WO2010113990A1 - 液体還流型高速遺伝子増幅装置 - Google Patents
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- the present invention relates to a genetic analysis apparatus using a reaction vessel suitable for conducting a rapid genetic analysis research or clinical practice in basic life science, medical basic research and medical practice, for example, animals such as humans.
- the present invention relates to gene analysis that handles a reaction apparatus for detecting a specific base sequence at high speed from nucleic acid base sequences such as genomic DNA of plants and messenger RNA.
- PCR Polymerase chain reaction
- Thermal cycling is performed by raising and lowering the temperature of the reaction vessel used for the DNA amplification reaction.
- the temperature of the reaction vessel containing the sample is changed by a heater or Peltier element, heat exchange using hot air, and the reaction vessel is changed to a heater block or liquid bath at different temperatures.
- Roche Light Cycler introduces a sample, a DNA polymerase, a DNA piece serving as a primer, and a fluorescent labeling dye for measurement into each of a plurality of glass capillary tubes.
- the temperature of the minute droplet in the capillary tube is changed by blowing hot air having the same temperature as the temperature of the droplet to be changed, for example, two temperatures of 55 ° C. and 95 ° C., and at the same time, the glass capillary tube It has a mechanism for irradiating the fluorescent light with excitation light of a fluorescent dye and measuring the obtained fluorescence intensity. By these methods, it is possible to repeatedly change the temperature of the sample.
- Patent Document 1 a fluid collision thermal cycler device that controls the sample temperature by colliding a fluid jet against the outer wall of the sample-containing region has been reported (Special Table 2001-519224 (Patent Document 1)).
- the temperature speed of the heater or Peltier element is as low as several degrees C per second, and it is difficult to change the temperature without over-surreal temperature. Basically, if heat conduction in a solid is used, a thermal gradient is formed between the heat source and the surface, and strict control is impossible. Further, heat is taken away at the moment when the sample touches the heater or Peltier element, and a delay occurs until the surface temperature returns to the predetermined temperature. When the reaction tank is brought into contact with a different heater or liquid bath, the movement mechanism is complicated, or the temperature control of the heater or liquid bath is difficult. Furthermore, in the method of flowing a sample through channels having different temperature regions, there is a problem that the surface temperature of the channel itself changes as the sample moves, making temperature control difficult. In addition, when changing the temperature by blowing warm air, it is necessary to blow a large amount of air because the heat capacity of air is small. It is difficult to strictly control the typical blowing temperature in units of 1 ° C.
- an object of the present invention is to provide a reaction control apparatus capable of performing accurate temperature control, temperature measurement, and rapid temperature increase / decrease. More specifically, the present invention can perform accurate temperature control, temperature measurement and rapid temperature increase / decrease, thereby enabling high speed, high accuracy and high amplification rate PCR reaction. An object is to provide a DNA amplification device.
- the reaction control device of the present invention uses, as a heat exchange medium, a liquid having a large heat capacity that maintains each temperature for a plurality of temperatures that are desired to be changed.
- the means for changing a plurality of liquids having different heat capacities at a high speed and a microreaction tank in which heat exchange between the liquid having a large heat capacity and the sample liquid is performed quickly are used.
- a minute reaction tank composed of a structure and material suitable for heat exchange
- a heat exchange tank that circulates liquid at a temperature suitable for each reaction outside the minute reaction tank, and the temperature of the liquid with high accuracy.
- a plurality of liquid reservoir tanks including a heat source to be maintained, a switching valve system for guiding liquid from an arbitrary liquid reservoir tank to the outside of the reaction tank in order to rapidly change the temperature of the micro reaction tank, and switching of the valve system And a mixing prevention mechanism for liquids having different temperatures.
- the present invention provides the following liquid reflux reaction control device.
- a reaction vessel having one or more wells for containing a sample;
- a heat exchange tank that is provided in contact with the reaction tank so as to conduct heat to the reaction tank, and has an inlet and an outlet for introducing and discharging a liquid at a predetermined temperature, and
- a plurality of liquid reservoir tanks each having a temperature-controllable heat source for keeping the liquid at a predetermined temperature;
- a tubular flow path connecting the inlet and outlet of the heat exchange tank and the liquid reservoir tank;
- a pump installed on the tubular flow channel for circulating the liquid between the heat exchange tank and the liquid reservoir tank;
- a switching valve installed on the tubular flow channel for controlling the flow of the circulating liquid, the flow of the liquid having a predetermined temperature from the plurality of liquid reservoir tanks into the heat exchange tank
- a switching valve for controlling the temperature of the reaction vessel to a desired temperature by switching at a predetermined time interval;
- the liquid reflux reaction control device according to (1) which is used as a PCR device.
- a fluorescent dye is contained in the sample, the fluorescence emitted from the fluorescent dye in the well is detected in conjunction with the temperature switching of the reaction vessel, and the change in fluorescence intensity over time is measured.
- the liquid reflux reaction control device according to (1) or (2) comprising a fluorescence detection means for the above.
- the liquid reflux reaction control device according to (3) wherein the fluorescence detection means is provided corresponding to each of the wells of the reaction tank.
- the liquid reflux reaction control device means for estimating a temperature change of the sample solution from a change in fluorescence intensity of the sample solution arranged in one or a plurality of wells of the reaction vessel; Means for rapidly changing the temperature of the reactor based on the results;
- the liquid reflux reaction control device further comprising: (6) The liquid reflux reaction control device according to any one of (1) to (5), wherein the number of liquid reservoir tanks is the same as the number of temperatures desired to be set in the reaction tank. (7) The liquid reflux reaction control device according to (6), wherein the number of the liquid reservoir tanks is 2 or 3.
- the bottom and wall surfaces of the reaction vessel are formed of aluminum, nickel, magnesium, titanium, platinum, gold, silver, copper-containing metal, or silicon having a thickness of 1 to 100 microns, or (1 )
- the liquid reflux reaction control device according to any one of the above.
- the liquid reflux reaction control apparatus according to any one of (1) to (8), wherein the shape of the bottom surface of the well is a flat bottom, a hemisphere, a triangular pyramid, or a sphere.
- any of the above (1) to (9), wherein each of the wells contains a reagent necessary for the reaction in a dry state in advance, and can be reacted by elution by contact with the sample solution.
- a liquid reflux reaction control device according to claim 1.
- the liquid reflux type according to any one of (1) to (10), wherein the reaction vessel further includes a hole or an optical window that facilitates measurement of an optical signal from the sample in the reaction vessel. Reaction control device.
- a method for attaching and detaching the reaction tank to the heat exchange tank is as follows: (A) A cylindrical frame is provided on the outer periphery of the reaction tank, a cylindrical reaction tank receiving port is provided in the heat exchange tank, and the outer surface of the frame of the reaction tank and the reaction tank receiving port of the heat exchange tank A system in which a screw thread is provided on the surface, and the reaction tank is detachably attached to the heat exchange tank by rotational movement along the screw thread, (B) The cylindrical frame on the outer periphery of the reaction tank and the cylindrical reaction tank receiving port of the heat exchange tank are respectively tapered, and the reaction tank is detachably pressure-bonded to the reaction tank receiving port.
- the liquid reflux reaction control device according to (12) or (13), comprising: (15)
- the liquid reservoir tank includes a heat source, a thermometer, and a liquid stirring system, and the liquid stirring system stirs the liquid in the liquid reservoir tank continuously or at a duty cycle ratio of 10% or more.
- the liquid reflux reaction control device according to any one of (1) to (14) above, further comprising a heat source control system capable of suppressing the temperature distribution of the liquid in the liquid reservoir tank to within 5 ° C.
- the liquid reflux reaction control device according to any one of (1) to (15), further including a switching valve control mechanism for controlling the operation of the switching valve.
- the switching valve can guide the liquid in any liquid reservoir tank among the plurality of liquid reservoir tanks to the heat exchange tank, and the liquid in the heat exchange tank is returned to the original liquid reservoir tank.
- the liquid reflux type reaction control system according to any one of the above (1) to (16), which can be returned.
- the liquid in the heat exchange tank is guided to a liquid reservoir tank that is held at a temperature closest to the temperature.
- the liquid reflux reaction control device according to (16) or (17), wherein the switching valve is controlled.
- An auxiliary temperature control mechanism further including a heat insulating material, a heater, and a cooling mechanism, the auxiliary temperature control mechanism for suppressing fluctuations in the temperature of the liquid inside the flow path connecting the switching valve and the liquid reservoir tank.
- the liquid reflux type reaction control device according to any one of (1) to (18), comprising a temperature control mechanism.
- the liquid from the liquid reservoir tank is continuous with the liquid from the liquid reservoir tank regardless of whether or not the liquid inside the flow path connecting the switching valve and the liquid reservoir tank is guided to the heat exchange tank.
- the liquid reflux type reaction control device according to any one of (1) to (19), wherein the switching valve is provided with a mechanism for suppressing a change in temperature by being replaced with.
- the switching valve is composed of a piston that slides in a hollow structure having a circular or polygonal cross section, and controls the temperature of the liquid in contact with the reaction vessel according to the position of the piston.
- the liquid reflux reaction control apparatus according to any one of (20).
- the piston is (A) mechanically applying an external force to the piston rod connected to the piston, (B) by using a piston that is a magnetic body or a piston in which the magnetic body is mounted, by interaction between the piston and a magnetic field generation mechanism that includes an electromagnetic coil disposed outside the switching valve, or (C) By creating a pressure difference due to the flow of the circulating liquid at both ends of the piston, The liquid reflux reaction control device according to (21), which slides.
- a cylindrical, disc-shaped, and conical rotator that has a plurality of grooves on the outer surface that serve as a flow path for the liquid sent from the liquid reservoir tank, and is connected to each of the grooves so that fluid communication is possible.
- the rotating body in which the tunnel-shaped flow path is formed is rotatably inserted into the heat exchange tank, The ends of the tunnel-shaped flow path function as inlets or outlets of the switching valve, respectively.
- the liquid reflux reaction control device according to (1), further including a sample evaporation prevention mechanism including a heating mechanism for heating the optically transparent portion of the member.
- the liquid reflux reaction control device wherein the distance between the optically transparent portion of the member and the surface of the reaction vessel having the well is 3 mm or less.
- the liquid reflux reaction control apparatus according to (27), wherein the temperature of the optically transparent portion of the member heated by the heating mechanism is in the range of 80 ° C. to 110 ° C.
- Advantages of the present invention in which the temperature of the reaction vessel is controlled by the refluxing liquid include the following.
- the temperature overshoot problem can be solved. That is, since the temperature of the liquid that is constantly refluxing is substantially constant, the temperature of the reaction vessel surface and the temperature of the liquid can be equilibrated almost instantaneously.
- the heat capacity of the reaction vessel and the sample is insignificant compared to the refluxing liquid, and the liquid flows continuously even if heat is locally deprived from the liquid. Therefore, basically no thermal gradient is generated.
- the temperature of the reaction vessel does not exceed the temperature of the liquid. According to the exemplary embodiment of the present invention, it is possible to change the temperature by 30 ° C.
- the present invention since the time required for temperature change can be extremely shortened, for example, the total time for performing the PCR reaction can be remarkably shortened compared with the conventional apparatus.
- the liquid kept at a constant temperature is brought into contact with the outside of the reaction tank having excellent thermal conductivity, and the liquid at a different temperature is quickly replaced with a liquid at a higher temperature. It is possible to control with accuracy and to quickly raise and lower the temperature. According to the present invention, a PCR reaction with high speed, high accuracy, and high amplification rate can be performed.
- the present invention is advantageous in a PCR reaction using a very small amount of sample because evaporation of the sample solution due to heating of the sample solution can be prevented.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of an embodiment of the reaction control device of the present invention.
- the reaction control device of the present invention typically comprises a reaction vessel 1, a reaction vessel frame 2, a heat exchange vessel 3, a liquid reservoir tank 4, a heat source 5, and agitation.
- a mechanism 6, a pump 7, a switching valve 8, a bypass flow path 9, and an auxiliary temperature control mechanism 10 are provided.
- it further includes a fluorescence detector 201, a control analysis unit 202 for sending a control signal 203, and an optical window (or hole) 204.
- the reaction vessel 1 can typically be composed of a metal such as aluminum, nickel, magnesium, titanium, platinum, gold, silver, and copper having a plurality of depressions (wells), or a thin plate such as silicon.
- a metal such as aluminum, nickel, magnesium, titanium, platinum, gold, silver, and copper having a plurality of depressions (wells)
- a thin plate such as silicon.
- the material is not limited to these materials as long as it has high thermal conductivity and does not interfere with PCR.
- the surface of the metal thin film may be coated with a hydrophilic material such as plastic and which prevents corrosion of the metal.
- the thickness of the thin plate in the indented region is preferably configured to be thinner than the surroundings in order to enhance thermal conductivity, and is typically about 10 to 30 microns thick, but is not limited thereto.
- the area between adjacent depressions is preferably thicker to ensure overall strength, and typically has a thickness in the range of 100 microns to 500 microns, but is not so limited.
- the reaction tank 1 is typically formed integrally with the bottom of the reaction tank frame 2 having a shape such as a square or a circle.
- the reaction tank 1 and the reaction tank frame 2 are typically configured to be detachable from the heat exchange tank 3 (see FIG. 4).
- the heat exchange tank 3 is used by introducing a heat exchange liquid.
- the temperature of the introduced liquid is controlled by a heat source 5 arranged inside the liquid reservoir tank 4.
- a stirring mechanism 6 is preferably provided.
- the liquid in the liquid reservoir tank 4 is guided into the flow path by the pump 7.
- the liquid is guided to the heat exchange tank 3 by the switching valve 8 or directly returned to the liquid reservoir tank 4 by being guided to the bypass channel 9. If necessary, the temperature of the liquid is delicately controlled by the auxiliary temperature control mechanism 10 to suppress temperature fluctuations in the liquid reservoir tank 4.
- the liquid introduced into the heat exchange tank 3 may be water, but is not limited to this, and any liquid may be used as long as it has a large heat capacity and low viscosity (eg, liquid ammonia). it can.
- any liquid eg, liquid ammonia
- the sample liquid can be surely brought to 100 ° C., or by using a liquid having a freezing point lower than that of water, while preventing the coagulation of the liquid circulating in the apparatus. It is also possible to reliably change the temperature up to the freezing point of water.
- the reaction vessel frame 2 is provided with a change in the fluorescence intensity of the fluorescent dye in the sample solution that changes due to the reaction of the sample solution in the reaction vessel 1, in one or more reaction vessels.
- An optical window 204 that transmits the excitation light of the fluorescent dye as well as the fluorescence is disposed so that each of the optical windows can be measured.
- the time change of the fluorescence intensity of each measured reaction tank 1 can be measured by arrange
- an excitation light irradiation mechanism and a fluorescence detection mechanism are provided in each of the plurality of fluorescence detectors 201.
- the different PCR amplification information of each of the plurality of reaction vessels 1 to which the liquid has been dropped can be independently measured.
- the fluorescence intensity data acquired by the fluorescence detector 201 is recorded by the control analysis unit 202 and has a function of estimating the amount of DNA or mRNA in the sample solution obtained by the PCR reaction.
- the control analysis unit 202 obtains switching information of the switching valve 8 to estimate whether or not the temperature change of the sample liquid after the valve switching has reached a target temperature from the change in fluorescence intensity over time, and It also has a mechanism for controlling valve switching based on the result.
- FIG. 1 a configuration is shown in which one detector is arranged in each reaction tank 1, but a plurality of light sources for fluorescence excitation such as a fluorescence excitation light source and a cooled CCD camera can be combined. You may measure the fluorescence intensity change of the reaction tank 1.
- the volume of the sample solution is usually several ⁇ L or less per well, but a range of 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L per well can be used, preferably 0.5 ⁇ L to 10 ⁇ L per well, More preferably, it is 1 ⁇ L to 10 ⁇ L per well, even more preferably 1 ⁇ L to 5 ⁇ L per well, and most preferably 1 ⁇ L to 2 ⁇ L per well.
- the well may contain mineral oil or the like for preventing evaporation of the sample solution.
- the volume of the mineral oil is preferably about several ⁇ L (eg, 3 to 4 ⁇ L), but is not limited to this, and it will be apparent to those skilled in the art that it can be appropriately changed depending on the size of the well and the sample amount.
- FIG. 2 is a schematic view of the heat exchange tank 3 used in the reaction control device of the present invention.
- the heat exchange tank 3 includes an inlet A (11) and an inlet B (12) for introducing liquids having different temperatures as a basic configuration. Further, the heat exchange tank 3 includes a plurality of outlets, outlet A (13) and outlet B (14) for returning the liquid in the heat exchange tank 3 to the liquid reservoir tank 4.
- 2A shows a state in which a liquid at a certain temperature from the liquid reservoir tank 4 is introduced from the inlet A (11) and discharged from the outlet A (13), and
- FIG. 2B shows a liquid at a different temperature from the liquid reservoir tank 4.
- the number of inlets is not limited to two, and a plurality of inlets corresponding to a plurality of temperatures for which the temperature of the sample liquid is desired to be changed can be prepared. For example, when a three-temperature system is desired, the number of inlets is three.
- the number of outlets is not limited to 2 as in the case of the inlets. Note that the arrows in FIG. 2 roughly indicate the direction in which the liquid introduced into or discharged from the heat exchange tank 3 flows.
- the total volume of the liquid circulated between the heat exchange tank 3 and the liquid reservoir tank 4 is usually several tens mL or more, preferably 100 mL or more in consideration of the heat capacity and temperature stability of the liquid. Preferably, it is 200 mL or more, and most preferably 300 mL or more.
- the upper limit of the volume can be appropriately set in consideration of the portability of the apparatus.
- the capacity of the heat exchange tank 3 is preferably about 10 times or more the sample amount per well, more preferably about 100 times or more, and most preferably about 1000 times or more.
- the capacity of the heat exchange bath is about 0.01 mL to 10 mL per well, more preferably about 0.05 mL to 5 mL, and most preferably about 0.1 mL to 2 mL. is there.
- FIG. 3 is a schematic diagram showing the form of the reaction tank used in the reaction control apparatus of the present invention and the method for dissolving the lyophilized reagent.
- Various shapes of reaction tanks or wells can be used, and FIG. 3A shows, as an example, a reaction tank A (21) in which the surface in contact with the liquid of the heat exchange tank is a hemispherical reaction tank B. (22), reaction tank C (23) having a triangular pyramid shape and reaction tank D (24) having a spherical shape are shown.
- reaction tank A (21) in which the surface in contact with the liquid of the heat exchange tank is a hemispherical reaction tank B.
- reaction tank C (23) having a triangular pyramid shape
- reaction tank D (24) having a spherical shape are shown.
- the efficiency of heat conduction those skilled in the art can easily understand that the larger the area of the surface in contact with the liquid in the heat exchange tank, the better the efficiency.
- a freeze-dried reagent 25 it is possible to prepare a freeze-dried reagent 25 at the bottom of the reaction vessel 26.
- the reagent can be dissolved in the sample by moving the sample liquid 28 up and down. Is possible.
- the freeze-dried reagent 25 can be dissolved by forming the freeze-dried reagent 25 on the surface of the fiber ball 29 in which nylon fibers or the like are bundled and inserting the sample into the sample 28 inside the reaction vessel 26 and stirring. It is.
- FIG. 4 is a schematic diagram showing a cylindrical reaction frame 32 used in the reaction control device of the present invention and a method for attaching it to the heat exchange tank 37. Since it is inconvenient to directly handle a reaction tank composed of a thin film, it is convenient to fix the reaction tank 31 to a reaction tank frame 32 as shown in FIG. 4A.
- the reaction vessel frame 32 is preferably formed of a heat insulating material such as polystyrene, polycarbonate, PEEK, acrylic or the like. In addition, it is desirable for rapid and highly accurate temperature increase / decrease of the reaction tank 31 to suppress the coupling area with the reaction tank 31 as small as possible (for example, 5 mm 2 or less).
- FIG. 4B shows an embodiment in which the reaction tank 31 is attached to the heat exchange tank 37.
- a thread 34 is formed on the surface of the reaction tank frame 32, and the reaction tank frame 32 is connected to the reaction tank receiving port 33 of the heat exchange tank 37.
- the method of screwing is shown.
- FIG. 4B it is desirable to attach a seal 35 to the opening in order to maintain watertightness.
- FIG. 4C shows yet another mounting method. As shown in FIG. 4C, it is also possible to employ a tapered reaction vessel frame 36 and attach it to the heat exchange vessel 38 only by pressure.
- FIG. 5 shows a specific example of a valve switching mechanism used in the reaction control device of the present invention.
- An inlet valve A (41) and an inlet valve B (43) for introducing a liquid into the reaction tank, an outlet valve A (42) and an outlet valve B (44) for introducing the liquid to the outside are shown.
- the liquid guided from the inlet valve A (41) returns from the outlet valve A (42) to the liquid reservoir tank 4, and the liquid guided from the inlet valve A (43) flows from the outlet bawl B (44) to another liquid reservoir tank 4. Return.
- the sample in the reaction vessel can be reacted.
- the inlet valve B (43) and the outlet valve A (42) or the inlet valve A (41) and the outlet valve B (44) are simultaneously opened for a moment. By doing so, it is possible to suppress mixing of liquids having different temperatures, and the temperature control of the liquid reservoir tanks of the respective systems becomes easy.
- the circulation rate of the liquid is not particularly limited, but is usually about 1 mL / second to 100 mL / second, more preferably 5 mL / second to 50 mL / second, and most preferably 7 mL / second to 15 mL / second. .
- FIG. 6A shows a graph obtained from data related to temperature control realized by using the above mechanism. As shown in FIG. 6A, the temperature can be raised from 60 ° C. to 92 ° C. and returned to 60 ° C. in a short time such as 1.5 seconds.
- FIG. 6B is a graph showing the results of real-time PCR.
- the solution conditions for performing PCR are as follows.
- Reaction buffer 1.0 ⁇ L, 2mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 ⁇ L, 25 M magnesium sulfate 1.2 ⁇ L, 10% fetal bovine serum 0.125 ⁇ L, SYBR Green I 0.5 ⁇ L, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sterile water 3.725 ⁇ L , KOD plus polymerase 0.25 ⁇ L, genomic DNA 1.0 ⁇ L.
- As temperature conditions first, 95 ° C. for 10 seconds, and then, 40 cycles of 95 ° C. for 1 second and 60 ° C. for 3 seconds were performed. The circulation rate of the liquid was about 10 mL / second.
- FIG. 7 shows a variation relating to a method for desorbing the reaction vessel 59 and the reaction vessel frame 51 used in the reaction control device of the present invention from the heat exchange vessel.
- the reaction tank 59 is stretched and attached to the slide glass type reaction tank frame 51 (FIG. 7A).
- the reaction vessel frame 51 can be slid sideways along the guide rail 53 and pressed against the seal 54 to be fixed (FIG. 7B).
- FIG. 8 is a schematic diagram showing a variation of the valve switching mechanism used in the reaction control device of the present invention, and shows a drive mechanism of a slide type piston valve different from that shown in FIG.
- a piston 65 that can slide to the left and right is used as a valve mechanism that changes the temperature of the reaction vessel 66.
- liquid is introduced from the inlet A (61) into the heat exchange tank 67, and is led to the outside from the outlet A (62).
- liquid is introduced from the inlet B (63) into the heat exchange tank 67, and is guided to the outside from the outlet B (64).
- the reaction tank 66 reaches equilibrium with the temperature of the liquid introduced from the inlet A (61). Conversely, when the piston 65 slides to the left, the reaction tank 66 is introduced from the inlet B (63). It reaches equilibrium with the temperature of the liquid. Moreover, when the piston 65 is located directly under the reaction tank 66, the reaction tank 66 can be removed without liquid leaking. It is desirable that the piston 65 is made of a material excellent in heat insulation, or is hollow and filled with gas, or is in a vacuum state. Note that the arrows in FIG. 8 roughly indicate the direction of liquid flow.
- FIG. 9 shows several variations of the piston drive mechanism of the piston valve used in the reaction control device of the present invention.
- the piston 71 is integrated with the piston rod 72 and is directly moved from the outside (FIG. 9A).
- the piston 73 is made of a ferromagnetic material such as iron or nickel, or a magnet 74 is incorporated in a piston made of another material.
- An electromagnetic coil 75 is installed outside and the current is controlled to slide the piston 73 left and right (FIG. 9B).
- FIG. 9C shows several variations of the piston drive mechanism of the piston valve used in the reaction control device of the present invention.
- the piston 71 is integrated with the piston rod 72 and is directly moved from the outside (FIG. 9A).
- the piston 73 is made of a ferromagnetic material such as iron or nickel, or a magnet 74 is incorporated in a piston made of another material.
- An electromagnetic coil 75 is installed outside and the current is controlled to slide the piston 73 left and right (FIG. 9B).
- FIG. 10 shows another embodiment of a valve switching mechanism used in the reaction control device of the present invention.
- a rotary valve 81 made of an inclined elliptical plate to which a rod 82 as a rotary shaft is coupled is inserted into a heat exchange tank 83 having a circular cross section.
- the rotary valve 81 divides the heat exchange tank 83 into left and right, and the liquid introduced from the right or left of the heat exchange tank can be guided to the reaction tank 84 by turning the rotary shaft 82.
- the shape of the rotary valve 81 in FIG. 10 is an inclined flat plate, but other shapes such as a spiral screw are also possible, and any shape that produces a similar effect by rotating the rotating shaft may be used.
- the black arrow in FIG. 10 shows the rotation direction of the rotating shaft 82, and the outline arrow roughly shows a mode that the liquid flows.
- FIG. 11 shows a structure in which the liquid is replaced by a structure other than the valve.
- the heat exchange tank 98 is partitioned by a membrane A (95) and a membrane B (96).
- the liquid introduced from the inlet A (91) is led to the outside by the outlet A (92). Since the membrane exists, it is not derived from the inlet B (93) or the outlet B (94) (FIG. 11A).
- the pressure of the liquid introduced from the inlet A (91) exceeds the pressure of the liquid introduced from the inlet B (93), by pushing the membrane A (95) and the membrane B (96) to the left side, The heat of the liquid introduced from the inlet A (91) is transmitted to the reaction tank 97 (FIG. 11B).
- the membrane is desirably made of a thin film having excellent heat resistance such as heat resistant rubber. Note that the arrows in FIG. 11 roughly indicate the direction of liquid flow.
- FIG. 12 is a schematic diagram showing still another drive mechanism of the temperature setting type valve used in the reaction control device of the present invention.
- the temperatures that can be set are not limited to two.
- FIG. 12 shows a structure in which three or more reaction vessel temperatures can be set.
- a rotary valve 101 having a groove 102 formed on the side surface is inserted into the heat exchange tank 103.
- An inlet and an outlet are provided on both sides of the rotary valve 101.
- the liquid introduced from the inlet A (104) flows into the groove 102 through the flow path 108 and transfers heat to the reaction tank 109 before the outlet A. Guided out from (105).
- the liquid introduced from the inlet B (106) is led out from the outlet B (107) without contacting the reaction tank 109.
- the rotary valve 101 is preferably made of a heat insulating material.
- FIG. 13 is a schematic diagram showing an example of the configuration of a heat exchange tank used in the reaction control device of the present invention.
- the upper panel A is a side view and the lower panel B is a top view.
- reaction vessel 1 includes a plurality of concave depressions 306 arranged in an array for containing a sample.
- a heat exchange tank 3 is disposed in contact with the lower part of the reaction tank 1 via an O-ring 305, and the temperature of the reaction tank 1 is determined by the heat exchange liquid introduced into the heat exchange tank 3 from the inlet A11 and the inlet A12. Is adjusted.
- An evaporation prevention mechanism 301 is disposed in close contact with the upper portion of the reaction tank 1. The evaporation preventing mechanism 301 can prevent the sample liquid from being heated and evaporated by the heat from the heat exchange tank 1 and dissipated.
- the evaporation prevention mechanism 301 typically includes a contact member 302, an optically transparent member (eg, a glass heater) 303, and a polymer sheet 304 as necessary.
- the polymer sheet 304 can enhance the adhesion between the adhesion member 302 and the reaction tank 1.
- the sample solution contained in the depression 306 passes through the optically transparent member 303, and the fluorescence detector 202 whose operation is controlled by the control analysis unit 201 detects the change in the fluorescence intensity of the sample.
- the PCR reaction can be performed by repeating temperature changes at high speed of droplets of the reaction liquid of 1 to 10 microliters of the liquid amount placed in each of the depressions 306.
- the reaction vessel 1 in which the droplets of the PCR solution are set is disposed so as to be in close contact with the heat exchange vessel 3 via the O-ring 305.
- the heat exchange tank 3 is connected to a plurality of inlets for heat exchange liquid, and two or more heat exchange liquids having different temperatures are injected from the inlet.
- the inlet A11 and the inlet B12 are shown as an example of heat exchange at two temperatures.
- the number of inlets is not limited to this, and if necessary, three are similarly used. In order to achieve the above different temperatures in the reaction vessel 1, three or more inlets can be configured.
- the optically transparent member 303 on the upper surface of the evaporation preventing mechanism 301 is optically connected to the outside by an optical device such as the fluorescence detector 101 to change the fluorescence intensity of the droplet of the reaction liquid in the recess 306 of the reaction tank 1. It may be made of a transparent material that optically transmits light, such as glass or plastic, so that the indicator can be observed. Further, the optically transparent member 303 is optically capable of raising the temperature by passing a current such as ITO (Indium Tin Oxide) on the surface of the optically transparent material. A glass heater in which a heat generating portion made of a transparent material is added and the optically transparent glass and the heat generating portion are integrated may be used. By heating the upper surface of the evaporation preventing mechanism using such a glass heater, it is possible to prevent evaporation of the PCR solution droplets in the reaction tank 1.
- an optical device such as the fluorescence detector 101 to change the fluorescence intensity of the droplet of the reaction liquid in the recess 30
- one exemplary embodiment of the evaporation prevention mechanism 301 is a glass heater 303 in which an optically transparent glass and a heat generation mechanism are integrated, a sealing member 302, and a high pressure for closely contacting the reaction tank 1 and the sealing member 302. It consists of a molecular sheet 304.
- the saturated vapor pressure is immediately obtained in the space between the reaction tank 1 and the evaporation prevention mechanism 301.
- the saturated vapor pressure is reached, for example, the temperature of the glass heater 303 in contact with the outside air is heated in the range of 80 ° C. to 110 ° C.
- the glass surface heated by the glass heater 303 has an effect of preventing fogging and has an advantage that the fluorescence amount detection of the reaction solution in the fluorescence detector 101 is not hindered.
- the sealing performance of the sealing member 301 can be enhanced by the polymer sheet 304 or the like.
- Polymer sheets that can be used include, but are not limited to, rubber, silicon, and the like.
- the glass heater 303 since reducing the volume of the space between the evaporation prevention mechanism and the reaction tank 1 makes it possible to suppress the total amount of water vapor that has reached the saturated water vapor pressure to a smaller amount, the glass heater 303, It is advantageous to make the distance from the surface of the reaction vessel 1 as small as possible.
- the distance between the glass heater 303 and the surface of the reaction vessel 1 is preferably about 10 mm or less, more preferably about 7 mm or less, still more preferably about 5 mm or less, and about 3 mm or less. Is most preferred.
- the glass heater 303 is used as an example of the heating mechanism on the upper surface of the evaporation preventing mechanism 301.
- a metal plate having a heating mechanism or a heat conduction system is connected to the fluorescence detector 101 from the fluorescence detector 101.
- a glass heater 303 may be used instead of the glass heater 303 in which an optically transparent window capable of detecting the fluorescence of the droplet is arranged. Further, when the evaporation preventing mechanism is used, even a very small amount of droplets can be prevented from evaporating. Therefore, it is not necessary to arrange a liquid layer such as mineral oil on the droplets.
- the present invention is useful as a reaction apparatus for performing a reaction required to strictly control the temperature of a sample.
- the present invention is also useful as a reaction apparatus for carrying out a reaction required to rapidly change the temperature of a sample.
- the present invention is particularly useful as a PCR apparatus capable of performing a PCR reaction with high speed, high accuracy, and high amplification rate. Since the apparatus of the present invention can be miniaturized, it is useful as a portable PCR apparatus.
- the present invention can prevent evaporation of the sample liquid due to heating of the sample solution, and thus is useful in a PCR reaction using a very small amount of sample.
Abstract
本発明は、サンプルを容れるための１または複数のウェルを有する反応槽と、前記反応槽に熱を伝導しうるように該反応槽に接して設けられ、所定の温度の液体をそれぞれ導入および排出するためのインレットおよびアウトレットを備えた熱交換槽と、液体をそれぞれ所定の温度に保つための温度制御可能な熱源を備えた複数の液体リザーバタンクと、前記熱交換槽の前記インレットおよび前記アウトレットと前記液体リザーバタンクとの間を接続する管状の流路と、前記管状流路上に設置された、前記熱交換槽と前記液体リザーバタンクとの間で前記液体を循環させるためのポンプと、前記管状流路上に設置された、前記循環する前記液体の流れを制御するための切り替えバルブであって、前記複数の液体リザーバタンクからの所定の温度の前記液体の前記熱交換槽への流入を所定の時間間隔で切り替えることによって、前記反応槽の温度を所望の温度に制御する、切り替えバルブとを備え、前記サンプルの量が１ウェル当たり数μＬ以下であり、循環させる前記液体の総容積が１液体リザーバタンク当たり数十ｍＬ以上である、液体還流型反応制御装置を提供する。
Description
本発明は、基礎生命科学、医学基礎研究ならびに医療現場において、迅速に微量の遺伝子解析の研究や臨床を行うに適する反応容器を用いた遺伝子解析装置に関するものであり、例えば人間をはじめとする動物や植物のゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ等の核酸塩基配列から特定の塩基配列を高速で検出するための反応装置を扱う遺伝子解析に関するものである。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction以下、PCRと略記する。）は、様々な種類の核酸の混合物から特定の核酸配列を増幅する方法である。混合物中にゲノムDNA あるいはメッセンジャーRNAから逆転写した相補的DNA等のDNAテンプレート、２種類以上のプライマーと熱安定性酵素、マグネシウムなどの塩、および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）をいれ、核酸を分離させる工程と、前記プライマーを結合させる工程と、熱安定性酵素によってプライマーが結合した核酸を鋳型としてハイブリダイゼーションさせる工程を少なくとも一回繰り返すことによって、特定の核酸配列を増幅させることができる。DNA増幅反応に用いられる反応容器を昇温、降温させることによって、熱サイクルを行っている。温度変化用の機構は色々と挙げられるが、サンプルを含む反応容器の温度をヒーターないしペルチェ素子、温風を用いた熱交換で変化させる機構、反応容器を異なる温度のヒータブロックもしくは液体バスに交互に接触させることにより温度を変化させる機構、異なる温度の領域を有する流路中にサンプルを流して温度を変える方法がある。現状の市販装置として最速なものとして、例えばロッシュ社のライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ）では、複数のガラスキャピラリー管の各々に試料とＤＮＡポリメラーゼとプライマーとなるＤＮＡ小片および計測用の蛍光標識色素を導入し、このキャピラリー管内の微量液滴の温度を、例えば５５℃と９５℃の２つの温度など、変化させたい液滴の温度と同じ温度の温風を吹き付けることで変化させ、同時に、このガラスキャピラリー管に蛍光色素の励起光を照射し、得られた蛍光強度を計測する機構を有するものである。これらの方法によりサンプルの温度を繰り返し変化させることが可能である。
また、試料含有領域の外壁へ流体ジェットを衝突させることにより、試料温度を制御する流体衝突熱サイクラー装置が報告されている（特表２００１―５１９２２４（特許文献１））
ヒーターないしペルチェ素子での温度速度は、毎秒数℃程度と遅く、また温度のオーバーシュールなしに温度を変化させることは困難である。基本的に固体中の熱伝導を利用すると熱源と表面の間には熱勾配が形成されてしまい、厳密な制御は不可能である。また、サンプルがヒーターないしペルチェ素子に触れた瞬間に熱が奪われ、表面温度が所定温度に復帰するまでの遅延が発生する。また異なるヒーターないし液体バスに反応槽を接触させる場合には、移動用の機構が複雑であるとか、ヒーターないし液体バスの温度制御が困難である。さらに、異なる温度領域を有する流路中にサンプルを流す方法においては、サンプルの移動に伴って流路自体の表面温度が変化してしまい、温度制御が困難であるといった問題がある。また、温風を吹き付けて温度変化を行う場合には、空気の熱容量が少ないため、多量の空気を吹き付ける必要があり、また、同様に空気の熱容量が少ないため、電熱線等で吹き付ける空気の最終的な吹き出し温度を１℃単位で厳密に制御することは困難である。
従って、本発明は、正確な温度制御、温度測定と迅速な昇温、降温を行うことができる反応制御装置を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、正確な温度制御、温度測定と迅速な昇温、降温を行うことができ、それによって高速であり、高精度、高増幅率のPCR反応を行うことができるDNA増幅装置を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の反応制御装置は、サンプル液の温度変化について、変化させたい複数の温度について、各温度が維持された熱容量の大きな液体を熱交換の媒体に用いることと、この熱容量の大きな複数の異なる温度の液体を高速で変化させる手段と、この熱容量の大きな液体とサンプル液との熱交換が迅速に行われる微小反応槽を用いることを特徴とする。具体的には、熱交換に適した構造および材質で構成される微小反応槽と、各反応に適した温度の液体を微小反応槽外部に循環させる熱交換槽と、液体の温度を高精度で維持する熱源を含む複数の液体リザーバタンクと、微小反応槽の温度を迅速に変化させるために任意の液体リザーバタンクから反応槽外部へ液体導くための切り替えバルブ系と、上記バルブ系の切り替えの際に異なる温度の液体の混合防止機構から構成されている。
すなわち、本発明は、以下の液体還流型反応制御装置を提供する。
（１）サンプルを容れるための１または複数のウェルを有する反応槽と、
上記反応槽に熱を伝導しうるように該反応槽に接して設けられ、所定の温度の液体をそれぞれ導入および排出するためのインレットおよびアウトレットを備えた熱交換槽と、
液体をそれぞれ所定の温度に保つための温度制御可能な熱源を備えた複数の液体リザーバタンクと、
上記熱交換槽の上記インレットおよび上記アウトレットと上記液体リザーバタンクとの間を接続する管状の流路と、
上記管状流路上に設置された、上記熱交換槽と上記液体リザーバタンクとの間で上記液体を循環させるためのポンプと、
上記管状流路上に設置された、上記循環する上記液体の流れを制御するための切り替えバルブであって、上記複数の液体リザーバタンクからの所定の温度の上記液体の上記熱交換槽への流入を所定の時間間隔で切り替えることによって、上記反応槽の温度を所望の温度に制御する、切り替えバルブと、
を備え、
上記サンプルの量が１ウェル当たり数μＬ以下であり、循環させる上記液体の総容積が１液体リザーバタンク当たり数十ｍＬ以上である、液体還流型反応制御装置。
（２）ＰＣＲ装置として使用する、上記（１）に記載の液体還流型反応制御装置。
（３）さらに、上記サンプル中に蛍光色素を含有させた場合に、上記反応槽の温度切り替えに連動して上記ウェル内の上記蛍光色素が発する蛍光を検出し、蛍光強度の時間変化を測定するための蛍光検出手段を備える、上記（１）または（２）に記載の液体還流型反応制御装置。
（４）上記蛍光検出手段が、上記反応槽の上記ウェルの各々に対応して設けられている、上記（３）に記載の液体還流型反応制御装置。
（５）上記反応槽の一つまたは複数のウェルに配置された上記サンプル液の蛍光強度変化からサンプル液の温度変化を見積もる手段と、
その結果に基づいて上記反応槽の温度を迅速に変化させる手段と、
をさらに備える、上記（３）または（４）に記載の液体還流型反応制御装置。
（６）上記液体リザーバタンクの数が、上記反応槽の設定したい温度の数と同一である上記（１）～（５）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（７）上記液体リザーバタンクの数が、２または３である、上記（６）に記載の液体還流型反応制御装置。
（８）上記反応槽の底面および壁面が、厚さ1ミクロンから100ミクロンのアルミ、ニッケル、マグネシウム、チタン、プラチナ、金、銀、銅を含む金属、もしくはシリコンから形成されている、上記（１）～（７）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（９）上記ウェルの底面の形状が、平底状、半球状、三角錐状、または球状である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１０）上記ウェルの各々に、反応に必要な試薬が乾燥した状態で予め内包されており、サンプル溶液との接触により溶出して反応を可能とする、上記（１）～（９）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１１）上記反応槽が、該反応槽内の上記サンプルからの光学信号の測定を容易にする孔もしくは光学窓をさらに備える、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１）サンプルを容れるための１または複数のウェルを有する反応槽と、
上記反応槽に熱を伝導しうるように該反応槽に接して設けられ、所定の温度の液体をそれぞれ導入および排出するためのインレットおよびアウトレットを備えた熱交換槽と、
液体をそれぞれ所定の温度に保つための温度制御可能な熱源を備えた複数の液体リザーバタンクと、
上記熱交換槽の上記インレットおよび上記アウトレットと上記液体リザーバタンクとの間を接続する管状の流路と、
上記管状流路上に設置された、上記熱交換槽と上記液体リザーバタンクとの間で上記液体を循環させるためのポンプと、
上記管状流路上に設置された、上記循環する上記液体の流れを制御するための切り替えバルブであって、上記複数の液体リザーバタンクからの所定の温度の上記液体の上記熱交換槽への流入を所定の時間間隔で切り替えることによって、上記反応槽の温度を所望の温度に制御する、切り替えバルブと、
を備え、
上記サンプルの量が１ウェル当たり数μＬ以下であり、循環させる上記液体の総容積が１液体リザーバタンク当たり数十ｍＬ以上である、液体還流型反応制御装置。
（２）ＰＣＲ装置として使用する、上記（１）に記載の液体還流型反応制御装置。
（３）さらに、上記サンプル中に蛍光色素を含有させた場合に、上記反応槽の温度切り替えに連動して上記ウェル内の上記蛍光色素が発する蛍光を検出し、蛍光強度の時間変化を測定するための蛍光検出手段を備える、上記（１）または（２）に記載の液体還流型反応制御装置。
（４）上記蛍光検出手段が、上記反応槽の上記ウェルの各々に対応して設けられている、上記（３）に記載の液体還流型反応制御装置。
（５）上記反応槽の一つまたは複数のウェルに配置された上記サンプル液の蛍光強度変化からサンプル液の温度変化を見積もる手段と、
その結果に基づいて上記反応槽の温度を迅速に変化させる手段と、
をさらに備える、上記（３）または（４）に記載の液体還流型反応制御装置。
（６）上記液体リザーバタンクの数が、上記反応槽の設定したい温度の数と同一である上記（１）～（５）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（７）上記液体リザーバタンクの数が、２または３である、上記（６）に記載の液体還流型反応制御装置。
（８）上記反応槽の底面および壁面が、厚さ1ミクロンから100ミクロンのアルミ、ニッケル、マグネシウム、チタン、プラチナ、金、銀、銅を含む金属、もしくはシリコンから形成されている、上記（１）～（７）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（９）上記ウェルの底面の形状が、平底状、半球状、三角錐状、または球状である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１０）上記ウェルの各々に、反応に必要な試薬が乾燥した状態で予め内包されており、サンプル溶液との接触により溶出して反応を可能とする、上記（１）～（９）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１１）上記反応槽が、該反応槽内の上記サンプルからの光学信号の測定を容易にする孔もしくは光学窓をさらに備える、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１２）上記反応槽が、上記熱交換槽に対して着脱可能に設置されている、上記（１）～（１１）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１３）上記反応槽の上記熱交換槽への着脱方式が、
（ａ）上記反応槽の外周に筒状の枠を、上記熱交換槽に筒状の反応槽受け口を設け、上記反応槽の上記枠の外表面と、上記熱交換槽の反応槽受け口の内表面とにねじ山を設けて、該ねじ山に沿った回転運動により上記反応槽を上記熱交換槽に着脱可能に装着する方式、
（ｂ）上記反応槽の外周の上記筒状の枠および上記熱交換槽の上記筒状の反応槽受け口をそれぞれテーパー状にして、上記反応槽受け口に対して上記反応槽を着脱可能に圧着させる方式、
（ｃ）上記反応槽をスライドガラス状の反応槽枠内に固定し、上記熱交換槽の反応槽受け口にガイドレールを設け、該ガイドレールに沿って上記スライドガラス状の反応槽枠を着脱可能に装着する方式、および
（ｄ）上記スライドガラス状の反応槽枠を、ヒンジを有するスライド受けに挿入し、該ヒンジ機構に基づいた回転動作により、上記スライドガラス状の上記反応槽枠を上記熱交換槽の上記反応槽受け口に対して着脱可能に装着する方式、
のうちのいずれかである、上記（１２）に記載の液体還流型反応制御装置。
（１４）さらに、上記液体が還流している状態でありながら、上記液体を上記液体還流型反応制御装置の外部に漏らすことなく上記反応槽を上記熱交換槽から着脱することを可能とする機構を備えている、上記（１２）または（１３）に記載の液体還流型反応制御装置。
（１５）上記液体リザーバタンクが、熱源、温度計、液体攪拌系を備え、該液体攪拌系は該液体リザーバタンク内の液体を連続的もしくはデュティーサイクル比１０％以上で攪拌することにより、該液体リザーバタンク内の該液体の温度分布を５℃以内に抑制できる熱源制御系を備える、上記（１）～（１４）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１６）上記切り替えバルブの動作を制御する切り替えバルブ制御機構をさらに備える、上記（１）～（１５）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１７）上記切り替えバルブは、上記複数の液体リザーバタンクのうち、任意の液体リザーバタンクの液体を上記熱交換槽に導くことができ、上記熱交換槽中の上記液体を元の液体リザーバタンクに戻すことができる、上記（１）～（１６）のいずれかに記載の液体還流型反応制御系。
（１８）上記切り替えバルブの制御により上記熱交換槽内の上記液体を置換する際、上記熱交換槽内部の上記液体はその温度に最も近い温度に保持されている液体リザーバタンクに導かれる様に上記切り替えバルブが制御される、上記（１６）または（１７）に記載の液体還流型反応制御装置。
（１９）さらに、断熱材、ヒーター、および冷却機構を含む補助温度制御機構であって、上記切り替えバルブと上記液体リザーバタンクとを結合する上記流路内部の上記液体の温度の変動を抑制する補助温度制御機構を備えている、上記（１）～（１８）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２０）さらに、上記切り替えバルブと上記液体リザーバタンクとを結合する上記流路内部の上記液体が上記熱交換槽に導かれるか非かにかかわらず、上記液体リザーバタンクからの上記液体と連続的に置換されることにより温度の変化を抑制する機構を上記切り替えバルブ内に備えている、上記（１）～（１９）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１３）上記反応槽の上記熱交換槽への着脱方式が、
（ａ）上記反応槽の外周に筒状の枠を、上記熱交換槽に筒状の反応槽受け口を設け、上記反応槽の上記枠の外表面と、上記熱交換槽の反応槽受け口の内表面とにねじ山を設けて、該ねじ山に沿った回転運動により上記反応槽を上記熱交換槽に着脱可能に装着する方式、
（ｂ）上記反応槽の外周の上記筒状の枠および上記熱交換槽の上記筒状の反応槽受け口をそれぞれテーパー状にして、上記反応槽受け口に対して上記反応槽を着脱可能に圧着させる方式、
（ｃ）上記反応槽をスライドガラス状の反応槽枠内に固定し、上記熱交換槽の反応槽受け口にガイドレールを設け、該ガイドレールに沿って上記スライドガラス状の反応槽枠を着脱可能に装着する方式、および
（ｄ）上記スライドガラス状の反応槽枠を、ヒンジを有するスライド受けに挿入し、該ヒンジ機構に基づいた回転動作により、上記スライドガラス状の上記反応槽枠を上記熱交換槽の上記反応槽受け口に対して着脱可能に装着する方式、
のうちのいずれかである、上記（１２）に記載の液体還流型反応制御装置。
（１４）さらに、上記液体が還流している状態でありながら、上記液体を上記液体還流型反応制御装置の外部に漏らすことなく上記反応槽を上記熱交換槽から着脱することを可能とする機構を備えている、上記（１２）または（１３）に記載の液体還流型反応制御装置。
（１５）上記液体リザーバタンクが、熱源、温度計、液体攪拌系を備え、該液体攪拌系は該液体リザーバタンク内の液体を連続的もしくはデュティーサイクル比１０％以上で攪拌することにより、該液体リザーバタンク内の該液体の温度分布を５℃以内に抑制できる熱源制御系を備える、上記（１）～（１４）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１６）上記切り替えバルブの動作を制御する切り替えバルブ制御機構をさらに備える、上記（１）～（１５）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（１７）上記切り替えバルブは、上記複数の液体リザーバタンクのうち、任意の液体リザーバタンクの液体を上記熱交換槽に導くことができ、上記熱交換槽中の上記液体を元の液体リザーバタンクに戻すことができる、上記（１）～（１６）のいずれかに記載の液体還流型反応制御系。
（１８）上記切り替えバルブの制御により上記熱交換槽内の上記液体を置換する際、上記熱交換槽内部の上記液体はその温度に最も近い温度に保持されている液体リザーバタンクに導かれる様に上記切り替えバルブが制御される、上記（１６）または（１７）に記載の液体還流型反応制御装置。
（１９）さらに、断熱材、ヒーター、および冷却機構を含む補助温度制御機構であって、上記切り替えバルブと上記液体リザーバタンクとを結合する上記流路内部の上記液体の温度の変動を抑制する補助温度制御機構を備えている、上記（１）～（１８）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２０）さらに、上記切り替えバルブと上記液体リザーバタンクとを結合する上記流路内部の上記液体が上記熱交換槽に導かれるか非かにかかわらず、上記液体リザーバタンクからの上記液体と連続的に置換されることにより温度の変化を抑制する機構を上記切り替えバルブ内に備えている、上記（１）～（１９）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２１）上記切り替えバルブが、断面が円もしくは多角形の中空構造中をスライドするピストンから構成されており、該ピストンの位置によって上記反応槽に接する液体の温度を制御する、上記（１）～（２０）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２２）上記切り替えバルブにおいて、上記ピストンが、
（ａ）該ピストンに接続されたピストンロッドに対して機械的に外力を加えることによって、
（ｂ）自体磁性体であるピストンもしくは磁性体が内部に装着されたピストンを使用して、該ピストンと上記切り替えバルブ外部に配置された電磁コイルとを含む磁場発生機構との相互作用によって、または
（ｃ）ピストン両端に上記循環する液体の流れによる圧力差を生じさせることによって、
スライドする、上記（２１）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２３）上記切り替えバルブにおいて、
円柱状、円盤状、円錐状の回転体であって、上記液体リザーバタンクから送られた液体の流路となる複数の溝が外表面に形成され、さらに上記溝のそれぞれに流体連絡可能に接続されたトンネル状の流路が形成された回転体が、上記熱交換槽に回転可能に挿入されており、
上記トンネル状の流路の端がそれぞれ上記切り替えバルブのインレットまたはアウトレットとして機能し、
上記回転体が回転することにより、上記インレットに導入される異なる温度の液体が上記溝部分を流れる際に反応槽外部に接触する、上記（１）～（２０）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２４）上記循環させる液体として、熱容量が大きく、かつ粘性が低い液体を用いる、上記（１）～（２３）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２５）上記循環させる液体として、沸点が水の沸点より高い液体を用いる、上記（１）～（２４）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２６）上記循環させる液体として、凝固点が水の凝固点より低い液体を用いる、上記（１）～（２５）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２２）上記切り替えバルブにおいて、上記ピストンが、
（ａ）該ピストンに接続されたピストンロッドに対して機械的に外力を加えることによって、
（ｂ）自体磁性体であるピストンもしくは磁性体が内部に装着されたピストンを使用して、該ピストンと上記切り替えバルブ外部に配置された電磁コイルとを含む磁場発生機構との相互作用によって、または
（ｃ）ピストン両端に上記循環する液体の流れによる圧力差を生じさせることによって、
スライドする、上記（２１）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２３）上記切り替えバルブにおいて、
円柱状、円盤状、円錐状の回転体であって、上記液体リザーバタンクから送られた液体の流路となる複数の溝が外表面に形成され、さらに上記溝のそれぞれに流体連絡可能に接続されたトンネル状の流路が形成された回転体が、上記熱交換槽に回転可能に挿入されており、
上記トンネル状の流路の端がそれぞれ上記切り替えバルブのインレットまたはアウトレットとして機能し、
上記回転体が回転することにより、上記インレットに導入される異なる温度の液体が上記溝部分を流れる際に反応槽外部に接触する、上記（１）～（２０）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２４）上記循環させる液体として、熱容量が大きく、かつ粘性が低い液体を用いる、上記（１）～（２３）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２５）上記循環させる液体として、沸点が水の沸点より高い液体を用いる、上記（１）～（２４）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２６）上記循環させる液体として、凝固点が水の凝固点より低い液体を用いる、上記（１）～（２５）のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
（２７）上記反応槽の上記ウェル側の表面を密封して覆う部材であって、該ウェル中のサンプル溶液の光学的な観察が可能なように少なくとも一部が光学的に透明な部材と、
上記部材の上記光学的に透明な部分を加熱する加熱機構と
を含むサンプル蒸発防止機構をさらに備える、上記（１）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２８）上記部材の上記光学的に透明な部分と上記反応槽の上記ウェルのある表面との距離が３ｍｍ以下である、上記（２７）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２９）上記加熱機構によって加熱される上記部材の上記光学的に透明な部分の温度が８０℃から１１０℃の範囲である、上記（２７）に記載の液体還流型反応制御装置。
上記部材の上記光学的に透明な部分を加熱する加熱機構と
を含むサンプル蒸発防止機構をさらに備える、上記（１）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２８）上記部材の上記光学的に透明な部分と上記反応槽の上記ウェルのある表面との距離が３ｍｍ以下である、上記（２７）に記載の液体還流型反応制御装置。
（２９）上記加熱機構によって加熱される上記部材の上記光学的に透明な部分の温度が８０℃から１１０℃の範囲である、上記（２７）に記載の液体還流型反応制御装置。
還流する液体で反応槽の温度を制御する本発明の利点として次のようなものが挙げられる。まず温度のオーバーシュート問題を解決することができる。すなわち、常に還流している液体の温度はほぼ一定であることから、反応槽表面の温度と液体の温度はほぼ瞬時に平衡化することができる。本発明において、反応槽およびサンプルの熱容量は、還流している液体と比較して微々たるものであり、また、局所的に液体から熱が奪われたとしても液体は連続して流れてくることから、熱勾配は基本的に発生しない。勿論、反応槽の温度は液体の温度を超えることはない。本発明の代表的な実施形態によれば、異なる温度の液体を熱交換槽に順次に流し込むことにより、0.5秒以内に30℃以上温度を変化させることが可能である。したがって、本発明によれば、温度変更に必要な時間を極めて短くできることから、例えば、ＰＣＲ反応を遂行するためのトータルタイムを従来の装置よりも格段に短縮することが可能である。
本発明に従った反応制御装置においては、熱伝導率に優れた反応槽の外部に一定温度の保持された液体を接触させ、さらに異なる温度の液体で迅速に置換することにより、サンプル温度を高精度で制御すること、および迅速な昇温、降温が可能となる。本発明によれば、高速、高精度、高増幅率のPCR反応を行うことができる。
また、本発明は、サンプル溶液が加熱されることによるサンプル液の蒸発を防ぐことができるため、微量のサンプルを使用するＰＣＲ反応において有利である。
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明するが、これらの実施形態は例示であって、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
図１は、本発明の反応制御装置の一実施形態の全体構成を示す模式図である。本発明の反応制御装置は、典型的には、反応槽（reaction vessel）１、反応槽枠２、熱交換槽（heat exchange vessel）３、液体リザーバタンク（liquid reservoir tank）４、熱源５、攪拌機構６、ポンプ７、切り替えバルブ８、バイパス流路９、および補助温度制御機構１０を備える。好ましくは、さらに蛍光検出器２０１、および制御信号２０３を送るための制御解析部２０２、および光学窓（または孔）２０４を備える。
反応槽１は、典型的には、窪み（ウェル）を複数個有するアルミ、ニッケル、マグネシウム、チタン、プラチナ、金、銀、および銅などの金属、もしくはシリコン等の薄板などから構成され得るが、熱伝導性が高く、PCRを妨げない材料であればこれらの材料に限定されない。また、金属薄膜の表面をプラスチック等の親水性でかつ金属の腐食を防ぐ素材で被覆してもよい。窪み領域における薄板の厚さは、熱伝導性を高めるため周囲に比べて薄く構成されていることが好ましく、典型的には10から30ミクロン程度の厚さであるがこれに限定されない。隣り合った窪みの間の領域は全体的に強度を担保するためにより厚くなっていることが好ましく、典型的には、厚さが100ミクロンから500ミクロンの範囲にあるがこれに限定されない。反応槽１は、典型的には、四角、円形などの形状の反応槽枠２の底面に固定されて一体的に形成される。反応槽１および反応槽枠２は、典型的には、熱交換槽３に対して着脱可能に構成される（図４を参照）。
熱交換槽３には熱交換用の液体が導入されて使用される。導入される液体の温度は、液体リザーバタンク４の内部に配置されている熱源５により制御されている。熱源５の表面から迅速に熱を奪い、液体リザーバタンク４内部の温度を均一にするために、攪拌機構６が備えられていることが好ましい。液体リザーバタンク４中の液体はポンプ７により流路内部に導かれる。切り替えバルブ８によって、液体は熱交換槽３に導かれるか、バイパス流路９に導かれることにより直接液体リザーバタンク４に戻る。必要に応じて、補助温度制御機構１０によって、液体の温度が微妙に制御され、液体リザーバタンク４内部の温度変動を抑制するようになっている。
熱交換槽３に導入される液体としては、水を用いてもよいがこれに限定されず、熱容量が大きく、かつ、粘性が低い液体（例：液体アンモニア）ならば任意のものを用いることができる。また、例えば、水より沸点の高い液体を用いることで、確実に、サンプル液を１００℃にしたり、あるいは、水より凝固点の低い液体を用いることで、装置内で循環する液体の凝固を防ぎながら水の凝固点までの温度の変化を確実に行うこともできる。
好適には、図１に示すように、反応槽枠２には、反応槽１内のサンプル液の反応によって変化するサンプル液中の蛍光色素の蛍光強度の変化を、１つあるいは複数の反応槽の各々について計測できるように、蛍光色素の励起光ならびに蛍光を透過する光学窓２０４が配置されている。また、蛍光検出器２０１が配置されることで、計測された各反応槽１の蛍光強度の時間変化を計測することができる。図１の実施例では、複数の蛍光検出器２０１各々の内に、励起光照射機構と、蛍光検出機構が具備されており、例えば、ＰＣＲ反応を行わせる場合には、異なるプライマー、あるいは異なるサンプル液を滴下した複数の反応槽１の各々の異なるＰＣＲ増幅情報を独立して計測することができる構成となっている。また、蛍光検出器２０１で取得された蛍光強度データは、制御解析部２０２で記録され、ＰＣＲ反応によって得られたサンプル液内のＤＮＡ量、あるいは、ｍＲＮＡ量を見積もる機能を有する。さらに、制御解析部２０２では、切り替えバルブ８の切り替え情報を取得することで、バルブ切り替え後のサンプル液の温度変化が目的の温度に達したかどうかを、蛍光強度の時間変化から見積もる機能、およびその結果に基づいてバルブ切り替えを制御する機構も有する。これは、蛍光色素が普遍的にもつ水分子の運動に基づいた蛍光消光が液温に依存することを利用して、蛍光強度の単位時間での変化量が小さくなること、あるいは、ゼロとなることから見積もるものであり、特に、ＤＮＡを変性させる高温状態の達成の確認に有効である。
また、図１に示す実施例では、各反応槽１に１つの検出器を配置する構成を示したが、蛍光励起用光源と冷却ＣＣＤカメラなどの蛍光定量検出が可能なカメラを組み合わせて複数の反応槽１の蛍光強度変化を計測してもよい。あるいは、反応槽１の数より少ない検出器を用いる場合には、Ｘ－Ｙ面で高速に移動することができる機械式駆動機構を検出器と組み合わせることで、すべての反応槽１の蛍光強度を計測してもよい。
また、サンプル液の容量は、通常１ウェル当たり数μＬ以下であるが、１ウェル当たり０．１μＬ～１００μＬの範囲を使用することができ、好ましくは、１ウェル当たり０．５μＬ～１０μＬであり、さらに好ましくは、１ウェル当たり１μＬ～１０μＬであり、さらにより好ましくは、１ウェル当たり１μＬ～５μＬであり、最も好ましくは、１ウェル当たり１μＬ～２μＬである。ウェルにはサンプル液の他に、サンプル液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルなどを含有させてもよい。ミネラルオイルの容量としては、数μＬ（例：３～４μＬ）程度が好ましいが、これに限定されず、ウェルの大きさやサンプル量により適宜変更しうることは当業者に明らかである。
図２は、本発明の反応制御装置に使用される熱交換槽３の概略図である。熱交換槽３は、基本構成として、異なる温度の液体を導入するインレットＡ（１１）、インレットＢ（１２）を備える。また、熱交換槽３は、熱交換槽３の液体を液体リザーバタンク４に戻すための複数のアウトレット、アウトレットＡ（１３）およびアウトレットＢ（１４）を備える。図２Ａは、液体リザーバタンク４からのある温度の液体をインレットＡ（１１）から導入し、アウトレットＡ（１３）から排出する様子を、図２Ｂは、液体リザーバタンク４からの別の温度の液体をインレットＢ（１２）から導入し、アウトレットＢ（１４）から排出する様子を、それぞれ模式的に示す。インレットの数は２に限定されず、サンプル液の温度を変化させたい複数の温度に一致する数だけ２温度分以上の複数を用意することができる。例えば、３温度系を達成したい場合にはインレットの数は３つとなる。アウトレットの数もインレットの場合と同様、２に限定されない。なお、図２中の矢印は熱交換槽３に導入または熱交換槽３から排出する液体の流れる方向を大まかに示したものである。
熱交換槽３と液体リザーバタンク４との間を循環させる液体の総容積は、液体の熱容量や温度の安定性などを考慮して、通常数十ｍＬ以上であり、好ましくは、１００ｍＬ以上、より好ましくは、２００ｍＬ以上、さらに最も好ましくは、３００ｍＬ以上である。容積の上限は、装置の可搬性等を考慮して適宜設定できる。
熱交換槽３の容量は、ウェル当たりのサンプル量の約１０倍以上が好ましく、約１００倍以上であることがより好ましく、約１０００倍以上であれば最も好ましい。典型的には、熱交換槽の容量は、１ウェルに対して約０．０１ｍＬ～１０ｍＬであり、より好ましくは、約０．０５ｍＬ～５ｍＬであり、最も好ましくは、約０．１ｍＬ～２ｍＬである。
図３は、本発明の反応制御装置に使用される反応槽の形態と凍結乾燥試薬の溶解方法を示す模式図である。色々な形状の反応槽またはウェルを用いることが可能であり、図３Ａは一つの例として、熱交換槽の液体と接する面が、フラットな反応槽Ａ（２１）、半球状である反応槽Ｂ（２２）、三角錐状である反応槽Ｃ（２３）、球状である反応槽Ｄ（２４）を、それぞれ示している。熱伝導の効率を考えると、熱交換槽の液体と接する面の面積が大きいほど効率がよいことは当業者ならば容易に理解できる。
反応に必要な試薬は凍結乾燥しておくと便利である。図３Ｂに示すように、反応槽２６の底部に凍結乾燥試薬２５を調製しておくことは可能である。また、サンプルを分注する際に用いられる分注チップ２７内部にプラグ状の凍結乾燥試薬２５を形成しておけば、サンプル液２８を上下に移動させることにより試薬をサンプル中に溶解することが可能である。または、ナイロン繊維等が束ねられている繊維玉２９表面に凍結乾燥試薬２５を形成しておき、反応槽２６内部のサンプル２８中に挿入して攪拌することにより凍結乾燥試薬を溶解することも可能である。
図４は、本発明の反応制御装置に使用される円柱型反応枠３２、およびその熱交換槽３７への取り付け方法を示す模式図である。薄膜から構成されている反応槽を直接ハンドリングするのは不便であるので、図４Ａに示すように、反応槽３１を反応槽枠３２に固定すると便利である。反応槽枠３２は断熱性材質であるポリスチレン、ポリカーボネート、ＰＥＥＫ，アクリル等で形成することが望ましい。また、反応槽３１との結合面積をできるだけ小さく（例：５ｍｍ２以下）抑えることが、反応槽３１の迅速かつ高精度な昇温、降温に望ましい。
図４Ｂは、反応槽３１を熱交換槽３７に装着する１つの態様として、反応槽枠３２の表面にネジ山３４を形成しておき、反応槽枠３２を熱交換槽３７の反応槽受け口３３にねじ込む方法を示す。図４Ｂに示すように、水密性の保持のために、開口部にシール３５を装着することが望ましい。図４Ｃはさらに別の装着方法を示す。図４Ｃに示すように、テーパー状反応槽枠３６を採用し、圧力のみで熱交換槽３８に装着することも可能である。
図５は、本発明の反応制御装置に使用されるバルブの切り替え機構の具体例を示す。反応槽に液体を導入するためのインレットバルブＡ（４１）、インレットバルブＢ（４３）、外部に導くためのアウトレットバルブＡ（４２）とアウトレットバルブＢ（４４）が示されている。インレットバルブＡ（４１）から導かれる液体はアウトレットバルブＡ（４２）から液体リザーバタンク４に戻り、インレットバルブＡ（４３）から導かれる液体はアウトレットバウルＢ（４４）から別の液体リザーバタンク４に戻る。この二つの状態を交互に繰り替えることにより、反応槽中のサンプルを反応することができる。さらに望ましいバルブ切り替え方法としては、上記の二つの状態以外に、インレットバルブＢ（４３）とアウトレットバルブＡ（４２）、もしくはインレットバルブＡ（４１）とアウトレットバルブＢ（４４）が一瞬の間同時に開放することにより、異なる温度の液体が混合することを抑制でき、それぞれの系の液体リザーバタンクの温度制御が容易になる。
液体の循環速度は、特に限定されないが、通常約１ｍＬ／秒～１００ｍＬ／秒であり、より好ましくは、５ｍＬ／秒～５０ｍＬ／秒であり、最も好ましくは、７ｍＬ／秒～１５ｍＬ／秒である。
図６Ａは、上記の機構を用いることによって実現できた温度制御に関するデータから得られたグラフを示す。図６Ａに示すように、1.5秒といった短時間で、温度を60℃から92℃に昇温させ、また60℃に戻すことが可能である。図６Ｂは、リアルタイムPCRによる結果を示すグラフである。PCRを行うときの溶液条件は以下のとおりである。反応バッファー 1.0 μL、2mM dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 1μL、25 mM 硫酸マグネシウム 1.2 μL、10％牛胎仔血清 0.125μL、SYBR Green I 0.5 μL、プライマー2種類各0.6μL、 滅菌水 3.725μL、KOD plus polymerase 0.25μL、ゲノムDNA1.0 μLの割合で混ぜ合わせた。温度条件としては、まず95℃ 10 sec行い、次に95℃ 1 sec、60℃ 3 secの温度変化を40サイクル行った。液体の循環速度は、約１０ｍＬ／秒であった。
図７は、本発明の反応制御装置に使用される反応槽５９および反応槽枠５１の熱交換槽への脱着方法に関するバリエーションを示す。反応槽５９は、スライドガラス型反応槽枠５１に張られて取り付けられている（図７Ａ）。このスライドガラス型反応槽枠５１を熱交換槽に装着するにあたって、ガイドレール５３に沿って反応槽枠５１を横にスライドさせ、シール５４に押し付けて固定することができる（図７Ｂ）。または、スライドガラス型反応枠５１をスライド受け口５５に挿入して、ヒンジ５６を活用して、シール５７に押し付けることも可能である（図７Ｃ）。
図８は、本発明の反応制御装置に使用されるバルブの切り替え機構のバリエーションを示す模式図であり、図５に示したものとは異なるスライド型ピストンバルブの駆動機構を示す。反応槽６６の温度を変えるバルブ機構として左右にスライドできるピストン６５を用いる。ピストン６５の左側にはインレットＡ（６１）から熱交換槽６７に液体が導入され、アウトレットＡ（６２）から外部に導かれる。ピストン６５の右側にはインレットＢ（６３）から熱交換槽６７に液体が導入され、アウトレットＢ（６４）から外部に導かれる。ピストン６５が反応槽６６に対して右にスライドすると、反応槽６６はインレットＡ（６１）から導入された液体の温度と平衡に達し、逆に左側にスライドするとインレットＢ（６３）から導入される液体の温度と平衡に達する。また、ピストン６５が反応槽６６の真下に位置する場合には、液体が漏れることなく反応槽６６を外すことができる。ピストン６５は断熱性に勝れた素材で製作するか、内部が空洞になっており気体で満たされていたり、または真空状態にあることが望ましい。なお、図８中の矢印は、液体の流れる方向を大まかに示す。
図９は、本発明の反応制御装置に使用されるピストンバルブのピストンの駆動機構のいくつかのバリエーションを示す。一つの方法としては、ピストン７１がピストンロッド７２と一体になっており、外部から直接動かす方法である（図９Ａ）。別の方法としては、ピストン７３を鉄、ニッケル等の強磁性材料で作製するか、その他の素材で作製されたピストンの内部に磁石７４を組み込む。外部に電磁コイル７５を設置し、電流を制御することにより、ピストン７３を左右にスライドする（図９Ｂ）。さらなる方法としては、インレット側の圧力もしくはアウトレットの流体抵抗を制御することにより、ピストン７６の両側での圧力差を利用してピストン７６を左右にスライドすることも可能である（図９Ｃ）。なお、図９中の白抜き矢印はピストンの動く方向を示し、黒塗り矢印は、流体の流れを示し、矢の向きによって流体の流れる方向を、矢の太さによって流量を大まかに示す。
図１０は、本発明の反応制御装置に使用されるバルブの切り替え機構の別の形態を示す。回転軸としての棒８２が結合されている傾いた楕円形の板からなる回転弁８１が、断面が円形の熱交換槽８３内部に挿入されている。回転弁８１は熱交換槽８３を左右に分断しており、回転軸８２を回すことにより、熱交換槽の右もしくは左から導入される液体を反応槽８４に導くことができる。図１０における回転弁８１の形状としては、傾斜した平板であるが、その他の螺旋ネジ等の形状も可能であり、回転軸を回転させることにより同様な効果を生み出す形状であればよい。なお、図１０中の黒塗り矢印は回転軸８２の回転方向を示し、白抜き矢印は、液体の流れる様子を大まかに示す。
図１１は、バルブ以外の構造により液体を置換する構造を示す。熱交換槽９８はメンブランＡ（９５）とメンブランＢ（９６）によって仕切られている。インレットＡ（９１）から導入された液体はアウトレットＡ（９２）により外部に導き出される。メンブランが存在するが故、インレットＢ（９３）やアウトレットＢ（９４）から導き出されることはない（図１１Ａ）。インレットＡ（９１）から導入される液体の圧力が、インレットＢ（９３）から導入される液体の圧力に勝る場合には、メンブランＡ（９５）とメンブランＢ（９６）を左側に押し出すことによって、インレットＡ（９１）から導入される液体の熱が反応槽９７に伝わる（図１１Ｂ）。インレットＡ（９１）とインレットＢ（９３）から導入される液体の圧力の関係が逆の場合には、反応槽９７の温度はインレットＢ（９３）から導入される液体の温度と平衡状態に達する（図１１Ｃ）。メンブランは耐熱ゴム等、耐熱性に優れた薄い膜から作製することが望ましい。なお、図１１中の矢印は、液体の流れる方向を大まかに示す。
図１２は、本発明の反応制御装置に使用される温度設定型バルブのさらに別の駆動機構を示す模式図である。本発明においては、設定できる温度は二つに限定されるものではない。図１２には、反応槽の温度を３つ以上設定できる構造を示す。熱交換槽１０３には、側面に溝１０２が形成されたロータリーバルブ１０１が挿入されている。ロータリーバルブ１０１の両側にはインレットとアウトレットが設けられており、例えばインレットＡ（１０４）から導入された液体は流路１０８を経て溝１０２に流れこみ、反応槽１０９に熱を伝えてからアウトレットＡ（１０５）から外に導かれる。それに対して、インレットＢ（１０６）から導入された液体は反応槽１０９に接することなく、アウトレットＢ（１０７）から外に導かれる。しかし、ロータリーバルブ１０１を回転することにより、任意のインレットから導入された液体を反応槽と接することが可能である（図１２Ｃ）。経過時間１１１に伴ってロータリーバルブ１０１を回転することにより、図１２Ｃのグラフに示すように温度１１０を変化させることが可能である。ロータリーバルブ１０１は断熱性材料から作製されていることが望ましい。
図１３は、本発明の反応制御装置に使用される熱交換槽の構成の一例を示す模式図である。上部パネルＡはその側面図であり、下部パネルＢは上面図である。
図１３を参照して、反応槽１はサンプルを容れるためのアレイ状に配置された凹状の複数の窪み３０６を備える。反応槽１の下部には、Ｏ－リング３０５を介して熱交換槽３が接して配置されており、インレットＡ１１およびインレットＡ１２から熱交換槽３に導入される熱交換液によって反応槽１の温度が調節される。反応槽１の上部には、蒸発防止機構３０１が密着して配置される。この蒸発防止機構３０１によって、サンプル液が熱交換槽１からの熱によって加熱され蒸発して散逸することを防ぐことができる。蒸発防止機構３０１は、典型的には、密着部材３０２、光学的に透明な部材（例：ガラスヒーター）３０３、および必要に応じて高分子シート３０４を備える。高分子シート３０４は、密着部材３０２と反応槽１との密着性を高めることができる。窪み３０６に容れられたサンプル溶液は、光学的に透明な部材３０３を通して、制御解析部２０１により動作が制御された蛍光検出器２０２によりサンプルの蛍光強度の変化が検出される。
図１３に示す実施例では、窪み３０６の各々に載せた液量１マイクロリットルから１０マイクロリットル微量の反応液の液滴の高速での温度変化を繰り返すことでＰＣＲ反応を行うことができる。まず、ＰＣＲ溶液の液滴がセットされた反応槽１は、熱交換槽３にＯ－リング３０５を介して密着するように配置される。熱交換槽３には、熱交換液用の複数のインレットが接続されており、２つ以上の温度の異なる熱交換液がインレットから注入される。本実施例では、２つの温度の熱交換をするひとつの例としてインレットＡ１１とインレットＢ１２を示しているが、インレットの数はこれに限定されるわけではなく、必要に応じて、同様に３つ以上の異なる温度を反応槽１で実現させるために３つ以上のインレットを構成することができる。
蒸発防止機構３０１の上面の光学的に透明な部材３０３は、外部から蛍光検出器１０１等の光学装置により反応槽１の窪み３０６中の反応液の液滴の蛍光強度の変化等の光学的な指標の観察が可能なように、ガラスやプラスチック等の光学的に光を透過する透明な素材で構成され得る。さらに、この光学的に透明な部材３０３は、上記の光学的に透明な素材の表面にＩＴＯ(Indium Tin Oxide：酸化インジウムスズ)等の電流を流すことで温度を上昇させることができる光学的に透明な素材でできた発熱部を付加し、光学的に透明なガラスと発熱部とが一体化したガラスヒーターとしてもよい。このようなガラスヒーターを使用して蒸発防止機構の上面を加熱することで反応槽１のPCR溶液の液滴の蒸発を防止することができる。
したがって、蒸発防止機構３０１の一つの例示的な実施形態は、光学的に透明なガラスと発熱機構とが一体化したガラスヒーター３０３、密封部材３０２、反応槽１と密閉部材３０２とを密着させる高分子シート３０４からなる。反応槽１を蒸発防止機構３０１と熱交換槽３で挟み込むことにより、微量の反応液の蒸発があっても反応槽１と蒸発防止機構３０１との間の空間内ですぐに飽和蒸気圧となる。この飽和蒸気圧となった場合に水蒸気が密封部材３０２およびガラスヒーター３０３などの内壁で結露することが無いように、例えば、外気に接するガラスヒーター３０３の温度を８０℃から１１０℃の範囲で加熱することで、水蒸気の結露を防ぐことができる。また、このようにガラスヒーター３０３によって加熱されたガラス表面には曇り止めの効果があり、蛍光検出器１０１での反応液の蛍光量検出を妨げないという利点がある。
密封部材３０１の密封の性能は、高分子シート３０４等で高めることが可能である。使用されうる高分子シートとしては、ゴム、シリコン等があるがこれらに限定されない。
また、蒸発防止機構と反応槽１との間の空間の容積をより少なくすることが、飽和水蒸気圧に達した水蒸気の全量をより少量に抑えることを可能にすることから、ガラスヒーター３０３と、反応槽１の表面との間の距離をできるだけ小さくすると有利である。ガラスヒーター３０３と反応槽１の表面との距離は、約１０ｍｍ以下であることが好ましく、約７ｍｍ以下であることがより好ましく、約５ｍｍ以下であることがさらにより好ましく、約３ｍｍ以下であることが最も好ましい。また、本実施例では蒸発防止機構３０１の上面の加熱機構についてガラスヒーター３０３を一つの例として用いたが、同様に加熱機構や熱伝導系を持った金属板等に、蛍光検出器１０１からの液滴の蛍光検出が可能となる光学的に透明な窓を配置したものをガラスヒーター３０３の代わりに用いても良い。また、蒸発防止機構を用いた場合は、微量の液滴であっても蒸発が防がれることから、液滴の上にミネラルオイル等の液層の配置は行わなくても良い。
このようにして、図１３に示す実施例では、熱交換槽３からの熱による反応槽の水滴の蒸発によるサンプル液の散逸を防ぐことができる。
本発明は、サンプルの温度を厳密に制御することが求められる反応を行うための反応装置として有用である。本発明はまた、サンプルの温度変更を迅速に行うことが求められる反応を行うための反応装置として有用である。
本発明は特に、高速、高精度、高増幅率のPCR反応を行うことができるＰＣＲ装置として有用である。本発明の装置はまた、小型化が可能なため、ポータブルＰＣＲ装置として有用である。
また、本発明は、サンプル溶液が加熱されることによるサンプル液の蒸発を防ぐことができるため、微量のサンプルを使用するＰＣＲ反応において有用である。
１ 反応槽
２ 反応槽枠
３ 熱交換槽
４ 液体リザーバタンク
５ 熱源
６ 攪拌機構
７ ポンプ
８ 切り替えバルブ
９ バイパス流路
１０ 補助温度制御機構
１１ インレットＡ
１２ インレットＢ
１３ アウトレットＡ
１４ アウトレットＢ
２１，２２，２３，２４，２６ 反応槽
２５ 凍結乾燥試薬
２７ 分注チップ
２８ サンプル
２９ 繊維玉
３１ 反応槽
３２ 反応槽枠
３３ 反応槽受け口
３４ ネジ山
３５ シール
３６ テーパー状反応槽枠
３７，３８ 熱交換槽
４１ インレットバルブＡ
４２ アウトレットバルブＡ
４３ インレットバルブＢ
４４ アウトレットバルブＢ
５１ スライドガラス型反応槽枠
５２，５８ 熱交換槽の反応槽受け口
５３ ガイドレール
５４，５７ シール
５５ スライド受け口
５６ ヒンジ
５９ 反応槽
６１ インレットＡ
６２ アウトレットＡ
６３ インレットＢ
６４ アウトレットＢ
６５ ピストン
６６ 反応槽
６７ 熱交換槽
７１ ピストン
７２ ピストンロッド
７３ ピストン
７４ 磁石
７５ 電磁コイル
７６ ピストン
８１ 回転弁
８２ 回転軸
８３ 熱交換槽
８４ 反応槽
９１ インレットＡ
９２ アウトレットＡ
９３ インレットＢ
９４ アウトレットＢ
９５ メンブランＡ
９６ メンブランＢ
９７ 反応槽
９８ 熱交換槽
１０１ ロータリーバルブ
１０２ 溝
１０３ 熱交換槽
１０４ インレットＡ
１０５ アウトレットＡ
１０６ インレットＢ
１０７ アウトレットＢ
１０８ 流路
１０９ 反応槽
１１０ 温度
１１１ 経過時間
２０１ 蛍光検出器
２０２ 制御解析部
２０３ 制御信号
２０４ 光学窓
３０１ 蒸発防止機構
３０２ 密封部材
３０３ ガラスヒーター
３０４ 高分子シート
３０５ O-リング
３０６ 窪み（ウェル）
２ 反応槽枠
３ 熱交換槽
４ 液体リザーバタンク
５ 熱源
６ 攪拌機構
７ ポンプ
８ 切り替えバルブ
９ バイパス流路
１０ 補助温度制御機構
１１ インレットＡ
１２ インレットＢ
１３ アウトレットＡ
１４ アウトレットＢ
２１，２２，２３，２４，２６ 反応槽
２５ 凍結乾燥試薬
２７ 分注チップ
２８ サンプル
２９ 繊維玉
３１ 反応槽
３２ 反応槽枠
３３ 反応槽受け口
３４ ネジ山
３５ シール
３６ テーパー状反応槽枠
３７，３８ 熱交換槽
４１ インレットバルブＡ
４２ アウトレットバルブＡ
４３ インレットバルブＢ
４４ アウトレットバルブＢ
５１ スライドガラス型反応槽枠
５２，５８ 熱交換槽の反応槽受け口
５３ ガイドレール
５４，５７ シール
５５ スライド受け口
５６ ヒンジ
５９ 反応槽
６１ インレットＡ
６２ アウトレットＡ
６３ インレットＢ
６４ アウトレットＢ
６５ ピストン
６６ 反応槽
６７ 熱交換槽
７１ ピストン
７２ ピストンロッド
７３ ピストン
７４ 磁石
７５ 電磁コイル
７６ ピストン
８１ 回転弁
８２ 回転軸
８３ 熱交換槽
８４ 反応槽
９１ インレットＡ
９２ アウトレットＡ
９３ インレットＢ
９４ アウトレットＢ
９５ メンブランＡ
９６ メンブランＢ
９７ 反応槽
９８ 熱交換槽
１０１ ロータリーバルブ
１０２ 溝
１０３ 熱交換槽
１０４ インレットＡ
１０５ アウトレットＡ
１０６ インレットＢ
１０７ アウトレットＢ
１０８ 流路
１０９ 反応槽
１１０ 温度
１１１ 経過時間
２０１ 蛍光検出器
２０２ 制御解析部
２０３ 制御信号
２０４ 光学窓
３０１ 蒸発防止機構
３０２ 密封部材
３０３ ガラスヒーター
３０４ 高分子シート
３０５ O-リング
３０６ 窪み（ウェル）
Claims (29)
- サンプルを容れるための１または複数のウェルを有する反応槽と、
前記反応槽に熱を伝導しうるように該反応槽に接して設けられ、所定の温度の液体をそれぞれ導入および排出するためのインレットおよびアウトレットを備えた熱交換槽と、
液体をそれぞれ所定の温度に保つための温度制御可能な熱源を備えた複数の液体リザーバタンクと、
前記熱交換槽の前記インレットおよび前記アウトレットと前記液体リザーバタンクとの間を接続する管状の流路と、
前記管状流路上に設置された、前記熱交換槽と前記液体リザーバタンクとの間で前記液体を循環させるためのポンプと、
前記管状流路上に設置された、前記循環する前記液体の流れを制御するための切り替えバルブであって、前記複数の液体リザーバタンクからの所定の温度の前記液体の前記熱交換槽への流入を所定の時間間隔で切り替えることによって、前記反応槽の温度を所望の温度に制御する、切り替えバルブと、
を備え、
前記サンプルの量が１ウェル当たり数μＬ以下であり、循環させる前記液体の総容積が１液体リザーバタンク当たり数十ｍＬ以上である、
液体還流型反応制御装置。 - ＰＣＲ装置として使用する、請求項１に記載の液体還流型反応制御装置。
- さらに、前記サンプル中に蛍光色素を含有させた場合に、前記反応槽の温度切り替えに連動して前記ウェル内の前記蛍光色素が発する蛍光を検出し、蛍光強度の時間変化を測定するための蛍光検出手段を備える、請求項１または２に記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記蛍光検出手段が、前記反応槽の前記ウェルの各々に対応して設けられている、請求項３に記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記反応槽の一つまたは複数のウェルに配置された前記サンプル液の蛍光強度変化からサンプル液の温度変化を見積もる手段と、
その結果に基づいて前記反応槽の温度を迅速に変化させる手段と、
をさらに備える、請求項３または４に記載の液体還流型反応制御装置。 - 前記液体リザーバタンクの数が、前記反応槽の設定したい温度の数と同一である請求項１～５のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記液体リザーバタンクの数が、２または３である、請求項６に記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記反応槽の底面および壁面が、厚さ1ミクロンから100ミクロンのアルミ、ニッケル、マグネシウム、チタン、プラチナ、金、銀、銅を含む金属、もしくはシリコンから形成されている、請求項１～７のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記ウェルの底面の形状が、平底状、半球状、三角錐状、または球状である、請求項１～８のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記ウェルの各々に、反応に必要な試薬が乾燥した状態で予め内包されており、サンプル溶液との接触により溶出して反応を可能とする、請求項１～９のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記反応槽が、該反応槽内の前記サンプルからの光学信号の測定を容易にする孔もしくは光学窓をさらに備える、請求項１～１０のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記反応槽が、前記熱交換槽に対して着脱可能に設置されている、請求項１～１１のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記反応槽の前記熱交換槽への着脱方式が、
（ａ）前記反応槽の外周に筒状の枠を、前記熱交換槽に筒状の反応槽受け口を設け、前記反応槽の前記枠の外表面と、前記熱交換槽の反応槽受け口の内表面とにねじ山を設けて、該ねじ山に沿った回転運動により前記反応槽を前記熱交換槽に着脱可能に装着する方式、
（ｂ）前記反応槽の外周の前記筒状の枠および前記熱交換槽の前記筒状の反応槽受け口をそれぞれテーパー状にして、前記反応槽受け口に対して前記反応槽を着脱可能に圧着させる方式、
（ｃ）前記反応槽をスライドガラス状の反応槽枠内に固定し、前記熱交換槽の反応槽受け口にガイドレールを設け、該ガイドレールに沿って前記スライドガラス状の反応槽枠を着脱可能に装着する方式、および
（ｄ）前記スライドガラス状の反応槽枠を、ヒンジを有するスライド受けに挿入し、該ヒンジ機構に基づいた回転動作により、前記スライドガラス状の前記反応槽枠を前記熱交換槽の前記反応槽受け口に対して着脱可能に装着する方式、
のうちのいずれかである、請求項１２に記載の液体還流型反応制御装置。 - さらに、前記液体が還流している状態でありながら、前記液体を前記液体還流型反応制御装置の外部に漏らすことなく前記反応槽を前記熱交換槽から着脱することを可能とする機構を備えている、請求項１２または１３に記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記液体リザーバタンクが、熱源、温度計、液体攪拌系を備え、該液体攪拌系は該液体リザーバタンク内の液体を連続的もしくはデュティーサイクル比１０％以上で攪拌することにより、該液体リザーバタンク内の該液体の温度分布を５℃以内に抑制できる熱源制御系を備える、請求項１～１４のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記切り替えバルブの動作を制御する切り替えバルブ制御機構をさらに備える、請求項１～１５のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記切り替えバルブは、前記複数の液体リザーバタンクのうち、任意の液体リザーバタンクの液体を前記熱交換槽に導くことができ、前記熱交換槽中の前記液体を元の液体リザーバタンクに戻すことができる、請求項１～１６のいずれかに記載の液体還流型反応制御系。
- 前記切り替えバルブの制御により前記熱交換槽内の前記液体を置換する際、前記熱交換槽内部の前記液体はその温度に最も近い温度に保持されている液体リザーバタンクに導かれる様に前記切り替えバルブが制御される、請求項１６または１７に記載の液体還流型反応制御装置。
- さらに、断熱材、ヒーター、および冷却機構を含む補助温度制御機構であって、前記切り替えバルブと前記液体リザーバタンクとを結合する前記流路内部の前記液体の温度の変動を抑制する補助温度制御機構を備えている、請求項１～１８のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- さらに、前記切り替えバルブと前記液体リザーバタンクとを結合する前記流路内部の前記液体が前記熱交換槽に導かれるか非かにかかわらず、前記液体リザーバタンクからの前記液体と連続的に置換されることにより温度の変化を抑制する機構を前記切り替えバルブ内に備えている、請求項１～１９のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記切り替えバルブが、断面が円もしくは多角形の中空構造中をスライドするピストンから構成されており、該ピストンの位置によって前記反応槽に接する液体の温度を制御する、請求項１～２０のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記切り替えバルブにおいて、前記ピストンが、
（ａ）該ピストンに接続されたピストンロッドに対して機械的に外力を加えることによって、
（ｂ）自体磁性体であるピストンもしくは磁性体が内部に装着されたピストンを使用して、該ピストンと前記切り替えバルブ外部に配置された電磁コイルとを含む磁場発生機構との相互作用によって、または
（ｃ）ピストン両端に前記循環する液体の流れによる圧力差を生じさせることによって、
スライドする、請求項２１に記載の液体還流型反応制御装置。 - 前記切り替えバルブにおいて、
円柱状、円盤状、円錐状の回転体であって、前記液体リザーバタンクから送られた液体の流路となる複数の溝が外表面に形成され、さらに前記溝のそれぞれに流体連絡可能に接続されたトンネル状の流路が形成された回転体が、前記熱交換槽に回転可能に挿入されており、
前記トンネル状の流路の端がそれぞれ前記切り替えバルブのインレットまたはアウトレットとして機能し、
前記回転体が回転することにより、前記インレットに導入される異なる温度の液体が前記溝部分を流れる際に反応槽外部に接触する、請求項１～２０のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。 - 前記循環させる液体として、熱容量が大きく、かつ粘性が低い液体を用いる、請求項１～２３に記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記循環させる液体として、沸点が水の沸点より高い液体を用いる、請求項１～２４のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記循環させる液体として、凝固点が水の凝固点より低い液体を用いる、請求項１～２５のいずれかに記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記反応槽の前記ウェル側の表面を密封して覆う部材であって、該ウェル中のサンプル溶液の光学的な観察が可能なように少なくとも一部が光学的に透明な部材と、
前記部材の前記光学的に透明な部分を加熱する加熱機構と
を含むサンプル蒸発防止機構をさらに備える、請求項１に記載の液体還流型反応制御装置。 - 前記部材と前記反応槽の前記ウェル側の表面との距離が３ｍｍ以下である、請求項２７に記載の液体還流型反応制御装置。
- 前記加熱機構によって加熱される前記部材の前記光学的に透明な部分の温度が８０℃から１１０℃の範囲である、請求項２７に記載の液体還流型反応制御装置。
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