ES2243393T3 - Monitorizacion de la hibridacion durante la pcr. - Google Patents
Monitorizacion de la hibridacion durante la pcr.Info
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Abstract
Método de monitorización a tiempo real de la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de: la amplificación de la secuencia objetivo por la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de SYBR¿ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de SYBR¿ Green I, una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación durante un conjunto de ciclos de amplificación; y la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR¿ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR¿ Green I tras la iluminación de la muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra, o bien, la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR¿ Green I posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR¿ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
Description
Monitorización de la hibridación durante la
PCR.
Esta Solicitud Europea es una división de la
solicitud de la EP 97931089.
La presente invención se refiere, en general, a
la observación de señales de fluorescencia que resultan de la
hibridación conjuntamente con la reacción en cadena de la
polimerasa. Más específicamente, la presente invención se refiere a
la observación de la hibridación con fluorescencia durante y/o
inmediatamente después de la PCR y la utilización de esta
información para la identificación, la detección de alteraciones de
secuencias, y la cuantificación del producto.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
fundamental para la biología molecular y es la primera técnica
molecular práctica para el laboratorio clínico. A pesar de su
utilidad y popularidad, la comprensión actual de la PCR no está muy
avanzada. Las condiciones adecuadas para amplificaciones
satisfactorias se deben encontrar mediante prueba y error y la
optimización es empírica. Incluso los entendidos en la materia
necesitan utilizar una técnica potente sin una teoría explicativa o
predictiva del proceso.
La PCR se consigue mediante el ciclado de
temperaturas de la muestra, que provoca la desnaturalización
(separación) del ADN, la unión (fijación) de cebadores específicos,
y la existencia (extensión) de replicación. Un ciclo de la PCR se
realiza habitualmente entre 2 y 8 minutos, requiriendo de 1 a 4
horas para una amplificación de 30 ciclos. La respuesta de la
temperatura de la muestra en la mayoría de la instrumentación para
PCR es muy lenta en comparación con los tiempos necesarios para la
desnaturalización, fijación y extensión. Las reacciones físicas
(desnaturalización y fijación) y enzimáticas (extensión) en la PCR
tienen lugar muy rápidamente. Los tiempos de amplificación para PCR
se pueden reducir desde horas a menos de 15 minutos.
Las técnicas de ciclado rápido son posibles
mediante la respuesta rápida de la temperatura y la homogeneidad de
temperatura posibles para muestras en contenedores de muestras con
una relación de área superficial-volumen elevada,
tales como tubos capilares. Para mayor información, véanse también:
C.T. Wittwer. G.B. Reed, y K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification
(Amplificación de ADN por ciclado rápido), en K.B. Mullis, F. Ferre,
y R.A. Gibbs, The polymerase chain reaction (La reacción en cadena
de la polimerasa), Birkhauser, Boston, 174-181
(1994). Una mejor homogeneidad de la temperatura permite que los
requerimientos del tiempo y la temperatura de la PCR estén mejor
definidos y se entiendan mejor. Una mejor homogeneidad de la
temperatura también incrementa la precisión de cualquier técnica
analítica utilizada para monitorizar la PCR durante la
amplificación.
La fluorimetría es una técnica sensible y
versátil con muchas aplicaciones en biología molecular. Durante
muchos años se ha utilizado bromuro de etidio para monitorizar la
distribución de tamaños de ácidos nucleicos separados por
electroforesis en gel. El gel se transilumina habitualmente con luz
ultravioleta y se observa la fluorescencia roja del ácido nucleico
de doble cadena. Específicamente, el bromuro de etidio se utiliza
normalmente para analizar los productos de la PCR después de
completar la amplificación. Además, la patente EPA 0 640 828 A1 de
Higuchi y Watson da a conocer la utilización de bromuro de etidio
durante la amplificación para monitorizar la cantidad de ADN de
doble cadena mediante la medición de la fluorescencia en cada ciclo.
Se observó que la intensidad de la fluorescencia aumentaba y
disminuía inversamente con la temperatura, era máxima a la
temperatura de fijación/extensión (50ºC), y mínima a la temperatura
de desnaturalización (94ºC). En cada ciclo se obtuvo la máxima
fluorescencia como una medida de la cantidad de ADN. La aplicación
de Higuchi y Watson no enseña la utilización de la fluorescencia
para monitorizar las hibridaciones, ni sugiere la medición de
fluorescencia a diferentes temperaturas para seguir la extensión de
la hibridación. Además, Higuchi y Watson no enseñan ni sugieren la
utilización de la dependencia con la temperatura de la hibridación
del producto de la PCR para la identificación o cuantificación de
productos de la PCR.
Sin embargo, la aplicación de Higuchi y Watson no
menciona la utilización de otros fluoróforos, que incluyen sistemas
de sondas doblemente marcadas que generan fluorescencia cuando se
hidrolizan mediante la actividad de la
5'-exonucleasa de ciertas polimerasas de ADN, tal
como se da a conocer en la Patente de Estados Unidos No. 5.210.015
de Gelfand y otros. La fluorescencia observada a partir de estas
sondas depende, principalmente, de la hidrólisis de la sonda entre
sus dos fluoróforos. La cantidad de producto de la PCR se estima
mediante la medición de la fluorescencia una vez por ciclo. A pesar
de que la hibridación de estas sondas parece que es necesaria para
que tenga lugar la hidrólisis, la señal de fluorescencia surge,
principalmente, de la hidrólisis de las sondas, sin hibridación, en
la que una sonda de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes en
los extremos opuestos del mismo proporciona un sistema de sondas de
inhibición útiles para detectar el producto de PCR y la hibridación
de ácido nucleico. K.J. Livak y otros, 4 PCR Math. Appl.
357-362 (1995). No se sugiere el seguimiento de la
dependencia de la temperatura de la hibridación de la sonda con
fluorescencia para identificar las alteraciones de las secuencias en
productos de la PCR.
Se ha explotado en muy diferentes formatos la
hibridación específica de un ácido nucleico a una cadena
complementaria para la identificación. Por ejemplo, después de la
digestión de la enzima de restricción, el ADN genómico se puede
fraccionar por tamaño e hibridar a sondas mediante una transferencia
Southern. Como ejemplo adicional, se pueden detectar mutaciones de
bases únicas mediante "transferencias de puntos" con
oligonucleótidos específicos de alelo. Habitualmente, la hibridación
se realiza durante minutos a horas a una temperatura única para
conseguir la discriminación necesaria. Alternativamente, la
extensión de la hibridación se puede monitorizar de forma dinámica
mientras cambia la temperatura mediante técnicas de fluorescencia.
Por ejemplo, para monitorizar la hibridación se han utilizado curvas
de fusión por fluorescencia. L.E. Morrison y L.M. Stols, Sensitive
fluorescence-based thermodynamic and kinetic
measurements of DNA hybridization in solution (Mediciones cinéticas
y termodinámicas basadas en la sensibilidad a la fluorescencia de la
hibridación de ADN en solución), 32 Biochemistry
3095-3104, 1993). Las velocidades de barrido de
temperatura son, habitualmente, de 10ºC/hora o inferior, en parte
debido a la elevada masa térmica de la cubeta del fluorímetro.
Los métodos actuales para monitorizar la
hibridación requieren mucho tiempo. Si la hibridación se pudiera
seguir en segundos en lugar de horas, la hibridación se podría
monitorizar durante la amplificación por la PCR, incluso durante una
PCR de ciclado rápido. Entre las muchas utilizaciones de la
monitorización de la hibridación durante la PCR, tal como se
describirá con detalle en la presente, se incluyen la identificación
y cuantificación del producto, la detección de alteraciones en las
secuencias, y el control automático de los parámetros del ciclado de
temperatura mediante retroalimentación de la fluorescencia.
La técnica anterior, tal como se ha explicado
anteriormente, lleva a cabo un ciclado de temperaturas de forma
lenta y empírica. Cuando se necesita el análisis de los productos de
la PCR por hibridación, se requieren etapas adiciones que consumen
tiempo. De este modo, sería un gran avance en la técnica
proporcionar métodos para monitorizar la hibridación durante la PCR
y analizar la reacción mientras tiene lugar, es decir, durante o
inmediatamente después del ciclado de temperaturas sin manipular la
muestra. Mediante la monitorización de la hibridación durante la
PCR, los principios subyacentes que permiten el funcionamiento de la
PCR se pueden seguir y utilizar para analizar y optimizar la
reacción durante la amplificación.
La Patente EP 0640 828A da a conocer un aparato
para monitorizar simultáneamente reacciones múltiples de ácidos
nucleicos. Utiliza un ciclador y sensor térmico para detectar la luz
emitida en las pausas del ciclador térmico.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un colorante de ADN específico de doble cadena para
monitorizar la hibridación del producto durante la PCR.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un sistema para identificar productos amplificados por
la PCR mediante curvas de fusión por fluorescencia.
Es también otro objetivo de la presente invención
proporcionar un método para mejorar la sensibilidad de la
cuantificación de la PCR con colorantes de ADN específico de doble
cadena.
Es aún otro objetivo de la presente invención
para determinar la cantidad de producto específico amplificado por
la PCR mediante curvas de fusión, corregir la amplificación no
específica detectada con el colorante de ADN específico de doble
cadena.
Un objetivo adicional de la presente invención es
proporcionar un método de cuantificación relativa de productos de la
PCR diferentes con colorantes de ADN específico de doble cadena.
Es aún otro objetivo de la presente invención
proporcionar un método de cuantificación del producto mediante la
cinética de refijación del producto en presencia de un colorante de
ADN específico de doble cadena.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar un método para determinar un número de copias de la
plantilla inicial mediante el seguimiento de la fluorescencia de una
sonda o sondas de hibridación en cada ciclo durante la amplificación
por la PCR.
Un objetivo adicional de la presente invención es
proporcionar un sistema para la cuantificación relativa de
diferentes productos de la PCR mediante curvas de fusión de la
sonda.
Es aún otro objetivo de la presente invención
proporcionar métodos para determinar el número de copias de la
plantilla inicial mediante el ajuste de las curvas de fluorescencia
frente al número de ciclos.
Es aún otro objetivo de la presente invención
proporcionar un sistema y un método para realizar la PCR, la
monitorización de forma rápida y también de forma continua y el
ajuste de los parámetros de la reacción mientras tiene lugar la
reacción.
Otro objetivo de la presente invención es
reemplazar las sondas de ácidos nucleicos por análogos o derivados
sintéticos de ácidos nucleicos, por ejemplo, por ácidos nucleicos
peptídicos (PNA), con la condición de que se puedan también marcar
con compuestos fluorescentes.
Estos y otros objetivos y ventajas de la presente
invención quedarán completamente claras a partir de la descripción y
reivindicaciones que se indican a continuación, o se pueden aprender
mediante la práctica de la presente invención.
La presente invención proporciona un método de
monitorización a tiempo real de la amplificación de una secuencia de
ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho
método las etapas de:
la amplificación de la secuencia diana mediante
la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad
de SYBR™ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la
polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de SYBR™
Green I, una polimerasa termoestable, y cebadores para la secuencia
de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y
el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo,
una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación
durante un conjunto de ciclos de amplificación; y
la iluminación de la mezcla con una luz a una
longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una
parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una
emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la
muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la
cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra,
o bien, la iluminación de la muestra con una luz
a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a,
como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la
monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la
muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una
curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
La presente invención también proporciona una
mezcla de reacción de la PCR para amplificar una secuencia de
nucleótidos diana, comprendiendo la mezcla una muestra de ADN que
tiene cebadores de oligonucleótidos de la secuencia diana en una
cantidad suficiente para la amplificación por PCR, una polimerasa
termoestable y SYBR™ Green I en una cantidad capaz de proporcionar
una señal de fluorescencia indicativa de la concentración de la
secuencia diana en dicha mezcla.
Preferiblemente, la presente invención se
caracteriza por la iluminación de la mezcla con una luz a una
longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una
parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una
emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la
muestra, estando dicha emisión fluorescente relacionada con la
cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra, y se
caracteriza, además, por la iluminación de la muestra con una luz a
una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a,
como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la
monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la
muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una
curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
El método se puede utilizar para detectar una
secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica durante
la amplificación utilizando un perfil rápido de ciclos de
temperatura.
Preferiblemente, el perfil de ciclos de
temperatura tiene una duración inferior a 2 minutos. Para generar
una curva de fusión, la muestra se ilumina y se detecta la
fluorescencia a medida que se incrementa la temperatura.
La presente invención, particularmente, disminuye
el tiempo total necesario para la amplificación y análisis por la
PCR respecto a técnicas anteriores, mientras que al mismo tiempo, se
permite la opción de incrementar significativamente la calidad de la
reacción mediante la optimización de las condiciones de
amplificación.
La presente invención proporciona métodos y
aplicaciones para una monitorización continua de la fluorescencia de
la amplificación del ADN. La instrumentación requerida combina
componentes ópticos con estructuras para proporcionar un ciclado
rápido de temperaturas para monitorizar de forma continua la
amplificación del ADN mediante un conjunto de diferentes técnicas de
fluorescencia. En una realización ilustrativa, se adquiere
fluorescencia de forma continua a partir de una única muestra o,
alternativamente, a partir de muestras múltiples sobre un carrusel
rotatorio, sometiendo simultáneamente todas las muestras a un
ciclado térmico rápido. En las referencias de las solicitudes de
patentes anteriores se puede encontrar información adicional sobre
la instrumentación asociada.
Según la presente invención, se monitorizó la
fluorescencia durante la amplificación del ADN mediante el colorante
específico de doble cadena, SYBR Green I. Los datos de fluorescencia
obtenidos una vez en cada ciclo permiten la cuantificación del
número de copias de la plantilla inicial.
Además, en comparación con la medición de la
fluorescencia una vez por ciclo, se dan a conocer realizaciones de
la presente invención que monitorizan la temperatura, el tiempo y la
fluorescencia de forma continua a través de cada ciclo, produciendo
así una espiral tridimensional. Esta espiral tridimensional se puede
reducir a representaciones de temperatura frente a tiempo,
fluorescencia frente a tiempo, y fluorescencia frente a temperatura.
Se pueden utilizar las representaciones de fluorescencia frente a
temperatura de la fluorescencia de las sondas de hibridación para
detectar alteraciones de las secuencias en el producto. Estas
alteraciones de las secuencias pueden ser naturales, tales como en
mutaciones o polimorfismos, o artificiales, tales como en una
plantilla diseñada de forma alternativa para una PCR
cuantitativa.
Según un aspecto preferido de la presente
invención, se utiliza la monitorización de la fluorescencia para
obtener las curvas de fusión del producto durante la PCR mediante la
monitorización de la fluorescencia con SYBR™ Green I. La
representación de la fluorescencia en función de la temperatura a
medida que el ciclador térmico calienta a través de la temperatura
de disociación del producto permite obtener una curva de fusión del
producto de la PCR. La forma y posición de esta curva de fusión del
ADN es función de la proporción GC/AT, la longitud, y la secuencia,
y se puede utilizar para diferenciar productos de amplificación
separados por menos de 2ºC en la temperatura de fusión. Los
productos deseados se pueden distinguir de los productos no
deseados, incluyendo dímeros de cebadores. El análisis de las curvas
de fusión se puede utilizar para ampliar el intervalo dinámico de la
PCR cuantitativa y para diferenciar productos diferentes en
amplificación múltiples. Con la utilización de colorante, en cada
ciclo se pueden seguir la desnaturalización, la refijación y la
extensión del producto. La monitorización continua de la
fluorescencia permite la obtención de curvas de fusión y curvas de
fijación del producto durante el ciclado de temperaturas.
La presente invención proporciona reactivos y
métodos para la PCR de ciclo rápido con amplificación y análisis
combinados mediante la monitorización de la fluorescencia en menos
de treinta minutos, más preferiblemente, en menos de quince minutos,
y más preferiblemente, en menos de diez minutos.
Un método de monitorización en tiempo real de una
amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de una
secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica
comprende la amplificación de la secuencia diana mediante la
reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de
SYBR™ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la
polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica del SYBR™
Green I, una polimerasa termoestable, y cebadores para la secuencia
de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y
el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo,
una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación
durante un conjunto de ciclos de amplificación; y
la iluminación de la mezcla con una luz a una
longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una
parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una
emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la
muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la
cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra,
o bien, la iluminación de la muestra con una luz
a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I, posterior a,
como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la
monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la
muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una
curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
Una mezcla de reacción de la PCR para amplificar
una secuencia de nucleótidos diana comprende una muestra de ADN que
tiene los cebadores de oligonucleótidos diana en una cantidad
suficiente para la amplificación por PCR, una polimerasa
termoestable y SYBR™ Green I en una cantidad capaz de proporcionar
una señal de fluorescencia indicativa de la concentración de la
secuencia diana en dicha mezcla.
Un método para analizar una secuencia de ADN
diana de una muestra biológica comprende la amplificación de la
secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en
presencia de una sustancia fluorescente que se une al ácido
nucleico, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa
las etapas de adición a la muestra biológica de una polimerasa
termoestable y cebadores para la secuencia diana de ácidos nucleicos
y el ciclado térmico de la muestra biológica entre, como mínimo, una
temperatura de desnaturalización y una temperatura de
elongación;
la excitación de la muestra con luz a una
longitud de onda absorbida por la sustancia fluorescente que se une
al ácido nucleico; y
la monitorización de la fluorescencia dependiente
de la temperatura de la sustancia fluorescente que se une al ácido
nucleico a medida que cambia la temperatura de la muestra, en la que
la sustancia fluorescente que se une al ácido nucleico comprende un
colorante fluorescente que se une al ácido nucleico de doble cadena,
SYBR™ Green I.
La fluorescencia dependiente de la temperatura se
puede utilizar para identificar los productos amplificados,
preferiblemente, mediante el análisis de las curvas de fusión. Se
pueden determinar las cantidades relativas de dos o más productos
amplificados mediante el análisis de las curvas de fusión. Por
ejemplo, las áreas bajo las curvas de fusión se encuentran mediante
una regresión mínimo-cuadrática no lineal de la suma
de gaussianos múltiples.
Se han eliminado las figuras originales
6-14, 16-18, 33-36 y
46-48.
Las figuras 1A y B son gráficos que representan
un paradigma de la PCR de equilibrio (A) y un paradigma de la PCR
cinética (B).
La figura 2 muestra fragmentos útiles de
temperatura frente a tiempo para la monitorización de la hibridación
por fluorescencia.
La figura 3 es una tabla de temperatura frente a
tiempo ejemplificante del ciclado rápido de temperaturas para la
PCR.
La figura 4 muestra los resultados de cuatro
perfiles diferentes temperatura/tiempo (A-D) y sus
productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos
(inserción).
Las figuras 5A, B y C muestran el mecanismo de
generación de fluorescencia para tres métodos diferentes de
monitorización de la fluorescencia de la PCR: (A) colorante de ADN
de doble cadena, sondas de hibridación.
La figura 15 es una representación de la
fluorescencia frente al número de ciclos para un número diferente de
reacciones de copia de la plantilla inicial monitorizadas con SYBR™
Green I: 0, (\Delta); 1, (\sqbullet); 10, (-); 10^{2} (-);
10^{3}, (+); 10^{4}, (\bullet); 10^{5}, (\lozenge);
10^{6}, (x); 10^{7}, (\blacktriangle); 10^{8}, (\Box);
10^{9}, (\blacklozenge).
Las figuras 19A-C proporcionan
una comparación de tres técnicas de monitorización de la
fluorescencia para la PCR, que incluyen el colorante de ADN
específico de doble cadena, SYBR™ Green I (A), una sonda de
hidrólisis de fluoresceína/rodamina doblemente marcada (B), y una
sonda de hibridación marcada con fluoresceína con un cebador marcado
en la Cy5 (C); la figura 19D muestra el coeficiente de variación
para las tres técnicas de monitorización representadas en las
figuras 19A-C.
La figura 20 muestra una representación habitual
del logaritmo de la fluorescencia frente al número de ciclos de una
amplificación estándar monitorizada con SYBR™ Green I.
La figura 21 muestra el ajuste a una curva
exponencial para los ciclos 20-27 de los datos de la
figura 20.
La figura 22 muestra un ajuste exponencial en una
muestra desconocida para determinar el número de copias iniciales a
partir de los datos de la amplificación.
La figura 23 muestra una representación habitual
de la fluorescencia frente al número de ciclos de cinco estándares
monitorizados en cada ciclo con sondas de hibridación adyacentes, en
la que los números de copias iniciales se representan tal como se
indica a continuación: 10^{3}, (\bullet); 10^{4},
(\lozenge); 10^{5}, (\blacktriangle); 10^{6}, (\Box);
10^{7} (\blacklozenge).
La figura 24 muestra una curva ajustada a los
datos estándares de la figura 23.
La figura 25 muestra una representación habitual
de la fluorescencia frente al número de ciclos de cinco estándares
monitorizados en cada ciclo con una sonda de hidrólisis, en la que
los números de copias iniciales se representan tal como se indica a
continuación: 1,5, (\bullet); 15, (\lozenge); 150,
(\blacktriangle); 1500, (\Box); 15.000, (\blacklozenge).
La figura 26 muestra una curva ajustada a los
datos estándares de la figura 25.
La figura 27 muestra una representación habitual
del logaritmo de la fluorescencia frente al número de ciclos de tres
amplificaciones estándares monitorizadas con SYBR Green I, en la
que: (\sqbullet); (\bullet); (\blacktriangle).
La figura 28 muestra diferentes curvas ajustadas
a los datos estándares de la figura 27.
Las figuras 29A y B muestran representaciones de
(A) el tiempo frente a la fluorescencia y (B) el tiempo frente a la
temperatura demostrando la relación inversa entre la temperatura y
la fluorescencia.
La figura 30 es una tabla que muestra
representaciones en 2 dimensiones de la temperatura frente al
tiempo, la fluorescencia frente al tiempo, y la fluorescencia frente
a la temperatura, también mostradas como una representación en 3
dimensiones, para la amplificación de un fragmento 180 pares de
bases del genoma de la hepatitis B en presencia de SYBR Green I.
La figura 31 es una proyección de la
fluorescencia frente a la temperatura para la amplificación de un
fragmento de 536 pares de bases del gen de la
beta-globina humana en presencia de SYBR Green
I.
Las figuras 32A y B proporcionan una
representación que muestra (A) un cambio lineal en la proporción de
la fluorescencia con la temperatura para sondas de hidrólisis, y (B)
un cambio radical con la temperatura para sondas de hibridación.
La figura 37 muestra curvas de fusión para
productos amplificados por PCR del virus de la hepatitis B
(\bullet; 50% GC, 180 pares de bases);
beta-globina (\blacktriangle; 53,2% GC, 536 pares
de bases); y antígeno específico de próstata (X; 60,3% GC, 292 pares
de bases).
La figura 38 muestra curvas de fusión para el
producto amplificado por PCR del virus de la hepatitis B a
velocidades de calentamiento de 0,1ºC a 5,0ºC.
La figura 39 muestra curvas de fusión para el
producto amplificado por PCR del virus de la hepatitis B a varias
concentraciones de SYBR™ Green I.
Las figuras 40A y B muestran (A) curvas de fusión
y (B) bandas fraccionadas electroforéticamente de productos de un
fragmento de beta-globina amplificado con (a) sin
plantilla añadida, (b) 10^{6} copias de la plantilla añadida bajo
condiciones poco estrictas, y (c) 10^{6} copias de la plantilla
añadida bajo condiciones más estrictas.
Las figuras 41A y B muestran (A) curvas de fusión
y (B) picos de la fusión del fragmento del virus de la hepatitis B
(HBV), \beta-globina, y una mezcla de los
mismos.
Las figuras 42A-D muestran (A)
una representación de la fluorescencia relativa frente al número de
ciclos para productos amplificados por PCR de varias cantidades de
plantilla de \beta-globina, (B) picos de fusión y
(C) bandas electroforéticas de los diversos productos, y (D) la
fluorescencia corregida de los datos de (A).
Las figuras 43A y B muestran (A) curvas de fusión
y (B) picos de fusión de productos amplificados por PCR de una
mezcla del gen de la fibrosis cística y el oncógeno
c-erbB-2.
La figura 44 muestras los picos de fusión en
varios números de ciclos para el gen de la fibrosis cística (CFTR) y
el c-erbB-2 (neu).
La figura 45 muestra un gráfico de picos de
fusión integrados de productos de la PCR de CFTR y neu.
La figura 49 muestra la forma de las curvas de
refijación de productos amplificados de la PCR de
\beta-globina de varias cantidades iniciales de
plantilla.
La figura 50 muestra la determinación de una
constante de velocidad de segundo orden para determinar la
concentración inicial de plantilla.
La figura 51 muestra un diagrama de bloques para
controlar el ciclado térmico a partir de los datos de
fluorescencia.
Las figuras 52A y B muestran (A) una
representación de la temperatura frente al tiempo obtenida después
de 20 ciclos y (B) una representación de la fluorescencia frente al
tiempo obtenida después de 25 ciclos en la que el ciclado térmico se
controló a partir de los datos de fluorescencia.
En la descripción y las reivindicaciones de la
presente invención, se utilizará la siguiente terminología según las
definiciones establecidas posteriormente.
Tal como se utiliza en la presente, "ácido
nucleico", "ADN", y términos similares que también incluyen
análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen un
esqueleto diferente a un esqueleto fosfodiéster. Por ejemplo, los
denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que son conocidos en
la técnica y que tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces
fosfodiéster en el esqueleto, se consideran dentro del alcance de la
presente invención.
Tal como se utiliza en la presente, la
"monitorización continua" y términos similares se refieren a la
monitorización en repetidas veces durante un ciclo de la PCR,
preferiblemente durante las transiciones de temperatura, y más
preferiblemente, obteniendo, como mínimo, un punto en cada
transición de la temperatura.
Tal como se utiliza en la presente, la
monitorización "ciclo por ciclo" significa la monitorización de
la reacción de la PCR una vez por ciclo, preferiblemente, durante la
fase de fijación de la PCR.
Tal como se utiliza en la presente, una
"cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para
producir un efecto seleccionado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de
cebadores de la PCR es una cantidad suficiente para amplificar un
segmento de ácido nucleico mediante la PCR siempre que también se
proporcionen una ADN polimerasa, una disolución tampón, una
plantilla, y otras condiciones, incluyendo condiciones de
temperatura, conocidas en la técnica y que sean necesarias para
realizar la PCR.
La PCR requiere la desnaturalización de la
plantilla repetitiva y la fijación de cebadores. Estas transiciones
de hibridación dependen de la temperatura. Los ciclos de temperatura
de la PCR que rigen la amplificación desnaturalizan de forma
alternativa el producto acumulado a una temperatura elevada y fijan
cebadores al producto a una temperatura inferior. Las temperaturas
de transición de la desnaturalización del producto y la fijación de
los cebadores dependen, principalmente, del contenido y la longitud
de GC. Si se diseña una sonda para hibridarse de forma interna al
producto de la PCR, la temperatura de fusión de la sonda también
depende del contenido de GC, la longitud, y el grado de
complementariedad a la diana. Las sondas de fluorescencia
compatibles con la PCR pueden monitorizar la hibridación durante la
amplificación.
Según la presente invención, que se utiliza
preferiblemente junto con el ciclado rápido (descrito completamente
en el No. de Serie de Estados Unidos 08/658.993, archivado el 4 de
junio de 1996, titulado "System and Method For Monitoring PCR
Processes" ("Sistema y Método para la Monitorización de
Procesos de la PCR"), y el No. de Serie de Estados Unidos
08/537.612, archivado el 2 de octubre de 1995, titulada "Method
For Rapid Thermal Cycling of Biological Simples" ("Método Para
el Ciclado Térmico Rápido en Muestras Biológicas"), mencionados
anteriormente), un paradigma cinético es apropiado para la PCR. En
lugar de pensar en la PCR como tres reacciones (desnaturalización,
fijación, extensión) que tienen lugar a tres temperaturas diferentes
durante tres períodos de tiempo (figura 1A), es más útil un
paradigma cinético para la PCR (figura 1B). Con un paradigma
cinético, la curva de la temperatura frente al tiempo consiste en
transiciones continuas entre reacciones solapadas. La
desnaturalización y la fijación son tan rápidas que no es necesario
mantener una temperatura particular durante un cierto tiempo. La
extensión tiene lugar siempre en un intervalo de temperaturas a
velocidades variantes. Un análisis completo necesitaría el
conocimiento de todas las constantes de velocidad pertinentes sobre
todas las temperaturas. Si se conocieran las constantes de velocidad
de todas las reacciones, se podría desarrollar una "descripción
físico-química de la PCR". La determinación de
estas velocidades necesitaría un control preciso de la temperatura
de la muestra y se simplifica ampliamente mediante la monitorización
de la reacción durante el ciclado de temperaturas.
La figura 2 muestra fragmentos útiles de la
temperatura frente al tiempo para la monitorización de la
hibridación por fluorescencia. Las curvas de fusión de los productos
se obtienen durante un incremento lento de la temperatura hasta la
desnaturalización. Mediante el descenso rápido de la temperatura
tras la desnaturalización hasta una temperatura constante, se puede
seguir, opcionalmente, la fijación del producto, la sonda, o el
cebador. Las curvas de fusión de la sonda se obtienen mediante el
calentamiento lento a lo largo de temperaturas alrededor de la
temperatura de fusión de la sonda. La realización representada en la
figura 2 proporciona todos los análisis durante el ciclado de
temperaturas con una exposición inmediata a tiempo real. Las sondas
fluorescentes se incluyen como parte de la solución de amplificación
para la monitorización continua del cebador, la sonda, o la
hibridación del producto durante el ciclado de temperaturas.
Las técnicas de hibridación por fluorescencia
contenidas en la presente se basan en el ciclado rápido, con
ventajas en la velocidad y la especificidad.
En la figura 3 se muestra un perfil de
temperatura de la muestra durante la PCR de ciclo rápido. En estas
figuras, la desnaturalización y la fijación aparecen como
"picos" de temperatura, en oposición al plateau amplio del
ciclado de temperaturas convencionales para PCR, por ejemplo, la
figura 1A. En la figura 4, el ciclado rápido de temperaturas se
compara con el ciclado convencional de temperaturas, y en la que se
muestra que en 15 minutos se pueden completar 30 ciclos de la
amplificación y que los productos resultantes de la PCR contienen
muchos menos productos secundarios. De este modo, con el ciclado
rápido, los tiempos necesarios para la amplificación se reducen,
aproximadamente, 10 veces, y se mejora la especificidad.
La figura 4 muestra los resultados de cuatro
perfiles diferentes de temperatura/tiempo (A-D) y
sus productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos
(A-D). Los perfiles A y B de la figura 4 se
obtuvieron utilizando un dispositivo de bloque calentador de la
técnica anterior que utiliza un tubo de microfuga de la técnica
anterior. Tal como se puede observar en la figura 4, las
transiciones entre temperaturas son lentas y en los perfiles A y B
se observan muchas bandas no específicas. El perfil B muestra la
mejora en la eliminación de algunas de las bandas no específicas (en
comparación con el perfil A) mediante la limitación del tiempo que
cada muestra permanece a cada temperatura, indicando así que a
tiempos más cortos se consiguen resultados más deseables.
Los perfiles C y D se obtuvieron utilizando un
ciclador rápido de temperatura. Tal como se puede observar en la
figura 4, la amplificación es específica y, aunque el rendimiento es
máximo con tiempos de elongación de 60 segundos (C), es aún
completamente adecuado con tiempos de elongación de 10 segundos
(D).
Se determinaron también los tiempos y
temperaturas óptimas para la amplificación de un fragmento de 536
pares de bases de beta-globina de ADN genómico
humano. Los rendimientos de la amplificación y la especificad de los
productos fueron óptimos cuando la desnaturalización (93ºC) y la
fijación (55ºC) fueron inferiores a 1 segundo. No se encontró
ninguna ventaja cuando se alargaron los tiempos de desnaturalización
o fijación. El rendimiento se incrementó con tiempos de elongación
más largos a 77ºC, pero hubo poco cambio con tiempos de elongación
más largos de 10-20 segundos. Estos resultados
inesperados indican que los dispositivos disponibles previamente
utilizados para la amplificación del ADN no maximizan las
condiciones necesarias para optimizar los requerimientos físicos y
enzimáticos de la reacción.
Se puede obtener información adicional de: C.T.
Wittwer y otros, "Rapid Cycle Allele-Specific
Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus"
("Amplificación Específica de Alelo de Ciclo Rápido con el Locus
delta F(508) de la Fibrosis Cística"), 39 Clinical
Chemistry 804 (1993) y C.T. Wittwer y otros, "Rapid DNA
Amplification" ("Amplificación rápida del ADN"), THE
POLIMERASE CHAIN REACTION 174 (1994). La instrumentación utilizada
para la adquisición de fluorescencia y el ciclado rápido de
temperaturas se describe en profundidad en el No. de Serie
08/537.612, véase anteriormente.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
reacción en cadena de la polimerasa se puede realizar rápidamente.
Además de facilitar la transferencia rápida de calor, la utilización
de tubos capilares óptimamente transparentes permite la
monitorización continua por fluorescencia de la amplificación del
ADN según la presente invención.
Las sondas fluorescentes se pueden utilizar para
detectar y monitorizar la amplificación del ADN. Entre las sondas
útiles se incluyen colorantes de ADN específico de doble cadena y
sondas específicas de secuencia.
En la figura 5A, la fluorescencia depende de la
hibridación del producto de la PCR, tal como se detecta con un
colorante de ADN específico de doble cadena.
El método de la figura 5A no es específico de la
secuencia, a pesar de que la especificidad del producto se puede
determinar mediante curvas de fusión, un aspecto de la presente
invención.
Selección del colorante de ADN específico de
doble cadena. Los técnicos en la materia conocerán la utilización de
bromuro de etidio en técnicas de fluorescencia. Cuando se utiliza un
colorante fluorescente específico de doble cadena durante la
amplificación, la fluorescencia aumenta, generalmente, a medida que
se produce más producto de doble cadena, véase R. Higuchi y otros,
"Simultaneous amplification and detection of specific DNA
sequences" ("Amplificación y detección simultánea de las
secuencias de ADN específicas"), 10 Bio/Technology
413-417 (1992). En la técnica se conoce también un
ensayo de la PCR por fluorescencia para el ARN de la hepatitis C que
utiliza el intercalador YO-PRO-1.
Véase T. Ishiguro y otros, "Homogeneous quantitative assay of
hepatitis C virus RNA by polimerase chain reaction in the presence
of a fluorescent intercalater" ("Ensayo cuantitativo homogéneo
del ARN del virus de la hepatitis C mediante la reacción en cadena
de la polimerasa de un intercalador fluorescente"), 229 Anal.
Biochem. 207-213 (1995). Se prefiere que el SYBR™
Green I, que se conoce bien en la técnica y está disponible en
Molecular Probes of Eugene, Oregón, se utilice como colorante
específico de doble cadena. La estructura molecular de este
colorante es un secreto comercial, pero está recomendado por el
fabricante como un colorante específico de doble cadena más sensible
para la detección de ADN en geles. Sin embargo, el SYBR™ Green I es
termolábil y, de este modo, no es útil para la monitorización de la
fluorescencia de la PCR según los métodos convencionales en los que
la temperatura de la mezcla de reacción se mantiene en las
temperaturas de fusión durante períodos prolongados de tiempo.
Debido a esta labilidad con el calor, no se esperaba descubrir que
el SYBR™ Green I se pudiera utilizar para monitorizar las reacciones
PCR cuando las temperaturas de fusión no se mantienen durante
períodos prolongados, es decir, cuando la PCR se lleva a cabo
mediante ciclado rápido según el paradigma cinético descrito
anteriormente.
anteriormente.
Se compararon diferentes colorantes de ADN
específicos de doble cadena mediante la monitorización de la
amplificación de un fragmento de 110 pares de bases de la pareja de
cebadores PCO3/PCO4 del gen de la beta-globina
humana de 10.000 copias de la platilla. Los cebadores se
sintetizaron mediante la química estándar de la fosforamidita tal
como se conoce en la técnica, es decir, utilizando la Pharmacia
Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey). Los cebadores
PCO3/PCO4 de la beta-globina humana (110 pares de
bases) se describen en C.T. Wittwer y otros, "Automated polymerase
chain reaction in capillary tubes with hot air" ("Reacción en
cadena de la polimerasa automatizada en tubos capilares con aire
caliente"), 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357
(1989), que se incorpora en la presente por referencia. La
amplificación del ADN se realizó en Tris 50 mM, pH 8,5 (25ºC),
MgCl_{2} 3 mM, albúmina de suero bovino 500 \mug/ml, 0,5 \muM
de cada cebador, 0,2 mM de cada desoxinucleósido trifosfato y 0,2 U
de Taq polimerasa por cada 5 \mul de muestra a menos que se afirme
lo contrario en los siguientes ejemplos. El producto de la
amplificación purificado se utilizó como plantilla del ADN y se
obtuvo mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación en
etanol, véase D.M. Wallace, "Large- and
small-scale phenol extractions and precipitation of
nucleic acids" ("Extracciones con fenol y precipitación de
ácidos nucleicos a pequeña y gran escala"), 152 Methods in
Enzimology 33-48 (1987), seguidas por la eliminación
de los cebadores mediante lavados repetidos a través de un
microconcentrador Centricon 30 (Amicon, Danvers, Massachusetts). Las
concentraciones de las plantillas se determinaron mediante la
absorbancia a 260 nm. Las proporciones A(260):A(280)
de las plantillas eran superiores a 1,7.
El SYBR™ Green I (Molecular Probes, Eugene,
Oregon) se utilizó en una dilución 1:10.000, el bromuro de etidio en
una concentración de 5 \mug/ml, y naranja de acridina en una
concentración de 3 \mug/ml. Se determinó que estas concentraciones
eran las concentraciones óptimas para maximizar la señal de
fluorescencia observada durante la amplificación para cada
colorante. La excitación se realizó a través de un filtro de
interferencia a 450-490 nm a partir de una fuente de
arco de xenón, a excepción del bromuro de etidio, en el que se
utilizó una excitación a 520-550 nm. Para el SYBR™
Green I, se monitorizó la emisión a 520-550 nm. La
fluorescencia del bromuro de etidio se observó a través de un paso
de banda de 580-620 nm. La señal del naranja de
acridina se recogió como la proporción de la fluorescencia verde
(520-550 nm) con respecto a la roja (>610 nm). La
fluorescencia de la muestra antes de la amplificación se comparó con
la fluorescencia después de 35 ciclos (94ºC máximo, 60ºC durante 20
segundos) a 60ºC. El incremento de la fluorescencia fue de 5,3 veces
para el SYBR™ Green I, de 1,7 veces para el bromuro de etidio, y de
1,2 veces para el naranja de acridina. En experimentos separados, la
fluorescencia del SYBR™ Green I fue estable durante más de 30
minutos a 70ºC. Se excita también de forma conveniente con luz
visible y se constata que es menos mutágeno que el bromuro de
etidio. La fluorescencia de fondo, en todos los casos, surge
principalmente de los cebadores.
El SYBR™ Green I es el colorante específico de
doble cadena para monitorizar por fluorescencia la PCR, según la
presente invención, principalmente, debido a la sensibilidad
superior, que resulta de una mayor discriminación entre los ácidos
nucleicos de cadena doble y de cadena simple. El SYBR™ Green I se
puede utilizar en cualquier amplificación y no es caro. Además, la
especificidad del producto se puede obtener mediante el análisis de
curvas de fusión, tal como se describirá inmediatamente.
Fluorescencia ciclo por ciclo. El análisis
convencional del punto final de la amplificación de ADN mediante
electroforesis en gel identifica el tamaño del producto y estima la
pureza. Sin embargo, dado que la amplificación es inicialmente
estocástica, a continuación exponencial, y finalmente estagnante, la
utilidad del análisis del punto final se limita a la cuantificación.
Un aspecto de la presente invención incluye la monitorización ciclo
por ciclo con sondas de hibridación para la cuantificación del
número de copias de la plantilla inicial. Tal como se apreciará por
los técnicos en la materia, la monitorización de una vez por ciclo
de muestras múltiples que experimentan la amplificación del ADN es
una potente herramienta cuantitativa. La monitorización ciclo por
ciclo se consigue mediante la adquisición de fluorescencia durante
la extensión o la fase combinada de fijación/extensión de cada ciclo
y relacionando la fluorescencia con la concentración del
producto.
\newpage
La monitorización ciclo por ciclo de la PCR se
realizó mediante tres técnicas de fluorescencia diferentes. La
fluorescencia se monitorizó mediante (i) el colorante específico de
doble cadena, SYBR™ Green I (ii) una disminución en la inhibición de
la fluoresceína por rodamina tras la división de exonucleasa de una
sonda de hidrólisis doblemente marcada y (iii) la transferencia de
energía de resonancia de la fluoresceína a la Cy5 mediante sondas de
hibridación adyacentes. Sin embargo, la presente invención sólo
incluye la monitorización de la fluorescencia mediante el colorante
específico de doble cadena, SYBR™ Green I.
Los reactivos y las condiciones de amplificación
fueron las descritas en el Ejemplo 2. Los cebadores RS42/KM29 (536
pares de bases) y PC03/PC04 (110 pares de bases) de la
beta-globina humana se describen en C.T. Wittwer y
otros, "Automated polymerase chain reaction in capillary tubes
with hot air" ("Reacción en cadena de la polimerasa
automatizada en tubos capilares con aire caliente"), 17 Nucl.
Acids. Res. 4353-4357 (1989), que se incorpora en la
presente por referencia. El ciclado de temperaturas para la
beta-globina fue de 95ºC como máximo, 61ºC como
mínimo, 15 segundos a 72ºC y una velocidad promedio entre
temperaturas de 5,2ºC/s. Los cebadores de
beta-actina y la sonda dual de fluoresceína/rodamina
se obtuvieron de Perkin Elmer (no. N808-0230). El
ciclado de temperaturas para la beta-actina fue de
94ºC como máximo, 15 segundos a 60ºC con una velocidad promedio
entre temperaturas de 6,2ºC/s. Las sondas marcadas individualmente
5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT
GAGGA-fluoresceína-3' (Secuencia de
Identificación (SEQ ID No:3) y
5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT
GTGGG
GCAAGp (SEQ ID No:4) se sintetizaron como en el Ejemplo 3. Estas sondas adyacentes se hibridan de forma interna a la pareja de cebadores de la beta-globina PC03/PC04 en la misma cadena de ADN y están separadas por una pareja de bases. El ciclado de temperaturas fue de 94ºC como máximo, 20 segundos a 59ºC con una velocidad promedio entre temperaturas de 7,0ºC/s. Las sondas de hibridación (beta-actina y beta-globina) se utilizaron cada una en una concentración de 0,2 \muM.
GCAAGp (SEQ ID No:4) se sintetizaron como en el Ejemplo 3. Estas sondas adyacentes se hibridan de forma interna a la pareja de cebadores de la beta-globina PC03/PC04 en la misma cadena de ADN y están separadas por una pareja de bases. El ciclado de temperaturas fue de 94ºC como máximo, 20 segundos a 59ºC con una velocidad promedio entre temperaturas de 7,0ºC/s. Las sondas de hibridación (beta-actina y beta-globina) se utilizaron cada una en una concentración de 0,2 \muM.
Cuando se monitorizan muestras múltiples una vez
por ciclo con SYBR™ Green I, se puede distinguir un intervalo de
10^{7} a 10^{8} de concentración inicial de plantilla, tal como
se representa en la figura 15. Esta amplificación es de un fragmento
de 536 pares de bases del gen de la beta-globina,
con SYBR™ Green I como colorante específico de doble cadena. Cuando
se normalizaron los datos como el porcentaje de fluorescencia máxima
de cada muestra, se separaron claramente cien copias iniciales de
diez copias. Sin embargo, la diferencia entre una y diez copias era
marginal, y no se observó diferencia entre cero y una copia de
promedio por muestra.
La señal de fluorescencia de las sondas de
hibridación no es acumulativa y desarrolla una nueva señal durante
cada fase de fijación. La fluorescencia es una medida directa de la
concentración del producto debido a que la hibridación es una
reacción de pseudo primer orden. Dado que la concentración de la
sonda es mucho mayor que la del producto, la fracción de producto
hibridado a la sonda es independiente de la concentración de
producto. Estas características indican que la utilización de una
sonda individual de hibridación junto con un cebador marcado
proporcionará una monitorización superior de la acumulación de
producto para su cuantificación. La varianza inherente de las
diferentes técnicas de fluorescencia durante la monitorización ciclo
por ciclo es también importante para la cuantifica-
ción.
ción.
Se realizó la amplificación del ADN, según el
Ejemplo 2, para cada uno de los tres métodos diferentes de
monitorización de la fluorescencia. Se utilizó SYBR™ Green I en una
dilución 1:10.000 en la amplificación de un fragmento de 205 pares
de bases de beta-globina humana a partir de los
cebadores KM29 y PC04. La sonda y las condiciones de hidrólisis son
las especificadas en el Ejemplo 7. La sonda de hibridación,
TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-fluoresceína (SEQ ID
No: 5) se utilizó con KM29 y el cebador marcado en Cy5
CAACTTCATCCACGTT*CACC (SEQ ID No: 6), en la que T* era una base T
marcada en Cy5, que se sintetizó como en el ejemplo 8. Todas las
amplificaciones se realizaron en diez replicados con 15.000 copias
de la plantilla (50 ng de ADN genómico humano/10 \mul). Los ciclos
de temperatura fueron de 31 segundos de duración (máximo de 94ºC,
60ºC durante 20 segundos, velocidad promedio entre temperaturas de
6,2ºC/s). La fluorescencia se adquirió para cada muestra entre los
segundos 15 y 20 de la fase de fijación/extensión.
La figura 19A permite la comparación de tres
técnicas de monitorización de la fluorescencia para la PCR. Las
sondas de fluorescencia son el colorante de ADN de doble cadena,
SYBR™ Green I (figura 19A), una sonda de hidrólisis de
fluoresceína/rodamina doblemente marcada (figura 19B), y una sonda
de hibridación marcada con fluoresceína con un cebador marcado en
Cy5 (figura 19C). Todas las sondas tenían casi la misma sensibilidad
con la fluorescencia detectable que tenía lugar alrededor del ciclo
20. Con la amplificación extendida, la señal siguió incrementándose
con la sonda de hidrólisis, se niveló con el SYBR™ Green I, y
disminuyó ligeramente con la sonda de hibridación. La precisión de
las tres técnicas de monitorización de la fluorescencia se comparan
en la figura 19D. Para cada punto se indican la media +/- la
desviación estándar. Los datos están representados como el
coeficiente de variación (desviación estándar/media) de la
proporción de la fluorescencia sobre la línea base (tomada como el
promedio de los ciclos 11-15).
A pesar de que el cambio en la proporción de
fluorescencia de la sonda de hidrólisis es mayor que la de la sonda
de hibridación (figuras 19B y 19C), el coeficiente de variación de
la fluorescencia de las sondas de hidrólisis es superior (figura
19D). Es decir, la fluorescencia resultante del método con la sonda
de hibridación es más precisa que el que utiliza una sonda de
hidrólisis, aunque los niveles absolutos de la señal son inferiores.
Ésta es una ventaja inesperada de las sondas de hibridación sobre
las sondas de hidrólisis doblemente marcadas más habituales.
Cuantificación del número de copias iniciales de
la plantilla. La PCR cuantitativa se ha convertido en una importante
técnica tanto en la investigación biomédica como en el laboratorio
clínico. El proceso de cuantificación incluye frecuentemente la
elaboración de una curva estándar de muestras que contienen números
de copias conocidos de la secuencia diana. El número de copias de
una muestra desconocida se determina por extrapolación entre los
valores conocidos. Cuando se monitoriza ciclo por ciclo una curva de
amplificación completa utilizando fluorescencia, radioactividad o
cualquier otro método que proporciona una señal proporcional a la
cantidad de ADN presente, se dispone de muchos puntos para el
análisis y no está claro qué valor elegir para representar una
muestra estándar o desconocida. La técnica anterior se utiliza para
elegir una "valor umbral" de la señal y, a continuación,
utilizar el número de ciclos cuando la muestra estándar o
desconocida traspasa ese umbral como valor representativo (véase
Higuchi y Watson, EPA 0 640 828 A1). Esta aproximación utiliza una
cantidad muy pequeña de los datos disponibles en una curva de
amplificación. Además, la asignación del valor umbral es altamente
subjetiva y está sometido a una desviación consciente o
inconsciente. En una curva de amplificación se podrían utilizar
objetivamente más de los datos disponibles mediante la aplicación de
técnicas de ajuste de curvas no lineales a los datos.
Preferiblemente, se podrían encontrar ecuaciones que describen la
forma de las curvas de amplificación mediante factores de modelación
del proceso subyacente.
Se podrían utilizar un conjunto de diferentes
ecuaciones para ajustar los datos obtenidos durante la
amplificación. Las amplificaciones de ADN tienen, habitualmente, un
fragmento logarítmico lineal y los datos en este fragmento se pueden
ajustar a una ecuación que describe un incremento exponencial como
el esperado en una amplificación de ADN. La parte logarítmica lineal
de una amplificación de ADN se puede describir mediante la siguiente
ecuación:
y =
A*[ADN]*(1+E)^{n}
en la que A es un factor de escala
que convierte unidades de señal en unidades de ADN; [ADN] es la
concentración inicial de ADN en la reacción; E es la eficacia de la
reacción; y n es el número de
ciclos.
Un proceso de cuantificación implicaría: (1) el
ajuste de los estándares conocidos a esta ecuación permitiendo la
flotación de los parámetros A y E, y (2) el ajuste de las muestras
desconocidas a la ecuación utilizando los valores de A y E a partir
de los estándares y permitiendo la flotación de [ADN]. Esta técnica
utiliza muchos más datos y utiliza la parte de los datos, la parte
logarítmica lineal, que probablemente es más informativa. Las
figuras 20, 21 y 22 muestran un ejemplo de esta aproximación. Se
amplificaron diluciones de diez veces de un producto de PCR
purificado como una curva estándar y se utilizó un estándar de ADN
genómico humano "desconocido". La figura 20 muestra que la
parte logarítmica lineal es identificada fácilmente por el usuario o
bien, mediante software. La figura 21 muestra un ajuste de la
ecuación y = A*[ADN]*(1+E)^{n} al estándar de 10^{4}
copias. La figura 22 utiliza valores promedio de los estándares para
A y E y ajusta la [ADN]. El valor de ajuste de 16.700 está muy
próximo al valor teórico para un gen copia único en el ADN genómico
(15.000 copias).
La utilización de todos los datos en una curva de
amplificación incluiría el nivel de fondo y el valor del plateau.
Mientras que con un número de copias el valor del plateau no es
informativo, con un número bajo de copias es frecuentemente
proporcional al número de copias iniciales. El nivel de fondo podría
ser útil en la determinación del primer punto que muestra un
incremento significativo de la señal. En este punto no se conocen
todos los factores implicados en la forma de la curva de
amplificación del ADN, así que una aproximación es describir la
forma de la curva. La figura 23 muestras las curvas de amplificación
que utilizan sondas de hibridación fluorescentes para detectar
rangos de magnitud de quinto orden de las concentraciones de la
plantilla de ADN. Cada curva se ajusta a la ecuación:
y =
((as*x+ab)-(ds*x+db))/(1+(x/c)^{\wedge}b)+(ds*x+db)
en la que "as" es el fondo de
la línea inclinada, "ab" es la intersección de y con la línea
de fondo, "ds" es la pendiente de la línea plateau, "db"
es la intersección de y con la línea inclinada, "c" es el
número de ciclo en el que la reacción está a medio camino entre el
fondo y la línea plateau (A_{50}), y "b" es la pendiente de
la parte logarítmica lineal de la
amplificación.
Esta ecuación proporciona buenos ajustes a estos
datos de amplificación, y la figura 24 muestra que el valor de la
A_{50} se correlaciona bien con el logaritmo del número de copias
iniciales a lo largo de siete órdenes de magnitud. La figura 25
muestra la misma ecuación ajustada a los datos de amplificaciones
que utilizaron una sonda de hidrólisis para detectar una plantilla
de ADN sobre un rango de 5 órdenes de magnitud. Esta ecuación
proporciona buenos ajustes a estos datos de amplificación, y la
figura 26 muestra que el valor de la A_{50} se correlaciona bien
con el logaritmo del número de copias iniciales. Esto demuestra la
flexibilidad de la aproximación completa del ajuste de la curva ya
que la ecuación ha proporcionado buenos ajustes tanto a los plateaus
estrechos de las curvas de amplificación con sondas de hibridación
como a los "plateaus" de incremento estable de las curvas con
sondas de hidrólisis.
Los ajustes totales de las curvas no se limitan a
esta ecuación. La figura 27 muestra una amplificación de tres
concentraciones de la plantilla de ADN ajustada a la ecuación:
y =
(((as*x+ab)-(dmax*x/dd+x))/(1+(x/c)^{\wedge}b))+(dmax*x/dd+x),
que es similar a las primeras
ecuaciones de 6 parámetros excepto que el plateau se define mediante
una curva hiperbólica en lugar de mediante una línea. La figura 28
muestra que la A_{50} para esta ecuación se correlaciona bien con
el número de copias
iniciales.
Aunque la A_{50} se ha utilizado en estos
ejemplos, se podía elegir el nivel entre el fondo y el plateau si
una técnica particular es más robusta, inferior o superior en el
perfil de amplificación. Por ejemplo, se evalúa la mejor correlación
entre el número de copias iniciales y la A_{10}, la A_{20}, la
A_{30}, la A_{40} y la A_{50} en un conjunto de curvas
estándar de amplificación. Se determina el nivel de amplificación
que mejor se correlaciona con el número de copias iniciales
conocidas. Esto será diferente para los diferentes sistemas de
detección. La figura 19 muestra el coeficiente de variación para
varios sistemas de detección. El nivel de amplificación que es el
mejor indicador es probable que sea el nivel con el coeficiente de
variación más bajo.
Dado que la reacción de amplificación de ADN se
entiende mejor por sí misma, se podrían utilizar otras ecuaciones
que tienen parámetros que reflejan los procesos físicos. El plateau
de la curva de amplificación del ADN tiene diferentes causas en
diferentes reacciones. Frecuentemente es debido a la incapacidad de
los cebadores de competir con el producto en la refijación en los
últimos ciclos. Este efecto se podría capturar con un parámetro que
depende del cuadrado de la concentración del producto en la reacción
(ya que la velocidad de refijación es proporcional al cuadrado de la
concentración de producto). Otra causa del plateau puede ser la
depleción de los cebadores. Las reacciones limitadas por los
cebadores tienen una forma característica, tienen un plateau
estrecho que se puede reconocer. Los ajustes de la reacción limitada
por los cebadores incluirán parámetros que definen este máximo
estrecho. Las reacciones limitadas por las enzimas tienen un plateau
redondo que se puede ajustar adecuadamente. Se pueden idear factores
del peso de manera que reflejen los coeficientes de variación
conocidos para el sistema dado cuanto mayor es el peso, más fiables
son los puntos de los datos. Mediante el ajuste de más puntos en un
perfil de amplificación, se pueden obtener estimaciones más precisas
y robustas de un número inicial de copias. Se pueden utilizar uno o
más de los parámetros de estos ajustes para estimar el número
inicial de copias de muestras desconocidas.
Monitorización continua de la fluorescencia de la
PCR. A continuación, se describirá la característica de la presente
invención de monitorización continua, es decir, la monitorización de
forma repetida dentro de cada ciclo de la PCR. Aunque la
monitorización de la fluorescencia durante la PCR se puede realizar
una vez en cada ciclo a una temperatura constante, la presente
invención proporciona la ventaja importante de proporcionar una
monitorización continua a lo largo del ciclo de la PCR. La
temperatura es importante porque la fluorescencia cambia a medida
que cambia la temperatura. Las figuras 29A y B muestran la relación
inversa entre la temperatura y la fluorescencia para el SYBR™ Green
I. Este es un efecto desconcertante durante el ciclado de
temperaturas que se elimina, habitualmente, considerando la
fluorescencia sólo una vez por ciclo a una temperatura de extensión
constante. Sin embargo, según la presente invención, la
monitorización de la fluorescencia durante los cambios de
temperatura es muy informativa. Anteriormente a la presente
invención, no se ha realizado la monitorización continua de la
fluorescencia dentro de cada ciclo, en oposición a una vez por cada
ciclo. Según la presente invención, se obtienen datos de tiempo,
temperatura y fluorescencia cada segundo, cada 200 ms, cada 100 ms o
incluso a una frecuencia mayor. Dichos datos pueden revelar detalles
exactos de la desnaturalización, refijación y extensión del
producto, y la fijación y fusión de la sonda durante el ciclado
rápido, que no están disponibles en los métodos disponibles
previamente.
Se amplificó un fragmento de 180 pares de bases
del gen del antígeno de superficie de la hepatitis B a partir de
10^{6} copias del producto purificado de la PCR utilizando
cebadores 5'-CGTGGTGGAC
TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID No: 1), y
5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID
No: 2) (Secuencia HVHEPB del Banco de Genes). Se siguieron las
condiciones de amplificación del Ejemplo 2, a excepción de que la
reacción contenía una dilución 1:20.000 del SYBR™ Green I y
MgCl_{2} 2 mM. Cada ciclo de temperaturas fue de 27 segundos
(máximo de 92ºC, mínimo de 59ºC, 5 s a 70ºC, velocidad promedio
entre temperaturas de 3,0ºC/s). Se adquirieron datos de tiempo,
temperatura, y 2 canales de fluorescencia cada 200 ms y se mostró de
forma continua como las representaciones de la fluorescencia frente
al número de ciclos y la fluorescencia frente a la temperatura. La
figura 30 muestra un rastreo tridimensional de la temperatura, el
tiempo y la fluorescencia para los ciclos 10 a 34. Esta curva
tridimensional también se proyecta en la figura 30 como
representaciones bidimensionales de la temperatura frente al tiempo,
la fluorescencia frente al tiempo, y la fluorescencia frente a la
temperatura. La proyección de la temperatura frente al tiempo de la
figura 30 se repite para cada ciclo y proporciona, esencialmente, la
misma información que la establecida en la figura 3. Dado que la
fluorescencia varía de forma inversa con la temperatura, la
proyección de la fluorescencia frente al tiempo mostrada en la
figura 30 en los ciclos iniciales es una imagen especular a escala
de la representación de la temperatura frente al tiempo (véase la
figura 29). A medida que se acumula el producto, la fluorescencia
aumenta a cualquier temperatura con el producto de doble cadena. Sin
embargo, a temperaturas de desnaturalización, la fluorescencia
vuelve a la línea base ya que sólo está presente ADN de cadena
única. La proyección de la fluorescencia frente a la temperatura de
los colorantes de doble cadena mostrada en la figura 30 elimina el
eje del tiempo y muestra la dependencia con la temperatura del tipo
de cadena durante la amplificación del ADN.
Se amplificó un fragmento de 536 pares de bases
del gen de la beta-globina humana a partir de 25 ng
de ADN genómico y una dilución 1:10.000 del SYBR™ Green I en un
volumen de 5 \mul. Cada ciclo de temperaturas fue de 28 segundos
(máximo de 95ºC, mínimo de 61ºC, 15 s a 72ºC con una velocidad
promedio entre temperaturas de 5,2ºC/s). El resto de condiciones son
las mismas que las descritas en la figura 30. Se muestran los ciclos
15-40. La dependencia con la temperatura del tipo de
cadena del producto durante la PCR se observa mediante las
representaciones de la fluorescencia frente a la temperatura que se
utilizan tal como se describe en la figura 31. Los ciclos iniciales
representados aparecen idénticos, con un incremento no lineal de la
fluorescencia a temperaturas inferiores. A medida que se lleva a
cabo la amplificación, los ciclos de temperaturas aparecen como
bucles ascendentes entre las temperaturas de fijación y
desnaturalización. A medida que la muestra se calienta, la
fluorescencia es elevada hasta que tiene lugar la desnaturalización.
A medida que se enfría la muestra, la fluorescencia aumenta,
reflejando la refijación del producto. Cuando la temperatura es
constante durante la extensión, el incremento de la fluorescencia se
correlaciona con la síntesis de ADN adicional.
Tal como se valorará del entendimiento de esta
descripción, la monitorización continua dentro de un ciclo puede
proporcionar elementos para comprender la mecánica de la
amplificación de ADN que no estaba disponible previamente en la
técnica. Utilizando la presente invención, se entienden muchos
aspectos de la amplificación de ADN que hasta ahora no se habían
entendido demasiado. Por ejemplo, la amplificación de ciclo rápido
constata la desnaturalización del producto en menos de un segundo,
mientras que la técnica anterior utiliza de diez segundos a un
minuto de desnaturalización. La observación de la fusión del
producto mediante la monitorización de la fluorescencia a tiempo
real con colorantes de doble cadena, según la presente invención
(figuras 30 y 31), muestra que la utilización de tiempos más cortos
de desnaturalización es eficaz. Como otro ejemplo, se han propuesto
muchas causas del conocido "efecto plateau", pero se disponen
de muy pocos datos para distinguir entre las alternativas. Tal como
se muestra en la figura 31, la refijación del producto es muy
rápida. De hecho, durante los ciclos posteriores de la
amplificación, la mayor parte del producto se refija en cada ciclo
durante el enfriamiento antes de alcanzar la temperatura de fijación
del cebador. Esto tiene lugar con velocidades de enfriamiento de
5-10ºC/s en la instrumentación de ciclo rápido. La
refijación del producto será más lenta, los cicladores de
temperatura de la técnica anterior serán más extensos y este efecto
indeseable será superior. La refijación del producto parece ser una
causa principal, o quizás la única, del "efecto plateau".
Ahora se considera la monitorización continua de
las sondas específicas de secuencia. Tal como se valorará del
entendimiento de esta descripción, la monitorización continua dentro
de un ciclo puede identificar la naturaleza de la fluorescencia de
la sonda.
Se realizó la monitorización continua de la
amplificación cada 200 ms con una sonda de hidrólisis doblemente
marcada (beta-actina) y sondas de hibridación
adyacentes (beta-globina), tal como en el Ejemplo 3.
En la figura 32A, se muestran los ciclos 20-45 de
una reacción monitorizada con la sonda de hidrólisis. Las sondas de
hidrólisis muestran un cambio lineal en la proporción de
fluorescencia con la temperatura y un incremento paralelo en la
fluorescencia a medida que se hidrolizan más sondas. En cambio, la
proporción de fluorescencia de las sondas de hibridación varía de
forma radical con la temperatura (figura 32B, ciclos
20-40). Durante la fase de fijación/extensión, las
sondas se hibridan al producto de cadena única y aumenta la
proporción de fluorescencia (Cy5/fluoresceína). Durante el
calentamiento hasta las temperaturas de desnaturalización del
producto, las sondas se disocian alrededor de los 70ºC, y la
proporción de la fluorescencia vuelve a los niveles de fondo.
La combinación de (1) la monitorización continua
de la fluorescencia dentro de cada ciclo de temperaturas y (2) el
análisis de la dependencia con la temperatura y el tiempo de la
hibridación, de la presente invención, proporciona ventajas que no
son obtenibles de otras maneras. La figura 2 muestra que la
información que previamente no se podía obtener, se puede extraer
mediante la monitorización continua durante todo el ciclo. La
monitorización continua de la fluorescencia durante la fase de
fusión del producto del ciclo proporciona información útil sobre la
pureza, la identidad, y la cantidad de ADN presente durante ese
ciclo.
A medida que se calienta la reacción de la PCR
desde la temperatura de extensión hasta la temperatura de
desnaturalización, cualquier ADN de la muestra se funde hasta
cadenas únicas. Esta desnaturalización se puede observar como una
gota en la fluorescencia del SYBR™ Green I. Para productos de la PCR
pequeños, la transición de fusión tiene lugar sobre un intervalo de
temperaturas pequeño y el punto medio de ese intervalo de fusión se
refiere como la Tm. De forma similar a la medición del tamaño por
electroforesis en gel, el análisis de los picos de fusión mide una
característica fundamental del ADN y se puede utilizar para
identificar productos amplificados. A diferencia de la
electroforesis en gel, el análisis de la curva de fusión puede
distinguir productos de la misma longitud pero de diferente
proporción GC/AT. Además, dos productos con la misma longitud y
contenido de GC, pero que difieren en la distribución de GC (por
ejemplo, distribuido a partes iguales frente a una abrazadera de GC
en un extremo), tendrían curvas de fusión muy diferentes.
La temperatura a la que los productos de la PCR
se funden varía sobre un intervalo amplio. Utilizando fórmulas
empíricas conocidas en la técnica, el efecto del contenido de GC en
la temperatura de fusión (Tm) del ADN predice que un 0% de dúplex GC
se fundiría 41ºC por debajo de un 100% de dúplex GC. Para un mismo
contenido de GC, un dímero de cebadores de 40 pares de bases se
fundiría 12ºC por debajo de un producto de 1000 pares de bases. Por
lo tanto, el intervalo de Tm para productos potenciales de la PCR
abarca, como mínimo, 50ºC. Este intervalo amplio permite diferenciar
la mayoría de productos de la PCR mediante curvas de fusión. De este
modo, la combinación de la monitorización de la fluorescencia de la
PCR con el análisis de las curvas de fusión proporciona la
amplificación, detección, y diferenciación simultánea de los
productos de la PCR.
Se obtuvieron curvas de fusión de ADN para tres
productos diferentes de la PCR en un fluorímetro microvolumétrico
integrado con un ciclador térmico de 24 muestras con instrumentación
óptica para la fluorescencia del SYBR™ Green I (LightCycler LC24,
Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho). Los cebadores para la
amplificación de las 180 pares de bases del gen del antígeno de
superficie de la hepatitis B fueron 5'-CGTGGTGGAC
TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID No: 1) y
5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID
No: 2). Los cebadores para la amplificación de las 292 pares de
bases del gen del antígeno específico de próstata (PSA) fueron
5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID
No: 7) y 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3'
(SEQ ID No: 8). La amplificación de las 536 pares de bases del gen
de la beta-globina humana se realizó como en el
Ejemplo 3, la PCR se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo
2. Los productos de amplificación se purificaron por extracción con
fenol/cloroformo y precipitación con etanol, seguidas por lavados
repetidos a través de un microconcentrador Centricon 30 (disponible
en Amicon de Danvers, Massachusetts). Las concentraciones de las
plantillas se determinaron mediante la absorbancia a 260 nm y se
obtuvieron proporciones A(260)/A(280) superiores a
1,7.
Se pipetearon cincuenta ng de ADN purificado en
Tris 50 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 2 mM, y 250 \mug/ml de albúmina de
suero bovino y un volumen de 5 \mul en el depósito de plástico
abierto de los tubos de reacción de vidrio compuesto/plástico, se
centrifugó a una velocidad baja para situar la muestra en la punta
del capilar de vidrio, y se selló el interior con un tapón de
plástico. Se adquirieron los datos de fluorescencia para las curvas
de fusión mediante la integración de la señal sobre
0,25-2,0 segundos durante una transición lineal de
temperatura hasta 95ºC a 0,1-10,0ºC/s. Se
adquirieron de forma continua datos de fluorescencia y se mostraron
en representaciones de fluorescencia frente a temperatura en el
entorno de programación LabView (Nacional Instrument, Austin, TX).
La figura 37 muestra las curvas de fusión de los tres productos
purificados de la PCR.
Las Tms de los tres productos de la figura 37
abarcan sólo 6 grados y dos de las curvas están separadas por sólo 2
grados. Esta pequeña separación es suficiente para permitir la fácil
diferenciación de los productos. La importancia del porcentaje de GC
sobre la longitud en la Tm se muestra mediante la fusión del
producto PSA de 292 pares de bases a una temperatura mayor que el
fragmento más largo de 536 pares de bases de la
beta-globina. Las curvas de fusión se obtienen
frecuentemente a velocidades de 0,5ºC/minuto para asegurar el
equilibrio. Además, a medida que disminuye la velocidad de
calentamiento, las curvas de fusión se desplazan a temperaturas más
bajas y se estrechan (figura 38; fragmento de hepatitis B). Sin
embargo, hay que apuntar que las curvas de fusión de la figura 37 se
obtuvieron durante una velocidad de calentamiento de 0,2ºC/segundo
(12ºC/minuto) y se pueden diferenciar productos que se diferencian
en la Tm por 2ºC o inferior.
La Tm aparente de los productos de la PCR también
depende de la concentración del colorante de ADN específico de doble
cadena (figura 39, fragmento de hepatitis B). Concentraciones
superiores de colorante incrementan la estabilidad del dúplex de ADN
y la Tm observada.
Para monitorizar las curvas de fusión con el
SYBR™ Green I, las condiciones preferidas son una dilución de
1:7.000-1:30.000 de SYBR™ Green I con velocidades de
calentamiento de 0,1-0,5ºC/segundo. Estas
condiciones permiten la fácil diferenciación de productos que
difieren en la Tm en 2ºC.
Un control más preciso de la temperatura y un
software para el análisis de los picos de fusión reducirá la
diferencia detectable en la Tm hasta una fracción de un grado. Esto
permitirá la diferenciación de la mayoría de los productos de la
PCR. Sin embargo, no todos los productos se pueden diferenciar
mediante la Tm, pues al ser posible malinterpretar los resultados de
la electroforesis debido a la comigración de dos o más productos, es
posible que alguno de los productos que se funden en el intervalo
esperado no sea el productos deseado. Sin embargo, si no hay un ADN
que se funda en el intervalo del producto esperado, se puede
concluir que ninguno de los productos esperados se encuentra
presente.
Otra forma para diferenciar los productos
disponible con el análisis de las curvas de fusión son los patrones
distintivos de fusión de dominios observados en productos más largos
de la PCR. Aunque los productos cortos (< 300 pares de bases) se
funden habitualmente en una transición, los productos más largos
pueden tener dominios de fusión internos que proporcionan curvas de
fusión con una forma compleja distintiva. Estas curvas de fusión
complejas se pueden utilizar como una huella dactilar para la
identificación del producto.
El análisis de las curvas de fusión se puede
utilizar para diferenciar el producto deseado de productos no
específicos, tales como dímeros de cebadores. Los dímeros de
cebadores se funden en un intervalo amplio de temperaturas bajas;
muy diferente de las curvas de fusión estrechas de los productos
específicos de la amplificación por la PCR. Los productos
heterogéneos más largos que surgen después de realizar muchos ciclos
en unas condiciones de fijación poco severas tienen curvas de fusión
más bajas y anchas en comparación con el producto puro de la
PCR.
Se realizó la amplificación del fragmento de 536
pares de bases del gen de la beta-globina, según el
Ejemplo 3, con una dilución 1:30.000 de SYBR™ Green I, a excepción
de que se variaron las condiciones. En la reacción A (figura 40), no
se añadió ninguna plantilla y la reacción se desarrolló en un ciclo
a 94ºC durante 0 s, 60ºC durante 0 s, y 72ºC durante 10 s durante 30
ciclos para producir productos pequeños no específicos de
amplificación. En B, la amplificación de 10^{6} copias iniciales
de la plantilla purificada en condiciones poco severas (94ºC durante
0 s, 50ºC durante 0 s, y 72ºC durante 10 s) durante 55 ciclos mostró
un intervalo amplio de tamaños de los productos de amplificación en
electroforesis en gel y se funden a lo largo de un intervalo amplio
de temperaturas. En C, 10^{6} copias iniciales de la plantilla
purificada se introdujeron en un ciclo a 94ºC durante 0 s, 60ºC
durante 0 s, y 72ºC durante 10 s durante 30 veces y se muestra una
banda única destacada y se funden en una transición estrecha. La
velocidad de la transición de la temperatura fue 0,2ºC/s. Se utilizó
la digestión con Hind III del ADN del fago \lambda (M) como
marcador.
La figura 40 muestra curvas de fusión que
reflejan de forma precisa la especificidad de una reacción PCR. La
curva de fusión C estrecha y de temperatura elevada corresponde a
una banda única en un gel. La curva de fusión A ancha y de
temperatura baja proviene del análisis de un control sin plantilla
que muestra únicamente dímeros de cebadores. La sobreamplificación
del producto en C proporciona la curva de fusión intermedia B, aún
claramente diferenciable del producto específico.
Las curvas de fusión observadas, por ejemplo, en
la figura 37, se pueden cuantificar mejor mediante la consideración,
en primer lugar, de la derivada de la fluorescencia (F) respecto a
la temperatura (T). Esta derivada se representa como -dF/dT frente a
T y convierte las curvas de fusión en picos de fusión.
Los fragmentos purificados del gen de la
hepatitis B y la beta-globina del Ejemplo 8 se
fundieron de forma individual y conjunta con una velocidad de
transición de temperatura de 0,2ºC/s y otras condiciones, tal como
se especifica en el Ejemplo 8 (figura 41). La determinación un poco
subjetiva de la Tm a partir de las curvas de fusión (superior) es
fácil visualmente a partir de los picos de fusión (inferior). El
área bajo los picos de fusión también se puede cuantificar mediante
la integración del área bajo las curvas. La línea base de
fluorescencia se extrajo en primer lugar de la representación -dF/dT
frente a T suponiendo que la magnitud de la línea base varía como el
área por debajo de la curva. A continuación, los picos se ajustaron
a gaussianos mediante regresión mínimo-cuadrática no
lineal con la media, desviación estándar, y altura del pico como
parámetros de ajuste. El área por debajo de cada gaussiano se tomó
como el área del pico. Todos los cálculos se realizaron en el
entorno de programación LabView (National Instruments, Austin, TX).
La figura 41 muestra un ejemplo de esta conversión de las curvas de
fusión en picos de fusión. El código para estos cálculos se incluye
como el apéndice A.
La capacidad para distinguir el producto
específico del dímero de cebadores y de otros componentes de la
reacción mejora la utilización de los colorantes de ADN específico
de doble cadena en la cuantificación de un número de copias
iniciales bajo. Se han cuantificado un número de copias iniciales de
la plantilla relativamente grandes utilizando bromuro de etidio
(Higuchi y Watson, véase anteriormente). Sin embargo, en un número
de copias iniciales bajo, la amplificación de fondo de los dímeros
de cebadores y otros componentes de la amplificación interfieren con
la señal de amplificación específica. Con la capacidad de la
presente invención para diferenciar productos específicos de
componentes no específicos, se pueden utilizar colorantes de ADN
específico de doble cadena para cuantificar el bajo número de copias
iniciales de la plantilla. Esto es ventajoso debido a la simplicidad
de utilización de estos colorantes. Los colorantes de ADN específico
de doble cadena se pueden utilizar en cualquier amplificación y no
son necesarios oligonucleótidos habituales marcados por
fluorescencia. La cuantificación de un número de copias bajo con
colorantes de ADN específico de doble cadena requiere una
especificidad de amplificación muy buena o, tal como se proporciona
en la presente invención, un medio para diferenciar el producto
deseado de la amplificación no específica.
La aproximación de la presente invención para la
determinación de la pureza del producto se utilizó para mejorar la
PCR cuantitativa basada en la monitorización de una vez por ciclo de
la fluorescencia de los colorantes de ADN específico de doble
cadena. Los datos de fluorescencia se adquirieron una vez por ciclo
después de la extensión de la polimerasa del producto para un
conjunto de reacciones que varían en la concentración inicial de la
plantilla de beta-globina purificada (véase la
figura 42A). La plantilla de la beta-globina y las
condiciones de amplificación fueron tal como se describen en el
Ejemplo 3. El incremento logarítmico lineal sobre la fluorescencia
de fondo empezó en un número de ciclo dependiente de la
concentración de platilla inicial. Las representaciones de las cinco
reacciones que varían de 10^{6} a 10^{2} copias por reacción se
separaron mediante, aproximadamente, cuatro ciclos. La muestra con
un promedio de 10^{2} copias por reacción mostró una disminución
en la eficacia de la reacción, y las reacciones con un número de
copias iniciales por debajo de 100 dieron perfiles de fluorescencia
que eran menos útiles. Los perfiles de fluorescencia para las
reacciones que contenían 10 y 1 copias (de promedio) aumentan en
orden inverso, y el control negativo mostró una amplificación
después de, aproximadamente, 30 ciclos. Esto es debido a la
amplificación de los dímeros de cebadores y otros productos de
amplificación no específicos que no se pueden distinguir del
producto deseado mediante la monitorización una vez por ciclo de la
fluorescencia de colorantes de ADN específico de doble cadena.
Los picos de fusión se obtuvieron para cada
muestra (figura 42B) y se encontró que se correlacionaban bien con
los resultados de la electroforesis (figura 42C). La reacción que
contenía un promedio de copias iniciales de plantilla de cero y una
no produjo una banda de electroforesis discernible en la posición de
las 536 pares de bases. Las reacciones que contenían 10 y 100 copias
iniciales de la plantilla mostraron bandas de electroforesis
débiles. Esto concordaba con el análisis de los picos de fusión, que
no mostró fusión del ADN en el intervalo del producto deseado
(90-92ºC) para las reacciones que contenían cero y
una copias iniciales y mostró picos pequeños en este intervalo de
temperaturas para 10 y 100 copias. Las bandas de electroforesis
intensas para las reacciones que contenían
10^{3}-10^{6} copias iniciales se correlacionan
bien con los picos de fusión amplios en el intervalo esperado de
90-92ºC.
La proporción del producto deseado con respecto
al producto total, determinada mediante la integración de los picos
de fusión, variaba de 0,28 para 10^{5} copias a 0,0002 para cero
copias iniciales de la plantilla. Cada valor de fluorescencia en la
figura 41A se multiplicó por la proporción adecuada para
proporcionar la representación corregida (designada como
"fluorescencia corregida" en la figura 42D). Este procedimiento
extendió el intervalo dinámico eficaz de cuantificación entre 10 y 1
copias iniciales de la plantilla.
Los picos de fusión pueden distinguir productos
específicos de productos no específicos (figura 40) y pueden
distinguir dos productos purificados de la PCR mezclados
conjuntamente (figura 41), de manera que podrían ser útiles para
distinguir dos productos específicos amplificados juntos en un único
tubo de reacción. Las curvas de fusión obtenidas por monitorización
continua de las reacciones PCR, según la presente invención, son
útiles en la PCR multiplex.
En este ejemplo, se amplificaron simultáneamente
dos fragmentos de genes a partir de ADN genómico y se monitorizaron
con la fluorescencia del SYBR™ Green I. Durante cada ciclo de
amplificación, se desnaturalizan diferentes productos de
amplificación a temperaturas de fusión dependientes de la longitud
del producto, la proporción de GC; y otros factores bien conocidos
en la técnica. La temperatura a la que cada producto se funde se
puede monitorizar con el colorante específico de doble cadena, SYBR™
Green I. Se amplificó un fragmento de 81 pares de bases del gen de
la fibrosis cística utilizando los cebadores descritos en la
presente como SEQ ID No: 14 y SEQ ID No: 15 junto con un fragmento
de 98 pares de bases del oncógeno
c-erB-2 (HER2/neu) utilizando los
cebadores descritos en la presente como SEQ ID No: 16 y SEQ ID No:
17.
Las reacciones de amplificación estaban
comprendidas de Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3
mM, 500 \mug/ml de albúmina de suero bovino, 200 \muM de cada
dNTP, y 0,5 \muM de los cebadores de la fibrosis cística, 0,3
\muM de los cebadores HER2/neu, una dilución 1:30.000 de SYBR™
Green I, 1 U de AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Perkin Elmer, Foster
City, CA), y 50 ng de ADN genómico humano en 10 \mul.
Después de la activación de la polimerasa a 95ºC
durante 30 minutos, las muestras se sometieron a un ciclo a 94ºC
durante 0 segundos (pendiente = 20), 55ºC durante 0 segundos
(pendiente = 20), y 70ºC durante 10 segundos (pendiente = 20)
durante 35 ciclos. Las muestras se enfriaron hasta 70ºC, y se
adquirieron los valores de fluorescencia de forma continua durante
un gradiente de 0,2ºC/s hasta 94ºC. Las curvas de fusión (figura 43)
mostraron claramente dos productos diferentes que funden a 78ºC
(CFTR) y 88ºC (neu). Los dos productos difieren en la Tm en,
aproximadamente, 10ºC y son fácilmente distinguibles.
La amplificación multiplex es útil en los casos
en que se necesita un control interno durante la amplificación. Por
ejemplo, muchas translocaciones son detectables mediante la PCR
colocando cebadores a cada lado del punto de ruptura. Si no tiene
lugar la amplificación, no habrá translocación, siempre y cuando el
ADN esté intacto y no esté presente ningún inhibidor. Estas
posibilidades se pueden descartar amplificando un locus de control
positivo en la misma mezcla de reacción. Dichas amplificaciones de
control se realizan mejor como controles internos con una
amplificación y detección simultánea.
En este ejemplo, se siguió el procedimiento del
Ejemplo 12 a excepción de que después de la activación de la
polimerasa a 95ºC durante 30 minutos, las muestras se sometieron a
un ciclo a 94ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), 55ºC durante 0
segundos (pendiente = 20), y 70ºC durante 10 segundos (pendiente =
20) durante 20 ciclos, seguido de 94ºC durante 0 segundos (pendiente
= 1), 55ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), y 70ºC durante 20
segundos (pendiente = 20) durante 15 ciclos. Para los ciclos
26-31, se adquirieron valores de fluorescencia de
forma continua durante cada transición de 1ºC/s desde 70ºC hasta
94ºC. Las curvas de fusión se transformaron en picos de fusión y se
mostraron (figura 44).
Hay que apuntar que la eficacia de la
amplificación del fragmento de CFTR aparece más grande que la del
fragmento de neu. La eficacia de la amplificación se puede
determinar de forma rigurosa integrando los datos de los picos de
fusión, tal como se indica en el Ejemplo 10.
Este tipo de datos cuantitativos referidos a un
control tiene muchas aplicaciones. Por ejemplo, ciertos oncógenos,
tales como HER2/neu, se amplifican in vivo en muchos tumores.
Es decir, los genes se replican en el ADN genómico, algunas veces
con muchas réplicas. Frecuentemente, el comportamiento clínico del
tumor depende del grado de replicación del oncógeno. La
amplificación del oncógeno y una plantilla de control permiten la
evaluación cuantitativa del número de copias relativo. A modo de
ejemplo adicional, la cuantificación de la carga viral en pacientes
infectados con VIH o hepatitis C es importante en la prognosis y la
terapia. Utilizando una plantilla de control y monitorizando la
eficacia de la amplificación de las plantillas, tanto de control
como naturales, durante la amplificación, se consigue una
cuantificación exacta del número de copias iniciales de las
plantillas.
La característica de la presente invención de
utilizar curvas de fusión para la cuantificación relativa se
explicará a continuación. Según la presente invención, una
utilización adicional de las curvas de fusión es la PCR
cuantitativa. La figura 42 mostró que había una correlación entre el
área bajo el pico de fusión y la cantidad de producto específico. La
cuantificación relativa de dos productos de la PCR sería posible si
los dos productos se amplificaran con una eficacia similar (o si se
conocieran las diferencias en las eficacias y se compensaran). La
cuantificación relativa de dos productos integrando las áreas de los
picos de fusión (véase el Ejemplo 10) es una aspecto de la presente
invención.
Se amplificaron y purificaron los fragmentos de
los genes de la fibrosis cística y HER2-neu del
Ejemplo 12, tal como se indica en el Ejemplo 2 y se ajustaron a 175
\mug/ml. Las muestras se mezclaron en varias proporciones (total
de 8 \mul) y se añadieron a una solución tampón (1 \mul) y SYBR™
Green I (1 \mul). Las concentraciones finales fueron Tris 50 mM,
pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, albúmina de suero bovino 250 \mug/ml, y
una dilución 1:30.000 de SYBR™ Green I. Las curvas de fusión se
obtuvieron a 0,2ºC/s, se extrajo la fluorescencia de fondo y se
integraron los picos, tal como se describe en el Ejemplo 10. Los
resultados se muestran en la figura 45. Se encontró una correlación
excelente entre las áreas relativas bajo los picos de fusión y las
cantidades relativas de los dos productos.
La cuantificación relativa de los dos productos
de la PCR es importante en muchas aplicaciones cuantitativas de la
PCR. La amplificación multiplex de dos o más productos seguida de la
integración de las áreas bajo los picos de fusión será
extremadamente útil en estas áreas. El ARNm se cuantifica
frecuentemente en relación con la cantidad de ARNm de un gen
doméstico.
Otra utilización importante de la cuantificación
relativa se encuentra en la PCR cuantitativa competitiva.
Habitualmente, se sintetiza un competidor que tiene los mismos
puntos de cebado, pero que difiere en la longitud de la secuencia
diana original. Se añaden cantidades conocidas del competidor a una
muestra desconocida y se realiza la cuantificación relativa. Los
competidores se pueden producir de manera que difieran de la
secuencia diana en la Tm en lugar de la longitud. Las cantidades
relativas de los productos se pueden cuantificar comparando las
áreas bajo sus puntos de fusión. Dado que se conoce la cantidad de
uno de los productos, se puede obtener la cantidad de la diana
original. La utilización del método de los picos de fusión es
significativamente más fácil que los métodos utilizados actualmente
que implican múltiples tubos en funcionamiento para cada muestra
desconocida y, frecuentemente, sacando tubos en varios números de
ciclos durante la reacción para encontrar la parte logarítmica
lineal de la reacción. A continuación, se deben determinar las
cantidades relativas de los dos productos. Habitualmente, esto se
realiza marcando uno de los dNTPs con un radioisótopo y, a
continuación, se cuantifica la cantidad de marcador incorporado en
cada banda después de la electroforesis en gel de agarosa. En
comparación, la presente invención permite la monitorización
continua de la reacción, de manera que la parte logarítmica lineal
de la amplificación se puede identificar fácilmente. La
cuantificación relativa se puede realizar rápidamente mediante la
integración de los picos de fusión. Un proceso de un día de duración
se reduce a menos de una hora.
A partir de la discusión anterior, se valorará
que la monitorización de la fluorescencia durante la amplificación
de ADN es una técnica analítica extraordinariamente poderosa. Cuando
se desean la detección y la cuantificación específicas de una
secuencia, se pueden utilizar sondas de transferencia de energía de
resonancia en lugar de colorantes de ADN específico de doble cadena.
La Tm de las sondas de hibridación se desplaza, aproximadamente,
4-8ºC si se encuentra presente una base individual
que no se apareja bien. Si se coloca una sonda de hibridación en un
sitio de mutación, las mutaciones de bases individuales son
detectables como un desplazamiento en la temperatura de fusión de la
sonda.
Concentración absoluta del producto mediante la
cinética de la refijación del producto. Las determinaciones de la
concentración de producto se llevan a cabo también de forma
ventajosa utilizando la presente invención. La monitorización
continua de la formación de ADN de doble cadena permite la
cuantificación del ADN en cualquier ciclo de la amplificación
mediante la cinética de la refijación. La temperatura de la muestra
se disminuye rápidamente desde la temperatura de desnaturalización y
se mantiene constante a una temperatura inferior que aún es
suficientemente elevada para evitar la fijación del cebador (figura
2). La velocidad de refijación del producto sigue una cinética de
segundo orden (véase B. Young y M. Anderson, "Quantitative
analysis of solution hybridation" ("Análisis cuantitativo de la
hibridación de la solución"), En: "Nucleic Acid Hybridization:
A Practical Approach" ("Hibridación de ácidos nucleicos: una
aproximación práctica") 47-71 (B. Hames y S.
Higgins, eds. (1985)).
Para cualquier temperatura y producto de la PCR
dados, se puede medir una constante de velocidad de segundo orden.
Una vez se conoce la constante de velocidad, se puede determinar
cualquier concentración de ADN desconocida a partir de los datos
experimentales de refijación. El enfriamiento nunca es instantáneo,
y parte de la refijación puede tener lugar antes de que se alcance
una temperatura constante. Un enfriamiento rápido maximizará la
cantidad de datos disponibles para la determinación de la constante
de velocidad y la concentración de ADN. La técnica requiere el
producto de la PCR puro, pero eso se puede asegurar mediante las
curvas de fusión obtenidas también durante el ciclado de
temperaturas que utiliza la presente invención. Este método de
cuantificación de la presente invención es, de forma ventajosa,
independiente de cualquier variación de la intensidad de la señal
entre las muestras.
Se amplificó un fragmento de 536 pares de bases
del gen de la beta-globina del ADN genómico humano
(Ejemplo 3) y se purificó (véase el Ejemplo 2). Se mezclaron
diferentes cantidades del ADN purificado con una dilución 1:30.000
de SYBR™ Green I en 5 \mul de Tris 50 mM, pH 8,3 y MgCl_{2} 3
mM. Las muestras se desnaturalizaron a 94ºC y, a continuación, se
enfriaron rápidamente hasta 85ºC. Se monitorizó con el tiempo la
fluorescencia a 520-500 nm a 85ºC. Cuando se
probaron diferentes concentraciones de ADN, la forma de la curva de
refijación era característica de la concentración de ADN (véase la
figura 49). Para cualquier temperatura y producto de la PCR dados,
se puede determinar una constante de velocidad de segundo orden. La
figura 50 muestra la determinación de una constante de velocidad de
la refijación de segundo orden para 100 ng del fragmento de 536
pares de bases en 5 \mul a 85ºC. La curva se ajustó mediante una
regresión mínimo-cuadrática no lineal con F_{max},
F_{min}, t_{o} y k como parámetros de flotación utilizando la
ecuación de velocidad de segundo orden mostrada en la figura 50. Los
programas de análisis para este tipo de ajuste de curvas son bien
conocidos en la técnica (por ejemplo, el usuario definió el ajuste
de la curva de Delta Graph, DeltaPoint, Inc, Monteray, CA). Una vez
se conoce la constante de velocidad, se puede determinar cualquier
concentración de ADN desconocida a partir de los datos
experimentales de refijación.
Con la constante de velocidad (k) definida, se
determinan las concentraciones de ADN en las muestras desconocidas.
Las curvas de la fluorescencia frente al tiempo de las muestras
desconocidas se ajustan mediante una regresión
mínimo-cuadrática no lineal, preferiblemente,
durante el ciclado de temperatura en tiempo real (por ejemplo,
utilizando el método no lineal de
Levenberg-Marquardt descrito en el entorno de
programación LabView, Nacional Instruments, Austin, TX). Para este
ajuste, F_{max}, F_{min}, t_{o}, y la [ADN] son los parámetros
de flotación y k es constante.
Dado que algunos colorantes fluorescentes afectan
a la refijación dependiente de alguna manera de la concentración, la
suposición de la cinética de segundo orden para la refijación del
producto se comprueba mediante la determinación de la constante de
velocidad a diferentes concentraciones estándares de ADN. Se define
la relación y se incorporan como necesarias las fórmulas
alternativas para el ajuste.
Las velocidades de fijación de la sonda se
utilizan para determinar la concentración de producto de forma
similar al método descrito anteriormente para determinar la
concentración del producto mediante la refijación del producto. Las
etapas se resumen, tal como se indica a continuación: (1) elección
de la ecuación de velocidad adecuada para el sistema, (2) análisis
de estándares de ADN conocidos para determinar la constante de
velocidad, (3) comprobación de la validez de la ecuación de
velocidad comparando las diferentes constantes de velocidad
derivadas de las diferentes concentraciones, y (4) utilización de
las constantes de velocidad para determinar la concentración de ADN
de muestras desconocidas a partir de sus datos de fijación de la
sonda.
Retroalimentación de la fluorescencia para el
control del ciclado de temperaturas. En comparación con el análisis
de punto final y ciclo por ciclo, la presente invención también
puede monitorizar la fluorescencia a lo largo de cada ciclo de
temperaturas. Se puede utilizar la monitorización continua de la
fluorescencia para controlar los parámetros del ciclado de
temperaturas. La presente invención utiliza la retroalimentación de
la fluorescencia para el control a tiempo real y la optimización de
la amplificación. Se puede utilizar la monitorización continua de la
fluorescencia de las muestras de la PCR que contienen un colorante
de ADN específico de doble cadena o sondas de oligonucleótidos
marcados de forma fluorescente, para monitorizar la hibridación y la
fusión durante los ciclos de amplificación individual. Este
información se puede utilizar mediante los algoritmos de control de
temperatura en los aparatos de ciclado de temperaturas para mejorar
y normalizar las condiciones de ciclado térmico. La PCR convencional
se realiza programando todos los parámetros del ciclado antes de la
amplificación. Con una monitorización continua, la determinación de
los requerimientos para el ciclado de temperaturas puede tener lugar
durante la amplificación, basándose en la observación continua de la
fijación, extensión, y desnaturalización. Entre las ventajas
potenciales de la utilización de la información de hibridación para
controlar el ciclado de temperaturas se incluyen:
1. Asegurar la desnaturalización completa del
producto de la PCR en cada ciclo:
- a.
- Minimizando la exposición a temperaturas de desnaturalización excesivamente elevadas, evitando así el daño inducido por el calor en los productos de amplificación y la polimerasa. La limitación del tiempo que el producto está expuesto a las temperaturas de desnaturalización es especialmente útil para la amplificación de productos largos.
- b.
- Incrementando la especificidad de la reacción minimizando la temperatura de desnaturalización. Esto se selecciona frente a productos con una Tm superior a la del producto de amplificación deseado.
2. Maximizar la eficacia de la amplificación
asegurando el tiempo adecuado para la fijación del cebador en cada
ciclo:
- a.
- Minimizando la cantidad de tiempo necesario para la amplificación sin permitir más tiempo del necesario para alcanzar una cierta eficacia de fijación del cebador.
- b.
- Aumentando la especificidad de la reacción minimizando el tiempo en la temperatura de fijación.
3. Maximizar la eficacia de la amplificación
asegurando el tiempo adecuado para la extensión del producto en cada
ciclo:
- a.
- Minimizando la cantidad de tiempo necesario para la amplificación sin permitir más tiempo del necesario para completar la extensión del producto.
- b.
- Aumentando la especificidad de la reacción seleccionando frente a productos más largos que el producto de amplificación deseado. Esto requeriría más tiempo que el asignado para completar la extensión del producto.
4. Iniciar los cambios del ciclado térmico
dependientes del nivel de fluorescencia obtenido o de la eficacia
actual de la amplificación. Por ejemplo, se pueden minimizar la
sobreamplificación y los productos de reacción no específicos
finalizando el ciclado térmico cuando la eficacia disminuye hasta un
cierto nivel. En otro ejemplo, el ciclado de temperaturas se puede
modificar para iniciar gradientes de temperaturas más lentos para la
adquisición de curvas de fusión cuando se puede detectar la
fluorescencia. Esto ahorra tiempo ya que los gradientes más lentos
no son necesarios en los ciclos iniciales. Otros cambios deseables
pueden resultar evidentes en la práctica continua de la presente
invención.
El control está basado en una estimación de los
parámetros de reacción a partir de los datos de fluorescencia. Los
datos originales de fluorescencia se adquieren como un cambio de la
fluorescencia con el tiempo (velocidades específicas de las
temperaturas de desnaturalización, fijación, y extensión), un cambio
en la fluorescencia con la temperatura (Tm del producto o la sonda),
o un cambio en la extensión de la amplificación (rendimiento y
eficacia de la amplificación). Estas velocidades, Tms y su primera y
segunda derivada se utilizan para determinar los parámetros de
reacción óptimos que incluyen la temperatura de desnaturalización y
el tiempo, la temperatura de fijación del cebador y el tiempo, la
temperatura de fijación de la sonda y el tiempo, la temperatura de
extensión de la enzima y el tiempo, y el número de ciclos.
Los colorantes de ADN específico de doble cadena
se utilizan para el control de la desnaturalización, el control de
la extensión, y para iniciar los cambios de ciclado térmico en un
cierto nivel de amplificación o eficacia.
Se modificó un ciclador térmico comercial de
monitorización de la fluorescencia (LC24 LightCycler, Idaho
Technology Inc., Idaho Falls, Idaho), de manera que no se programa
el software con los puntos de entrada temperatura/tiempo, pero se
programa para obtener valores de fluorescencia y, a continuación,
utilizar estos valores para el control del ciclador térmico.
Tal como se representa en el Diagrama de Bloques
Funcional (figura 51), el Programa Ejecución-Tiempo
se comunica a través de interfaces en serie y tablero DAQ con el
LightCycler. Esto permite un nivel de acceso elevado a los datos de
temperatura o fluorescencia y se puede utilizar por el software del
nivel del Tablero para el control de la temperatura. Sin embargo, en
la presente realización del instrumento, sólo los datos de
temperatura se transforman en forma digital en el nivel de hardware
controlador. Los datos de la fluorescencia se envían de forma
análoga a través del tablero interfaz de adquisición digital, se
analiza mediante el Programa Ejecución-tiempo, y se
devuelve al software del nivel del tablero a través de la interfaz
en serie.
Se adquirió un pico de fusión para el producto de
la PCR deseado y se adquirió una fluorescencia de línea base para la
muestra que contiene la mezcla de reacción a la temperatura a la que
el producto se fundió completamente.
A continuación, cada ciclo de la reacción utilizó
este valor de fluorescencia como un objetivo. La aproximación a la
desnaturalización del producto se realizó en dos etapas para superar
el lapso de tiempo debido a la necesidad de enviar el valor de
fluorescencia a un ordenador remoto para el análisis, y, a
continuación, devolver la instrucción de que el valor ha sido
alcanzado. Con cada etapa de fusión del producto, la temperatura se
incrementó hasta que la fluorescencia alcanzó un valor intermedio, a
continuación, se redujo el poder de calefacción, de manera que una
velocidad de gradiente de temperatura de, aproximadamente, 3ºC/s
proporcionó al ordenador el tiempo para analizar la fluorescencia y
señalar al ciclador térmico que había tenido lugar la
desnaturalización del producto.
La representación temperatura/tiempo resultante
(figura 52) muestra un incremento característico en la temperatura
de fusión después del ciclo 20 a medida que aumenta la concentración
del producto de amplificación. La Tm del producto es función de la
concentración del producto.
Durante la extensión constante a una temperatura
de fijación/extensión combinada, se monitorizó la fluorescencia y
esta información se utilizó para asegurar que se había permitido un
tiempo adecuado, pero no excesivo, para la extensión del producto.
La fluorescencia se monitorizó en intervalos de 10 segundos, si la
fluorescencia aumentaba más que una proporción establecida
(habitualmente, 1,00-1,05), a continuación, se
continuaba la etapa de fijación/extensión. De lo contrario, se
iniciaba la siguiente etapa de fusión del producto. El intervalo de
10 segundos se eligió para proporcionar un mínimo de 20 segundos en
la temperatura de fijación/extensión.
La representación fluorescencia/tiempo resultante
(figura 52) muestra un incremento característico en el tiempo de
residencia a la temperatura de fijación/extensión combinada a medida
que aumenta la concentración del producto de amplificación. A medida
que la concentración del cebador y la polimerasa se hace limitante,
se necesita más tiempo para completar la extensión del producto con
cada ciclo.
Al final de cada etapa de fijación/extensión, se
adquirió el valor de la fluorescencia y se guardó. Cuando este valor
había aumentado hasta 1,2 veces el valor más bajo de la
fluorescencia del final del ciclo y, posteriormente, se había parado
el incremento por debajo de una proporción establecida por el
usuario (habitualmente, 1,00-1,02), se terminó el
ciclado térmico. Alternativamente, se inició la etapa de obtención
de la curva de fusión introduciendo un segundo gradiente lento de
temperaturas de 0,1-0,2ºC/s a lo largo de la Tm del
producto y monitorizando de forma continua la fluorescencia de la
muestra.
La representación fluorescencia/tiempo resultante
(figura 52) muestra que después de veinticinco ciclos de
amplificación, la proporción del crecimiento de la fluorescencia
ciclo por ciclo cayó por debajo de 1,00 y se terminó la
reacción.
En una realización de la presente invención, se
utiliza la detección del plateau de amplificación para obtener
curvas de fusión de elevada resolución para cada muestra en un
proceso de muestras múltiples en el ciclo de temperatura óptima para
cada muestra. A medida que la muestra alcanza su plateau de
amplificación, se obtiene una curva de fusión para esa muestra, a
continuación, el ciclado regular de temperaturas se reanuda hasta
que otra reacción alcanza su plateau de amplificación.
A partir de la discusión anterior, se valorará
que la monitorización continua de la fluorescencia durante la
amplificación de ADN para monitorizar la hibridación es una técnica
analítica extraordinariamente poderosa. Utilizando los métodos
descritos en la presente y dependiendo del número de copias
iniciales de las plantillas presentes, se puede conseguir la
identificación y cuantificación del producto en cinco a veinte
minutos después del inicio del ciclado de temperaturas. La presente
invención consiguió varias ventajas no disponibles hasta la fecha en
la técnica. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos
de fluorescencia de un único color para monitorizar la pureza del
producto, la cuantificación relativa mediante la PCR multiplex o la
PCR competitiva, la cuantificación absoluta del producto mediante la
cinética de refijación, y un método mejorado para la cuantificación
de la plantilla inicial mediante representaciones de la
fluorescencia frente al número de ciclos.
La siguiente tabla describe colorantes de ADN
específico de doble cadena útiles en la monitorización continua de
la PCR. La fluorescencia de los colorantes de ADN específico de
doble cadena depende del estado de la cadena del ADN.
Hibridación | Colorante de dsADN | |
Mecanismo | Estado de la cadena | |
Síntesis de la sonda | Innecesario | |
Especificidad | Tm del producto | |
Análisis de fusión | Sí | |
Análisis multicolor | No |
Según la presente invención, el tiempo, la
temperatura y la fluorescencia se adquieren de 1-10
veces cada segundo y los detalles exactos de la hibridación del
producto y/o la sonda se observan durante el ciclado de
temperaturas. Con el colorante de ADN específico de doble cadena
SYBR™ Green I, se utiliza la hibridación del producto con respecto a
la temperatura para identificar los productos mediante curvas de
fusión. Además, la cuantificación relativa del producto se consigue
mediante la amplificación multiplex de dos o más productos
diferentes que difieren en la Tm. Además, la PCR competitiva se
realiza alterando la secuencia interna en los cebadores comunes, de
manera que dos o más productos tienen Tms diferentes. La
cuantificación absoluta del producto se obtiene enfriando
rápidamente el producto desnaturalizado y observando la cinética de
refijación. La sensibilidad de la cuantificación de la plantilla
inicial con las representaciones de la fluorescencia frente al
número de ciclos se incrementa mediante el análisis de las curvas de
fusión del producto para controlar la amplificación no específica y
los algoritmos de ajuste de las curvas. Finalmente, la
retroalimentación inmediata de la fluorescencia para controlar las
condiciones de desnaturalización, los tiempos de elongación y el
rendimiento del producto se obtienen monitorizando el estado de la
cadena del producto con colorantes de ADN específico de doble
cadena.
Cuando se desea el análisis multiplex en una
reacción PCR, es una práctica común utilizar diferentes marcadores
fluorescentes con un espectro de emisión distinguible para
identificar los múltiples productos. El análisis es complicado por
el número limitado de fluoróforos disponibles y el solapamiento de
los espectros de emisión de estos fluoróforos que están disponibles
(ver HM Shapiro, véase anteriormente). El análisis de la hibridación
de la sonda o el producto con las curvas de fusión es otro método
para distinguir múltiples productos de la PCR. Siguiendo la
hibridación durante el ciclado de temperaturas, se puede minimizar
el número de sondas y/o colores espectrales necesarios para
distinguir los múltiples productos.
En las siguientes páginas se encuentra el código
de programación para llevar a cabo la curva de fusión y otros
análisis.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Wittwer, Carl T.
\hskip3.9cmRirie, Kirk M.
\hskip3.9cmRasmussen, Randy P.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Monitorización de la hibridación durante la PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Thorpe, North and Western, L.L.P.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 9035 South 700 East, Suite 200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Sandy
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Utah
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 84070
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, capacidad 1,44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Toshiba T2150CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word Perfect 7.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/658.993
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 4-JUNIO-96
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/818.267
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 17-MARZO-97
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Alan J. Howarth
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.553
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 8616.CIP7
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (801)566-6633
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (801)566-0750
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGGTGGAC TTCTCTCAAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAGATGAG GCATAGCAGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTTCATC CACGTNCACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTCCGTGA CGTGGATT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTCCTCCG AGTATAGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GAGGAATACA GGTATT
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATT
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATCTGTAA GAGCAGATCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTTATCACA CTGGTGCTAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATACCTGTA TTCCTCGCCT GTC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCCTGGCA CCATTAAAGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATGCTTTG ATGACGCTTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGATCTTCT GCTGCCGTCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCTGACGT CCATCATCTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCCGTACT GCCCTGTGGG GCAAGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCCCTCCC CCATGCCATC CTGCGT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTTCATC CACGTTCACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGAGT CC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCGGCTAA ATAGTAGTGC GTCGA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGACGGTGC GGTGAGAGTG
\hfill20
Claims (6)
1. Método de monitorización a tiempo real de la
amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una
muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:
la amplificación de la secuencia objetivo por la
reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de
SYBR™ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la
polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de SYBR™
Green I, una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia
de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y
el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo,
una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación
durante un conjunto de ciclos de amplificación; y
la iluminación de la mezcla con una luz a una
longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una
parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una
emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la
muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la
cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra,
o bien, la iluminación de la muestra con una luz
a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a,
como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la
monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la
muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una
curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado por la iluminación de la mezcla con una luz a
una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo,
una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de
una emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la
muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la
cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra, y
caracterizado además por la iluminación de la muestra con una
luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior
a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y
la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la
muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una
curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, para
detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra
biológica durante la amplificación utilizando un perfil de ciclado
rápido de temperaturas.
4. Método, según la reivindicación 3, en el que
cada ciclo del perfil de ciclado rápido de temperaturas tiene una
duración de menos de 2 minutos.
5. Método, según la reivindicación 3, en el que
la muestra se ilumina y se detecta la fluorescencia a medida que
aumenta la temperatura, para generar una curva de fusión.
6. Mezcla de reacción de la PCR para amplificar
una secuencia de nucleótido diana, comprendiendo la mezcla una
muestra de ADN que tiene los cebadores del oligonucleótido de la
secuencia diana en una cantidad suficiente para la amplificación por
PCR, una polimerasa termoestable y el SYBR™ Green I en una cantidad
capaz de proporcionar una señal de fluorescencia indicativa de la
concentración de la secuencia diana en dicha mezcla.
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