitação de fluorescência apropriada e/ou dispositivo de captação de emissão de fluorescência (consulte, por exemplo, a Figura 8). O dispositivo de captação de emissão de fluorescência coleta a imagem da face de arranjo de fibra óptica e mede a intensidade do sinal de cada fibra individual examinando regiões de interesse na imagem.

[0083] Em algumas modalidades, é fornecido um subsistema de detecção que compreende tanto um dispositivo de imageamento infravermelho térmico como o subsistema de detecção de fluorescência. Tal disposição pode utilizar uma única fibra óptica para transportar toda a luz, isto é, radiação infravermelha de corpo negro e luz de excitação e emissão de fluorescência entre todos os detectores (isto é, o dispositivo de captação de infravermelho térmico e o um ou mais detectores de emissão de luz de fluorescência) e um vaso contendo uma matriz oleosa aquosa. Em outras modalidades, arranjos de fibra óptica separados são usados para detecção térmica e cada comprimento de onda de luz de excitação de fluorescência.

[0084] Em certos aspectos da presente revelação, uma medição de fluorescência é tomada de cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando esse vaso está em uma posição de detecção de produto de PCR. Em algumas modalidades, a posição de detecção de produto de PCR são os mesmos locais, por exemplo, mesmas estações de vaso, que a posição de aquecimento e a posição de monitoramento de temperatura. Em algumas modalidades, as fontes de radiação eletromagnética e os dispositivos de detecção térmica podem ser posicionados em e/ou em comunicação óptica com o topo dos vasos contendo as matrizes oleosas aquosas. É apresentada na Figura 2 uma modalidade do presente sistema em que uma fonte de radiação eletromagnética 201 (por exemplo, diodo de laser ou LED) e um detector 202 são posicionados em e/ou em comunicação óptica com o topo do vaso 101. Em uma modalidade, o detector 202 é uma combinação do dispositivo de captação de infravermelho térmico e do subsistema de detecção de fluorescência. A radiação eletromagnética é emitida da fonte de radiação eletromagnética 201 para o volume de mistura de reação aquosa 104 (linha pontilhada) posicionado em uma matriz oleosa aquosa que compreende um óleo de encapsulação 103 e um óleo carreador 102. Nessa modalidade, a radiação eletromagnética, como a radiação infravermelha, é transportada ao longo de uma trajetória óptica por uma fibra óptica ou tubo de luz 203 e focada no volume de mistura de reação aquosa 104 através de uma lente colimadora 204. Conforme a temperatura aumenta, o volume de mistura de reação aquosa 104 emite radiação infravermelha de corpo negro (linha pontilhada) que é transportada para o dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 202 por uma fibra óptica (ou fibras ópticas) 205. Após as etapas de monitoramento de temperatura e aquecimento serem concluídas, tanto a fonte de radiação eletromagnética 201 como o dispositivo de captação de infravermelho térmico do detector 202 são desligados para permitir a detecção de fluorescência. A luz de excitação de fluorescência é transportada do subsistema de detecção de fluorescência do detector 202 ao longo da fibra óptica (ou fibras ópticas) 205 e é focada pela lente 204 no volume de mistura de reação aquosa 104. Mediante a absorção da luz de fluorescência que tem o comprimento de onda apropriado, um fluoróforo covalentemente ligado a uma sonda de ácido nucleico emite fluorescência que é coletada e conduzida por fibra óptica (ou fibras ópticas) 205 para um dispositivo de captação de luz de emissão de fluorescência do detector 202. Em algumas modalidades, a luz de excitação de fluorescência que tem dois comprimentos de onda diferentes é transportada entre o subsistema de detecção de fluorescência e o volume de reação aquoso 104 por uma única fibra óptica 205. Em outras modalidades, a luz de excitação de fluorescência que tem dois comprimentos de onda diferentes é transportada entre o subsistema de detecção de fluorescência e o volume de reação aquoso 104 através de um feixe de fibras ópticas e/ou um ou dois arranjos de fibra óptica.

[0085] Em outras modalidades, a posição de detecção de produto de PCR está em um local diferente, por exemplo, estação de vaso, da posição de aquecimento. É mostrada na Figura 5 uma configuração em que uma fonte de radiação eletromagnética 501 é posicionada no topo do vaso 101 quando na posição de aquecimento. Após a etapa de aquecimento, o vaso 101 é movido pelo dispositivo de posicionamento para a próxima estação de vaso em que o detector 502 é posicionado no topo do vaso 101 quando na posição de detecção de PCR. A luz de excitação de fluorescência é transportada do subsistema de detecção de fluorescência do detector 502 ao longo da fibra óptica (ou fibras ópticas) 505 e é focada pela lente 506 no volume de mistura de reação aquosa 104. Mediante a absorção da luz de fluorescência que tem o comprimento de onda apropriado, um fluoróforo covalentemente ligado a uma sonda de ácido nucleico emite fluorescência (linha pontilhada) que é coletada e conduzida por fibra óptica (ou fibras ópticas) 505 para um dispositivo de captação de luz de emissão de fluorescência do detector 502. Em algumas modalidades, a luz de excitação de fluorescência que tem dois comprimentos de onda diferentes é transportada entre o subsistema de detecção de fluorescência e o volume de reação aquoso 104 por uma única fibra óptica 505. Em outras modalidades, a luz de excitação de fluorescência que tem dois comprimentos de onda diferentes é transportada entre o subsistema de detecção de fluorescência e o volume de reação aquoso 104 através de um feixe de fibras ópticas e/ou um ou dois arranjos de fibra óptica.

Modalidades que compreendem subsistemas integrados com uma configuração de correia em movimento

[0086] Em algumas modalidades, os presentes sistemas e métodos compreendem uma combinação de subsistemas para fornecer aquecimento fotônico acionado por luz de reação em reação; monitoramento de temperatura de reação em reação; e detecção de fluorescência de produtos de PCR para amplificação de PCR e detecção de produto. Em alguns aspectos, os presentes sistemas e métodos adicionalmente compreendem um dispositivo de posicionamento configurado para mover uma coleção de matrizes oleosas aquosas em etapas distintas através de uma pluralidade de estações de vaso, em que as estações de vaso podem incluir um ou mais dos subsistemas. Em uma modalidade preferencial, o dispositivo de posicionamento compreende uma correia flexível, como a correia 402 apresentada nas Figuras 4A e 4B. Nessa modalidade, a correia 402 compreende um material flexível (por exemplo, um polímero termoplástico) que forma uma estrutura de laço ao redor de duas ou mais engrenagens de transmissão 401, e em que uma pluralidade de vasos 404 são embutidos na correia 402. Engrenagens de transmissão 401 giram e fazem com que a correia 402 mova os vasos 404 de estação de vaso para estação de vaso. Os sistemas mecânico, eletrônico e de software que controlam o movimento da engrenagem de transmissão são descritos em detalhes em outro local no presente documento.

[0087] É apresentada nas Figuras 6A a 6C uma modalidade de um subsistema de aquecimento fotônico 600 que compreende uma pluralidade de fontes de radiação eletromagnética 602 e uma correia 402 como um dispositivo de posicionamento para mover os vasos 404 de estação de vaso para estação de vaso. O número de fontes de radiação eletromagnética 602 pode variar dependendo dos parâmetros de modelo e espaçamento. Além disso, o tamanho das fontes de radiação eletromagnética e do conjunto de circuitos e/ou cabeamento associados determinará a configuração espacial particular. Embora não pretenda ser limitante, o subsistema de aquecimento fotônico 600 inclui 504 fontes de radiação eletromagnética independentes 602 e uma correia 402 em que os vasos 404 são dispostos em fileiras de 12 vasos por fileira a um espaçamento de 9 mm para se encaixar nos padrões internacionais para espaçamento de poço.

[0088] Para reduzir a pegada do subsistema de aquecimento fotônico 600, as fontes de radiação eletromagnética 602 são empilhadas verticalmente em 42 módulos 601 posicionados em um lado da correia 402, com 12 fontes de radiação eletromagnética 602 em cada pilha vertical (consulte as Figuras 6A e 6B). Para fornecer calor fotônico diretamente para cada vaso 404 contendo uma matriz oleosa aquosa, o subsistema de aquecimento fotônico 600 é adi cionalmente configurado de modo que a disposição das fontes de radiação eletromagnética 602 correspondam à configuração dos vasos 404 na correia 402. Como tal, cada fonte de radiação eletromagnética 602 está em comunicação óptica com uma fibra óptica ou tubo de luz 602, em que cada fibra óptica ou tubo de luz 603 fornece uma trajetória óptica para guiar a radiação eletromagnética emitida para um vaso correspondente 404 quando esse vaso está na posição de aquecimento. Essa configuração facilita conexões fáceis ao conjunto de circuitos e a outro cabeamento.

[0089] A extremidade de cada fibra óptica ou tubo de luz 603 que está próxima ao vaso correspondente 404 termina em uma lente configurada para focar o feixe de radiação eletromagnética no volume de mistura de reação aquosa ou material excitável plasmônico dependendo do comprimento de onda particular da radiação eletromagnética sendo usada. Por exemplo, durante o uso de radiação infravermelha, o feixe é focado no volume de mistura de reação aquosa e absorvido pelas moléculas de água para aquecer a mistura de reação aquosa. Alternativamente, se é usada luz visível, como luz azul, luz violeta, ou luz ultravioleta, o feixe é focado em um material excitável plasmônico, como um disco Mylar ou de folha de alumínio com camada de ouro, para converter a energia de luz em energia térmica. Com essa configuração, existem 42 pilhas de fontes de radiação eletromagnética 602 para fornecer 42 posições de aquecimento de ciclo de temperatura de PCR ou, alternativamente, duas posições de aquecimento de "começo quente" seguidas de 40 posições de aquecimento de ciclo de temperatura de PCR. Conforme mostrado na Figura 6B, cada módulo 601 é posicionado adjacente a cada um dentre a fileira de vasos 404 para acomodar uma posição de detecção de fluorescência e resfriamento entre cada ciclo de temperatura de PCR. Os vasos 404 são resfriados por um membro de resfriamento ativo ou passivo 403, como um metal dissipador de calor passivo, posicionado sob o lado de topo do laço da correia 402.

[0090] Em algumas modalidades, cada fonte de radiação eletromagnética 602 opera a uma saída de potência fixa e constante, em que cada fonte de radiação eletromagnética 602 pode ser ativada por um período de tempo específico, sob controle programável por computador, para fornecer a quantidade desejada de energia necessária para aquecer cada mistura de reação aquosa através de um ciclo de temperatura de PCR. Em outras modalidades, a saída de potência das fontes de radiação eletromagnética 602 pode ser variada.

[0091] A Figura 6A apresenta uma vista frontal do subsistema de aquecimento fotônico 600 e a correia 402, em que as fontes de radiação eletromagnética 602 são empilhadas verticalmente no módulo 601, com 12 fontes de radiação eletromagnética 602 em cada pilha vertical. Cada fibra óptica e tubo de luz 603 se estende da fonte de radiação eletromagnética correspondente 602 até o topo do vaso correspondente 404 da correia 402.

[0092] A Figura 6C apresenta uma vista de topo do subsistema de aquecimento fotônico 600 e da correia 402. Cada fonte de radiação eletromagnética 602 é eletronicamente conectada ao compartimento de componentes eletrônicos 604.

[0093] Em algumas modalidades, os vasos 404 são revestidos com um material excitável plasmônico como ouro para maximizar a conversão de luz (por exemplo, luz ultravioleta, violeta ou azul) em calor. Em outras modalidades, um disco Mylar ou de folha de alumínio com camada de ouro é disposto em cada vaso 404 para maximizar a conversão de luz (por exemplo, luz ultravioleta, violeta ou azul) em calor.

[0094] É um aspecto dessa revelação fornecer dados de PCR quantitativa em tempo real por meio da medição da fluorescência após cada ciclo de temperatura de PCR. A Figura 7 apresenta uma vista lateral que ilustra uma modalidade do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR. Nessa configuração, arranjos de fibra óptica 701 transladam luz entre os vasos da correia 402 e um conjunto de detectores de luz 708, que incluem detectores de emissão de luz de fluorescência e um dispositivo de captação de infravermelho térmico. O uso de arranjos de fibra óptica 701 permite a comunicação óptica entre os detectores e vasos espalhados em uma ampla área. Por exemplo, o uso de arranjos de fibra óptica 701 fornece a translação de luz entre vasos espalhados em uma área de 100 mm por 900 mm e um pequeno conjunto ordenado de faces de extremidade de fibra que ocupam uma área de apenas 10 mm por 15 mm, ou menos. Arranjos ópticos de fibra estão comercialmente disponíveis e são frequentemente usados para condensar sinais ópticos de poços de placa de microtitulação para imageamento eficiente por câmeras de CCD, como descrito em FiberGuide Industries, "White Paper: 2D Arrays" (disponível na página da web de FiberGuide Industries), cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0095] Conforme ilustrado na modalidade exemplificadora da Figura 7, existem 42 pilhas de fontes de radiação eletromagnética 602 para fornecer duas posições de aquecimento de "começo quente" (indicado por "D") seguidas de 40 posições de aquecimento de ciclo de temperatura de PCR. Conforme mostrado na Figura 7, cada módulo 601 é posicionado adjacente a cada um dentre a fileira de vasos na correia 402 para acomodar uma posição de monitoramento de temperatura e/ou uma posição de detecção de fluorescência e resfriamento entre cada ciclo de temperatura de PCR. Os vasos são resfriados por um membro de resfriamento ativo ou passivo 403, como um metal dissipador de calor passivo, posicionado sob o lado de topo do laço da correia 402. Conforme ilustrado na Figura 7, os arranjos de fibra óptica 701 fornecem uma trajetória óptica para os detectores de luz 708 de cada vaso da correia 402 quando esse vaso está na posição de detecção de produto de PCR e na posição de monitoramento de temperatura. Nessa modalidade, os detectores de luz 708 incluem duas câmeras de CCD 706, 710 como os detectores de emissão de luz de fluorescência e um imageador térmico 704 como o dispositivo de captação de infravermelho térmico. Apenas para propósitos ilustrativos, são incluídas duas fontes de luz de excitação de fluorescência 705, 707 de diferentes comprimentos de onda espectrais.

[0096] Os arranjos de fibra óptica 701 incluem três arranjos de fibra óptica 714, 715, 716, cada um em um feixe bem ordenado em uma extremidade conectado a placas de arranjo de fibra óptica 713, 712, 709, respectivamente. Dois dos arranjos de fibra óptica 715, 716 conduzem luz de excitação/emissão de fluorescência para detecção de fluorescência, enquanto o terceiro arranjo de fibra óptica 714 conduz radiação infravermelha de corpo negro para monitoramento de temperatura. Adicionalmente, cada arranjo de fibra óptica 715, 716 para detecção de fluorescência nessa modalidade exemplificadora compreende 480 fibras ópticas individuais com uma extremidade de cada fibra posicionada em um vaso quando esse vaso está na posição de detecção de produto de PCR. O arranjo de fibra óptica 714 para monitoramento de temperatura nessa modalidade exemplificadora compreende 504 fibras ópticas individuais com uma extremidade de cada fibra óptica posicionada em um vaso quando esse vaso está em uma posição de monitoramento de temperatura. A primeira posição de monitoramento de temperatura fornece uma leitura de temperatura de linha de base de uma fileira de vasos (indicado como "I") antes de o processo de aquecimento começar. As próximas duas posições de monitoramento de temperatura fornecem leituras de temperatura durante o processo de começo quente. As posições de monitoramento de temperatura restantes estão nas mesmas estações de vaso que os metais dissipadores de calor passivos 403 e as posições de detecção de PCR.

[0097] Para detecção de fluorescência, a fonte de luz de excitação 707 emite luz de excitação de fluorescência através de um cubo de filtro dicroico 702 para uma placa de arranjo de fibra óptica 709 opticamente conectada a um arranjo de feixe apertado ordenado configurado para fornecer uma trajetória óptica ao longo do arranjo de fibra óptica 716 para cada vaso quando esse vaso está na posição de detecção de produto de PCR. Adicionalmente, a luz de emissão de fluorescência do volume de mistura de reação aquosa é conduzida do vaso ao longo do arranjo de fibra óptica 716 para a placa de arranjo de fibra óptica 709. A placa de arranjo de fibra óptica 709 produz um arranjo de imagem em sua face por meio da condensação dos sinais ópticos da luz de emissão de fluorescência, e a câmera de CCD 706 coleta a imagem e mede a intensidade do sinal de cada fibra individual na imagem. Além disso, a fonte de luz de excitação 705 emite luz de excitação de fluorescência através de um cubo de filtro dicroico 711 para uma placa de arranjo de fibra óptica 712 opticamente conectada a um arranjo de feixe apertado ordenado configurado para fornecer uma trajetória óptica ao longo do arranjo de fibra óptica 715 para cada vaso quando esse vaso está na posição de detecção de produto de PCR. Adicionalmente, a luz de emissão de fluorescência do volume de mistura de reação aquosa é conduzida do vaso ao longo do arranjo de fibra óptica 715 para a placa de arranjo de fibra óptica 712. A placa de arranjo de fibra óptica 712 produz um arranjo de imagem em sua face por meio da condensação dos sinais ópticos da luz de emissão de fluorescência, e a câmera de CCD 710 coleta a imagem e mede a intensidade do sinal de cada fibra individual na imagem.

[0098] Para monitoramento de temperatura, a radiação infravermelha de corpo negro emitida de cada matriz oleosa aquosa no estágio de iniciação "I", após cada "começo quente" "D", e durante cada etapa de detecção de produto de PCR é conduzida ao longo do arranjo de fibra óptica 714 para uma placa de fibra óptica 713. A imagem infravermelha na face da placa de fibra óptica 713 é medida pelo imageador térmico 704, que mede a intensidade do sinal para cada vaso e converte a intensidade em temperatura. Em algumas modalidades, um filtro de radiação infravermelha 703 é colocado entre a face da placa de fibra óptica 713 e o imageador térmico 704.

[0099] Em outra modalidade, o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR adicionalmente compreende um subsistema de montagem configurado para montagem programável e automatizada de coleções de matrizes oleosas aquosas. É apresentada na Figura 8 uma vista lateral de uma modalidade do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR. Nessa modalidade, é fornecido um subsistema de montagem que compreende membros de descarga de líquido 801, 802, 803, 804. Em algumas modalidades, o membro de descarga de líquido 801 é um dispensador em batelada de 12 pontas configurado para dispensar óleo carreador, o membro de descarga de líquido 802 é um dispensador em batelada de 12 pontas configurado para dispensar óleo de encapsulação, o membro de descarga de líquido 803 é uma pipetadora automatizada (por exemplo, uma cabeça de pipetagem fixa com 12 pontas) configurada para dispensar um volume aquoso que compreende amostras de polinucleotídeo, e o membro de descarga de líquido 804 é uma pipetadora automatizada (por exemplo, uma única ponta, cabeça de pipetagem sem contato) configurada para dispensar um volume aquoso que compreende reagentes de PCR, primers e/ou sondas.

[00100] É apresentada na Figura 9 uma vista lateral de uma modalidade do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR. No subsistema de montagem da Figura 9, um controle de sistema faz com que a correia 402 mova uma fileira de 12 vasos para uma posição de montagem. Com base nos sinais de cada módulo operacional e no tempo necessário para completar a etapa de aquecimento de PCR mais lenta na correia 402, a correia 402 avança uma etapa (9 mm) quando todas as operações que ocorrem simultaneamente em todas as estações de vaso na correia 402 são concluídas. Por exemplo, em uma modalidade, o ciclo de temperatura de PCR com a duração mais longa é aproximadamente 15 segundos. Portanto, os processos que ocorrem não têm mais que aproximadamente 15 segundos para concluir cada processo antes de a correia ser programada para mover para a próxima etapa. Na primeira posição de montagem, uma pipetadora em batelada de 12 pontas 801 aspira óleo carreador de uma entrada de óleo carreador e dispensa o óleo carreador nas fileiras de vasos. A correia 402 move a fileira de vasos para a próxima posição de montagem em que uma pipetadora em batelada de 12 pontas 802 aspira óleo de encapsulação de uma entrada de óleo de encapsulação e dispensa o óleo de encapsulação nas fileiras de vasos. A correia 402 move a fileira de vasos para a próxima posição de montagem, em que cabeças de pipetagem fixas 803 aspiram um volume aquoso que contém a amostra de polinucleotídeo apropriada de, por exemplo, uma placa de entrada que compreende um código de barras. A estação de montagem pode compreender um leitor de código de barras configurado para ler o código de barras e acessar, por exemplo, software LIMS para identificar a amostra de polinucleotídeo e para determinar os primers e sondas apropriados para uso com cada amostra de polinucleotídeo particular. O sistema de controle então faz com que as cabeças de pipetagem fixas 803 dispensem a amostra de polinucleotídeo em quantos vasos forem necessários para acomodar o número de reações de primer/sonda a serem executadas. Em alguns casos, o número de execuções exigirá múltiplas fileiras de vasos. As cabeças de pipetagem fixas 803 têm aproximadamente 15 segundos, ou menos, dependendo da temporização dos ciclos de temperatura de PCR para realizar a etapa de dispensação para cada fileira. Ademais, as cabeças de pipetagem fixas 803 podem ser configuradas para mudanças de ponta automatizadas ou manual para evitar a contaminação ou, alternativamente, as cabeças de pipetagem fixas 803 podem ser configuradas para qualquer lavagem de ponta automatizada.

[00101] A correia 402 então move a fileira de vasos para a posição de montagem final, quando uma cabeça de pipetagem sem contato de ponta única 804 aspira um volume aquoso contendo a mistura de reação PCR apropriada, primers e sondas em uma quantidade suficiente para que todas as amostras de polinucleotídeo sejam testadas com essa mistura de reação PCR particular, primers e sondas. A subestação de montagem então faz com que a cabeça de pipetagem sem contato de ponta única 804 dispense a mistura de reação PCR, primers e sondas nas fileiras de vasos contendo a amostra de polinucleotídeo apropriada. As informações necessárias para identificar a mistura de reação PCR apropriada, primers e sondas para uma reação de genotipagem de PCR particular podem ser fornecidas de um LIMS. Em tal caso, listas carregadas de consultas simples forneceriam ao programa de software de montagem as informações necessárias do LIMS. Configurações similares de hardware e software adequadas para uso com o presente sistema são conhecidas na técnica. Tal como com todos os outros processos que ocorrem em uma dada estação de vaso, a etapa de dispensação de mistura de reação PCR, primers e sondas tem aproximadamente 15 segundos para ser concluída.

[00102] Após a montagem das reações na fileira de vasos, a correia 402 move a fileira para a próxima estação de vaso onde, opcionalmente, uma medição de temperatura inicial "I" pode ser tomada para fornecer essas informações para o software de controle de sistema para determinar a quantidade de energia de saída necessária para desnaturação de começo quente das amostras de polinucleotídeo em cada mistura de reação aquosa. Nessa posição de vaso, uma fibra óptica do arranjo de fibra óptica 714 é posicionada acima de cada poço e conduz radiação infravermelha de corpo negro emitida por cada matriz oleosa aquosa nessa estação de vaso para a placa de arranjo de fibra óptica 713, que condensa os sinais ópticos para imagear pelo imageador térmico 704. O imageador térmico 704 converte a intensidade de sinal em informações de temperatura que são usadas pelo software de sistema de controle para ajustar a duração de pulso das fontes de radiação eletromagnética 602 quando os vasos são movidos na direção da primeira posição de aquecimento de começo quente "D". Nessa modalidade, duas posições de começo quente são, cada uma, seguidas por uma posição de monitoramento de temperatura. O software de sistema de controle faz com que a correia 402 mova a fileira de vasos para a próxima estação de vaso, que é a primeira posição de aquecimento de começo quente "D". Nessa modalidade, cada fonte de radiação eletromagnética 602 é um diodo de laser que emite radiação infravermelha. Como tal, os diodos de laser 602 emitem radiação infravermelha através de tubos de luz 603, em que a extremidade de cada tubo de luz 603 é posicionada no topo de cada vaso na fileira para aplicar radiação infravermelha ao volume de mistura de reação aquosa contido no mesmo. De preferência, a temperatura de cada volume de mistura de reação aquosa é aumentada para cerca de 90 °C a cerca de 99 °C, com máxima preferência, para cerca de 95 °C, para desnaturar as amostras de polinucleotídeo em cada volume de mistura de reação aquosa. Após a primeira etapa de aquecimento de começo quente, o software de controle faz com que a correia mova a fileira de vasos para a próxima estação de vaso, que é uma posição de monitoramento de temperatura. Uma posição de aquecimento de começo quente adicional "D" é incluída no caso de a desnaturação de começo quente necessária exigir mais que 15 segundos.

[00103] Após a segunda etapa de aquecimento de começo quente, a correia 404 move a fileira de vasos para a próxima estação de vaso, que é uma posição de resfriamento e uma posição de monitoramento de temperatura. A posição de resfriamento compreende metal dissipador de calor passivo 403 posicionado proximamente sob o lado superior da correia 404 conforme mostrado na Figura 9. Conforme os blocos de metal dissipador de calor passivo 403 entram em contato com o fundo dos vasos, o calor é transferido da matriz oleosa aquosa através dos vasos e para o bloco de metal dissipador de calor 403 para resfriar as matrizes oleosas aquosas na fileira. De preferência, a temperatura das matrizes oleosas aquosas é diminuída para cerca de 60 °C. Nessa estação de vaso, a temperatura de cada matriz oleosa aquosa é medida através do imageador térmico 704.

[00104] Posteriormente, o sistema de controle faz com que a correia 402 mova a fileira de vasos para a próxima estação de vaso para começar o ciclo de temperatura de PCR. Os diodos de laser 602 emitem radiação infravermelha para o volume de mistura de reação aquosa em cada vaso na fileira, aumentando assim a temperatura do volume de mistura de reação aquosa. Adicionalmente, o software de sistema de controle permite condições de PCR específicas de marcador fazendo com que os diodos de laser emitam energia de radiação infravermelha e duração de pulso apropriados para aumentar a temperatura do volume de mistura de reação aquosa para a temperatura de recozimento e temperatura de alongamento apropriadas. Após a etapa de aquecimento ser concluída, o sistema de controle faz com que a correia 402 mova a fileira de vasos para a posição de resfriamento, posição de detecção de produto de PCR e posição de monitoramento de temperatura na próxima estação de vaso. Na posição de resfriamento, o calor é transferido de cada matriz oleosa aquosa na fileira para o metal dissipador de calor passivo 403, diminuindo assim a temperatura da matriz oleosa aquosa. A luz de excitação de fluorescência que tem comprimentos de onda espectrais adequados para excitação dos fluoróforos presentes na mistura de reação PCR (por exemplo, VIC e FAM) é emitida de fontes de luz de excitação de fluorescência 705, 707 através dos arranjos de fibra óptica 715, 716 e para a mistura de reação aquosa de cada vaso na fileira. A luz de emissão de fluorescência dos vasos é conduzida de volta através dos arranjos de fibra óptica 715, 716 para as câmeras de CCD 710, 706, que convertem a intensidade de sinal óptico em sinais de fluorescência em bruto para processamento pelo software de sistema de controle. Nessa posição de vaso, uma fibra óptica do arranjo de fibra óptica 714 é posicionada acima de cada poço e conduz radiação infravermelha de corpo negro emitida por cada matriz oleosa aquosa nessa estação de vaso para a placa de arranjo de fibra óptica 713, que condensa os sinais ópticos para imagear pelo imageador térmico 704. O imageador térmico 704 converte a intensidade de sinal em informações de temperatura que são usadas pelo software de sistema de controle para ajustar a duração de pulso das fontes de radiação eletromagnética quando os vasos são movidos na direção da posição de aquecimento. Esse processo é repetido até 40 ou mais ciclos de temperatura de PCR.

[00105] Em algumas modalidades, os cubos de filtro dicroico 706, 711 e o filtro de emissão de infravermelho 703 permite que as medições de temperatura e as medições de fluorescência ocorram simultaneamente evitam interferência pelos diferentes comprimentos de onda espectrais. Em outras modalidades, as medições de temperatura e as medições de fluorescência são realizadas sequencialmente no prazo disponível. O monitoramento de temperatura após a etapa de aquecimento é útil para fornecer ao software de sistema de controle informações de temperatura necessárias para determinar a saída de energia apropriada necessária para a próxima etapa de aquecimento. Em algumas modalidades que compreendem uma etapa de monitoramento de temperatura após a etapa de aquecimento fotônico, retroalimentações de temperatura dinâmicas durante as etapas de aquecimento não são possíveis devido à rápida dissipação de calor. Por exemplo, em algumas modalidades, os volumes de mistura de reação aquosa dissipam calor rapidamente e exibem uma diminuição na temperatura de cerca de 20 °C por segundo quando a fonte de aquecimento é removida. Portanto, em algumas modalidades, a posições de aquecimento compreendem isolamento para diminuir a perda de calor. Em outras modalidades, o monitoramento de temperatura na posição de detecção de produto de PCR é usado pelo software de sistema de controle para normalizar os dados de fluorescência em bruto, devido ao fato de que é conhecido na técnica que a luz de fluorescência que tem certos comprimentos de onda espectrais pode ser afetada pela temperatura. Contudo, modalidades que compreendem um mecanismo de resfriamento na posição de detecção de produto de PCR diminuem a temperatura da mistura de reação aquosa para permitir que todas as medições de fluorescência sejam tomadas aproximadamente na mesma temperatura.

[00106] Alternativamente, a retroalimentação de temperatura dinâmica durante as etapas de aquecimento fotônico pode ser realizada colocando os diodos de laser e os detectores térmicos na mesma posição. Contudo, conforme discutido acima, o imageamento térmico não pode ser realizado simultaneamente com o aquecimento se as fontes de radiação eletromagnética emitirem radiação infravermelha significativa na mesma banda infravermelha usada para aquecer os volumes de mistura de reação aquosa exceto se um processo de "cintilação" for usado (isto é, piscando alternativamente rápido a fonte de aquecimento infravermelho com captação de detecção de emissão de infravermelho de corpo negro). Em algumas modalidades, um termopar ou um termistor é usado no lugar do imageamento térmico, o que permite que o monitoramento de temperatura seja realizado simultaneamente com irradiação infravermelha permitindo retroalimentação de temperatura dinâmica durante o aquecimento fotônico.

[00107] Também é apresentado na Figura 9 um subsistema de descarte de refugo que compreende aspiradores 901, 903, um dispensador em batelada 902, um separador de óleo 905 e uma lâmpada ultravioleta 904. Após as matrizes oleosas aquosas terem sido movidas através de todas as posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura e posições de detecção de produto de PCR, as matrizes oleosas aquosas podem ser removidas dos vasos e descartadas. O sistema de controle faz com que a correia 402 mova a fileira de vasos da estação de vaso que compreende a posição de detecção de produto de PCR final para o aspirador 901. Em uma modalidade preferencial, o aspirador 901 está em uma cabeça de pipetagem de 12 posições. O aspirador 901 aspira toda a matriz oleosa aquosa de cada vaso na fileira e passa a matriz oleosa aquosa para refugo. Em algumas modalidades, a matriz oleosa aquosa é atravessada por um sistema de tubulação que eliminaria a necessidade de mover os aspiradores 901 para o local de refugo. O sistema de controle então faz com que a correia 402 mova a fileira de vasos para o dispensador em batelada 902, que dispensa óleo limpo ou água em cada vaso da fileira. Posteriormente, o sistema de controle faz com que a correia 402 mova a fileira de vasos para os aspiradores 903, que aspiram o óleo ou água de cada vaso na fileira. Conforme mostrado na Figura 9, uma modalidade pode compreender um separador de óleo 905 no qual os óleos portadores e de encapsulação são extraídos e reusados no subsistema de montagem. Após a segunda aspiração, o sistema de controle faz com que a correia 402 mova os poços para a parte de baixo do laço de correia, em que uma lâmpada ultravioleta 904 emite radiação ultravioleta para destruir todos os polinucleotídeos restantes nos vasos para evitar contaminação de polinucleotídeo de subsequentes reações de PCR.

[00108] É apresentada na Figura 10 uma disposição preferencial da posição de aquecimento fotônico, da posição de monitoramento de temperatura e da posição de detecção de produto de PCR do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR. Nessa modalidade, a correia, o subsistema de montagem e o subsistema de descarte de refugo são dispostos conforme mostrado na Figura 9. Na modalidade mostrada na Figura 10, contudo, o sistema compreende posições de aquecimento e posições de monitoramento de temperatura nas mesmas estações de vaso em uma configuração alternada com estações de vaso compreendendo as posições de detecção de produto de PCR (e posições de resfriamento). A correia move uma fileira de vasos para uma posição de aquecimento, em que as fontes de radiação eletromagnética são posicionadas abaixo dos vasos. Nessa modalidade, as fontes de radiação eletromagnética, por exemplo, LEDs, são posicionadas no fundo de cada vaso quando o vaso está em uma posição de aquecimento, em que os LEDs emitem radiação eletromagnética que tem um comprimento de onda espectral na faixa de cerca de 100 nm a cerca de 500 nm (isto é, comprimentos de onda de luz ultravioleta, violeta e azul) (consulte, por exemplo, a Figura 3). Em uma modalidade preferencial, os LEDs emitem luz azul. A radiação eletromagnética é focada através de uma lente de colimação em um filme Mylar revestido com ouro disposto entre o fundo do vaso e o óleo de encapsulação. A energia de luz é convertida em energia térmica (conforme descrito em outro local no presente documento) e aumenta a temperatura do volume de mistura de reação aquosa. Nessa modalidade, o monitoramento de temperatura simultâneo é realizado através de um sensor de imageamento térmico em comunicação óptica com a matriz oleosa aquosa. Em uma modalidade preferencial, uma fibra óptica é posicionada no topo de cada um dos vasos quando esse vaso está em uma posição de monitoramento de temperatura e conduz radiação infravermelha de corpo negro emitida da matriz oleosa aquosa para o sensor de imageamento térmico (consulte, por exemplo, a Figura 3). Em algumas modalidades, um filtro de emissão de infravermelho é colocado na trajetória óptica da radiação infravermelha de corpo negro e posicionado entre o sensor de imageamento térmico e uma face plana de uma placa de fibra óptica (consulte, por exemplo, a Figura 9). Nessa modalidade, cada ciclo de temperatura de PCR é concluído em cerca de dez segundos ou menos.

[00109] Após o primeiro ciclo de temperatura de PCR ser concluído, o sistema de controle faz com que a correia mova a fileira de vasos para a próxima estação de vaso, que compreende uma posição de detecção de produto de PCR. Conforme ilustrado na Figura 10, a luz de excitação de fluorescência que tem dois comprimentos de onda espectrais diferentes é gerada pelas fontes de luz de excitação de fluorescência do detector de excitação e emissão de fluorescência e transportada, por exemplo, por uma ou mais fibras ópticas posicionadas acima de cada vaso quando esse está na posição de detecção de produto de PCR, e transmitida para o volume de mistura de reação aquosa (mostrado por setas pontilhadas). Em resposta a isso, fluoróforos no volume de mistura de reação aquosa emitem luz de emissão de fluorescência que é transportada de volta para o detector de excitação e emissão de fluorescência por, por exemplo, a uma ou mais fibras ópticas (mostrado por setas pontilhadas). A intensidade da luz de emissão de fluorescência é, então, medida pelo detector de luz de emissão de fluorescência (por exemplo, câmera de CCD) do detector de excitação e emissão de fluorescência. Em algumas modalidades, a trajetória óptica de cada luz de excitação de fluorescência compreende uma fonte de luz de excitação de fluorescência, um cubo de filtro dicroico, uma placa de arranjo de fibra óptica, uma câmera de CCD e um arranjo de fibra óptica (consulte, por exemplo, a Figura 9). Em algumas modalidades, a trajetória óptica de cada luz de excitação de fluorescência é compreendida por apenas uma fonte de luz (LED ou laser) e a detecção de emissão de fluorescência é compreendida apenas por um filtro de emissão e uma câmera CCD ou CMOS. Adicionalmente, um dissipador de calor passivo pode ser disposto sob o lado superior da correia e posicionada abaixo de cada vaso quando na posição de detecção de PCR (consulte, por exemplo, a Figura 9). Após a etapa de detecção de produto de PCR ser concluída, o sistema de controle faz com que a correia mova a fileira de vasos para a próxima estação de vaso quando o processo é repetido por um número predeterminado de ciclos de temperatura de PCR na faixa de 1 a 40.

Sistemas de Controle Mecânico, Eletrônico e Software

[00110] São fornecidos no presente documento sistemas mecânicos, sistemas eletrônicos e funcionalidade de software adequados para controle do sistema de detecção de produto e amplificação de PCR. Uma ampla variedade de configurações eletrônicas e de software possíveis são adequadas para uso no fornecimento de um sistema de controle mecânico e eletrônico que tem a capacidade de ser incorporado ao presente sistema e estão dentro do alcance do versado na técnica. É apresentado na Figura 11 é um diagrama de blocos funcional de uma modalidade preferencial que compreende funções de controle para uma modalidade de dispositivo único do começo ao fim completa (como as modalidades de correia em movimento mostradas nas Figuras 9 e 10). Em algumas modalidades, o presente sistema compreende montar as reações em placas de poço off-line e/ou mover manualmente um arranjo de vasos para um dispositivo configurado de modo que detecção de fluorescência e aquecimento de PCR seja realizada sem mover os vasos (isto é, sem a necessidade de uma correia em movimento ou outro dispositivo de posicionamento automatizado). Tais modalidades são possibilitadas por meio da colocalização de componentes de detecção de fluorescência e aquecimento em trajetórias de luz comuns associadas a cada vaso. Em tal caso, o posicionamento de vaso e/ou montagem de ração não é necessário. Operações de aquecimento e detecção no dispositivo ocorreriam sequencialmente, em vez de simultaneamente em locais separados. Realizando o aquecimento de ciclo de PCR seguido de, sequencialmente, por detecção de fluorescência, são eliminadas as complicações impostas por possível interferência de detecção de fluorescência pela fonte de luz de aquecimento e pela mudança rápida de temperatura. Contudo, carregamento, processamento e descarregamento contínuos não são possíveis e a produtividade é mais limitada.

[00111] É representado na Figura 11 um diagrama de blocos funcional de uma modalidade preferencial que compreende funções de controle para uma modalidade de dispositivo único do começo ao fim completa. Conforme mostrado na Figura 11, o sistema compreende um Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal (PLC ou microcontrolador eletrônico) que é programado para fornecer funções para iniciar e controlar cada ação envolvida no fluxo de processo de uma "execução" ocorrendo no instrumento. Um "execução” é definido no presente documento como operações em um conjunto de reações montadas, processadas e monitoradas para fluorescência de produto de PCR em que o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR é executado autonomamente sem nenhuma entrada instrucional significativa durante o fluxo de processo e o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR não é desligado ou redefinido durante o fluxo de processo para qualquer operações de carregamento, descarregamento ou manutenção em batelada. Como tal, todas as informações de parâmetro de PCR e montagem de reação necessárias pelo sistema para suportar uma execução são predefinidas e comunicadas para o sistema antes de a execução começar. Uma modalidade que usa tal sistema de controle é o sistema à base de placa de microtitulação. Alternativamente, informações necessárias para começar a montagem e o processamento de amostras e reações disponíveis são comunicadas para o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR para começar as operações, e as informações adicionais são subsequentemente comunicadas para o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR para ampliar suas instruções e suportar montagem e processamento contínuos d amostras adicionais que são fornecidas de modo que a instrumentação de sistema não pare completamente a qualquer momento durante a execução e um fluxo de processo seja mantido.

[00112] Sob o controle do Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal, subsistemas individuais podem ter seus próprios microcontroladores eletrônicos ou podem ser controlados por sub-rotinas, múltiplos processadores e módulos eletrônicos do Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal. Em qualquer caso, os subsistemas realizam suas funções individuais em cooperação e coordenação de modo que a temporização de operações assegure montagem e processamento apropriados de todas as reações. Por exemplo, o tempo exato necessário realizar uma operação de aquecimento e resfriamento de termociclo de PCR particular para qualquer dado volume de montagem de reação não é conhecido antecipadamente e é determinado, dinamicamente, através de monitoramento de temperatura de retroalimentação do volume de montagem de reação particular durante o processo de aquecimento. Portanto, o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal coleta e compila informações de situação de sinal de retroalimentação para cada vaso sendo submetido a processamento e evita que o próximo processamento ocorra para qualquer vaso até que etapa anterior seja concluída para todos os vasos. A detecção de fluorescência não é iniciada até que o aquecimento de termociclo seja concluído. Da mesma forma, em um sistema de correia, os poços não avançam na correia pelos Controladores de Motor de Posição de Arranjo de Vaso até que seja confirmado pelo Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal que a montagem de reação está concluída e/ou as leituras de detecção de fluorescência estão concluídas para todos os poços. Uma vez que a montagem de reação, o aquecimento fotônico e/ou as leituras de detecção de fluorescência estão concluídas para todos os poços, o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal informa os Controladores de Processo de Posicionamento de Arranjo de Vaso para retransmitir informações de posicionamento de motor para os Controladores de Motor de Posição de Arranjo de Vaso para fazer com que o dispositivo de posicionamento (por exemplo, correia em movimento) mova os vasos para a próxima estação de vaso. Portanto, os volumes de reação particulares que exigem o tempo mais longo para uma dada etapa de processamento determinam a taxa de progresso de todo o sistema.

A.Controle do subsistema de montagem.

[00113] Conforme já estabelecido, algumas modalidades do sistema integram montagem de reação em linha. Em tais casos, o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal passa comandos e informações necessárias, como informações de volume e identificação de amostra, para os Controladores de Processo de Pipetagem de montagem de reação sobre onde obter amostras, reagentes e óleos. Os Controladores de Processo de Pipetagem enviam informações de posição de motor para os Controladores de Motor de Posição de Pipetagem e os Controladores de Motor de Aspiração/Dispensação de Pipetagem que movem líquidos para vasos de reação e informam ao Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal sobre a disposição de reações que foram montadas nos vasos. O Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal pode, alternativamente, comandar uma disposição predefinida particular de reações, mas o sistema funciona de modo mais eficiente se os Controladores de Processo de Pipetagem informarem ao Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal sobre a disposição das reações que pode criar rapidamente. O Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal pode, então, registrar a disposição em um Banco de Dados de Armazenamento Local de modo que, quando os dados de fluorescência são coletados, o sistema possa determinar qual mistura de reação particular gerou qual fluorescência.

B.Controle do subsistema de aquecimento fotônico e do subsistema de controle de fonte de luz e retroalimentação de temperatura de microcontrolador.

[00114] O subsistema de aquecimento fotônico emprega hardware ou software de controlador proporcional-integral-derivativo (PID) em combinação com conjuntos de regras de controle de aquecimento desenvolvido de modo personalizado para determinar a energia necessária para acionar as fontes de luz. Parâmetros e regras de PID são ajustadas para fornecer o aquecimento possível mais rápido sem ultrapassagem significativa de temperaturas desejadas de ponto de ajuste.

[00115] Conforme mostrado na Figura 11, o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal envia informações de perfil de aquecimento, incluindo quais pontos de ajuste de temperatura alcançar e a duração da retenção do volume de reação em cada temperatura, para os Controladores de Aquecimento e dispara os Controladores de Aquecimento para enviar informações de ponto de ajuste de temperatura para o Regulador de Potência de Aquecimento de PID. Em resposta, o Regulador de Potência de Aquecimento de PID transmite as informações de nível de potência para as Fontes de Alimentação de Fonte de Luz de Aquecimento, que fornecem a saída de energia apropriada para as Fontes de Luz de Aquecimento (isto é, as fontes de radiação eletromagnética). As Fontes de Luz de Aquecimento então emitem radiação eletromagnética para os vasos. Conforme discutido em outro local no presente documento, o presente sistema compreende uma pluralidade de Sensores de Temperatura (isto é, dispositivos de detecção térmica, como fibras ópticas em comunicação óptica com um dispositivo de captação de infravermelho térmico, termistores ou termopares), que, em algumas modalidades, fornecem informações de ciclo de temperatura de PCR em tempo real. Subsistemas eletrônicos e de software individuais reduzem a carga em alguns controladores de instrumento principais, especialmente se a velocidade de processador de Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal é limitada. Por exemplo, o aquecimento ocorre muito rápido em reações de pequeno volume. A fim de controlar precisa e rapidamente o processo de aquecimento, os valores de retroalimentação de temperatura são fornecidos aproximadamente a cada 100 a 200 milissegundos. Empregando um sistema de processador de controle de aquecimento separado, o processador não é envolvido em tarefas de controle sem aquecimento e pode lidar com o tempo de retorno de controle e retroalimentação rápida necessário para evitar potencial superaquecimento. Dessa forma, é fornecido um subsistema de controle de fonte de luz e retroalimentação de temperatura em que as informações de tensão, corrente ou imagem infravermelha geradas pelos Sensores de Temperatura são enviadas para um Processador de Sinal de Sensores de Temperatura que fornece informações de temperatura de retroalimentação para o Regulador de Potência de Aquecimento de PID, que, em resposta a isso, envia as informações de nível de potência atualizadas para as Fontes de Alimentação de Fonte de Luz de Aquecimento para ajustar a saída de energia para as Fontes de Luz de Aquecimento.

[00116] Uma vez que o ponto de ajuste de temperatura é alcançado, o Regulador de Potência de Aquecimento de PID transmite essas informações para os Controladores de Aquecimento. Nesse ponto, os Controladores de Aquecimento comandarão o Regulador de Potência de Aquecimento de PID para fornecer energia de saída adicional para as Fontes de Luz de Aquecimento para aumentar a temperatura da reação para o próximo ponto de ajuste de temperatura, ou, se o ciclo de temperatura de PCR está concluído, o Controlador de Aquecimento comandará o Regulador de Potência de Aquecimento de PID para terminar a saída de energia, desligando assim as Fontes de Luz de Aquecimento. Uma vez que o subsistema de aquecimento fotônico concluiu um ciclo de temperatura de PCR, os Controladores de Aquecimento informam o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal, por exemplo, por meio de protocolos de comunicação de dados ou estados de linha digital, que a reação foi concluída e aguarda instruções adicionais.

C.Controle do subsistema de detecção de fluorescência.

[00117] Os Controladores de Detecção de Fluorescência fornecem funcionalidade para ligar e desligar Fontes de Luz de Excitação de Fluorescência quando iniciador por comando do Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal. Da mesma forma, a iniciação de detecção de luz de emissão pelos Detectores de Emissão de Fluorescência é gerenciada pelo subsistema de detecção de fluorescência. Conforme mostrado na Figura 11, o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal dispara os Controladores de Detecção de Fluorescência que ativam as Fontes de Alimentação de Excitação de Fluorescência apropriadas resultando na emissão de luz de excitação de fluorescência de uma ou mais Fontes de Luz de Excitação de Fluorescência. Conforme descrito em outro local no presente documento, a luz de excitação de fluorescência pode ser conduzida para cada vaso contendo uma matriz oleosa aquosa quando esse vaso está na posição de detecção de produto de PCR. Os fluoróforos no volume de mistura de reação aquosa respondem à luz de excitação de fluorescência que tem o comprimento de onda espectral apropriado e emitem luz de emissão de fluorescência que é transportada para um Detector de Luz de Emissão de Fluorescência. O Detector de Luz de Emissão de Fluorescência envia informações de sinal em bruto para os Processadores de Sinal de Fluorescência, que coletam, processam e relatam os dados como unidades de fluorescência relativa para o Registrador de Dados de Fluorescência. O Registrador de Dados de Fluorescência passa as informações de unidade de fluorescência relativa para um Banco de Dados de Armazenamento Local e/ou um Processador de Análise Genética configurado para executar software de análise de dados de PCR, que determina a uma chamada genética de alelo para relatar com base nos dados de fluorescência e informações fornecidas pelas informações de plano de montagem de reação e amostra.

[00118] Em uma modalidade preferencial, dados de fluorescência são coletados após cada ciclo de temperatura de PCR. Em alguns aspectos, a qualidade e as características das reações de PCR são tais que o programa de software de análise de dados de PCR informa o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal que uma chamada genética de alelo foi realizada com base nas informações já disponíveis, e o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal pode, então, instruir os Controladores de Aquecimento e os Controladores de Detecção de Fluorescência a terminarem o processamento subsequente do volume de mistura de reação aquosa particular que corresponde aos dados de chamada genética. Esse controle de retroalimentação adicional economiza tempo e energia.

D.Sistemas externos e interfaces de usuário.

[00119] Na modalidade apresentada na Figura 11, o sistema emprega um LCD ou visor de imagem em vídeo para fornecer informações de situação sobre o instrumento (isto é, o Visor de Situação de LCD de Instrumento). Também há uma Interface de Controle Manual que permite funções, como manualmente começar, pausar ou abortar operações de instrumento. Também é mostrada na Figura 11 uma Interface de Usuário Baseada em PC que pode ser uma aplicação baseada em PC separada ou interface de usuário de página da web. Tal interface permitiria múltiplos usuários a capacidade de enviar informações para um instrumento para configurar e começar uma execução ou carregar reações adicionais em uma execução que já começou.

[00120] Serviços de Gerenciamento de Informações Laboratoriais (LIMS) são bem conhecidos na técnica e são sistemas de gerenciamento de informações e de laboratório baseados em software com recursos, como suporte de rastreamento de dados de fluxo de trabalho, arquitetura flexível, e interfaces de troca de dados, que suportam operações de um laboratório. Dessa forma, em algumas modalidades, o presente sistema compreende um programa LIMS. São mostrados na Figura 11 sistemas externos que incluem Serviços de Troca de Dados de LIMS conectados de modo comunicativo ao Banco de Dados de LIMS e ao Banco de Dados de Armazenamento Local e configurados para enviar "executar programação" e informações de plano para a Interface de Usuário Baseada em PC e "executar componentes” e informações de plano para o Controlador de Fluxo de Processo de Instrumento Principal.

[00121] Inúmeras variações dos componentes do sistema da invenção podem ser usadas, como exemplificado abaixo.

Recipientes

[00122] Muitas placas de microtitulação, tubos, frascos e dispositivos de retenção de líquido de múltiplas câmaras comercialmente disponíveis foram examinados em uma tentativa de encontrar um recipiente adequado para suportar o volume de líquido enquanto acomoda o aquecimento mediado por luz. O volume de líquido é flexível dependendo de necessidades específicas, e volumes menores podem geralmente ser aquecidos mais rápido com menos entrada de energia de luz. Contudo, por conveniência e simplicidade nos sistemas de protótipo, uma gotícula aquosa de 3 microlitros em 5 microlitros de óleo foi rotineiramente usada. O tamanho, formato e espessura de parede foram todos fatores que tornaram os recipientes comercialmente disponíveis examinados escolhas insatisfatórias para suportar aquecimento mediado por luz rápido e controlado do volume de líquido selecionado. Alguns recipientes não tinham um fundo adequado para uma área suficiente de metal ouro. Muitos outros tinham uma espessura de parede que criou uma taxa de dissipação de calor e massa térmica que quer era muito grande para ser prática com as fontes de luz desejadas. Lasers de alta potência foram frequentemente necessários para fornecer energia de luz suficiente para aquecer volumes ainda menores de líquido em alguns recipientes. Alguns formatos e tamanhos de recipiente produziram aquecimento não uniforme do líquido que resultou em termociclo insatisfatório. Alguns recipientes derreteram, delaminaram ou deformaram sob o calor gerado pelo ouro. Por fim, recipientes de plástico formados a vácuo de parede fina foram fabricados e esses provaram funcionar muito bem. Tais arranjos formados a vácuo de poços são relativamente baratos, potencialmente descartáveis, se desejado, e são adaptáveis a todas as modalidades examinadas do sistema. Moldes de formação a vácuo foram construídos, utilizando pinos de aço inoxidável, que produzem arranjos de recipiente de parede fina uniforme em qualquer disposição e configuração desejadas de um ou mais poços.

[00123] Recipientes de poço único, tiras de poços, e arranjos de fileiras e colunas de poços podem facilmente ser produzidos. A maioria arranjos de múltiplos poços são fabricados com um espaçamento centro a centro de 9 milímetros dos poços para suportar tecnologias de pipetagem de múltiplas pontas de padrão industrial. Contudo, qualquer espaçamento ou disposição desejada é viável. Diversos materiais de chapa de plástico disponíveis para formação a vácuo/termoformação foram testados para esse propósito. Diversos foram funcionais. Contudo, uma chapa de PETG (Modificada por Tereftlato de Polietileno Glicol) clara e transparente com uma espessura de 0,04 polegadas foi selecionada e empregada para a maioria dos arranjos de recipiente. Conforme ilustrado na Figura 14, para a maioria dos sistemas de teste de protótipo, arranjos de poços de fundo plano (a) com um diâmetro interno de 3 milímetros e profundidade de 5,5 milímetros foram fabricados. Vistos que esses arranjos de poço de parede fina careciam da rigidez de muitos recipientes de parede espessa, grandes arranjos de poços exigiam uma estrutura de suporte (b) para evitar flexão, flacidez e deformação do arranjo. O suporte foi fornecido por uma chapa de acrílico espessa 4 mm (0,125 pol) que foi cortada a laser para ter uma disposição de furos compatíveis com as posições e diâmetros dos poços no arranjo formado a vácuo de PETG de poços. Os recipientes de poço formados a vácuo foram inseridos nos furos na placa de suporte. Isso resultou em um dispositivo com arranjos de poços se projetando aproximadamente 1,5 mm abaixo da placa de suporte. A placa de suporte fornece não apenas suporte para o arranjo de poços, mas também fornece alinhamento preciso dos poços nas fontes de luz.

Materiais de Conversão de Luz/Calor

[00124] Para absorver a luz azul de comprimento de onda rotineiramente empregada e converter isso em calor para acionar o termociclo, é necessário um filme metálico de ouro no fundo do poço de reação (Figura 13). Idealmente, poderia ser usado outro depositado por vapor ou eletroplaqueado, aplicado diretamente ao fundo do poço. Contudo, os processos de deposição por vapor e de eletroplaqueamento são inconvenientes e impraticáveis para a maioria dos testes de protótipo. Uma alternativa é empregar folhas metálicas ou discos de filme revestidos com ouro (e na Figura 13) inseridos no fundo dos poços Esses discos são perfurados de estoque de chapas comercialmente disponíveis de filme Mylar revestido com ouro ou folha de alumínio revestida com ouro. A maioria dos testes iniciais de protótipos foi realizada com filme Mylar revestido com ouro. Contudo, constatou-se que o Mylar poderia derreter, encolher ou perder seu revestimento de ouro sob certas circunstâncias. Além disso, foi difícil impedir que o filme Mylar flutuasse em alguns líquidos, especialmente quando a temperatura do líquido é rapidamente mudada e bolhas de gás são possíveis no volume de líquido. Provou-se que folha de alumínio comumente disponível era muito espessa para funcionar de maneira eficaz. Contudo, foi constatado que uma folha de alumínio revestida com ouro muito fina, normalmente usada como uma embalagem de doce, (CK Products/Oasis Supply embalagem de doce de filha metálica de ouro de 4x4 polegadas 89-44G) funcionou muito bem. Uma perfuração foi moldada de uma haste de aço afiada e placas de aço com um furo de diâmetro compatível que permitiu que discos de folha metálica de 3 mm fossem gerados. Esses discos foram inseridos com uma caneta de sucção a vácuo de pequeno diâmetro, lado do ouro para baixo, nos poços dos recipientes formados a vácuo. Os discos foram dimensionados para se encaixarem bem no fundo dos poços.

Matrizes de Óleo

[00125] Conforme anteriormente mencionado, dois óleos podem ser usados para suportar a gotícula aquosa, um óleo de encapsulação de silicone e um óleo carreador de perfluorocarboneto, e isso tem certas vantagens para centralizar e controle de contaminação. Contudo, constatou-se que o uso de dois óleos poderia resultar, sob algumas circunstâncias, em um efeito de "lâmpada de lava" quando os líquidos forem rapidamente aquecidos e resfriados pela luz. Observações feitas com uma pequena câmera de vídeo posicionada ao lado de um recipiente de único poço mostraram que empregar alguns óleos de perfluorocarboneto fez com que todo o volume de líquido fosse agitado, ficasse turvo e fosse dividido em gotículas menores durante o rápido aquecimento e resfriamento. Remover o óleo de perfluorocarboneto e apenas usar um óleo de silicone (c na Figura 13) eliminou essa agitação. Ainda há correntes termicamente induzidas estabelecidas no óleo, conforme indicado por estudos de vídeos de pequenas partículas que podem ser adicionadas ao óleo. Contudo, essas correntes não moveram significativamente a gotícula aquosa (d na Figura 13) que tendeu a repousar no centro de óleo logo acima da folha metálica de ouro no fundo do poço. De fato, essas pequenas correntes promovem uma temperatura mais uniforme no volume de líquido total, tornando o monitoramento e o controle de temperatura mais fáceis. Os volumes escolhidos da gotícula aquosa e o volume do óleo foram determinados pelo tamanho e formato do recipiente e forneceram uma camada de óleo sobre a gotícula aquosa com aproximadamente 0,5 a 1 milímetro de profundidade. A cobertura de óleo evitou a evaporação da gotícula aquosa.

Revestimento Hidrofóbico

[00126] Para fornecer o controle de contaminação e centralização oferecido pelo óleo carreador de perfluorocarboneto, foi encontrada uma alternativa simples que não exige o óleo carreador no volume de líquido. O meio fundo de cada poço nos arranjos formados a vácuo de poços é tratado com um revestimento super-hidrofóbico (HydroFoeTM da LotusLeaf Coatings, Inc.) (b na Figura 13). Muitas modalidades de sistema de protótipo incorporam esse revestimento. O revestimento acentua em grandes proporções a centralização da gotícula aquosa no óleo de silicone e repele todo contato entre as paredes do poço e a mistura de reação aquosa. Em sistemas de protótipos, cada poço é tratado por 5 minutos com 20 microlitros de HydroFoeTM. Sem o revestimento hidrofóbico, as gotículas aquosas poderiam, às vezes, se fixar às paredes do poço, o que se provou prejudicial para a detecção de fluorescência e imageamento térmico infravermelho e permitiu problemas potenciais de contaminação cruzada se o poço for usado novamente para subsequentes reações de PCR. O revestimento super-hidrofóbico é razoavelmente durável e o poço pode ser usado múltiplas vezes após um tratamento que suporta diversas reações de PCR. Substituir o óleo de perfluorocarboneto com um revestimento hidrofóbico simplifica a montagem de volumes de reação, reduz custos e elimina líquidos residuais de perfluorocarboneto potencialmente perigosos. Embora o HydroFoeTM seja atualmente usado nos sistemas de protótipos, existem muitos outros revestimentos de tratamento hidrofóbico comercialmente disponíveis que funcionariam igualmente bem.

Fonte de Luz

[00127] Muitas fontes de luz de laser e LED foram examinadas como possíveis fontes de energia para acionar o aquecimento. Muitos LEDs azuis comumente disponíveis não fornecem a saída de energia necessária para aquecer rapidamente os volumes de líquido de reação desejados. Alguns lasers e LEDs eram relativamente dispendiosos. Alguns eram grandes e volumosos e não se adequaram bem a serem posicionados sob poços que poderiam estar próximos em um arranjo de poços. Alguns exigiram sistemas de lente dispendiosos e complicados para focar a luz. Alguns lasers produziram uma fonte de luz intensa, de pequeno diâmetro e colimada que poderia ser facilmente posicionada para iluminar apenas a superfície de metal ouro no fundo do poço de reação. Esses lasers poderiam ser usados para aquecer muito rapidamente a maioria dos volumes de líquido testados. Contudo, esses lasers são geralmente considerados um perigo para o olho, o que é considerado indesejável. Foi constatado que os LEDS eram pequenos, baratos e forneceram a intensidade de luz necessária. Ademais, os LEDs selecionados poderiam ser posicionados muito próximos aos fundos dos poços nos recipientes formados a vácuo de parede fina (Figura 14) de modo que a maior parte da luz emitida pelos LEDs cruzasse com a camada de metal ouro no fundo dos poços. Isso torna os LEDs selecionados eficientes considerando a energia e elimina a necessidade de uma lente de focalização. OS LEDs azul real Luxeon Rebel ES 1W 700 mA (Lumileds Holding B.V.) funcionaram bem se a cúpula for removida do LED. Os LEDs Luxeon Z Series ES 700mA também funcionarem bem e são dispositivos de LED de “matriz nua” sem uma cúpula protetora. Remover a cúpula permite que a matriz seja posicionada muito próxima (1 milímetro) ao fundo do poço formado a vácuo, aprimorando a eficiência de transferência de energia. Esses LEDs estão disponíveis como dispositivos de montagem em superfície em pequenos blocos com contatos, permitindo que os mesmos sejam facilmente montados em uma placa de circuito impresso. Posicionamento de Fonte de Luz

[00128] Para um dispositivo de protótipo, foi projetada uma placa de circuito impresso permitindo um controle independente de 96 LEDs posicionados com um espaçamento de 9 milímetros (Figura 16). Esse modelo particular suporta uma modalidade comumente usada do sistema que utiliza tecnologias de pipetagem de múltiplas pontas projetadas para o modelo e pegada internacionais de poços em uma placa de microtitulação de 96 poços. Placas de circuito impresso similares para qualquer outra disposição de LEDs são viáveis.

[00129] Nem toda a energia elétrica de entrada é convertida em luz. Uma quantidade significativa de calor é gerada por um LED. Para manter a estabilidade e prolongar a vida do LED, o LED pode ser montado em um dissipador de calor para permitir que esse calo seja dissipado. Em sistemas de protótipos, ventiladores são posicionados para transportar esse calor na direção contrária aos LEDs e aos poços acima dos LEDs. Ventiladores adicionais são posicionados para fornecer um fluxo de ar através dos fundos para os poços. Esses ventiladores são ligados e desligados automaticamente por software de microcontrolador para promover o resfriamento mais rápido dos poços quando desejado.

Acionadores de Fonte de Luz

[00130] Para suportar um sistema de protótipo, foi montado um sistema de acionador de LED que fornece controle de potência por modulação de largura de pulso (PWM) de cada LED em um barramento único de I2C de um microcontrolador. O sistema de acionador de LED emprega uma série de módulos PCA9685, disponíveis junto à múltiplas fontes de componente eletrônico. Cada módulo PCA9685 pode fornecer sinais de PWM de 12 bits para até 16 LEDs endereçáveis. Os módulos contêm seu próprio relógio interno, eliminando a necessidade de atualizar continuamente as definições de PWM. Os módulos PCA9685 podem ser montados em série, permitindo que diversas centenas de LEDS sejam controlados em um barramento de I2C por um único microcontrolador. 6 módulos são necessários para acionar 96 LEDs. Para acomodar a corrente necessária para acionar os LEDs de 1W individuais, a saída de sinal de PWM para cada LED de um PCA9685 é roteada para uma unidade de potência RapidLED Meanwell LDD-700H montada em uma placa de driver RapidLED LDD-H-4 quad (Rapid LED). Uma LDD-700H é necessária para cada LED. Cada placa de driver é conectada a uma fonte de alimentação e tem conexões para cada saída de LED. A Figura 15 mostra a disposição básica de componentes necessários para acionar os LEDs. Apenas 32 LEDs são mostrados no diagrama, mas uma montagem foi projetada para teste que aciona 96 LEDs. Esse modelo é facilmente estendido para um número ainda maior de LEDs e é uma forma simples, barata e flexível de acionar múltiplos LEDs em sistemas de protótipos. Também são possíveis circuitos de controle de LED de funcionalidade similar e projetados de modo personalizado.

Sensores de Temperatura sem Contato

[00131] Para controlar e modular a intensidade dos LEDs, regulando assim temperaturas, é ideal usar retroalimentação de sensores de temperatura que podem continuamente monitorar as temperaturas de cada volume de líquido. Diferenças sutis no tamanho e composição das reações podem ocasionar variabilidade significativa na temporização e níveis exigidos de potência durante o aquecimento. Termistores ou termopares simples podem ser inseridos em cada reação para fornecer essas informações de temperatura de retroalimentação. Para muitos sistemas de protótipo e teste, termopares de 0,005 polegadas (Omega Engineering Inc.) foram inseridos em poços individuais. Contudo, isso apresenta múltiplos problemas com controle de contaminação, reuso de recipientes e fácil movimento de arranjos de poços para algumas modalidades do sistema. O método preferencial de monitoramento de temperatura para a maioria das modalidades é o uso de sensores de IR sem contato. Foram realizados testes de múltiplos sensores de IR sem contato. O tamanho, formato, posição/alinhamento, custo, precisão e campo de visão de muitos sensores de temperatura de IR sem contato de medição única distintos disponíveis eram inapropriados para uso com sucesso desses sensores nos presentes sistemas de protótipos. Os melhores resultados, até o presente momento, foram alcançados com tecnologias de imageamento de IR sem contato que podem simultaneamente reportar temperaturas de múltiplos pixels em uma imagem térmica capturada. Isso supera a necessidade de muitos sensores individuais e suporta captura e manipulação mais rápida e mais fácil de dados de temperatura para múltiplos poços. Além disso, analisando imagens térmicas de áreas inteiras ocupadas por poços de reação, não é necessário o alinhamento preciso de sensores de temperatura distintos individuais. Embora muitas câmeras de imageamento de IR disponíveis possam ser empregadas, o monitoramento de temperatura foi realizado em sistemas de protótipos com o sensor radiométrico FLIR Lepton® e a câmera de imageamento térmico FLIR Ax5-Series (FLIR Systems, Inc.). Ambos os dispositivos de imageamento térmico podem fazer interface com um microcontrolador ou computador e podem reportar temperaturas de imagens de objetos observados. Posicionando esses sistemas de imageamento acima de um arranjo de volumes de reação, as temperaturas podem ser monitoradas enquanto o aquecimento mediado por luz está ocorrendo. Em sistemas de protótipos, o pixel com a temperatura relatada mais alta que corresponde a um local de poço foi usado como a temperatura do poço. As temperaturas relatadas são temperaturas superficiais e podem ser alguns graus menores que as temperaturas relatadas simultaneamente por termopares embutidos mais próximo à camada de ouro. Contudo, é possível calibrar e compensar essas diferenças de temperatura desde que os tamanhos, configurações e volumes de líquido de recipiente sejam mantidos constantes.

Sensores de Fluorescência

[00132] A mistura de reação PCR de teste de sistema de protótipo típica é uma reação PCR TaqmanTM de duas sondas (bialélicas) que emprega sondas FAM e VIC fluorescentes. Algumas reações também contêm um corante ROX não ligado usado para avaliar volumes e concentrações de componentes de reação. Uma varredura de excitação e emissão espectral completa dessas reações de PCR mostrou janelas estreitas de excitação e emissão em que ocorreu uma interferência mínima de emissão entre os corantes de 2 sondas. Para as presentes misturas de reação de PCR de teste específicas, a janela ideal de excitação de FAM foi 475 a 500 nm com uma janela ideal de emissão entre 510 a 525 nm. A janela ideal de excitação de fluorescência de VIC foi 525 a 535 nm com uma janela ideal de emissão de 555 a 565 nm. Essas janelas de excitação e emissão foram usadas para selecionar fontes de luz de excitação e filtros ópticos de excitação e emissão em sistemas de protótipos.

[00133] Muitas tecnologias de sensores de fluorescência ópticos de reação distintos e de sensor de fluorescência de varredura podem medir a fluorescência gerada de volumes de reação individuais, um por um. Contudo, para fornecer coleta rápida de dados de fluorescência necessários para medições de fluorescência em tempo real (ciclo a ciclo) e para tornar a velocidade geral dos sistemas de protótipos a mais rápida possível, é desejável medir simultaneamente a fluorescência de múltiplos poços. Isso pode ser alcançado por meio do uso de arranjos de fibras ópticas e/ou por meio do uso paralelo de múltiplos sensores de fluorescência. Contudo, as tecnologias de câmera de imageamento de fluorescência foram adotadas na maioria dos sistemas de protótipos. Câmeras de imageamento sensíveis à luz ultrabaixa usadas com filtros de fluorescência excitação e emissão apropriados têm a capacidade de coletar dados de produto de PCR Taqman de sonda de fluorescência de FAM e VIC de múltiplas reações simultaneamente em um sistema de protótipo. A sensibilidade das câmeras não foi um problema principal. Avanços tecnológicos nessa área nos últimos anos tornaram relativamente fácil encontrar câmeras com capacidades adequadas. Foram examinadas diversas câmeras de astronomia de fluorescência e microscopia de fluorescência de baixo custo. Exemplos de câmeras funcionais incluem a Sony A7s II (Sony Corporation), Tucsen ISH1000 (Tucsen Photonics), ToupTek E3CMOS (ToupTek Photonics), AmScope MT5000 e AmScope MF603C (United Scope LLC).

Fontes de Luz de Excitação

[00134] Foram projetados fontes de luz de excitação e filtros de excitação e emissão. Para dispositivos em que apenas um poço é observado, ocupando uma área muito pequena, são possíveis inúmeras fontes de luz e filtros ópticos de banda estreita. Contudo, para excitação de fluorescência, com iluminação de uma área relativamente grande ocupada por um arranjo de poços de líquidos de reação PCR, é necessária uma luz de excitação intensa e uniforme. Fontes de luz de LED disponíveis têm uma saída espectral muito ampla e precisam ser fortemente filtradas para fornecer as larguras de banda estreita necessárias para suportar separação limpa de emissões de fluorescência de FAM e VIC. Filtros de interferência de passa-banda estreita padrão podem ser posicionados em LEDs para fornecer a janela espectral desejada, mas o ângulo de incidência de luz que atinge um filtro de interferência precisa ser precisamente controlado para eliminar desvios espectrais indesejados. Uma montagem física com tal disposição para cobrir uniformemente uma grande área ocupada por um arranjo de poços é um desafio de engenharia significativo. Para fornecer a intensidade de luz necessária e comprimentos de onda de excitação estreitos, lasers forneceram uma solução mais funcional. Dispositivos de linha de laser relativamente seguros podem projetar uma linha de luz intensa através de diversos poços de PCR simultaneamente. Por natureza, a largura de banda de emitida de um laser é muito estreita. Essa linha de laser pode ser rapidamente movida para cobrir poços adicionais ou os poços podem ser movidos sob a linha de laser para capturar a fluorescência de múltiplas fileiras de poços. Dois lasers, um para cada comprimento de onda de excitação desejado, podem sequencialmente irradiar todos os volumes de reação e ainda demorar apenas poucos segundos. Outra alternativa é usar um dispositivo de varredura de espelho de cabeça galvanizada para defletir um feixe de ponto de laser sequencialmente para cada um dos locais de poço desejados. Tais dispositivos são comumente usados na projeção de padrões de laser para concertos e telas para grandes públicos. Um dispositivo de varredura de espelho de cabeça galvanizada barato pode mover mais que 20 mil pontos por segundo. Para excitação de fluorescência tanto para linha de laser como lasers de varredura de cabeça galvanizada, a luz de fluorescência emitida pelas sondas FAM e VIC pode ser sequencialmente detectada por uma câmera que pode se integrar ao longo do tempo necessária para varrer um número desejado de poços. Uma única câmera com um filtro de passa-banda de 2 comprimentos de onda pode ser empregada ou duas câmeras, cada uma com um filtro de passa-banda estreita de comprimento de onda único menos dispendioso podem ser usadas.

[00135] A presente divulgação é ilustrada pelos exemplos que se seguem. A descrição mencionada acima e a seguir e os exemplos não se destinam a limitar, mas, em vez disso, são ilustrativos das modalidades descritas. Por conseguinte, entende-se que a presente revelação não se limita aos detalhes específicos dos exemplos.

EXEMPLO 1

[00136] A Figura 17 ilustra a fluorescência observada de 16 poços de reação após 40 ciclos de PCR extraída de uma única imagem (exposição de 200 ms) capturada por uma câmera ToupTek E3CMOS. A luz de emissão de fluorescência foi filtrada através de um filtro de interferência de passa-banda estreita de 565nm + /- 5nm antes de entrar na lente da câmera. Os poços foram iluminados por uma linha de laser de 532nm 20mW barata (Laserlands, Inc.) para fornecer a luz de excitação de VIC. A coleção de 16 amostras era uma variedade de genótipos com amostras negativas para VIC, VIC heterozigoto e VIC homozigoto. Essa variação nos genótipos contribui para a variação na altura dos picos. A fluorescência de VIC é demonstrada aqui visto que é mais difícil medir de forma limpa a fluorescência de VIC do que a fluorescência de FAM em típicas reações de PCR. As informações de intensidade de pixel foram extraídas da imagem adquirida com o uso de software de análise de imagem ImageJ publicamente disponível (imageJ.nih.gov).

[00137] Quando completamente automatizado, com o uso do sistema de câmera acima, adquirir imagens de fluorescência e extrair intensidade de fluorescência dos pixels nas imagens demora apenas alguns segundos. Múltiplas modalidades de sistema para utilizar essa abordagem são viáveis. Um conjunto de poços de reação poderia ser movido de um local onde o aquecimento é realizado para uma câmara adjacente onde as câmeras podem medir a fluorescência. Alternativamente, a câmera de detecção de fluorescência (ou câmeras) pode ser posicionada próxima a uma câmera de imageamento de IR ou sensores de IR distintos no mesmo local onde os poços são aquecidos. Os LEDs de 1 W de 450 nm usados para atualmente fornecer energia de luz de aquecimento em sistemas de protótipos produzem uma saída espectral ampla e muito clara que inunda a detecção de fluorescência mesmo com os melhores filtros de bloqueio de emissão disponíveis. Portanto, nessas modalidades de dispositivo de protótipo, a luz de aquecimento não pode estar ligada enquanto são feitas medições de fluorescência. Isso resulta em mais alguns segundos de resfriamento adicional dos volumes de reação após cada termociclo durante medições de fluorescência antes de o próximo ciclo de aquecimento poder começar. Enquanto as temperaturas dos volumes de reação caem inicialmente muito rápido (geralmente 6 a 10 graus por segundo) da temperatura de desnaturação de 95 °C quando a luz de aquecimento é extinguida, a taxa de queda de temperatura é reduzida após os primeiros poucos segundos conforme a diferença entre a temperatura ambiente e a temperatura de reação diminui. Mesmo com tal atraso no início do próximo ciclo de aquecimento, o tempo adicional necessário para colocar o volume de reação de volta para a temperatura de recozimento desejada para iniciar o próximo ciclo é de apenas 1 ou 2 segundos em sistemas de protótipos com os volumes de reação especificados.

[00138] A presente divulgação é ilustrada pelos exemplos que se seguem. A descrição mencionada acima e a seguir e os exemplos não se destinam a limitar, mas, em vez disso, são ilustrativos das modalidades descritas. Por conseguinte, entende-se que a presente revelação não se limita aos detalhes específicos dos exemplos.

EXEMPLO 2 Detecção de Produto de PCR de reações de matriz oleosa aquosa mediada por Luz

[00139] Duas sondas TAQMAN® e pares de primers projetados de forma personalizada formando uma interrogação bialélica de loci- alvo de DNA foram testados com um ciclo de temperatura mediado por luz em uma matriz oleosa aquosa. As sondas e primers foram combinados com enzimas e reagentes de PCR TAQMAN® em poços vedados e foram testados através de tantos como 40 ciclos de temperatura de PCR em um termociclador de banho de água. Após o termociclo, os produtos de PCR foram, então, medidos em um leitor de fluorescência comercial em comprimentos de onda de emissão para os corantes de FAM e VIC que são associados às duas sondas para os alelos de lócus particulares. A fluorescência de FAM e/ou VIC elevada indica a presença de produtos de PCR amplificados para os alelos de DNA para os quais as sondas e primers foram projetados.

[00140] Para detecção de produtos de PCR mediada por luz em uma matriz oleosa aquosa, as amostras de DNA anteriormente extraídas foram adquiridas de um processo de produção de genotipagem de rotina. Essas amostras constituíam genótipos conhecidos. A amostra 1 era conhecida por produzir um produto de PCR para a sonda de FAM selecionada. A amostra 2 era conhecida por produzir um produto de PCR para a sonda de VIC selecionada. A amostra 3 era conhecida por produzir um produto de PCR para sondas de FAM e VIC para o lócus de DNA específico selecionado.

[00141] Uma placa de fundo plano límpida de 384 poços foi preparada com o fundo interno dos poços revestido com uma camada fina de tinta de emulsão de ouro. Um termopar de 0,005 polegadas foi inserido e posicionado no poço pintado de modo que a microesfera de termopar ficasse situada aproximadamente 0,5 mm acima da tinta de ouro. Reações de PCR de matriz oleosa aquosa foram montadas para cada uma das amostras e para um controle sem modelo (sem DNA adicionado à reação) nos poços preparados. Cada matriz oleosa aquosa era composta de 2 μl de uma mistura de reação PCR aquosa, idêntica em composição ao processo de genotipagem de produção, em 4 μl de um óleo de encapsulação de silicone em 4 μl de um óleo carreador de perfluorocarboneto.

[00142] Uma a uma, as reações de matriz oleosa aquosa na placa de 384 poços foram posicionadas em um diodo de laser de 405 nm de 200 mW focado para irradiar uma área da tinta de ouro de aproximadamente 1,5 mm de diâmetro. Um microcontrolador Arduino, como aqueles descritos elaboradamente na página da web da Arduino, e a fonte de alimentação regulada foram empregados para acionar a fonte de luz de modo que a luz pudesse ser piscada mais que 500 vezes por segundo com modulação de largura de pulso da potência dependente da temperatura captada pelo termopar no poço. O microcontrolador foi programado para fornecer dois segundos a uma temperatura alcançada de 62 °C, seguido de cinco segundos a uma temperatura alcançada de 72 °C, seguido de dois segundos a uma temperatura alcançada de 95 °C. O microcontrolador foi programado para repetir esse perfil de temperatura 40 vezes para realizar a amplificação de PCR. Os dados de perfil de temperatura dos dez primeiros ciclos de temperatura de PCR são fornecidos na Figura 12.

[00143] Antes e após o termociclo de PCR mediada por luz, a placa foi movida para um leitor de placa de fluorescência comercial onde a fluorescência de FAM e VIC foi medida para cada poço de reação. Foi observada fluorescência elevada para sondas de FAM e VIC para amostras conforme esperado. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 2: Tabela 2: Fluorescência relativa de amostras de genótipo conhecido antes e após 40 ciclos de PCR mediada por luz

NTC = sem controle de modelo

EXEMPLO 3 Extração de DNA por Choque Térmico

[00144] Uma exigência de um sistema de amplificação de PCR é uma fonte de amostras de DNA que pode ser incorporada às reações de PCR. Foi observado que quantidades suficientes de material orgânico contendo DNA pode ser encontrado sobre ou dentro de vários substratos que entraram em contato com várias plantas ou partes de planta. Líquido de bastonetes de algodão tirados de superfícies de planta, pequenos volumes de meio de cultura, ou líquidos enxaguados sobre várias partes de planta podem conter quantidades significativas de DNA. Tal material contendo DNA coletado fornece um meio de amostragem de DNA não destrutiva de plantas. O material contendo DNA "derramado" pode, às vezes, ser usado diretamente, sem purificação adicional, como uma fonte de DNA de PCR se for exposta a um "choque térmico" para liberar, libertar e/ou descompartimentalizar o DNA contido no líquido e/ou desnaturar ou destruir enzimas e outros materiais que são prejudiciais para a amplificação de PCR. Seja qual for o modo de ação exato, um único tratamento de aquecimento e resfriamento muito rápido pode tornar o DNA disponível e adequado para PCR. Dois ou mais ciclos de aquecimento e resfriamento rápidos potencialmente acentuariam esse efeito para algumas fontes de planta. Por meio de observação, um único volume de 3 microlitros de líquido aquoso de meio que circunda um embrião de planta ou tecido de planta cultivado pode conter DNA suficiente para muitas reações de PCR.

[00145] Em uma modalidade, o choque térmico é usado para obter DNA de material derramado em um aparelho da invenção com o uso da mesma fonte de calor usada em etapas subsequentes de amplificação de PCR conforme descrito acima. Em outra modalidade, uma posição ou local separado que emprega um aparelho de aquecimento fotônico é usado para rapidamente aquecer pequenas quantidades de líquido contendo esse material de planta derramado. Tão rápido quanto possível, elevar a temperatura do líquido da temperatura ambiente para 90 a 98 °C e imediatamente abaixar novamente para a temperatura ambiente fornece o choque térmico necessário. Esse processo pode ser adicionalmente melhorado em algumas modalidades reduzindo a temperatura do líquido para temperaturas abaixo de zero (-20 °C é frequentemente usado) por meio do uso de resfriamento de Peltier ou imersão em um banho frio antes do tratamento térmico. Esse processo pode ser adicionalmente melhorado por meio da incorporação de uma agitação ou vibração suave do líquido durante ou após o choque térmico. Essa agitação mistura o líquido uniformemente e/ou melhora a liberação do DNA. Tal aparelho de aquecimento (e resfriamento óptico) simplificaria a configuração de reações de PCR em dispositivos de mão ou portáteis e/ou poderia ser usado para acelerar um tratamento de choque térmico de uma única ou de múltiplas amostras de DNA enquanto também reduz os custos de energia.

[00146] Em outras modalidades, muitos outros processos de extração e purificação de DNA são possíveis para fornecer DNA para reações de PCR fotônica. Por exemplo, o DNA pode ser obtido incubando um material de planta com uma enzima; a enzima pode ser VISCOZYME® L, um complexo de múltiplas enzimas contendo uma ampla faixa de carboidrases, incluindo arabanase, celulase, β- glucanase, hemicelulase e xilanase. (Consulte o catálogo de produto da Sigma Aldrich). Uma vez que o material de planta é digerido pelas enzimas, um choque térmico poderia ser usado para preparar o DNA liberado para PCR. Alternativamente, o DNA pode ser obtido com o uso de técnicas de extração de DNA mais tradicionais, como, sem limitação, o uso de partículas magnéticas que se ligam a material genético ou qualquer método conhecido pelo versado na técnica.

Claims

1. Sistema de detecção de produto e amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) um subsistema de montagem que compreende: 1) uma pluralidade de vasos (101, 404); 11) um ou mais membros de dispensação de líquido (801, 802, 803, 804) configurados para montar uma coleção de matrizes oleosas aquosas, em que cada matriz oleosa aquosa compreende: 12) uma mistura de reação aquosa (104) que compreende um volume de amostra de polinucleotídeo e reagentes, os reagentes compreendendo um primeiro reagente que tem a capacidade de excitação por uma luz de excitação de fluorescência que tem um primeiro comprimento de onda espectral quando o primeiro reagente hibridiza à amostra de polinucleotídeo; e 13) um ou dois óleos não miscíveis selecionados do grupo que consiste em um óleo de encapsulação (103), um óleo carreador (102) e tanto um óleo de encapsulação (103) como um óleo carreador (102); em que componentes da mistura de reação aquosa (104) não se misturam com os um ou dois óleos não miscíveis; em que cada matriz oleosa aquosa é configurada para ser dispensada pelo um ou mais membros de dispensação de líquido em um vaso para amplificação de PCR e detecção de produto da pluraridade de vasos (101, 404); b) uma pluralidade de posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura e posições de detecção de produto de PCR definindo uma pluralidade de primeiras estações de vasos e segundas estações de vasos alternadas, em que a pluralidade de vasos (101, 404) pode ser posicionada, e em que cada uma das primeiras estações de vasos compreende uma das posições de aquecimento e uma das posições de monitoramento de temperatura, e cada uma das segundas estações de vasos compreende uma das posições de detecção de produto de PCR, ou cada uma das primeiras estações de vasos compreende uma das posições de aquecimento, e cada uma das segundas estações de vasos compreende uma das posições de detecção de produto de PCR e uma das posições de monitoramento de temperatura; c) um subsistema de aquecimento fotônico acionado por luz de reação em reação que compreende uma pluralidade de fontes de radiação eletromagnética (201, 309, 501, 602), em que, quando a pluralidade de vasos está nas posições de aquecimento, cada vaso está em comunicação óptica com uma fonte de radiação eletromagnética (201, 309, 501, 602) da pluralidade de fontes de radição eletromagnética, e a fonte de radiação eletromagnética (201, 309, 501, 602) emite radiação eletromagnética para esse vaso; d) um subsistema de monitoramento de temperatura de reação em reação que compreende uma pluralidade de dispositivos de detecção térmica (202, 307, 502, 704), em que, quando a pluralidade de vasos está nas posições de monitoramento de temperatura, cada vaso corresponde a um dispositivo de detecção térmica da pluralidade de dispositivos de detecção térmica (202, 307, 502, 704), e em que o dispositivo de detecção térmica (202, 307, 502, 704) é configurado para fornecer um sinal de medição dependente da temperatura da matriz oleosa aquosa contida no vaso; e) um subsistema de controle de fonte de luz e retroalimentação de temperatura de microcontrolador conectado de modo comunicativo tanto ao subsistema de aquecimento fotônico como ao subsistema de monitoramento de temperatura, em que o subsistema de controle de fonte de luz e retroalimentação de temperatura de microcontrolador é configurado para regular uma entrada de energia necessária para controle de uma saída e uma duração de uma energia eletromagnética emitida por cada fonte de radiação eletromagnética através de um ciclo de temperaturas de reação; f) um subsistema de detecção de fluorescência que compreende: i) uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência (705, 707); ii) um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência (706, 710); iii) uma pluralidade de primeiros membros ópticos (715, 716) em comunicação óptica com a uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência (705, 707), em que, quando os vasos estão na posição de detecção de produto de PCR, cada primeiro membro óptico (715, 716) é configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência que tem um primeiro comprimento de onda espectral da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência para um dos ditos vasos contendo a matriz oleosa aquosa, e em que cada primeiro membro óptico (715, 716) é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência (706, 710); e iv) um mecanismo de resfriamento ativo ou passivo (403) na posição de detecção de produto de PCR, em que cada um dos vasos na posição de detecção de produto de PCR é resfriado; g) um dispositivo de posicionamento; e h) um sistema de controle mecânico e eletrônico conectado de modo comunicativo ao dispositivo de posicionamento e ao subsistema de montagem, em que o sistema de controle mecânico e eletrônico é configurado para que o subsistema de montagem monte as matrizes oleosas aquosas na pluralidade de vasos, e em que o sistema de controle mecânico e eletrônico é configurado adicionalmente para que o dispositivo de posicionamento mova a pluralidade de vasos com a matriz oleosa aquosa do subsistema de montagem para cada uma das posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura e posições de detecção de produto de PCR.

2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma pluralidade de estações de vasos, em que as posições de aquecimento, posições de monitoramento de temperatura e posições de detecção de produto de PCR estão nas mesmas estações de vasos.

3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: i) o mecanismo de resfriamento ativo ou passivo é: (a) um dissipador de calor metálico passivo que compreende alumínio ou cobre; (b) correntes de ar de circulação ativa; (c) correntes de ar de circulação passiva; (d) um dispositivo de Peltier; (e) um líquido de circulação; ou (f) qualquer combinação de (a), (b), (c), (d) ou (e); ou ii) cada um da mistura de reação aquosa, óleo carreador e óleo de encapsulação é dispensado em cada um dos vasos, em que o óleo carreador é não miscível tanto com o óleo de encapsulação como com os componentes da mistura de reação aquosa, opcionalmente em que o óleo carreador tem uma densidade que varia de 1.200 kg/m3 a 2.000 kg/m3, o óleo de encapsulação tem uma densidade que varia de 700 kg/m3 a 990 kg/m3 e a mistura de reação aquosa tem uma densidade que varia de 900 kg/m 3 a 1.200 kg/m 3; ou iii) as fontes de radiação eletromagnética são selecionadas a partir do grupo que consiste em diodos de laser e diodos emissores de luz, opcionalmente em que as fontes de radiação eletromagnética são diodos de laser que emitem luz infravermelha tendo um comprimento de onda espectral na faixa de 1.300 nm a 2.200 nm, ou de preferência na faixa de 1.300 nm a 1.500 nm.

4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que cada fonte de radiação eletromagnética é configurada para uniformemente aquecer o volume da mistura de reação aquosa em cada vaso correspondente quando o vaso está na posição de aquecimento através do ciclo de temperaturas de reação que compreende: (i) uma temperatura de recozimento na faixa de 50 °C a 65 °C; (ii) uma temperatura de alongamento na faixa de 65 °C a 75 °C; e (iii) uma temperatura de desnaturação na faixa de 90 °C a 99 °C; e em que o mecanismo de resfriamento ativo ou passivo é configurado para resfriar cada um dos vasos para uma faixa de temperatura de 55 °C a 65 °C quando o vaso está na posição de detecção de produto de PCR.

5. Sistema, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume da mistura de reação aquosa é menor ou igual a 10 μl e em que a mistura de reação aquosa é aquecida através do ciclo de temperaturas (i), (ii) e (iii), em menos de ou em 20 segundos, em menos de ou em 15 segundos, ou em menos de ou em 10 segundos, opcionalmente em que o ciclo de temperaturas de reação em (i), (ii) e (iii) é repetido por mais 1 a 60 ciclos.

6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o subsistema de detecção de fluorescência compreende ainda: v) um primeiro filtro de excitação que recebe luz da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência e permite a passagem da luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral; vi) um primeiro filtro de emissão para permitir a transmissão através da luz de emissão de fluorescência para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa em resposta à luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral e para bloquear substancialmente a transmissão de comprimentos de onda além dos comprimentos de onda da luz emitida; ou vii) tanto v) como vi).

7. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que cada primeiro membro óptico é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência que tem um segundo comprimento de onda espectral da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência para um dos ditos vasos contendo a matriz oleosa aquosa quando o vaso está em uma posição de detecção de produto de PCR, em que o volume da mistura de reação aquosa compreende um segundo reagente que tem a capacidade de excitação pela luz de excitação de fluorescência que tem o segundo comprimento de onda espectral quando o segundo reagente hibridiza à amostra de DNA, e em que cada primeiro membro óptico é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência.

8. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o subsistema de detecção de fluorescência compreende ainda uma pluralidade de segundos membros ópticos em comunicação óptica com a uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência, em que cada segundo membro óptico é configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência que tem um segundo comprimento de onda espectral da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência para um dos ditos vasos contendo a matriz oleosa aquosa quando o vaso está em uma posição de detecção de produto de PCR, em que o volume da mistura de reação aquosa compreende um segundo reagente que tem a capacidade de excitação pela luz de excitação de fluorescência que tem o segundo comprimento de onda espectral quando o segundo reagente hibridiza à amostra de DNA, e em que cada segundo membro óptico é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência.

9. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência são uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD), câmera de semicondutor de óxido de metal complementar (CMOS), arranjo de sensor ou uma combinação dos mesmos.

10. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que cada primeiro membro óptico compreende uma ou mais fibras ópticas e um ou mais diodos emissores de luz.

11. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que cada primeiro membro óptico compreende uma ou mais fibras ópticas e um ou mais diodos emissores de luz, e em que cada segundo membro óptico compreende uma ou mais fibras ópticas e um ou mais diodos emissores de luz.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) o primeiro reagente, o segundo reagente, ou tanto o primeiro reagente como o segundo reagente, compreende uma sonda de ácido nucleico covalentemente ligada a um fluoróforo; ou b) o subsistema de detecção de fluorescência compreende ainda: v) um primeiro filtro de excitação que recebe luz da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência e permite a passagem da luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral; e vi) um segundo filtro de excitação que recebe luz da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência e permite a passagem da luz de excitação de fluorescência que tem o segundo comprimento de onda espectral, e em que o segundo comprimento de onda espectral é diferente do primeiro comprimento de onda espectral; e opcionalmente o subsistema de detecção de fluorescência compreende ainda: vii) um primeiro filtro de emissão para permitir a transmissão através do mesmo de luz de emissão de fluorescência para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa em resposta à luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral e para bloquear substancialmente a transmissão de comprimentos de onda além dos comprimentos de onda da luz emitida; e viii) um segundo filtro de emissão para permitir a transmissão através do mesmo de luz de emissão de fluorescência para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa em resposta à luz de excitação de fluorescência que tem o segundo comprimento de onda espectral e para bloquear substancialmente a transmissão de comprimentos de onda além dos comprimentos de onda da luz emitida; e opcionalmente em que o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência é uma câmera de CCD, câmera de CMOS, arranjo de sensor ou uma combinação dos mesmos.

13. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) o subsistema de monitoramento de temperatura compreende ainda um dispositivo de captação de infravermelho térmico em comunicação óptica com cada dispositivo de detecção térmica; b) cada dispositivo de detecção térmica fornece um sinal de medição dependente da intensidade de uma radiação infravermelha recebida de corpo negro; e c) cada dispositivo de detecção térmica é configurado para fornecer uma trajetória de radiação térmica do volume da mistura de reação aquosa para o dispositivo de captação de infravermelho térmico, opcionalmente em que: i) o dispositivo de captação de infravermelho térmico é um imageamento térmico ou um sensor de infravermelho, e em que a pluralidade de dispositivos de detecção térmica não entra em contato fisicamente com a matriz oleosa aquosa; ii) o dispositivo de posicionamento é uma correia que compreende a pluralidade de vasos, cada vaso compreendendo um lado superior e um lado inferior, em que cada dispositivo de detecção térmica corresponde ao lado inferior de um dos vasos quando o vaso está na posição de aquecimento, e em que cada fonte de radiação eletromagnética corresponde ao lado superior de um dos vasos quando o vaso está na posição de aquecimento, em que a emissão de radiação eletromagnética para cada vaso e a detecção de radiação infravermelha de corpo negro emitida do volume de cada mistura de reação aquosa ocorrem simultaneamente; ou iii) o dispositivo de posicionamento é uma correia que compreende a pluralidade de vasos, cada vaso compreendendo um lado superior e um lado inferior, em que cada dispositivo de detecção térmica corresponde ao lado superior de um dos vasos quando o vaso está na posição de aquecimento, e em que cada fonte de radiação eletromagnética corresponde ao lado inferior de um dos vasos quando o vaso está na posição de aquecimento, em que a emissão de radiação eletromagnética para cada vaso e a detecção da radiação infravermelha de corpo negro emitida do volume de cada mistura de reação aquosa ocorrem simultaneamente, opcionalmente, em que as fontes de radiação eletromagnética são diodos emissores de luz que tem um comprimento de onda espectral na faixa de 380 nm a 500 nm e os vasos compreendem ainda uma camada fina que compreende um metal de transição selecionado do grupo que consiste em ouro, prata, níquel e platina, de preferência em que o metal de transição é ouro.

14. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro reagente compreende uma sonda de ácido nucleico covalentemente ligada a um fluoróforo.

15. Método de detecção de produto e amplificação de PCR mediada por luz, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a) fornecer o sistema de detecção de produto e amplificação de PCR, conforme definido na reivindicação 1; b) montar uma coleção de matrizes oleosas aquosas por meio de: 1) aspiração do um ou mais óleos não miscíveis, em que a etapa de aspiração compreende: (i) aspirar o óleo de encapsulação de uma entrada de óleo de encapsulação; (ii) aspirar o óleo carreador de uma entrada de óleo carreador; ou (iii) aspirar o óleo de encapsulação de uma entrada de óleo de encapsulação e aspirar o óleo carreador de uma entrada de óleo carreador; 2) aspiração de um volume de amostra de polinucleotídeo de uma entrada de amostra de polinucleotídeo; 3) aspiração de um volume de reagentes de uma entrada de mistura de reagente de PCR; 4) dispensação do volume de amostra de polinucleotídeo, o volume de reagentes e o um ou mais óleos não miscíveis na pluralidade de vasos, em que o volume de amostra de polinucleotídeo e o volume de reagentes formam uma mistura de reação aquosa, e em que componentes da mistura de reação aquosa não se misturam com o um ou mais óleos não miscíveis; em que as etapas 1), 2) e 3) são realizadas em qualquer ordem ou simultaneamente, e em que as etapas 1), 2) e 3) são realizadas antes da etapa 4); c) aquecer uniformemente cada volume da matriz oleosa aquosa, em que o aquecimento compreende: 1) posicionar a fonte de radiação eletromagnética em comunicação óptica com cada vaso contendo a matriz oleosa aquosa; 2) aquecer o volume da matriz oleosa aquosa até alcançar uma temperatura na faixa de 50 °C a 65 °C; 3) aquecer adicionalmente o volume da matriz oleosa aquosa até alcançar uma temperatura na faixa de 65 °C a 75 °C; e 4) aquecer adicionalmente o volume da matriz oleosa aquosa até alcançar uma temperatura na faixa de 90 °C a 99 °C; d) resfriar cada matriz oleosa aquosa por meio do posicionamento de cada um dos vasos nas proximidades do mecanismo de resfriamento até que a matriz oleosa aquosa alcance uma temperatura na faixa de 55 °C a 65 °C. e) medir a emissão de fluorescência de cada vaso contendo a matriz oleosa aquosa, em que a medição compreende: 1) posicionar um primeiro membro óptico em comunicação óptica com cada vaso contendo a matriz oleosa aquosa, em que cada primeiro membro óptico é configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de excitação de fluorescência que tem um primeiro comprimento de onda espectral da uma ou mais fontes de luz de excitação de fluorescência para um dos ditos vasos contendo a matriz oleosa aquosa quando o vaso está em uma posição de detecção de produto de PCR, em que o volume da mistura de reação aquosa compreende um primeiro reagente que tem a capacidade de excitação pela luz de excitação de fluorescência que tem o primeiro comprimento de onda espectral quando o primeiro reagente hibridiza à amostra de polinucleotídeo, e em que cada primeiro membro óptico é adicionalmente configurado para fornecer uma trajetória óptica para luz de emissão de fluorescência da mistura de reação aquosa para o um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência; e 2) medir o sinal produzido pelo um ou mais dispositivos de captação de luz de emissão de fluorescência de pelo menos uma mistura de reação aquosa; e f) repetir c) a e) por um número predeterminado de ciclos adicionais.