KR20120022841A - 액체 환류형 고속 유전자 증폭 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플을 수용하기 위한 1 개 또는 복수의 웰을 갖는 반응조와, 상기 반응조에 열을 전도할 수 있도록 그 반응조에 접하여 형성되고, 소정 온도의 액체를 각각 도입 및 배출하기 위한 인렛 및 아웃렛을 구비한 열 교환조와, 액체를 각각 소정 온도로 유지하기 위한 온도 제어할 수 있는 열원을 구비한 복수의 액체 저장 탱크와, 상기 열 교환조의 상기 인렛 및 상기 아웃렛과 상기 액체 저장 탱크 사이를 접속시키는 관 형상의 유로와, 상기 관 형상 유로 상에 설치된, 상기 열 교환조와 상기 액체 저장 탱크 사이에서 상기 액체를 순환시키기 위한 펌프와, 상기 관 형상 유로 상에 설치된, 상기 순환하는 상기 액체의 흐름을 제어하기 위한 전환 밸브로서, 상기 복수의 액체 저장 탱크로부터의 소정 온도의 상기 액체의 상기 열 교환조로의 유입을 소정 시간 간격으로 전환함으로써, 상기 반응조의 온도를 원하는 온도로 제어하는 전환 밸브를 구비하고, 상기 샘플의 양이 1 웰당 수 ㎕ 이하이고, 순환시키는 상기 액체의 총 용적이 1 액체 저장 탱크당 수십 ㎖ 이상인, 액체 환류형 반응 제어 장치를 제공한다.
Description
본 발명은 기초 생명 과학, 의학 기초 연구 및 의료 현장에 있어서, 신속하게 미량의 유전자 해석의 연구나 임상을 실시하기에 적합한 반응 용기를 사용한 유전자 해석 장치에 관한 것으로, 예를 들어 인간을 비롯한 동물이나 식물의 게놈 DNA, 메신저 RNA 등의 핵산 염기 배열로부터 특정 염기 배열을 고속으로 검출하기 위한 반응 장치를 취급하는 유전자 해석에 관한 것이다.
폴리머라아제 연쇄 반응 (Polymerase chain reaction, 이하, PCR 이라고 약기한다) 은, 여러 종류의 핵산의 혼합물로부터 특정 핵산 배열을 증폭시키는 방법이다. 혼합물 중에 게놈 DNA 혹은 메신저 RNA 로부터 역전사된 상보적 DNA 등의 DNA 템플레이트, 2 종류 이상의 프라이머와 열 안정성 효소, 마그네슘 등의 염, 및 4 종류의 데옥시리보뉴클레오시드3인산 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 을 넣어 핵산을 분리시키는 공정과, 상기 프라이머를 결합시키는 공정과, 열 안정성 효소에 의해 프라이머가 결합된 핵산을 주형으로 하여 하이브리다이제이션시키는 공정을 적어도 1 회 반복함으로써 특정 핵산 배열을 증폭시킬 수 있다. DNA 증폭 반응에 사용되는 반응 용기를 승온, 강온시킴으로써 열 사이클을 실시하고 있다. 온도 변화용 기구 (機構) 는 다양하게 들 수 있는데, 샘플을 포함한 반응 용기의 온도를 히터 내지 펠티에 소자, 온풍을 사용한 열 교환에 의해 변화시키는 기구, 반응 용기를 상이한 온도의 히터 블록 혹은 액체 배스에 교대로 접촉시킴으로써 온도를 변화시키는 기구, 상이한 온도의 영역을 갖는 유로 중에 샘플을 흘려 온도를 바꾸는 방법이 있다. 현 상황의 시판 장치로서 최속인 것으로서, 예를 들어 로슈 (ROCHE) 사의 라이트 사이클러 (Light Cycler) 에서는, 복수의 유리 캐필러리관 각각에 시료와 DNA 폴리머라아제와 프라이머가 되는 DNA 소편 및 계측용 형광 표지 색소를 도입하고, 이 캐필러리관 내의 미량 액적의 온도를 예를 들어 55 ℃ 와 95 ℃ 의 2 가지 온도 등, 변화시키고자 하는 액적의 온도와 동일한 온도의 온풍을 분사함으로써 변화시키고, 동시에 이 유리 캐필러리관에 형광 색소의 여기광을 조사하고, 얻어진 형광 강도를 계측하는 기구를 갖는 것이다. 이들 방법에 의해 샘플의 온도를 반복하여 변화시킬 수 있다.
또, 시료 함유 영역의 외벽에 유체 제트를 충돌시킴으로써, 시료 온도를 제어하는 유체 충돌 열 사이클러 장치가 보고되어 있다 (일본 공표특허공보 제2001 519224호 (특허문헌 1)).
히터 내지 펠티에 소자에서의 온도 속도는 매초 수 ℃ 정도로 느리고, 또한 온도의 오버슈트없이 온도를 변화시키는 것은 곤란하다. 기본적으로 고체 중의 열 전도를 이용하면 열원과 표면 사이에는 열 구배가 형성되어, 엄밀한 제어는 불가능하다. 또, 샘플이 히터 내지 펠티에 소자에 닿은 순간에 열을 빼앗겨, 표면 온도가 소정 온도로 복귀할 때까지의 지연이 발생한다. 또, 상이한 히터 내지 액체 배스에 반응조를 접촉시키는 경우에는, 이동용 기구가 복잡하거나, 히터 내지 액체 배스의 온도 제어가 곤란하다. 또한, 상이한 온도 영역을 갖는 유로 중에 샘플을 흘리는 방법에 있어서는, 샘플의 이동에 수반하여 유로 자체의 표면 온도가 변화하여 온도 제어가 곤란하다는 문제가 있다. 또, 온풍을 분사하여 온도 변화를 실시하는 경우에는, 공기의 열 용량이 적기 때문에, 다량의 공기를 분사할 필요가 있고, 또 마찬가지로 공기의 열 용량이 적기 때문에, 전열선 등에 의해 분사하는 공기의 최종적인 분출 온도를 1 ℃ 단위로 엄밀하게 제어하는 것은 곤란하다.
따라서, 본 발명은 정확한 온도 제어, 온도 측정과 신속한 승온, 강온을 실시할 수 있는 반응 제어 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 정확한 온도 제어, 온도 측정과 신속한 승온, 강온을 실시할 수 있고, 이로써 고속이며, 고정밀도, 고증폭률의 PCR 반응을 실시할 수 있는 DNA 증폭 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 반응 제어 장치는, 샘플액의 온도 변화에 대하여, 변화시키고자 하는 복수의 온도에 대하여, 각 온도가 유지된 열 용량이 큰 액체를 열 교환 매체에 사용하는 것과, 이 열 용량이 큰 복수의 상이한 온도의 액체를 고속으로 변화시키는 수단과, 이 열 용량이 큰 액체와 샘플액의 열 교환이 신속하게 행해지는 미소 반응조를 사용하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 열 교환에 적합한 구조 및 재질로 구성되는 미소 반응조와, 각 반응에 적합한 온도의 액체를 미소 반응조 외부로 순환시키는 열 교환조와, 액체의 온도를 고정밀도로 유지하는 열원을 포함하는 복수의 액체 저장 탱크와, 미소 반응조의 온도를 신속하게 변화시키기 위해 임의의 액체 저장 탱크로부터 반응조 외부로 액체 유도하기 위한 전환 밸브계와, 상기 밸브계의 전환시에 상이한 온도의 액체의 혼합 방지 기구로 구성되어 있다.
즉, 본 발명은 이하의 액체 환류형 반응 제어 장치를 제공한다.
(1) 샘플을 수용하기 위한 1 개 또는 복수의 웰을 갖는 반응조와,
상기 반응조에 열을 전도할 수 있도록 그 반응조에 접하여 형성되고, 소정 온도의 액체를 각각 도입 및 배출하기 위한 인렛 및 아웃렛을 구비한 열 교환조와,
액체를 각각 소정 온도로 유지하기 위한 온도 제어할 수 있는 열원을 구비한 복수의 액체 저장 탱크와,
상기 열 교환조의 상기 인렛 및 상기 아웃렛과 상기 액체 저장 탱크 사이를 접속시키는 관 형상의 유로와,
상기 관 형상 유로 상에 설치된, 상기 열 교환조와 상기 액체 저장 탱크 사이에서 상기 액체를 순환시키기 위한 펌프와,
상기 관 형상 유로 상에 설치된, 상기 순환하는 상기 액체의 흐름을 제어하기 위한 전환 밸브로서, 상기 복수의 액체 저장 탱크로부터의 소정 온도의 상기 액체의 상기 열 교환조로의 유입을 소정 시간 간격으로 전환함으로써, 상기 반응조의 온도를 원하는 온도로 제어하는 전환 밸브를 구비하고,
상기 샘플의 양이 1 웰당 수 ㎕ 이하이고, 순환시키는 상기 액체의 총 용적이 1 액체 저장 탱크당 수십 ㎖ 이상인, 액체 환류형 반응 제어 장치.
(2) PCR 장치로서 사용하는, 상기 (1) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(3) 추가로, 상기 샘플 중에 형광 색소를 함유시킨 경우에, 상기 반응조의 온도 전환에 연동하여 상기 웰 내의 상기 형광 색소가 발하는 형광을 검출하여, 형광 강도의 시간 변화를 측정하기 위한 형광 검출 수단을 구비하는, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(4) 상기 형광 검출 수단이, 상기 반응조의 상기 웰 각각에 대응하여 형성되어 있는, 상기 (3) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(5) 상기 반응조의 1 개 또는 복수의 웰에 배치된 상기 샘플액의 형광 강도 변화로부터 샘플액의 온도 변화를 추측하는 수단과,
그 결과에 기초하여 상기 반응조의 온도를 신속하게 변화시키는 수단을 추가로 구비하는, 상기 (3) 또는 (4) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(6) 상기 액체 저장 탱크의 수가, 상기 반응조의 설정하고자 하는 온도의 수와 동일한 상기 (1) ? (5) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(7) 상기 액체 저장 탱크의 수가 2 개 또는 3 개인, 상기 (6) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(8) 상기 반응조의 바닥면 및 벽면이, 두께 1 미크론 내지 100 미크론의 알루미늄, 니켈, 마그네슘, 티탄, 플라티나, 금, 은, 구리를 함유하는 금속, 혹은 실리콘으로 형성되어 있는, 상기 (1) ? (7) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(9) 상기 웰의 바닥면의 형상이, 평저 형상, 반구 형상, 삼각뿔 형상 또는 구 형상인, 상기 (1) ? (8) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(10) 상기 웰 각각에, 반응에 필요한 시약이 건조된 상태에서 미리 내포되어 있고, 샘플 용액과의 접촉에 의해 용출시켜 반응을 가능하게 하는, 상기 (1) ? (9) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(11) 상기 반응조가, 그 반응조 내의 상기 샘플로부터의 광학 신호의 측정을 용이하게 하는 구멍 혹은 광학 창을 추가로 구비하는, 상기 (1) ? (10) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(12) 상기 반응조가, 상기 열 교환조에 대해 착탈할 수 있게 설치되어 있는, 상기 (1) ? (11) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(13) 상기 반응조의 상기 열 교환조에 대한 착탈 방식이,
(a) 상기 반응조의 외주에 통 형상의 프레임을, 상기 열 교환조에 통 형상의 반응조 수용구를 형성하고, 상기 반응조의 상기 프레임의 외표면과, 상기 열 교환조의 반응조 수용구의 내표면에 나사산을 형성하고, 그 나사산을 따른 회전 운동에 의해 상기 반응조를 상기 열 교환조에 착탈할 수 있게 장착하는 방식,
(b) 상기 반응조 외주의 상기 통 형상의 프레임 및 상기 열 교환조의 상기 통 형상의 반응조 수용구를 각각 테이퍼 형상으로 하여, 상기 반응조 수용구에 대해 상기 반응조를 착탈할 수 있게 압착시키는 방식,
(c) 상기 반응조를 슬라이드 글라스 형상의 반응조 프레임 내에 고정시키고, 상기 열 교환조의 반응조 수용구에 가이드 레일을 형성하고, 그 가이드 레일을 따라 상기 슬라이드 글라스 형상의 반응조 프레임을 착탈할 수 있게 장착하는 방식, 및
(d) 상기 슬라이드 글라스 형상의 반응조 프레임을, 힌지를 갖는 슬라이드 수용구에 삽입하고, 그 힌지 기구에 기초한 회전 동작에 의해, 상기 슬라이드 글라스 형상의 상기 반응조 프레임을 상기 열 교환조의 상기 반응조 수용구에 대해 착탈할 수 있게 장착하는 방식,
중 어느 것인, 상기 (12) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(14) 추가로, 상기 액체가 환류하고 있는 상태이면서, 상기 액체를 상기 액체 환류형 반응 제어 장치의 외부로 누출시키지 않고 상기 반응조를 상기 열 교환조로부터 착탈할 수 있게 하는 기구를 구비하고 있는, 상기 (12) 또는 (13) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(15) 상기 액체 저장 탱크가, 열원, 온도계, 액체 교반계를 구비하고, 그 액체 교반계는 그 액체 저장 탱크 내의 액체를 연속적 혹은 듀티 사이클비 10 ％ 이상으로 교반함으로써, 그 액체 저장 탱크 내의 그 액체의 온도 분포를 5 ℃ 이내로 억제할 수 있는 열원 제어계를 구비하는, 상기 (1) ? (14) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(16) 상기 전환 밸브의 동작을 제어하는 전환 밸브 제어 기구를 추가로 구비하는, 상기 (1) ? (15) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(17) 상기 전환 밸브는, 상기 복수의 액체 저장 탱크 중, 임의의 액체 저장 탱크의 액체를 상기 열 교환조로 유도할 수 있고, 상기 열 교환조 중의 상기 액체를 원래의 액체 저장 탱크로 되돌릴 수 있는, 상기 (1) ? (16) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어계.
(18) 상기 전환 밸브의 제어에 의해 상기 열 교환조 내의 상기 액체를 치환할 때, 상기 열 교환조 내부의 상기 액체는 그 온도에 가장 가까운 온도로 유지되고 있는 액체 저장 탱크로 유도되도록 상기 전환 밸브가 제어되는, 상기 (16) 또는 (17) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(19) 추가로, 단열재, 히터 및 냉각 기구를 포함하는 보조 온도 제어 기구로서, 상기 전환 밸브와 상기 액체 저장 탱크를 결합시키는 상기 유로 내부의 상기 액체의 온도의 변동을 억제하는 보조 온도 제어 기구를 구비하고 있는, 상기 (1) ? (18) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(20) 추가로, 상기 전환 밸브와 상기 액체 저장 탱크를 결합시키는 상기 유로 내부의 상기 액체가 상기 열 교환조로 유도되는지 여부에 관계없이, 상기 액체 저장 탱크로부터의 상기 액체와 연속적으로 치환됨으로써 온도의 변화를 억제하는 기구를 상기 전환 밸브 내에 구비하고 있는, 상기 (1) ? (19) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(21) 상기 전환 밸브가, 단면이 원 혹은 다각형의 중공 구조 안을 슬라이드하는 피스톤으로 구성되어 있고, 그 피스톤의 위치에 의해 상기 반응조에 접하는 액체의 온도를 제어하는, 상기 (1) ? (20) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(22) 상기 전환 밸브에 있어서, 상기 피스톤이,
(a) 그 피스톤에 접속된 피스톤 로드에 대해 기계적으로 외력을 가함으로써,
(b) 자체 자성체인 피스톤 혹은 자성체가 내부에 장착된 피스톤을 사용하여, 그 피스톤과 상기 전환 밸브 외부에 배치된 전자 코일을 포함하는 자장 (磁場) 발생 기구의 상호 작용에 의하거나, 또는
(c) 피스톤 양단에 상기 순환하는 액체의 흐름에 의한 압력차를 발생시킴으로써 슬라이드하는, 상기 (21) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(23) 상기 전환 밸브에 있어서,
원주 형상, 원반 형상, 원추 형상의 회전체로서, 상기 액체 저장 탱크로부터 이송된 액체의 유로가 되는 복수의 홈이 외표면에 형성되고, 또한 상기 홈 각각에 유체 연락할 수 있게 접속된 터널 형상의 유로가 형성된 회전체가, 상기 열 교환조에 회전할 수 있게 삽입되어 있고,
상기 터널 형상의 유로의 단 (端) 이 각각 상기 전환 밸브의 인렛 또는 아웃렛으로서 기능하며,
상기 회전체가 회전함으로써, 상기 인렛에 도입되는 상이한 온도의 액체가 상기 홈 부분을 흐를 때에 반응조 외부에 접촉하는, 상기 (1) ? (20) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(24) 상기 순환시키는 액체로서, 열 용량이 크고, 또한 점성이 낮은 액체를 사용하는, 상기 (1) ? (23) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(25) 상기 순환시키는 액체로서, 비점이 물의 비점보다 높은 액체를 사용하는, 상기 (1) ? (24) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(26) 상기 순환시키는 액체로서, 응고점이 물의 응고점보다 낮은 액체를 사용하는, 상기 (1) ? (25) 중 어느 하나에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(27) 상기 반응조의 상기 웰측의 표면을 밀봉하여 덮는 부재로서, 그 웰 중의 샘플 용액의 광학적인 관찰이 가능하도록 적어도 일부가 광학적으로 투명한 부재와,
상기 부재의 상기 광학적으로 투명한 부분을 가열하는 가열 기구를 포함하는 샘플 증발 방지 기구를 추가로 구비하는, 상기 (1) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(28) 상기 부재의 상기 광학적으로 투명한 부분과 상기 반응조의 상기 웰의 어느 표면의 거리가 3 ㎜ 이하인, 상기 (27) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
(29) 상기 가열 기구에 의해 가열되는 상기 부재의 상기 광학적으로 투명한 부분의 온도가 80 ℃ 내지 110 ℃ 의 범위인, 상기 (27) 에 기재된 액체 환류형 반응 제어 장치.
환류하는 액체로 반응조의 온도를 제어하는 본 발명의 이점으로서, 다음과 같은 것을 들 수 있다. 먼저, 온도의 오버슈트 문제를 해결할 수 있다. 즉, 항상 환류하고 있는 액체의 온도는 거의 일정하기 때문에, 반응조 표면의 온도와 액체의 온도는 거의 순식간에 평형화할 수 있다. 본 발명에 있어서, 반응조 및 샘플의 열 용량은, 환류하고 있는 액체와 비교하여 미미한 것이고, 또 국소적으로 액체로부터 열을 빼앗겼다고 해도 액체는 연속해서 흘러오는 것이기 때문에, 열 구배는 기본적으로 발생하지 않는다. 물론, 반응조의 온도는 액체의 온도를 초과하는 경우는 없다. 본 발명의 대표적인 실시형태에 의하면, 상이한 온도의 액체를 열 교환조에 순차적으로 흘려넣음으로써, 0.5 초 이내에 30 ℃ 이상 온도를 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 온도 변경에 필요한 시간을 매우 짧게 할 수 있기 때문에, 예를 들어, PCR 반응을 수행하기 위한 토털 타임을 종래의 장치보다 현격히 단축시킬 수 있다.
본 발명에 따른 반응 제어 장치에 있어서는, 열 전도율이 우수한 반응조의 외부에 일정 온도로 유지된 액체를 접촉시키고, 또한 상이한 온도의 액체로 신속하게 치환함으로써, 샘플 온도를 고정밀도로 제어하는 것, 및 신속한 승온, 강온이 가능해진다. 본 발명에 의하면, 고속, 고정밀도, 고증폭률의 PCR 반응을 실시할 수 있다.
또, 본 발명은 샘플 용액이 가열됨에 의한 샘플액의 증발을 방지할 수 있기 때문에, 미량의 샘플을 사용하는 PCR 반응에 있어서 유리하다.
도 1 은 본 발명의 반응 제어 장치의 전체 구성을 나타내는 모식도이다.
도 2 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 열 교환조의 개략도이다.
도 3 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 반응조의 형태와 동결 건조 시약의 용해 방법을 나타내는 모식도이다.
도 4 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 원주형 반응조 프레임과 열 교환조에 대한 장착 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 밸브의 전환 시퀀스를 나타내는 모식도이다.
도 6 은 본 발명의 반응 제어 장치를 사용하여 실시한 (A) 온도 변화에 관한 데이터와, (B) PCR 반응의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 슬라이드 글라스형 반응조 프레임과 열 교환조에 대한 장착 방법을 나타내는 모식도이다.
도 8 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 슬라이드형 피스톤 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 9 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 슬라이드형 피스톤 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 10 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 회전 밸브식 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 11 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 멤브레인에 의한 온도 변화 기구를 나타내는 모식도이다.
도 12 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 온도 설정형 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 13 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 열 교환조의 구성의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 열 교환조의 개략도이다.
도 3 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 반응조의 형태와 동결 건조 시약의 용해 방법을 나타내는 모식도이다.
도 4 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 원주형 반응조 프레임과 열 교환조에 대한 장착 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 밸브의 전환 시퀀스를 나타내는 모식도이다.
도 6 은 본 발명의 반응 제어 장치를 사용하여 실시한 (A) 온도 변화에 관한 데이터와, (B) PCR 반응의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 슬라이드 글라스형 반응조 프레임과 열 교환조에 대한 장착 방법을 나타내는 모식도이다.
도 8 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 슬라이드형 피스톤 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 9 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 슬라이드형 피스톤 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 10 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 회전 밸브식 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 11 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 멤브레인에 의한 온도 변화 기구를 나타내는 모식도이다.
도 12 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 온도 설정형 밸브의 구동 기구를 나타내는 모식도이다.
도 13 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 열 교환조의 구성의 일례를 나타내는 모식도이다.
이하, 도면을 참조하면서 본 발명의 실시형태에 대하여 설명하지만, 이들 실시형태는 예시로서, 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
도 1 은 본 발명의 반응 제어 장치의 일 실시형태의 전체 구성을 나타내는 모식도이다. 본 발명의 반응 제어 장치는, 전형적으로는 반응조 (1 ; reaction vessel), 반응조 프레임 (2), 열 교환조 (3 ; heat exchange vessel), 액체 저장 탱크 (4 ; liquid reservoir tank), 열원 (5), 교반 기구 (6), 펌프 (7), 전환 밸브 (8), 바이패스 유로 (9), 및 보조 온도 제어 기구 (10) 를 구비한다. 바람직하게는 추가로 형광 검출기 (201), 및 제어 신호 (203) 를 보내기 위한 제어 해석부 (202), 및 광학 창 (204 ; 또는 구멍) 을 구비한다.
반응조 (1) 는, 전형적으로는 패임부 (웰) 를 복수 개 갖는 알루미늄, 니켈, 마그네슘, 티탄, 플라티나, 금, 은 및 구리 등의 금속, 혹은 실리콘 등의 박판 등으로 구성될 수 있는데, 열 전도성이 높고, PCR 을 방해하지 않는 재료라면 이들 재료에 한정되지 않는다. 또, 금속 박막의 표면을 플라스틱 등의 친수성이면서 또한 금속의 부식을 방지하는 소재로 피복해도 된다. 패임부 영역에 있어서의 박판의 두께는, 열 전도성을 높이기 위해 주위에 비해 얇게 구성되어 있는 것이 바람직하고, 전형적으로는 10 내지 30 미크론 정도의 두께인데, 이것에 한정되지 않는다. 인접한 패임부 간의 영역은 전체적으로 강도를 담보하기 위해 보다 두껍게 되어 있는 것이 바람직하고, 전형적으로는 두께가 100 미크론 내지 500 미크론의 범위에 있는데, 이것에 한정되지 않는다. 반응조 (1) 는, 전형적으로는 사각, 원형 등의 형상의 반응조 프레임 (2) 의 바닥면에 고정되어 일체적으로 형성된다. 반응조 (1) 및 반응조 프레임 (2) 은, 전형적으로는 열 교환조 (3) 에 대해 착탈할 수 있게 구성된다 (도 4 를 참조).
열 교환조 (3) 에는 열 교환용 액체가 도입되어 사용된다. 도입되는 액체의 온도는, 액체 저장 탱크 (4) 의 내부에 배치되어 있는 열원 (5) 에 의해 제어되고 있다. 열원 (5) 의 표면으로부터 신속하게 열을 빼앗아, 액체 저장 탱크 (4) 내부의 온도를 균일하게 하기 위해, 교반 기구 (6) 가 구비되어 있는 것이 바람직하다. 액체 저장 탱크 (4) 중의 액체는, 펌프 (7) 에 의해 유로 내부로 유도된다. 전환 밸브 (8) 에 의해, 액체는 열 교환조 (3) 로 유도되거나, 바이패스 유로 (9) 로 유도됨으로써 직접 액체 저장 탱크 (4) 로 되돌아간다. 필요에 따라 보조 온도 제어 기구 (10) 에 의해 액체의 온도가 미묘하게 제어되어, 액체 저장 탱크 (4) 내부의 온도 변동을 억제하도록 되어 있다.
열 교환조 (3) 에 도입되는 액체로는 물을 사용해도 되지만, 이것에 한정되지 않고, 열 용량이 크고 또한 점성이 낮은 액체 (예：액체 암모니아) 라면 임의의 것을 사용할 수 있다. 또, 예를 들어 물보다 비점이 높은 액체를 사용함으로써 확실하게 샘플액을 100 ℃ 로 하거나, 혹은 물보다 응고점이 낮은 액체를 사용함으로써, 장치 내에서 순환하는 액체의 응고를 방지하면서 물의 응고점까지의 온도의 변화를 확실하게 실시할 수도 있다.
바람직하게는, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 반응조 프레임 (2) 에는, 반응조 (1) 내의 샘플액의 반응에 의해 변화하는 샘플액 중의 형광 색소의 형광 강도의 변화를 1 개 혹은 복수의 반응조 각각에 대하여 계측할 수 있도록, 형광 색소의 여기광 및 형광을 투과하는 광학 창 (204) 이 배치되어 있다. 또, 형광 검출기 (201) 가 배치됨으로써, 계측된 각 반응조 (1) 의 형광 강도의 시간 변화를 계측할 수 있다. 도 1 의 실시예에서는, 복수의 형광 검출기 (201) 내에 각각 여기광 조사 기구와 형광 검출 기구가 구비되어 있으며, 예를 들어, PCR 반응을 실시하게 하는 경우에는, 상이한 프라이머 혹은 상이한 샘플액을 적하한 복수의 반응조 (1) 각각의 상이한 PCR 증폭 정보를 독립적으로 계측할 수 있는 구성으로 되어 있다. 또, 형광 검출기 (201) 에 의해 취득된 형광 강도 데이터는, 제어 해석부 (202) 에서 기록되어, PCR 반응에 의해 얻어진 샘플액 내의 DNA 량 혹은 mRNA 량을 추측하는 기능을 갖는다. 또한, 제어 해석부 (202) 에서는, 전환 밸브 (8) 의 전환 정보를 취득함으로써, 밸브 전환 후의 샘플액의 온도 변화가 목적하는 온도에 이르렀는지 여부를 형광 강도의 시간 변화로부터 추측하는 기능, 및 그 결과에 기초하여 밸브 전환을 제어하는 기구도 갖는다. 이것은 형광 색소가 보편적으로 갖는 물 분자의 운동에 기초한 형광 소광이 액온에 의존하는 것을 이용하여, 형광 강도의 단위 시간에서의 변화량이 작아지는 것 혹은 제로가 되는 것으로부터 추측하는 것으로서, 특히, DNA 를 변성시키는 고온 상태의 달성의 확인에 유효하다.
또, 도 1 에 나타내는 실시예에서는, 각 반응조 (1) 에 1 개의 검출기를 배치하는 구성을 나타냈는데, 형광 여기용 광원과 냉각 CCD 카메라 등의 형광 정량 검출이 가능한 카메라를 조합하여 복수의 반응조 (1) 의 형광 강도 변화를 계측해도 된다. 혹은 반응조 (1) 의 수보다 적은 검출기를 사용하는 경우에는, X-Y 면에서 고속으로 이동할 수 있는 기계식 구동 기구를 검출기와 조합함으로써 모든 반응조 (1) 의 형광 강도를 계측해도 된다.
또, 샘플액의 용량은, 통상적으로 1 웰당 수 ㎕ 이하이지만, 1 웰당 0.1 ㎕ ? 100 ㎕ 의 범위를 사용할 수 있고, 바람직하게는 1 웰당 0.5 ㎕ ? 10 ㎕ 이고, 더욱 바람직하게는 1 웰당 1 ㎕ ? 10 ㎕ 이고, 더욱 더 바람직하게는 1 웰당 1 ㎕ ? 5 ㎕ 이며, 가장 바람직하게는 1 웰당 1 ㎕ ? 2 ㎕ 이다. 웰에는 샘플액 외에, 샘플액의 증발을 방지하기 위한 미네랄 오일 등을 함유시켜도 된다. 미네랄 오일의 용량으로는 수 ㎕ (예：3 ? 4 ㎕) 정도가 바람직하지만, 이것에 한정되지 않고, 웰의 크기나 샘플량에 따라 적절히 변경할 수 있음은 당업자에게 분명하다.
도 2 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 열 교환조 (3) 의 개략도이다. 열 교환조 (3) 는, 기본 구성으로서, 상이한 온도의 액체를 도입하는 인렛 A (11), 인렛 B (12) 를 구비한다. 또, 열 교환조 (3) 는 열 교환조 (3) 의 액체를 액체 저장 탱크 (4) 로 되돌리기 위한 복수의 아웃렛, 아웃렛 A (13) 및 아웃렛 B (14) 를 구비한다. 도 2A 는 액체 저장 탱크 (4) 로부터의 임의의 온도의 액체를 인렛 A (11) 로부터 도입하고, 아웃렛 A (13) 로부터 배출하는 모습을, 도 2B 는 액체 저장 탱크 (4) 로부터의 다른 온도의 액체를 인렛 B (12) 로부터 도입하고, 아웃렛 B (14) 로부터 배출하는 모습을 각각 모식적으로 나타낸다. 인렛의 수는 2 개에 한정되지 않고, 샘플액의 온도를 변화시키고자 하는 복수의 온도에 일치하는 수만큼 2 온도분 이상의 복수를 준비할 수 있다. 예를 들어, 3 온도계를 달성하고자 하는 경우에는 인렛의 수는 3 개가 된다. 아웃렛의 수도 인렛의 경우와 마찬가지로 2 개에 한정되지 않는다. 또한, 도 2 중의 화살표는 열 교환조 (3) 에 도입 또는 열 교환조 (3) 로부터 배출하는 액체가 흐르는 방향을 대략적으로 나타낸 것이다.
열 교환조 (3) 와 액체 저장 탱크 (4) 사이를 순환시키는 액체의 총 용적은, 액체의 열 용량이나 온도의 안정성 등을 고려하여 통상적으로 수십 ㎖ 이상이고, 바람직하게는 100 ㎖ 이상, 보다 바람직하게는 200 ㎖ 이상, 또한 가장 바람직하게는 300 ㎖ 이상이다. 용적의 상한은, 장치의 가반성 등을 고려하여 적절히 설정할 수 있다.
열 교환조 (3) 의 용량은, 웰당 샘플량의 약 10 배 이상이 바람직하고, 약 100 배 이상인 것이 보다 바람직하며, 약 1000 배 이상이면 가장 바람직하다. 전형적으로는, 열 교환조의 용량은 1 웰에 대해 약 0.01 ㎖ ? 10 ㎖ 이고, 보다 바람직하게는 약 0.05 ㎖ ? 5 ㎖ 이며, 가장 바람직하게는 약 0.1 ㎖ ? 2 ㎖ 이다.
도 3 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 반응조의 형태와 동결 건조 시약의 용해 방법을 나타내는 모식도이다. 여러 가지 형상의 반응조 또는 웰을 사용할 수 있으며, 도 3A 는 일례로서, 열 교환조의 액체와 접하는 면이 플랫한 반응조 A (21), 반구 형상인 반응조 B (22), 삼각뿔 형상인 반응조 C (23), 구 형상인 반응조 D (24) 를 각각 나타내고 있다. 열 전도의 효율을 생각하면, 열 교환조의 액체와 접하는 면의 면적이 클수록 효율이 양호하다는 것은 당업자라면 용이하게 이해할 수 있다.
반응에 필요한 시약은 동결 건조시켜 두면 편리하다. 도 3B 에 나타내는 바와 같이, 반응조 (26) 의 바닥부에 동결 건조 시약 (25) 을 조제해 두는 것은 가능하다. 또, 샘플을 분주 (分注) 할 때에 사용되는 분주 칩 (27) 내부에 플러그 형상의 동결 건조 시약 (25) 을 형성해 두면, 샘플액 (28) 을 상하로 이동시킴으로써 시약을 샘플 중으로 용해시킬 수 있다. 또는 나일론 섬유 등이 다발져 있는 섬유 구슬 (29) 표면에 동결 건조 시약 (25) 을 형성해 두고, 반응조 (26) 내부의 샘플액 (28) 중으로 삽입하여 교반함으로써 동결 건조 시약을 용해시킬 수도 있다.
도 4 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 원주형 반응 프레임 (32), 및 그 열 교환조 (37) 에 대한 장착 방법을 나타내는 모식도이다. 박막으로 구성되어 있는 반응조를 직접 핸들링하는 것은 불편하기 때문에, 도 4A 에 나타내는 바와 같이, 반응조 (31) 를 반응조 프레임 (32) 에 고정시키면 편리하다. 반응조 프레임 (32) 은 단열성 재질인 폴리스티렌, 폴리카보네이트, PEEK, 아크릴 등으로 형성하는 것이 바람직하다. 또, 반응조 (31) 와의 결합 면적을 가능한 한 작게 (예：5 ㎟ 이하) 억제하는 것이 반응조 (31) 의 신속하고 또한 고정밀도의 승온, 강온에 바람직하다.
도 4B 는 반응조 (31) 를 열 교환조 (37) 에 장착하는 1 개의 양태로서, 반응조 프레임 (32) 의 표면에 나사산 (34) 을 형성해 두고, 반응조 프레임 (32) 을 열 교환조 (37) 의 반응조 수용구 (33) 에 비틀어 넣는 방법을 나타낸다. 도 4B 에 나타내는 바와 같이, 수밀성의 유지를 위해, 개구부에 시일 (35) 을 장착하는 것이 바람직하다. 도 4C 는 또 다른 장착 방법을 나타낸다. 도 4C 에 나타내는 바와 같이, 테이퍼 형상 반응조 프레임 (36) 을 채용하여, 압력만으로 열 교환조 (38) 에 장착할 수도 있다.
도 5 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 밸브의 전환 기구의 구체예를 나타낸다. 반응조에 액체를 도입하기 위한 인렛 밸브 A (41), 인렛 밸브 B (43), 외부로 유도하기 위한 아웃렛 밸브 A (42) 와 아웃렛 밸브 B (44) 가 도시되어 있다. 인렛 밸브 A (41) 로부터 유도되는 액체는 아웃렛 밸브 A (42) 로부터 액체 저장 탱크 (4) 로 되돌아가고, 인렛 밸브 A (43) 로부터 유도되는 액체는 아웃렛 밸브 B (44) 로부터 다른 액체 저장 탱크 (4) 로 되돌아간다. 이 2 가지 상태를 교대로 교환함으로써 반응조 중의 샘플을 반응시킬 수 있다. 더욱 바람직한 밸브 전환 방법으로는, 상기 2 가지 상태 이외에, 인렛 밸브 B (43) 와 아웃렛 밸브 A (42), 혹은 인렛 밸브 A (41) 와 아웃렛 밸브 B (44) 가 일순간에 동시에 개방됨으로써, 상이한 온도의 액체가 혼합되는 것을 억제할 수 있어, 각각의 계의 액체 저장 탱크의 온도 제어가 용이해진다.
액체의 순환 속도는 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 약 1 ㎖/초 ? 100 ㎖/초이고, 보다 바람직하게는 5 ㎖/초 ? 50 ㎖/초이며, 가장 바람직하게는 7 ㎖/초 ? 15 ㎖/초이다.
도 6A 는 상기 기구를 사용함으로써 실현시킬 수 있었던 온도 제어에 관한 데이터로부터 얻어진 그래프를 나타낸다. 도 6A 에 나타내는 바와 같이, 1.5 초와 같은 단시간에 온도를 60 ℃ 로부터 92 ℃ 로 승온시키고, 또 60 ℃ 로 되돌릴 수 있다. 도 6B 는 리얼 타임 PCR 에 의한 결과를 나타내는 그래프이다. PCR 을 실시할 때의 용액 조건은 이하와 같다. 반응 버퍼 1.0 ㎕, 2 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 ㎕, 25 mM 황산마그네슘 1.2 ㎕, 10 ％ 소의 태자 (胎仔) 혈청 0.125 ㎕, SYBR Green I 0.5 ㎕, 프라이머 2 종류 각 0.6 ㎕, 멸균수 3.725 ㎕, KOD plus polymerase 0.25 ㎕, 게놈 DNA 1.0 ㎕ 의 비율로 혼합하였다. 온도 조건으로는, 먼저 95 ℃ 에서 10 sec 실시하고, 다음으로 95 ℃ 에서 1 sec, 60 ℃ 에서 3 sec 의 온도 변화를 40 사이클 실시하였다. 액체의 순환 속도는 약 10 ㎖/초였다.
도 7 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 반응조 (59) 및 반응조 프레임 (51) 의 열 교환조에 대한 탈착 방법에 관한 변형예를 나타낸다. 반응조 (59) 는, 슬라이드 글라스형 반응조 프레임 (51) 에 부착되어 장착되어 있다 (도 7A). 이 슬라이드 글라스형 반응조 프레임 (51) 을 열 교환조에 장착함에 있어서, 가이드 레일 (53) 을 따라 반응조 프레임 (51) 을 옆으로 슬라이드시키고, 시일 (54) 에 가압하여 고정시킬 수 있다 (도 7B). 또는 슬라이드 글라스형 반응 프레임 (51) 을 슬라이드 수용구 (55) 에 삽입하고, 힌지 (56) 를 활용하여 시일 (57) 에 가압할 수도 있다 (도 7C).
도 8 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 밸브의 전환 기구의 변형예를 나타내는 모식도로서, 도 5 에 나타낸 것과는 상이한 슬라이드형 피스톤 밸브의 구동 기구를 나타낸다. 반응조 (66) 의 온도를 바꾸는 밸브 기구로서 좌우로 슬라이드할 수 있는 피스톤 (65) 을 사용한다. 피스톤 (65) 의 좌측에는 인렛 A (61) 로부터 열 교환조 (67) 로 액체가 도입되고, 아웃렛 A (62) 로부터 외부로 유도된다. 피스톤 (65) 의 우측에는 인렛 B (63) 로부터 열 교환조 (67) 로 액체가 도입되고, 아웃렛 B (64) 로부터 외부로 유도된다. 피스톤 (65) 이 반응조 (66) 에 대해 오른쪽으로 슬라이드하면, 반응조 (66) 는 인렛 A (61) 로부터 도입된 액체의 온도와 평형에 이르고, 반대로 좌측으로 슬라이드하면 인렛 B (63) 로부터 도입되는 액체의 온도와 평형에 이른다. 또, 피스톤 (65) 이 반응조 (66) 바로 밑에 위치하는 경우에는, 액체가 누출되는 일 없이 반응조 (66) 를 떼어낼 수 있다. 피스톤 (65) 은 단열성이 우수한 소재로 제작하거나, 내부가 공동 (空洞) 으로 되어 있어 기체로 채워져 있거나, 또는 진공 상태에 있는 것이 바람직하다. 또한, 도 8 중의 화살표는 액체가 흐르는 방향을 대략적으로 나타낸다.
도 9 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 피스톤 밸브의 피스톤의 구동 기구의 몇 가지 변형예를 나타낸다. 한 가지 방법으로는, 피스톤 (71) 이 피스톤 로드 (72) 와 일체로 되어 있어, 외부에서 직접 움직이게 하는 방법이다 (도 9A). 다른 방법으로는, 피스톤 (73) 을 철, 니켈 등의 강자성 재료로 제작하거나, 그 밖의 소재로 제작된 피스톤의 내부에 자석 (74) 을 삽입한다. 외부에 전자 코일 (75) 을 설치하고, 전류를 제어함으로써, 피스톤 (73) 을 좌우로 슬라이드한다 (도 9B). 또 하나의 방법으로는, 인렛측의 압력 혹은 아웃렛의 유체 저항을 제어함으로써, 피스톤 (76) 양측에서의 압력차를 이용하여 피스톤 (76) 을 좌우로 슬라이드할 수도 있다 (도 9C). 또한, 도 9 중의 흰색 화살표는 피스톤이 움직이는 방향을 나타내고, 검은색 화살표는 유체의 흐름을 나타내고, 화살표의 방향에 의해 유체가 흐르는 방향을, 화살표의 굵기에 의해 유량을 대략적으로 나타낸다.
도 10 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 밸브의 전환 기구의 다른 형태를 나타낸다. 회전축으로서의 막대 (82) 가 결합되어 있는 기울어진 타원형의 판으로 이루어지는 회전 밸브 (81) 가, 단면이 원형인 열 교환조 (83) 내부에 삽입되어 있다. 회전 밸브 (81) 는 열 교환조 (83) 를 좌우로 분단시키고 있고, 회전축 (82) 을 돌림으로써, 열 교환조의 오른쪽 혹은 왼쪽으로부터 도입되는 액체를 반응조 (84) 로 유도할 수 있다. 도 10 에 있어서의 회전 밸브 (81) 의 형상으로는 경사진 평판이지만, 그 밖의 나선 나사 등의 형상도 가능하고, 회전축을 회전시킴으로써 동일한 효과를 낳는 형상이면 된다. 또한, 도 10 중의 검은색 화살표는 회전축 (82) 의 회전 방향을 나타내고, 흰색 화살표는 액체가 흐르는 모습을 대략적으로 나타낸다.
도 11 은 밸브 이외의 구조에 의해 액체를 치환하는 구조를 나타낸다. 열 교환조 (98) 는 멤브레인 A (95) 와 멤브레인 B (96) 에 의해 구획되어 있다. 인렛 A (91) 로부터 도입된 액체는, 아웃렛 A (92) 에 의해 외부로 도출된다. 멤브레인이 존재하기 때문에, 인렛 B (93) 나 아웃렛 B (94) 로부터 도출되는 경우는 없다 (도 11A). 인렛 A (91) 로부터 도입되는 액체의 압력이, 인렛 B (93) 로부터 도입되는 액체의 압력보다 큰 경우에는, 멤브레인 A (95) 와 멤브레인 B (96) 를 좌측으로 밀어냄으로써, 인렛 A (91) 로부터 도입되는 액체의 열이 반응조 (97) 로 전달된다 (도 11B). 인렛 A (91) 와 인렛 B (93) 로부터 도입되는 액체의 압력 관계가 반대인 경우에는, 반응조 (97) 의 온도는 인렛 B (93) 로부터 도입되는 액체의 온도와 평형 상태에 이른다 (도 11C). 멤브레인은 내열 고무 등 내열성이 우수한 얇은 막으로 제작하는 것이 바람직하다. 또한, 도 11 중의 화살표는, 액체가 흐르는 방향을 대략적으로 나타낸다.
도 12 는 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 온도 설정형 밸브의 또 다른 구동 기구를 나타내는 모식도이다. 본 발명에 있어서는, 설정할 수 있는 온도는 2 개로 한정되는 것은 아니다. 도 12 에는 반응조의 온도를 3 개 이상 설정할 수 있는 구조를 나타낸다. 열 교환조 (103) 에는 측면에 홈 (102) 이 형성된 로터리 밸브 (101) 가 삽입되어 있다. 로터리 밸브 (101) 의 양측에는 인렛과 아웃렛이 형성되어 있어, 예를 들어 인렛 A (104) 로부터 도입된 액체는 유로 (108) 를 거쳐 홈 (102) 으로 흘러들어와, 반응조 (109) 에 열을 전달하고 나서 아웃렛 A (105) 로부터 밖으로 유도된다. 이에 대해, 인렛 B (106) 로부터 도입된 액체는 반응조 (109) 에 접하지 않고, 아웃렛 B (107) 로부터 밖으로 유도된다. 그러나, 로터리 밸브 (101) 를 회전시킴으로써, 임의의 인렛으로부터 도입된 액체를 반응조와 접할 수 있다 (도 12C). 경과 시간 (111) 에 수반하여 로터리 밸브 (101) 를 회전시킴으로써, 도 12C 의 그래프에 나타내는 바와 같이 온도 (110) 를 변화시킬 수 있다. 로터리 밸브 (101) 는 단열성 재료로 제작되어 있는 것이 바람직하다.
도 13 은 본 발명의 반응 제어 장치에 사용되는 열 교환조의 구성의 일례를 나타내는 모식도이다. 상부 패널 A 는 그 측면도이고, 하부 패널 B 는 상면도이다.
도 13 을 참조하여, 반응조 (1) 는 샘플을 수용하기 위한 어레이 형상으로 배치된 오목 형상의 복수의 패임부 (306) 를 구비한다. 반응조 (1) 의 하부에는, O-링 (305) 을 개재하여 열 교환조 (3) 가 접하여 배치되어 있고, 인렛 A (11) 및 인렛 B (12) 로부터 열 교환조 (3) 에 도입되는 열 교환액에 의해 반응조 (1) 의 온도가 조절된다. 반응조 (1) 의 상부에는, 증발 방지 기구 (301) 가 밀착되어 배치된다. 이 증발 방지 기구 (301) 에 의해, 샘플액이 열 교환조 (3) 로부터의 열에 의해 가열되고 증발되어 산일 (散逸) 되는 것을 방지할 수 있다. 증발 방지 기구 (301) 는, 전형적으로는 밀봉 부재 (302), 광학적으로 투명한 부재 (303, 예：유리 히터), 및 필요에 따라 고분자 시트 (304) 를 구비한다. 고분자 시트 (304) 는 밀봉 부재 (302) 와 반응조 (1) 의 밀착성을 높일 수 있다. 패임부 (306) 에 수용된 샘플 용액은, 광학적으로 투명한 부재 (303) 를 통하여, 제어 해석부 (202) 에 의해 동작이 제어된 형광 검출기 (201) 에 의해 샘플의 형광 강도의 변화가 검출된다.
도 13 에 나타내는 실시예에서는, 패임부 (306) 각각에 실은 액량 1 마이크로리터 내지 10 마이크로리터 미량 반응액의 액적의 고속에서의 온도 변화를 반복함으로써 PCR 반응을 실시할 수 있다. 먼저, PCR 용액의 액적이 세팅된 반응조 (1) 는, 열 교환조 (3) 에 O-링 (305) 을 개재하여 밀착하도록 배치된다. 열 교환조 (3) 에는 열 교환액용의 복수의 인렛이 접속되어 있어, 2 개 이상의 온도가 상이한 열 교환액이 인렛으로부터 주입된다. 본 실시예에서는, 2 개의 온도의 열 교환을 하는 하나의 예로서 인렛 A (11) 와 인렛 B (12) 를 나타내고 있는데, 인렛의 수는 이것에 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 마찬가지로 3 개 이상의 상이한 온도를 반응조 (1) 에서 실현시키기 위해 3 개 이상의 인렛을 구성할 수 있다.
증발 방지 기구 (301) 의 상면의 광학적으로 투명한 부재 (303) 는, 외부로부터 형광 검출기 (201) 등의 광학 장치에 의해 반응조 (1) 의 패임부 (306) 중의 반응액의 액적의 형광 강도의 변화 등의 광학적인 지표의 관찰이 가능하도록, 유리나 플라스틱 등의 광학적으로 광을 투과하는 투명한 소재로 구성될 수 있다. 또한, 이 광학적으로 투명한 부재 (303) 는, 상기의 광학적으로 투명한 소재의 표면에 ITO (Indium Tin Oxide：산화인듐주석) 등의 전류를 흘림으로써 온도를 상승시킬 수 있는 광학적으로 투명한 소재로 이루어진 발열부를 부가하여, 광학적으로 투명한 유리와 발열부가 일체화된 유리 히터로 해도 된다. 이와 같은 유리 히터를 사용하여 증발 방지 기구의 상면을 가열함으로써 반응조 (1) 의 PCR 용액의 액적의 증발을 방지할 수 있다.
따라서, 증발 방지 기구 (301) 의 하나의 예시적인 실시형태는, 광학적으로 투명한 유리와 발열 기구가 일체화된 유리 히터 (303), 밀봉 부재 (302), 반응조 (1) 와 밀봉 부재 (302) 를 밀착시키는 고분자 시트 (304) 로 이루어진다. 반응조 (1) 를 증발 방지 기구 (301) 와 열 교환조 (3) 사이에 둠으로써, 미량의 반응액의 증발이 있어도 반응조 (1) 와 증발 방지 기구 (301) 사이의 공간 내에서 바로 포화 증기압이 된다. 이 포화 증기압이 된 경우에 수증기가 밀봉 부재 (302) 및 유리 히터 (303) 등의 내벽에서 결로되는 일이 없도록, 예를 들어 외기에 접하는 유리 히터 (303) 의 온도를 80 ℃ 내지 110 ℃ 의 범위에서 가열함으로써 수증기의 결로를 방지할 수 있다. 또, 이와 같이 유리 히터 (303) 에 의해 가열된 유리 표면에는 흐림 방지의 효과가 있어, 형광 검출기 (201) 에서의 반응액의 형광량 검출을 방해하지 않는다는 이점이 있다.
밀봉 부재 (302) 의 밀봉의 성능은, 고분자 시트 (304) 등에 의해 높일 수 있다. 사용될 수 있는 고분자 시트로는 고무, 실리콘 등이 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
또, 증발 방지 기구와 반응조 (1) 사이의 공간의 용적을 보다 줄이는 것이, 포화 수증기압에 이른 수증기의 전체량을 보다 소량으로 억제할 수 있다는 점에서, 유리 히터 (303) 와 반응조 (1) 의 표면 사이의 거리를 가능한 한 작게 하면 유리하다. 유리 히터 (303) 와 반응조 (1) 의 표면의 거리는 약 10 ㎜ 이하인 것이 바람직하고, 약 7 ㎜ 이하인 것이 보다 바람직하고, 약 5 ㎜ 이하인 것이 더욱 바람직하며, 약 3 ㎜ 이하인 것이 가장 바람직하다. 또, 본 실시예에서는 증발 방지 기구 (301) 의 상면의 가열 기구에 대하여 유리 히터 (303) 를 하나의 예로서 사용했지만, 마찬가지로 가열 기구나 열 전도계를 가진 금속판 등에, 형광 검출기 (201) 로부터의 액적의 형광 검출이 가능해지는 광학적으로 투명한 창을 배치한 것을 유리 히터 (303) 대신에 사용해도 된다. 또, 증발 방지 기구를 사용한 경우에는, 미량의 액적이라 하더라도 증발이 방지되기 때문에, 액적 상에 미네랄 오일 등의 액층의 배치는 실시하지 않아도 된다.
이와 같이 하여 도 13 에 나타내는 실시예에서는, 열 교환조 (3) 로부터의 열에 의한 반응조의 물방울의 증발에 의해 샘플액의 산일을 방지할 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명은 샘플의 온도를 엄밀하게 제어할 것이 요구되는 반응을 실시하기 위한 반응 장치로서 유용하다. 본 발명은 또한 샘플의 온도 변경을 신속하게 실시할 것이 요구되는 반응을 실시하기 위한 반응 장치로서 유용하다.
본 발명은, 특히 고속, 고정밀도, 고증폭률의 PCR 반응을 실시할 수 있는 PCR 장치로서 유용하다. 본 발명의 장치는 또한 소형화가 가능하기 때문에, 포터블 PCR 장치로서 유용하다.
또, 본 발명은 샘플 용액이 가열됨에 의한 샘플액의 증발을 방지할 수 있기 때문에, 미량의 샘플을 사용하는 PCR 반응에 있어서 유용하다.
1 : 반응조
2 : 반응조 프레임
3 : 열 교환조
4 : 액체 저장 탱크
5 : 열원
6 : 교반 기구
7 : 펌프
8 : 전환 밸브
9 : 바이패스 유로
10 : 보조 온도 제어 기구
11 : 인렛 A
12 : 인렛 B
13 : 아웃렛 A
14 : 아웃렛 B
21, 22, 23, 24, 26 : 반응조
25 : 동결 건조 시약
27 : 분주 칩
28 : 샘플액
29 : 섬유 구슬
31 : 반응조
32 : 반응조 프레임
33 : 반응조 수용구
34 : 나사산
35 : 시일
36 : 테이퍼 형상 반응조 프레임
37, 38 : 열 교환조
41 : 인렛 밸브 A
42 : 아웃렛 밸브 A
43 : 인렛 밸브 B
44 : 아웃렛 밸브 B
51 : 슬라이드 글라스형 반응조 프레임
52, 58 : 열 교환조의 반응조 수용구
53 : 가이드 레일
54, 57 : 시일
55 : 슬라이드 수용구
56 : 힌지
59 : 반응조
61 : 인렛 A
62 : 아웃렛 A
63 : 인렛 B
64 : 아웃렛 B
65 : 피스톤
66 : 반응조
67 : 열 교환조
71 : 피스톤
72 : 피스톤 로드
73 : 피스톤
74 : 자석
75 : 전자 코일
76 : 피스톤
81 : 회전 밸브
82 : 회전축
83 : 열 교환조
84 : 반응조
91 : 인렛 A
92 : 아웃렛 A
93 : 인렛 B
94 : 아웃렛 B
95 : 멤브레인 A
96 : 멤브레인 B
97 : 반응조
98 : 열 교환조
101 : 로터리 밸브
102 : 홈
103 : 열 교환조
104 : 인렛 A
105 : 아웃렛 A
106 : 인렛 B
107 : 아웃렛 B
108 : 유로
109 : 반응조
110 : 온도
111 : 경과 시간
201 : 형광 검출기
202 : 제어 해석부
203 : 제어 신호
204 : 광학 창
301 : 증발 방지 기구
302 : 밀봉 부재
303 : 유리 히터
304 : 고분자 시트
305 : O-링
306 : 패임부 (웰)
2 : 반응조 프레임
3 : 열 교환조
4 : 액체 저장 탱크
5 : 열원
6 : 교반 기구
7 : 펌프
8 : 전환 밸브
9 : 바이패스 유로
10 : 보조 온도 제어 기구
11 : 인렛 A
12 : 인렛 B
13 : 아웃렛 A
14 : 아웃렛 B
21, 22, 23, 24, 26 : 반응조
25 : 동결 건조 시약
27 : 분주 칩
28 : 샘플액
29 : 섬유 구슬
31 : 반응조
32 : 반응조 프레임
33 : 반응조 수용구
34 : 나사산
35 : 시일
36 : 테이퍼 형상 반응조 프레임
37, 38 : 열 교환조
41 : 인렛 밸브 A
42 : 아웃렛 밸브 A
43 : 인렛 밸브 B
44 : 아웃렛 밸브 B
51 : 슬라이드 글라스형 반응조 프레임
52, 58 : 열 교환조의 반응조 수용구
53 : 가이드 레일
54, 57 : 시일
55 : 슬라이드 수용구
56 : 힌지
59 : 반응조
61 : 인렛 A
62 : 아웃렛 A
63 : 인렛 B
64 : 아웃렛 B
65 : 피스톤
66 : 반응조
67 : 열 교환조
71 : 피스톤
72 : 피스톤 로드
73 : 피스톤
74 : 자석
75 : 전자 코일
76 : 피스톤
81 : 회전 밸브
82 : 회전축
83 : 열 교환조
84 : 반응조
91 : 인렛 A
92 : 아웃렛 A
93 : 인렛 B
94 : 아웃렛 B
95 : 멤브레인 A
96 : 멤브레인 B
97 : 반응조
98 : 열 교환조
101 : 로터리 밸브
102 : 홈
103 : 열 교환조
104 : 인렛 A
105 : 아웃렛 A
106 : 인렛 B
107 : 아웃렛 B
108 : 유로
109 : 반응조
110 : 온도
111 : 경과 시간
201 : 형광 검출기
202 : 제어 해석부
203 : 제어 신호
204 : 광학 창
301 : 증발 방지 기구
302 : 밀봉 부재
303 : 유리 히터
304 : 고분자 시트
305 : O-링
306 : 패임부 (웰)
Claims (29)
- 샘플을 수용하기 위한 1 개 또는 복수의 웰을 갖는 반응조와,
상기 반응조에 열을 전도할 수 있도록 그 반응조에 접하여 형성되고, 소정 온도의 액체를 각각 도입 및 배출하기 위한 인렛 및 아웃렛을 구비한 열 교환조와,
액체를 각각 소정 온도로 유지하기 위한 온도 제어할 수 있는 열원을 구비한 복수의 액체 저장 탱크와,
상기 열 교환조의 상기 인렛 및 상기 아웃렛과 상기 액체 저장 탱크 사이를 접속시키는 관 형상의 유로와,
상기 관 형상 유로 상에 설치된, 상기 열 교환조와 상기 액체 저장 탱크 사이에서 상기 액체를 순환시키기 위한 펌프와,
상기 관 형상 유로 상에 설치된, 상기 순환하는 상기 액체의 흐름을 제어하기 위한 전환 밸브로서, 상기 복수의 액체 저장 탱크로부터의 소정 온도의 상기 액체의 상기 열 교환조로의 유입을 소정 시간 간격으로 전환함으로써, 상기 반응조의 온도를 원하는 온도로 제어하는 전환 밸브를 구비하고,
상기 샘플의 양이 1 웰당 수 ㎕ 이하이고, 순환시키는 상기 액체의 총 용적이 1 액체 저장 탱크당 수십 ㎖ 이상인, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항에 있어서,
PCR 장치로서 사용하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
추가로, 상기 샘플 중에 형광 색소를 함유시킨 경우에, 상기 반응조의 온도 전환에 연동하여 상기 웰 내의 상기 형광 색소가 발하는 형광을 검출하여, 형광 강도의 시간 변화를 측정하기 위한 형광 검출 수단을 구비하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 형광 검출 수단이, 상기 반응조의 상기 웰 각각에 대응하여 형성되어 있는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 반응조의 1 개 또는 복수의 웰에 배치된 상기 샘플액의 형광 강도 변화로부터 샘플액의 온도 변화를 추측하는 수단과,
그 결과에 기초하여 상기 반응조의 온도를 신속하게 변화시키는 수단을 추가로 구비하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액체 저장 탱크의 수가, 상기 반응조의 설정하고자 하는 온도의 수와 동일한 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 6 항에 있어서,
상기 액체 저장 탱크의 수가 2 개 또는 3 개인, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반응조의 바닥면 및 벽면이, 두께 1 미크론 내지 100 미크론의 알루미늄, 니켈, 마그네슘, 티탄, 플라티나, 금, 은, 구리를 함유하는 금속, 혹은 실리콘으로 형성되어 있는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 웰의 바닥면의 형상이, 평저 형상, 반구 형상, 삼각뿔 형상 또는 구 형상인, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 웰 각각에, 반응에 필요한 시약이 건조된 상태에서 미리 내포되어 있고, 샘플 용액과의 접촉에 의해 용출시켜 반응을 가능하게 하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반응조가, 그 반응조 내의 상기 샘플로부터의 광학 신호의 측정을 용이하게 하는 구멍 혹은 광학 창을 추가로 구비하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반응조가, 상기 열 교환조에 대해 착탈할 수 있게 설치되어 있는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 12 항에 있어서,
상기 반응조의 상기 열 교환조에 대한 착탈 방식이,
(a) 상기 반응조의 외주에 통 형상의 프레임을, 상기 열 교환조에 통 형상의 반응조 수용구를 형성하고, 상기 반응조의 상기 프레임의 외표면과, 상기 열 교환조의 반응조 수용구의 내표면에 나사산을 형성하고, 그 나사산을 따른 회전 운동에 의해 상기 반응조를 상기 열 교환조에 착탈할 수 있게 장착하는 방식,
(b) 상기 반응조 외주의 상기 통 형상의 프레임 및 상기 열 교환조의 상기 통 형상의 반응조 수용구를 각각 테이퍼 형상으로 하여, 상기 반응조 수용구에 대해 상기 반응조를 착탈할 수 있게 압착시키는 방식,
(c) 상기 반응조를 슬라이드 글라스 형상의 반응조 프레임 내에 고정시키고, 상기 열 교환조의 반응조 수용구에 가이드 레일을 형성하고, 그 가이드 레일을 따라 상기 슬라이드 글라스 형상의 반응조 프레임을 착탈할 수 있게 장착하는 방식, 및
(d) 상기 슬라이드 글라스 형상의 반응조 프레임을, 힌지를 갖는 슬라이드 수용구에 삽입하고, 그 힌지 기구에 기초한 회전 동작에 의해, 상기 슬라이드 글라스 형상의 상기 반응조 프레임을 상기 열 교환조의 상기 반응조 수용구에 대해 착탈할 수 있게 장착하는 방식,
중 어느 것인, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
추가로, 상기 액체가 환류하고 있는 상태이면서, 상기 액체를 상기 액체 환류형 반응 제어 장치의 외부로 누출시키지 않고 상기 반응조를 상기 열 교환조로부터 착탈할 수 있게 하는 기구를 구비하고 있는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액체 저장 탱크가, 열원, 온도계, 액체 교반계를 구비하고, 그 액체 교반계는 그 액체 저장 탱크 내의 액체를 연속적 혹은 듀티 사이클비 10 ％ 이상으로 교반함으로써, 그 액체 저장 탱크 내의 그 액체의 온도 분포를 5 ℃ 이내로 억제할 수 있는 열원 제어계를 구비하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전환 밸브의 동작을 제어하는 전환 밸브 제어 기구를 추가로 구비하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전환 밸브는, 상기 복수의 액체 저장 탱크 중, 임의의 액체 저장 탱크의 액체를 상기 열 교환조로 유도할 수 있고, 상기 열 교환조 중의 상기 액체를 원래의 액체 저장 탱크로 되돌릴 수 있는, 액체 환류형 반응 제어계. - 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
상기 전환 밸브의 제어에 의해 상기 열 교환조 내의 상기 액체를 치환할 때, 상기 열 교환조 내부의 상기 액체는 그 온도에 가장 가까운 온도로 유지되고 있는 액체 저장 탱크로 유도되도록 상기 전환 밸브가 제어되는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로, 단열재, 히터 및 냉각 기구를 포함하는 보조 온도 제어 기구로서, 상기 전환 밸브와 상기 액체 저장 탱크를 결합시키는 상기 유로 내부의 상기 액체의 온도의 변동을 억제하는 보조 온도 제어 기구를 구비하고 있는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로, 상기 전환 밸브와 상기 액체 저장 탱크를 결합시키는 상기 유로 내부의 상기 액체가 상기 열 교환조로 유도되는지 여부에 관계없이, 상기 액체 저장 탱크로부터의 상기 액체와 연속적으로 치환됨으로써 온도의 변화를 억제하는 기구를 상기 전환 밸브 내에 구비하고 있는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전환 밸브가, 단면이 원 혹은 다각형의 중공 구조 안을 슬라이드하는 피스톤으로 구성되어 있고, 그 피스톤의 위치에 의해 상기 반응조에 접하는 액체의 온도를 제어하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 21 항에 있어서,
상기 전환 밸브에 있어서, 상기 피스톤이,
(a) 그 피스톤에 접속된 피스톤 로드에 대해 기계적으로 외력을 가함으로써,
(b) 자체 자성체인 피스톤 혹은 자성체가 내부에 장착된 피스톤을 사용하여, 그 피스톤과 상기 전환 밸브 외부에 배치된 전자 코일을 포함하는 자장 발생 기구의 상호 작용에 의하거나, 또는
(c) 피스톤 양단에 상기 순환하는 액체의 흐름에 의한 압력차를 발생시킴으로써 슬라이드하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전환 밸브에 있어서,
원주 형상, 원반 형상, 원추 형상의 회전체로서, 상기 액체 저장 탱크로부터 이송된 액체의 유로가 되는 복수의 홈이 외표면에 형성되고, 또한 상기 홈 각각에 유체 연락할 수 있게 접속된 터널 형상의 유로가 형성된 회전체가, 상기 열 교환조에 회전할 수 있게 삽입되어 있고,
상기 터널 형상의 유로의 단이 각각 상기 전환 밸브의 인렛 또는 아웃렛으로서 기능하며,
상기 회전체가 회전함으로써, 상기 인렛에 도입되는 상이한 온도의 액체가 상기 홈 부분을 흐를 때에 반응조 외부에 접촉하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 순환시키는 액체로서, 열 용량이 크고, 또한 점성이 낮은 액체를 사용하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 순환시키는 액체로서, 비점이 물의 비점보다 높은 액체를 사용하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 순환시키는 액체로서, 응고점이 물의 응고점보다 낮은 액체를 사용하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 반응조의 상기 웰측의 표면을 밀봉하여 덮는 부재로서, 그 웰 중의 샘플 용액의 광학적인 관찰이 가능하도록 적어도 일부가 광학적으로 투명한 부재와,
상기 부재의 상기 광학적으로 투명한 부분을 가열하는 가열 기구를 포함하는 샘플 증발 방지 기구를 추가로 구비하는, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 27 항에 있어서,
상기 부재와 상기 반응조의 상기 웰측의 표면의 거리가 3 ㎜ 이하인, 액체 환류형 반응 제어 장치. - 제 27 항에 있어서,
상기 가열 기구에 의해 가열되는 상기 부재의 상기 광학적으로 투명한 부분의 온도가 80 ℃ 내지 110 ℃ 의 범위인, 액체 환류형 반응 제어 장치.
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