DE112016007245T5 - Verfahren zum Nachweisen von Ziel-Nukleinsäuremolekülen - Google Patents

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Takuya Hanashi
Tetsuya Tanabe
Takeshi Hanami
Yoshihide Hayashizaki
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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit hoher Empfindlichkeit durch Verwenden von FRET bereit. Das Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst einen Schritt des Assoziierens einer ersten und einer dritten Sonde, die mit einer ersten fluoreszierenden Substanz markiert sind, die ein Energiedonor ist, mit einer zweiten Sonde, die mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energieakzeptor ist, um ein Assoziat in einem Nukleinsäuremolekül zu bilden; und einen Schritt, in dem Licht mit einer Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an das Assoziat abgegeben wird, um das Ziel-Nukleinsäuremolekül anhand der Fluoreszenz nachzuweisen, die von der zweiten fluoreszierenden Substanz in dem Assoziat als ein Indikator freigesetzt wird, wobei ein Bereich, der mit der zweiten Sonde assoziiert, zwischen einem Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert, und einem Bereich liegt, der im Ziel-Nukleinsäuremolekül mit der dritten Sonde assoziiert.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit hoher Empfindlichkeit unter Verwendung von Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET).
  • Stand der Technik
  • Als Verfahren zum Nachweisen einer Nukleinsäure mit einen bestimmten Basensequenz wurden häufig Verfahren zum Untersuchen einer Basensequenz einer Nukleinsäure beschrieben, indem künstlich synthetisierte kurzkettige Oligonukleotide wie Sonden und Primer verwendet wurden. Insbesondere wurden in genetischen Analysen wie somatischer Zellenmutation und Einzelnukleotid-Polymorphismus wegen der hervorragenden Nachweisempfindlichkeit verschiedene Verfahren unter Verwendung von Fluoreszenz entwickelt.
  • Beispielsweise ist ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung von FRET bekannt (siehe beispielsweise PTL 1). In diesem Verfahren assoziieren (hybridisieren) eine Donorsonde, an die eine fluoreszierende Substanz (Donorpigment) gebunden ist, die ein Energiedonor für FRET ist, bzw. eine Akzeptorsonde, an die eine fluoreszierende Substanz (Akzeptorpigment) gebunden ist, die ein Energieakzeptor ist, mit zwei daneben liegenden Bereichen des Ziel-Nukleinsäuremoleküls. In einem Assoziat, das durch sowohl die Donorsonde als auch die Akzeptorsonde erhalten wird, die mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziieren, tritt, da das Akzeptorpigment und das Donorpigment nahe aneinander liegen, in einem Fall, in dem das Assoziat mit Licht mit einer Erregungswellenlänge des Donorpigments bestrahlt wird, FRET vom erregten Donorpigment auf, und dadurch wird Fluoreszenz vom Akzeptorpigment erzeugt. Indessen tritt FRET nicht im Ziel-Nukleinsäuremolekül auf, an das keine der Sonden gebunden ist, und daher kann keine Fluoreszenz vom Akzeptorpigment erhalten werden. Wie oben beschrieben wird dieses Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren des Ziel-Nukleinsäuremoleküls verwendet, da Fluoreszenz vom Akzeptorpigment nur in dem Fall beobachtet werden kann, in dem das Ziel-Nukleinsäuremolekül, das ein Nachweisziel ist, vorliegt.
  • Außerdem offenbaren PTL 2 und PTL 3 als ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit nur einer Sondenart, ohne FRET zu verwenden, ein Verfahren, in dem eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die mit einer fluoreszierenden Atomgruppe markiert ist, die einen exzitonischen Effekt zeigt (Exzitonkopplung). Der exzitonische Effekt ist beispielsweise ein Effekt, bei dem mehrere Pigmente parallel aggregieren, um ein H-Aggregat auszubilden, und daher wird fast keine Fluoreszenzemission gezeigt. Eine Sonde (E-Sonde) mit einem exzitonischen Effekt setzt im freien Zustand fast keine Fluoreszenz frei, wenn die Sonde mit einem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, dissoziiert das H-Aggregat jedoch, wodurch Fluoreszenz abgegeben wird.
  • Liste der Bezugsverweise
  • Patentliteratur
    • [PTL 1] Japanisches Patent Nr. 4118932
    • [PTL 2] Japanische ungeprüfte Patentanmeldung, Nr. der ersten Veröffentlichung: 2013-183736
    • [PTL 3] PCT Internationale Veröffentlichung Nr. WO2014/034818
  • Kurzdarstellung der Erfindung
  • Technische Problemstellung
  • In einem Fall, in dem ein Nukleinsäuremolekül unter Verwendung einer FRET-Sonde nachgewiesen wird, wird die Lichtintensität der nachzuweisenden Fluoreszenz maßgeblich kleiner als die in einem Fall des Nachweisens unter Verwendung einer Sonde, die mit einem einzigen fluoreszierenden allgemein verwendeten Pigment, markiert ist, und daher nimmt der Nachweiswirkungsgrad des Ziel-Nukleinsäuremoleküls ab.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit hoher Empfindlichkeit durch Verwenden von FRET, und eines Sondensatzes, der in dem Verfahren verwendet wird.
  • Problemlösung
  • Infolge ausgiebiger Forschung zum Lösen des vorstehenden Problems stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Folgendes fest und schlossen daher die vorliegende Erfindung ab. Ein Assoziat wird so ausgebildet, dass zwei Donorsonden an einer Position angeordnet sind, an der in einem Ziel-Nukleinsäuremolekül eine Akzeptorsonde zwischen denselben liegt, und Fluoreszenzresonanz-Energie von den beiden Donorsonden an die eine Akzeptorsonde geliefert wird, wodurch die Leuchtdichte der Fluoreszenz von der Akzeptorsonde verstärkt wird.
  • Das heißt, dass ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls und ein Sondensatz gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden [1] bis [11] sind.
    • [1] Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend:
      • einen Schritt (a), in dem in eine nukleinsäurehaltige Probe eine erste Sonde, die mit einer ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energiedonor in einem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist, eine zweite Sonde, die mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energieakzeptor in dem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist, und eine dritte Sonde gemischt wird, die mit der ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, um eine Probelösung zuzubereiten;
      • einen Schritt (b), in dem ermöglicht wird, dass das Ziel-Nukleinsäuremolekül in der Probelösung, die in Schritt (a) zubereitet wurde, mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde assoziiert, um ein Assoziat aus der ersten Sonde, der zweiten Sonde, der dritten Sonde und dem Ziel-Nukleinsäuremolekül zu bilden; und
      • einen Schritt (c), in dem nach Schritt (b) Licht mit einer Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an die Probelösung abgegeben wird, um das Ziel-Nukleinsäuremolekül anhand der Fluoreszenz nachzuweisen, die von der zweiten fluoreszierenden Substanz in dem Assoziat als ein Indikator freigesetzt wird,
      • wobei ein Bereich, der mit der zweiten Sonde assoziiert, zwischen einem Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert, und einem Bereich liegt, der mit der dritten Sonde in dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert.
    • [2] Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß [1], in dem die erste Sonde, die zweite Sonde oder die dritte Sonde eine Sonde ist, in der sich die Emissionsleuchtdichte gemäß einem Zustand des Assoziierens oder Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ändert.
    • [3] Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß [2], in dem die erste fluoreszierende Substanz oder die zweite fluoreszierende Substanz eine fluoreszierende Atomgruppe ist, die exzitonische Effekte zeigt.
    • [4] Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach einem beliebigen aus [1] bis [3],
      • in dem ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der ersten Sonde gebunden ist, und einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist, und
      • ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der dritten Sonde gebunden ist, und der Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der die Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist.
    • [5] Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach einem beliebigen von [1] bis [4], in dem eine Basenlänge der zweiten Sonde 5 bis 17 Basen beträgt.
    • [6] Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach einem beliebigen von [1] bis [5],
      • in dem ein erstes Ziel-Nukleinsäuremolekül, das mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde assoziiert, und ein zweites Ziel-Nukleinsäuremolekül, das sich nur an eine aus der ersten Sonde und der dritten Sonde und an die zweite Sonde bindet, in der nukleinsäurehaltigen Probe enthalten sind,
      • in (b) ein erstes Assoziat, das durch Assoziieren des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde erhalten wird, und ein zweites Assoziat gebildet werden, das durch Assoziieren des zweiten Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit der zweiten Sonde und einer beliebigen aus der ersten Sonde und der dritten Sonde erhalten wird, und
      • in Schritt (c) das Licht mit der Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an die Probelösung abgegeben wird, und das erste Ziel-Nukleinsäuremolekül und das zweite Ziel-Nukleinsäuremolekül anhand Fluoreszenz-Leuchtdichte, die von der zweiten fluoreszierenden Substanz in dem Assoziat von einem Molekül als Anzeiger freigesetzt wird, unverwechselbar nachgewiesen werden, um ein Häufigkeitsverhältnis des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls und des zweiten Ziel-Nukleinsäuremoleküls in der Probelösung zu berechnen.
    • [7] Sondensatz zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend:
      • eine erste Sonde, in der ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit einer ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energiedonor in einem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist;
      • eine zweite Sonde, in der ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energieakzeptor in einem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist; und
      • eine dritte Sonde, in der ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit der ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist,
      • wobei die erste Sonde, die zweite Sonde und die dritte Sonde mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ein Assoziat bilden können, in dem, bezogen auf die zweite Sonde, die dritte Sonde auf einer der ersten Sonde entgegengesetzten Seite angeordnet ist, und
      • in einem Fall, in dem Licht mit einer Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an das Assoziat abgegeben wird, ein Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zwischen der ersten fluoreszierenden Substanz in der ersten Sonde und der zweiten fluoreszierenden Substanz in der zweiten Sonde und zwischen der ersten fluoreszierenden Substanz in der dritten Sonde und der zweiten fluoreszierend Substanz in der zweiten Sonde stattfindet und von der zweiten fluoreszierenden Substanz freigesetzte Fluoreszenz nachgewiesen wird.
    • [8] Sondensatz nach [7], wobei die erste Sonde, die zweite Sonde oder die dritte Sonde eine Sonde ist, in der sich die Emissionsleuchtdichte gemäß einem Zustand des Assoziierens oder Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ändert.
    • [9] Sondensatz nach [8], in dem die erste fluoreszierende Substanz oder die zweite fluoreszierende Substanz eine fluoreszierende Atomgruppe ist, die exzitonische Effekte zeigt.
    • [10] Sondensatz nach einem von [7] bis [9],
      • wobei in dem Assoziat
      • ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der ersten Sonde gebunden ist, und einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist, und
      • ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der dritten Sonde gebunden ist, und der Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der die Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist.
    • [11] Sondensatz nach einem von [7] bis[10], wobei eine Basenlänge der zweiten Sonde 5 bis 17 Basen beträgt.
  • Vorteilhafte Auswirkungen der Erfindung
  • In dem Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung ist, da die Fluoreszenzresonanz-Energie von zwei Donorsonden bezüglich einer Akzeptorsonde geliefert wird, Fluoreszenz-Leuchtdichte, die von einem Assoziat abgegeben wird, das aus dem Ziel-Nukleinsäuremolekül, der Akzeptorsonde und der Donorsonde gebildet wird, im Vergleich zu einem Nachweisverfahren unter Verwendung von FRET der verwandten Technik groß, in dem eine Akzeptorsonde und eine Donorsonde verwendet werden. Entsprechend kann durch Verwenden des Nachweisverfahrens der Nachweiswirkungsgrad für das Ziel-Nukleinsäuremolekül verbessert werden.
  • Außerdem kann das Nachweisverfahren anhand des Sondensatzes gemäß der vorliegenden Erfindung einfach und leicht ausgeführt werden.
  • Figurenliste
  • Es zeigen:
    • 1 eine schematische Ansicht eines Assoziats, das von einem Ziel-Nukleinsäuremolekül und jeder Sonde eines Nachweisverfahrens unter Verwendung einer FRET-Sonde der verwandten Technik (links) und eines Nachweisverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung (rechts) ausgebildet wird.
    • 2 ein Schaubild, das die Messergebnisse der Fluoreszenz-Leuchtdichte für jede Probelösung in Beispiel 1 zeigt.
    • 3 ein Schaubild, das die Messergebnisse der Anzahl der Moleküle von Assoziaten in jeder Probelösung zeigt, die durch SSMC in Beispiel 1 gemessen wurde.
    • 4 ein Schaubild, das die Messergebnisse der Fluoreszenz-Leuchtdichte für jede Probelösung in Bezugsbeispiel 1 zeigt.
    • 5 ein Schaubild, das die Messergebnisse der Anzahl der Moleküle von Assoziaten in jeder Probelösung zeigt, die durch SSMC in Bezugsbeispiel 1 gemessen wurde.
    • 6 ein Schaubild, das die Messergebnisse der Anzahl der Moleküle der Assoziate in jeder Probelösung zeigt, die durch SSMC in Bezugsbeispiel 2 gemessen wurde.
  • Beschreibung der Ausführungsformen
  • Ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung (nachstehend als „Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung“ bezeichnet) ist ein Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung einer FRET-Sonde, und ist durch das Verwenden einer ersten Sonde, die mit einer ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energiedonor in einem FRET-Phänomen ist, einer zweiten Sonde, die mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energieakzeptor in dem FRET-Phänomen ist, und einer dritten Sonde gekennzeichnet, die mit der ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist. Nachstehend kann in einigen Fällen „erste fluoreszierende Substanz“ als „fluoreszierende Donorsubstanz“ bezeichnet werden, und „zweite fluoreszierende Substanz“ kann als „fluoreszierende Akzeptorsubstanz“ bezeichnet werden. Die erste Sonde und die dritte Sonde, die mit der fluoreszierenden Donorsubstanz markiert sind, sind sogenannte Donorsonden, und die zweite Sonde, die mit der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz markiert ist, ist eine sogenannte Akzeptorsonde. Im Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind zwei Donorsonden so angeordnet, dass die Akzeptorsonde zwischen denselben liegt, und die eine Akzeptorsonde und die beiden Donorsonden assoziieren mit einem Molekül des Ziel-Nukleinsäuremoleküls. 1 eine schematische Ansicht eines Assoziats, das von einem Ziel-Nukleinsäuremolekül und jeder Sonde eines Nachweisverfahrens unter Verwendung einer FRET-Sonde der verwandten Technik und des Nachweisverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ausgebildet wird. Im Verfahren der verwandten Technik werden bezüglich eines Moleküls des Ziel-Nukleinsäuremoleküls eine Akzeptorsonde und eine Donorsonde assoziiert, sodass sie nebeneinander liegen, wodurch FRET verursacht wird (linke Zeichnung). Im Gegensatz dazu werden im Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung bezüglich des Ziel-Nukleinsäuremoleküls zwei Donorsonden (die ersten Sonde und die dritte Sonde) so angeordnet, dass die Akzeptorsonde (die zweite Sonde) zwischen denselben liegt, und daher wird Fluoreszenzresonanz-Energie an eine Akzeptorsonde von zwei Donorsonden geliefert (rechte Zeichnung). Theoretisch ist eine Menge von Fluoreszenzresonanz-Energie, die an den Akzeptor geliefert wird, ungefähr doppelt so groß wie die im Verfahren der verwandten Technik, und daher wird die Leuchtdichte der vom Akzeptor freigesetzten Fluoreszenz intensiviert, wodurch die Nachweisempfindlichkeit des Assoziats verbessert wird.
  • Die fluoreszierende Donorsubstanz und die fluoreszierende Akzeptorsubstanz, die in der vorliegenden Verbindung verwendet werden, können in geeigneter Weise aus Substanzen gewählt werden, die im Allgemeinen in der FRET-Sonde verwendet werden, solange sie eine beliebige Kombination von Substanzen sind, die in einem Fall FRET bewirken, in dem die Substanzen nahe genug aneinander liegen und Substanzen sind, die das Bilden des Assoziats nicht hemmen. Beispielsweise kann eine Kombination aus PE (Phycoerythrin) als die fluoreszierende Donorsubstanz und Cy5, Cy5.5, Texas Red (eingetragene Marke), Alexa Fluor (eingetragene Marke) 610, Alexa Fluor 647 und Alexa Fluor 680 als fluoreszierende Akzeptorsubstanz verwendet werden. Außerdem kann eine Kombination aus APC (Allophycocyanin) als fluoreszierende Donorsubstanz und Cy5.5 als fluoreszierende Akzeptorsubstanz verwendet werden.
  • Als erste Sonde, zweite Sonde und dritte Sonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Sonden verwendet werden, in denen sich die Emissionsleuchtdichte gemäß einem Zustand des Assoziierens oder Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ändert. Beispielsweise können durch Verwenden einer Sonde, in der die Emmissionsintensität im Zustand des Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül klein ist und die Emissionsintensität im Zustand des Assoziierend mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül groß ist, Hintergrund und Rauschen unterdrückt werden, wenn Fluoreszenz von FRET nachgewiesen wird, und die Nachweisempfindlichkeit der Ziel-Nukleinsäuremolekül weiter verbessert werden.
  • Beispielsweise kann die Sonde durch Verwenden einer fluoreszierenden Atomgruppe, die exzitonische Effekte zeigt, als fluoreszierende Donorsubstanz oder fluoreszierende Akzeptorsubstanz die Sonde sein, in der sich Emissionsleuchtdichte gemäß dem Zustand des Assoziierens oder Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ändert. Sowohl die fluoreszierende Donorsubstanz als auch die fluoreszierende Akzeptorsubstanz können fluoreszierende Atomgruppen sein, die exzitonische Effekte zeigen, und jede derselben kann eine fluoreszierende Atomgruppe sein, die exzitonische Effekte zeigt. In einem Fall, in dem eine beliebige derselben die fluoreszierende Atomgruppe ist, ist die fluoreszierende Donorsubstanz vorzugsweise die fluoreszierende Atomgruppe, die exzitonische Effekte zeigt, da der Hintergrund und das Rauschen wirksamer unterdrückt werden können.
  • Beispiele für die fluoreszierende Atomgruppe, die exzitonische Effekte zeigt, umfassen Thiazolorange und Derivate davon, Oxazolgelb und Derivate davon, Cyanin und Derivate davon Hemicyanin und Derivate davon, Methylrot und Derivate davon und Pigmentgruppen, die allgemein Cyaninpigmente oder Azopigmente genannt werden. Beispiele für die Cyaninpigmente umfassen Cy5, Cy5.5 und dergleichen. Außerdem können auch ein Pigment, bekannt als fluoreszierendes Pigment, das die Fluoreszenzintensität durch Binden an eine Nukleinsäure wie DNA ändert, ein fluoreszierendes Pigment, in dem sich Fluoreszenzintensität gemäß einer mikroskopischen Polarität ändert, und eine daraus abgeleitete Gruppe auf geeignete Weise verwendet werden. Beispiele für das fluoreszierende Pigment, das die Fluoreszenzintensität durch Binden an eine Nukleinsäure ändert, umfassen Ethidiumbromid. Beispiele für das fluoreszierende Pigment, in dem sich die Fluoreszenzintensität gemäß mikroskopischer Polarität ändert, umfassen Pyrencarboxamid und Prodan. Außerdem kann auch Fluorescein als die fluoreszierende Atomgruppe verwendet werden, die exzitonische Effekte zeigt.
  • Die Sonde, die exzitonische Effekte zeigt, kann eine fluoreszierende Atomgruppe, die einen exzitonischen Effekt zeigt, an ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül zur Assoziation mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül direkt oder indirekt über einen geeigneten Linker binden, oder kann eine fluoreszierende Atomgruppe, die mindestens zwei exzitonische Effekte zeigt, an das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül zur Assoziation mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül in einem Zustand binden, in dem sie nahe aneinander liegen. Beispiele für die Sonde, die die fluoreszierende Atomgruppe, die zwei exzitonische Effekte zeigt, an das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül in einem Zustand bindet, in dem sie nahe aneinander liegen, umfassen eine Sonde, in der eine Gruppe, die aus einer Struktur zusammengesetzt ist, die durch die allgemeine Formel (1) ausgedrückt wird, an eine Base in dem einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül zur Assoziation mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül gebunden ist (siehe PTL 2).
    Figure DE112016007245T5_0001
    Figure DE112016007245T5_0002
  • In der allgemeinen Formel (1) ist A CR, N, P, PO, B oder SiR und R ist ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe oder ein beliebiger Substituent.
  • In der allgemeinen Formel (1) sind B1, B2, und B3 Linker (Brückenatome oder Atomgruppen) und eine Hauptkettenlänge ist willkürlich. Die Hauptkette kann C, N, O, P, B, Si oder S enthalten oder nicht, und kann jede aus einer Einzelbindung, einer Doppelbindung, einer Dreifachbindung, einer Amidbindung, einer Esterbindung, einer Disulfidbindung, einer Iminogruppe, einer Etherbindung, einer Thioetherbindung und einer Thioesterbindung umfassen. B1, B2 und B3 können gleich oder unterschiedlich voneinander sein. Eine Gruppe, die aus der Struktur der allgemeinen Formel (1) zusammengesetzt ist, ist an eine Seitenkette in einer Base gebunden, die das s einzelsträngige Nukleinsäuremolekül in B3 bildet (Sternchen in Formel (1)).
  • In der allgemeinen Formel (1) sind C1 und C2 die fluoreszierenden Atomgruppen, die exzitonische Effekte zeigen, und können gleich oder unterschiedlich voneinander sein. Beispiele für fluoreszierende Atomgruppen, die exzitonische Effekte zeigen, umfassen die vorstehend angeführten. Außerdem können Beispiele dafür eine Atomgruppe umfassen, die durch die allgemeine Formel (2) oder allgemeine Formel (3) ausgedrückt wird.
    Figure DE112016007245T5_0003
    Figure DE112016007245T5_0004
    Figure DE112016007245T5_0005
  • In den allgemeinen Formeln (2) und (3) ist E O, S und Se, und n ist 0 oder eine positive ganze Zahl. Einer aus R1 und R2 ist eine Brückengruppe, die an B1 oder B2 in der allgemeinen Formel (1) gebunden ist, und der andere ist ein Wasserstoffatom oder eine niedrige Alkylgruppe. R3 bis R12 stellen jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Nitrogruppe, eine Cyanogrupep, eine Carbonylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Silylgruppe oder eine Borylgruppe dar. AR ist ein willkürlicher aromatischer Ring, der vorliegen kann oder nicht. In einem Fall, in dem mehrere R3 in der allgemeinen Formel (2) oder (3) vorliegen, können die mehreren R3 gleich oder voneinander unterschiedlich sein. In einem Fall, in dem mehrere R4 in der allgemeinen Formel (2) oder (3) vorliegen, können die mehreren R4 gleich oder voneinander unterschiedlich sein.
  • In einem Fall, in dem C1 oder C2 in der allgemeinen Formel (1) die Atomgruppe ist, die durch die allgemeine Formel (2) oder die allgemeine Formel (3) ausgedrückt wird, können E, AR, n und R1 bis R12 in C1 , und E, AR, n und R1 bis R12 in C2 gleich oder voneinander unterschiedlich sein.
  • Die erste Sonde und die dritte Sonde werden beide durch Markieren des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit der fluoreszierenden Donorsubstanz erhalten. Ähnlich wird die zweite Sonde durch Markieren des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz erhalten. Jede Sonde kann die fluoreszierende Donorsubstanz oder die fluoreszierende Akzeptorsubstanz an das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, direkt oder über einen Linker binden. Beispiele für den Linker umfassen ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einer Länge von 1 bis 10 Basen. Das Binden der fluoreszierenden Donorsubstanz oder der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz an das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, oder an den Linker kann anhand eines allgemeinen Verfahrens durchgeführt werden.
  • Eine Basensequenz des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in jeder Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, ist aufgrund der Basensequenzinformation des Ziel-Nukleinsäuremoleküls konzipiert. Beim Konzipieren ist es auch möglich, allgemein verwendete Software für Primer-Sonden-Design und dergleichen zu nutzen.
  • Die erste Sonde, die zweite Sonde und die dritte Sonde bilden mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül das Assoziat, in dem, bezogen auf die zweite Sonde, die dritte Sonde auf einer der ersten Sonde entgegengesetzten Seite angeordnet ist. Aus diesem Grund ist eine Basensequenz des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls von jeder Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, so konzipiert, dass ein Bereich („R2“ in 1), der mit der zweiten Sonde assoziiert, zwischen einem Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert („R1“ in 1), und einem Bereich im Ziel-Nukleinsäuremolekül liegt, der mit der dritten Sonde assoziiert („R3“ in 1). Im Ziel-Nukleinsäuremolekül können der Bereich, der mit der zweiten Sonde assoziiert, und der Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert, nebeneinander liegen, oder sie können durch 1 bis 5 Basen getrennt sein. Ähnlich können im Ziel-Nukleinsäuremolekül der Bereich, der mit der zweiten Sonde assoziiert, und der Bereich, der mit der dritten Sonde assoziiert, nebeneinander liegen, oder sie können durch 1 bis 5 Basen getrennt sein.
  • In der Assoziation zwischen dem Ziel-Nukleinsäuremolekül und den drei Sonden muss FRET um zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz in der ersten Sonde und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz in der zweiten Probe und zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz in der dritten Sonde und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz in der zweiten Probe auftreten. Entsprechend sind der Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert, der Bereich, der mit der zweiten Sonde assoziiert und der Bereich, der im Ziel-Nukleinsäuremolekül mit der dritten Sonde assoziiert so konzipiert, dass ein Abstand zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz in der ersten Sonde und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde kurz genug ist, damit FRET auftreten kann, und ein Abstand zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz in der dritten Sonde und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde kurz genug ist, damit FRET auftreten kann. Beispielsweise sind der Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert und der Bereich im Ziel-Nukleinsäuremolekül, der mit der zweiten Sonde assoziiert, so konzipiert, dass ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die fluoreszierende Donorsubstanz in der ersten Sonde gebunden ist, und einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der die Base assoziiert ist, an die die fluoreszierende Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger, vorzugsweise 6 Basen oder weniger, besonders bevorzugt 4 Basen oder weniger. Beispielsweise sind der Bereich, der mit der dritten Sonde assoziiert und der Bereich im Ziel-Nukleinsäuremolekül, der mit der zweiten Sonde assoziiert, so konzipiert, dass ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die fluoreszierende Donorsubstanz in der dritten Sonde gebunden ist, und der Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der die Base assoziiert ist, an die die fluoreszierende Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger, vorzugsweise 6 Basen oder weniger, besonders bevorzugt 4 Basen oder weniger. Daher ist die Base, an die die fluoreszierende Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde gebunden ist, vorzugsweise an oder nahe der Mitte der Sonde und eine Basenlänge ist vorzugsweise 5 bis 17.
  • Die Basensequenz des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in jeder Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, kann eine beliebige Sequenz sein, die spezifisch mit einem objektiven Bereich des Ziel-Nukleinsäuremoleküls assoziiert. Beispielsweise ist die Basensequenz des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in der ersten Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, vorzugsweise eine Basensequenz, die komplementär zu dem im Ziel-Nukleinsäuremolekül konzipierten Bereich ist, der mit der ersten Sonde assoziiert, oder kann eine Basensequenz sein, die Fehlpaarungen, in denen 1 bis 5 Basen substituiert, gelöscht oder eingesetzt wurden, bezüglich einer Sequenz aufweist, die komplementär zu der Basensequenz des entsprechenden Bereichs ist. Ähnlich ist jede der Basensequenzen des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in der zweiten Sonde und der dritten Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, vorzugsweise eine Basensequenz, die komplementär zu dem im Ziel-Nukleinsäuremolekül konzipierten Bereich ist, der mit der zweiten Sonde assoziiert, und dem Bereich, der mit der dritten Sonde assoziiert, oder kann eine Basensequenz sein, die Fehlpaarungen, in denen 1 bis 5 Basen substituiert, gelöscht oder eingesetzt wurden, bezüglich einer Sequenz aufweist, die komplementär zu der Basensequenz des entsprechenden Bereichs ist.
  • Eine Basenlänge des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in der ersten Sonde und der dritten Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie eine Länge ist, die spezifisch mit einem objektiven Bereich des Ziel-Nukleinsäuremoleküls assoziieren kann, und dies trifft auch auf allgemeine Sonden zu. Insbesondere kann beispielsweise eine Basenlänge 15 bis 50 Basen betragen und beträgt vorzugsweise 15 bis 35 Basen.
  • Das Ziel-Nukleinsäuremolekül kann nur aus natürlich auftretenden Nukleoiden wie DNA, RNA und 2'-0-Methyl RNA zusammengesetzt sein oder kann ein künstliches Nukleinsäuremolekül sein, in dem ein teilweiser oder vollständiger Teil davon künstliche Nukleotide enthält.
  • Das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül in jeder Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, kann nur aus natürlich auftretenden Nukleoiden wie DNA, RNA und 2'-O-Methyl RNA aufgebaut sein oder kann ein künstliches Nukleinsäuremolekül sein, in dem ein teilweiser oder vollständiger Teil davon künstliche Nukleotide enthält.
  • Der Begriff „künstliches Nukleotid“ bedeutet, dass ein Nukleotid ein künstlich synthetisiertes Nukleotid ist, das eine Struktur aufweist, die sich von der eines natürlich auftretenden Nukleotids unterscheidet, das jedoch ähnlich wie ein natürlich auftretendes Nukleotid wirken kann. Der Satz „kann ähnlich wie das natürlich auftretende Nukleotide wirken“ bedeutet, dass ein Nukleinsäuremolekül durch eine Phosphodiesterbindung oder dergleichen ähnlich wie das natürlich auftretenden Nukleotid gebildet werden kann.
  • Beispiele für ein solches künstliches Nukleotid umfassen verbrückte Nukleinsäure (BNA), 2'-O,4'-C-Ethyl-verbrückte Nukleinsäure (ENA), Peptid-Nukleinsäure (PNA), Glykol-Nukleinsäure (GNA), Threose-Nukleinsäure (TNA), Hexitol-Nukleinsäure (HNA) und dergleichen. BNA ist eine Nukleinsäure, in der ein Teil eines natürlich vorkommenden Nukleotids quervernetzt ist, und Beispiele dafür umfassen „Locked“ Nukleinsäure (LNA), die ein verbrücktes künstliches Nukleotid ist, in dem ein Sauerstoffatom an der 2'-Position und ein Kohlenstoffatom an der 4'-Position eines Riboserings über Methylen gebunden sind.
  • Insbesondere wird, da eine Basenlänge des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in der zweiten Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, relativ kurz ist, um spezifisch mit einem objektiven Bereich des Ziel-Nukleinsäuremoleküls zu assoziieren, vorzugsweise ein künstliches Nukleotid mit verbesserter künstlicher Erkennungsfähigkeit einbezogen, wie LNA und ENA.
  • Das Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung weist die folgenden Schritte (a) bis (c) auf.
    • Schritt (a) des Mischens der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde in eine nukleinsäurehaltige Probe, um eine Probelösung vorzubereiten.
    • Schritt (b), in dem ermöglicht wird, dass das Ziel-Nukleinsäuremolekül in der Probelösung, die in Schritt (a) zubereitet wurde, mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde assoziiert, um ein Assoziat aus der ersten Sonde, der zweiten Sonde, der dritten Sonde und dem Ziel-Nukleinsäuremolekül zu bilden.
    • Schritt (c), in dem nach Schritt (b) Licht mit einer Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an die Probelösung abgegeben wird, um das Ziel-Nukleinsäuremolekül anhand der Fluoreszenz nachzuweisen, die von der zweiten fluoreszierenden Substanz in dem Assoziat als ein Indikator freigesetzt wird.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet das Ziel-Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das eine spezifische Basensequenz (Ziel-Basensequenz) aufweist, die ein Ziel des Nachweises ist. Das Ziel-Nukleinsäuremolekül ist nicht besonders eingeschränkt, solange Basensequenzinformation zu dem Ausmaß deutlich ist, dass die erste Sonde und dergleichen konzipiert werden können. Beispielsweise kann das Ziel-Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül sein, das eine Basensequenz aufweist, die in einem Chromosom eines Tiers oder einer Pflanze oder in einem Gen eines Bakteriums oder eines Virus vorliegt, oder kann eine Nukleinsäuremolekül sein, das eine künstlich konzipierte Basensequenz aufweist. In der vorliegenden Erfindung kann das Ziel-Nukleinsäuremolekül eine doppelsträngige Nukleinsäure oder eine einzelsträngige Nukleinsäure sein. Außerdem kann die Ziel-Nukleinsäuremolekül eine aus DNA oder RNA sein. Beispiele für das Ziel-Nukleinsäuremolekül umfassen mRNA, hnRNA, genomische DNA, synthetische DNA durch PCR-Amplifikation und dergleichen, cDNA, die von RNA anhand reverser Transkriptase synthetisiert wurde und dergleichen.
  • Außerdem ist in der vorliegenden Erfindung die nukleinsäurehaltige Probe nicht besonders eingeschränkt, solange sie eine Probe ist, die ein Nukleinsäuremolekül enthält. Beispiele für die nukleinsäurehaltige Probe umfassen eine biologische Probe, die von einem Tier oder dergleichen genommen wurde, eine Probe, die aus kultivierten Zellen und dergleichen zubereitet wurde, eine Reaktionslösung nach einer Nukleinsäuresynthesereaktion und dergleichen. Die nukleinsäurehaltige Probe kann eine biologische Probe oder dergleichen selbst sein, oder kann eine Nukleinsäurelösung sein, die aus einer biologischen Probe oder dergleichen extrahiert und gereinigt wurde.
  • Zuerst wird als Schritt (a) die Probelösung durch Mischen der drei Sonden in die nukleinsäurehaltige Probe zubereitet. In diesem Fall kann nach Bedarf ein geeignetes Lösemittel hinzugefügt werden. Das Lösemittel unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, solange es ein Lösemittel ist, das FRET zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz und den Nachweis der Fluoreszenz, die von der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz abgegeben wird, nicht hemmt, und kann auf geeignete Weise aus Puffern ausgewählt werden, die allgemein im vorliegenden Feld verwendet werden. Beispiele für die Puffer umfassen einen Phosphatpuffer wie phosphatgepufferte Salzlösung ((PBS), pH 7,4), einen TRIS-Puffer und dergleichen.
  • Außerdem wird, um nicht spezifische Assoziation zwischen jeder Sonde und einem Nukleinsäuremolekül zu unterdrücken, das nicht das Ziel-Nukleinsäuremolekül ist, zuvor vorzugsweise ein Tensid, Formamid, Dimethylsulfoxid, Urea oder dergleichen zu der Probelösung hinzugefügt. Es kann nur eine Art dieser Komponenten hinzugefügt werden, oder es können zwei oder mehrere Arten davon kombiniert hinzugefügt werden. Durch Hinzufügen dieser Verbindungen ist es möglich, eine nicht spezifische Assoziation in einer Umgebung mit relativ niedrigen Temperatur weniger wahrscheinlich zu machen.
  • Als nächstes assoziiert als Schritt (b) das Ziel-Nukleinsäuremolekül in der in Schritt (a) zubereiteten Probelösung mit den drei Sonden, um ein Assoziat zu bilden. Damit das Ziel-Nukleinsäuremolekül spezifisch mit jeder Sonde assoziiert, werden zuerst alle Nukleinsäuremoleküle in der Probelösung denaturiert und danach wird ein Assoziat gebildet.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Satz „denaturierte Nukleinsäuremoleküle“, dass Basispaare dissoziiert sind. In der vorliegenden Erfindung wird, da der Einfluss auf die fluoreszierende Donorsubstanz und die fluoreszierende Akzeptorsubstanz relativ gering ist, vorzugsweise Denaturierung (Hitzedenaturierung) durch Behandeln mit hohen Temperaturen oder Denaturierung durch Behandeln mit niedriger Salzkonzentration durchgeführt. Aus diesen wird vorzugsweise Hitzedenaturierung durchgeführt, da die Durchführung einfach ist. Denaturierungsbedingungen hängen vom Ziel-Nukleinsäuremolekül und der Basensequenz und Basenlänge jeder Sonde ab. Beispielsweise können bezüglich der Hitzedenaturierung die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen denaturiert werden, indem die Probelösung bei einer Temperatur von 90 °C bis 100 °C in einem Fall, in dem das Ziel-Nukleinsäuremolekül oder die Sonde DNA ist, und bei 70 °C im Fall von RNA, mehrere Sekunden bis ungefähr 2 Minuten lang inkubiert werden. Indessen kann die Denaturierung durch Behandeln mit niedriger Salzkonzentration beispielsweise durch Verdünnen mit demineralisiertem Wasser oder dergleichen durchgeführt werden, sodass die Salzkonzentration der Probelösung so eingestellt wird, dass sie ausreichend niedrig ist.
  • Im Fall des Durchführens der Hitzedenaturierung kann nach der Hochtemperaturbehandlung durch Senken der Temperatur der Probelösung auf eine Temperatur, bei der das Ziel-Nukleinsäuremolekül und jede Sonde miteinander assoziieren können, ein Assoziat gebildet werden, das aus dem Ziel-Nukleinsäuremolekül, der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde in der Probelösung zusammengesetzt ist. Insbesondere wird eine Temperatur auf eine Temperatur von ± 3 °C eines Tm-Werts (Temperatur bei der 50% der doppelsträngigen DNA in einzelsträngige DNA dissoziiert) des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in jeder Sonde gesenkt, das mit der Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert. In einem Fall, im dem ein Tm-Wert des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, für jede Sonde unterschiedlich ist, wird eine Temperatur auf eine Temperatur des niedrigsten Temperatur-Tm-Werts ± 3 °C gesenkt. Indessen kann ähnlich auch in einem Fall in dem Denaturierung durch Behandeln mit niedriger Salzkonzentration durchgeführt wird, durch Hinzufügen einer Salzlösung oder dergleichen nach der Behandlung mit niedriger Salzkonzentration durch Erhöhen der Salzkonzentration der Probelösung auf eine Konzentration, bei der das Ziel-Nukleinsäuremolekül und jede Sonde miteinander assoziieren können, ein Assoziat gebildet werden, das aus dem Ziel-Nukleinsäuremolekül, der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde in der Probelösung zusammengesetzt ist. Ein Tm-Wert des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls von jeder Sonde, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, kann berechnet werden, indem eine allgemein verwendete Software für Primer-Sonden-Designing oder dergleichen verwendet wird.
  • Nach Schritt (b) wird als Schritt (c) Licht mit einer Erregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorsubstanz an die Probelösung abgegeben, um Fluoreszenz einer Fluoreszenz-Wellenlänge der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz nachzuwiesen. Wenn das Assoziat, das aus dem Ziel-Nukleinsäuremolekül, der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde zusammengesetzt ist, in der Probelösung mit dem Licht mit der Erregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorsubstanz bestrahlt wird, tritt FRET zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz in der ersten Sonde und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde und zwischen der fluoreszierenden Donorsubstanz in der dritten Sonde und der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz in der zweiten Sonde auf, und daher wird im Assoziat Fluoreszenz von der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz freigesetzt. Mit anderen Worten kann durch Messen eines Fluoreszenzsignals mit der Fluoreszenzwellenlänge der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz, das durch Freisetzten des Lichts mit der Erregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorsubstanz das Assoziat nachgewiesen werden, das aus dem Ziel-Nukleinsäuremolekül, der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde zusammengesetzt ist. In einem Fall, in dem das Ziel-Nukleinsäuremolekül in der nukleinsäurehaltigen Probe enthalten ist, und in einem Fall, in dem das Licht mit der Erregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorsubstanz abgegeben wird, wird Fluoreszenz der Fluoreszenz-Wellenlänge der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz nachgewiesen. Indessen wird in einem Fall, in dem das Ziel-Nukleinsäuremolekül nicht in der nukleinsäurehaltigen Probe enthalten ist, und in einem Fall, in dem das Licht mit der Erregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorsubstanz abgegeben wird, Fluoreszenz mit der Fluoreszenz-Wellenlänge der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz nicht nachgewiesen.
  • Ein Verfahren zum Messen eines Fluoreszenzsignals mit einer Fluoreszenz-Wellenlänge der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz, das von dem Assoziat freigesetzt wird, das das Ziel-Nukleinsäuremolekül in der Probelösung enthält, ist nicht besonders eingeschränkt und kann ein Verfahren zum Messen von Fluoreszenz-Intensität der gesamten Probelösung sein, oder kann ein Verfahren sein, in dem Moleküle in der Probelösung, die Fluoreszenz abgeben, für jedes Molekül nachgewiesen und gemessen werden.
  • Die Fluoreszenz-Intensität der Probelösung kann anhand eines allgemeinen Verfahrens mittels eines Fluoreszenz-Spektrophotometers wie eines Fluoreszenz-Plattenlesers oder dergleichen gemessen werden. Die Fluoreszenz-Intensität der fluoreszierenden Wellenlänge der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz der Probelösung hängt von einer Menge des Assoziats ab, das aus dem Ziel-Nukleinsäuremolekül und den drei Sonden zusammengesetzt ist, die in der Probelösung enthalten sind. Aus diesem Grund kann beispielsweise durch Erstellen einer Kalibrierungskurve, die eine Beziehung zwischen einer Menge der nachzuweisenden fluoreszierenden Akzeptorsubstanz und Fluoreszenz-Intensität im Voraus, eine Menge des Assoziats in der Probelösung, das das Ziel-Nukleinsäuremolekül enthält, das heißt, eine Menge des Ziel-Nukleinsäuremoleküls in der nukleinsäurehaltigen Probe, quantifiziert werden.
  • Beispiele für das Verfahren zum Messen eines Fluoreszenzsignals für jedes Molekül in der Probelösung umfassen Scanning Single Molecule Counting (SSMC) ( WO2012/102260 ), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), Fluorecscence Intensity Distribution Analysis (FIDA) und FIDA-Polarisation (FIDA-PO). Aus diesen wird die Messung mit SSMC bevorzugt, da der Nachweiswirkungsgrad für die Ziel-Nukleinsäuremoleküls im Vergleich zum Verfahren der verwandten Technik, die eine Donorsonde verwendet, merklich verbessert werden kann.
  • Ein solches Nachweisen und Analysieren eines Fluoreszenzsignals eines Moleküls kann anhand eines allgemeinen Verfahrens durchgeführt werden, wobei ein bekanntes einfaches Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopiesystem wie MF20 (gefertigt von Olympus Corporation) oder dergleichen verwendet wird.
  • Außerdem ist im Assoziat, das von den beiden Donorsonden (erste Sonde und dritte Sonde), einer Akzeptorsonde (zweite Sonde) und dem Ziel-Nukleinsäuremolekül gebildet wird, die vom Akzeptor durch FRET freigesetzte Leuchtdichte der Fluoreszenz stärker als die eines Assoziats, das von einer Donorsonde (erste Sonde oder dritte Sonde), einer Akzeptorsonde (zweite Sonde) und dem Ziel-Nukleinsäuremolekül gebildet wird. Im Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können zwei Arten von Ziel-Nukleinsäuremolekülen (erstes Ziel-Nukleinsäuremolekül and zweites Ziel-Nukleinsäuremolekül), die ähnliche Basensequenzen aufweisen, unverwechselbar nachgewiesen werden, indem eine Differenz der Intensität der Leuchtdichte genutzt wird.
  • Insbesondere wird zuerst das Konzipieren so vorgenommen, dass das Assoziat im ersten Ziel-Nukleinsäuremolekül durch Assoziation mit allen drei Sonden gebildet werden kann, die die erste Sonde, die zweite Sonde und die dritte Sonde sind, während das zweite Ziel-Nukleinsäuremolekül mit der zweiten Sonde assoziiert und mit nur einer von der ersten und der dritten Sonde assoziiert. In einem Fall, in dem das erste Ziel-Nukleinsäuremolekül und das zweite Ziel-Nukleinsäuremolekül in der nukleinsäurehaltigen Probe enthalten sind, die Schritt (a) unterzogen wird, wird ein erstes Assoziat, das durch Assoziieren des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde erhalten wird, bzw. ein zweites Assoziat, das durch Assoziieren des zweiten Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit der zweiten Sonde und einer beliebigen von der ersten Sonde und der dritten Sonde erhalten wird, in Schritt (b) in der in Schritt (a) zubereiteten Probelösung gebildet.
  • Anschließend ist in Schritt (2) in einem Fall, in dem das Licht mit der Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an die Probelösung abgegeben wird, die Leuchtdichte der vom Akzeptor im Assoziat freigesetzten Fluoreszenz im ersten Assoziat, das zwei Donorsonden im Assoziat enthält, im Vergleich zum zweiten Assoziat, das nur eine Donorsonde im Assoziat enthält, größer. Durch Verwenden der Leuchtdichte der Fluoreszenz, die vom Akzeptor (zweite fluoreszierende Substanz) im Assoziat von einem Molekül als Indikator freigesetzt wird, können das erste Ziel-Nukleinsäuremolekül, das im ersten Assoziat enthalten ist, und das zweite Ziel-Nukleinsäuremolekül, das im zweiten Assoziat enthalten ist, unverwechselbar nachgewiesen werden. In einem Fall, in dem das Fluoreszenzsignal für jedes Molekül in der Probelösung gemessen wird, ist ein Molekül mit hellerer Leuchtdichte der Fluoreszenz, die vom Akzeptor durch FRET freigesetzt wird, das erste Assoziat, das das erste Ziel-Nukleinsäuremolekül enthält, und ein dunkleres Molekül ist das zweite Assoziat, das das zweite Ziel-Nukleinsäuremolekül enthält. In einem Fall, in dem das erste Assoziat und das zweite Assoziat unverwechselbar nachgewiesen werden, indem ein Leuchtdichtewert der Fluoreszenz als Indikator verwendet wird, die vom Akzeptor freigesetzt wird, kann ein Häufigkeitsverhältnis des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls und des zweiten Ziel-Nukleinsäuremolekül in der Probelösung aus der Anzahl der Moleküle des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls und der Anzahl der Moleküle des zweiten Ziel-Nukleinsäuremoleküls in der Probelösung berechnet werden.
  • Das Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch zum Nachweisen von Gen-Polymorphismus verwendet werden. Beispielsweise werden aus Gen-Polymorphismen anhand eines Mutantentyps als erstes Ziel-Nukleinsäuremolekül und eines Wildtyps als zweites Ziel-Nukleinsäuremolekül, die erste Sonde und die zweite Sonde so konzipiert, dass sie mit dem Bereich assoziieren, in dem eine Basensequenz im Mutantentyp und im Wildtyp gleich ist, und die dritte Sonde wird so konzipiert, dass die mit dem ersten Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, das der Mutantentyp ist, jedoch nicht mit dem zweiten Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, das der Wildtyp ist. Entsprechend wird ein Assoziat, das das Ziel-Nukleinsäuremolekül des Wildtyps enthält, als eine Molekül mit schwacher Fluoreszenz-Leuchtdichte nachgewiesen, und ein Assoziat, das das Ziel-Nukleinsäuremolekül des Mutantentyps enthält, wird als ein Molekül mit heller Fluoreszenz-Leuchtdichte nachgewiesen. Außerdem kann aufgrund der erhaltenen Nachweisergebnisse ein Häufigkeitsverhältnis zwischen dem Nukleinsäuremolekül des Mutantentyps und dem Nukleinsäuremolekül des Wildtyps in der nukleinsäurehaltigen Probe erhalten werden.
  • Vorzugsweise werden auch die erste Sonde, die zweite Sonde und die dritte Sonde als ein Satz eingerichtet. Bei Verwenden des Sondensatzes, der diese drei Sonden enthält, kann das Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung leichter und einfacher durchgeführt werden. Vorzugsweise werden auch verschiedene Reagenzien, Geräte und dergleichen, die für das Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung im Sondensatz verwendet werden, als Kit zusammengestellt. Zusätzlich zu der Sonde kann das Kit verschiedene Puffer, die zum Zubereiten der Probelösung verwendet werden, einen Inkubator, angebrachten mit einem Thermostat, der zur Denaturierungsbehandlung und Assoziatbildung verwendet wird, und dergleichen enthalten.
  • Beispiele
  • Als Nächstes wird die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben, indem Beispiele und dergleichen gezeigt werden, die Erfindung ist jedoch nicht auf die nachstehenden Beispiele beschränkt.
  • [Beispiel 1]
  • Ziel-Nukleinsäuremoleküle mit einer optionalen Konzentration wurden anhand zwei Donorsonden und einer Akzeptorsonde nachgewiesen.
  • Bilden von Assoziat zwischen zwei Donorsonden und einer Akzeptorsonde und Ziel-DNA
  • Jede der Folgenden wurde in einem Reaktionspuffer (10 mM Tris-HCI, 400 mM NaCl, 0,05 % Triton X-100) gelöst, um eine Ziel-DNA (5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3', SEQ ID Nr. 1) mit einer endgültigen Konzentration von 0 bis 100 mM zu erhalten; eine Donorsonde a (5'-GAACCGCTCATTGCCAATGGTGATG-3', SEQ ID Nr. 2: die Sonde, in der im zweiten T eine fluoreszierende Atomgruppe mit zwei Thiazolorange modifiziert ist) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nM; eine Donorsonde b (5'-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCTTCTCC-3', SEQ ID Nr. 3: die Sonde, in der im zweiten T eine fluoreszierende Atomgruppe mit zwei Thiazolorange modifiziert ist) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nM; und eine Akzeptorsonde a (5'-ACCTGGCC-3', SEQ ID Nr. 4: die Sonde, in der im vierten T eine fluoreszierende Substanz ATTO633 modifiziert ist, eine Base außer dem vierten T ist ENA) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nm. Daher wurde eine Probelösung (Probelösung 1-1) zubereitet. Die so zubereitete Probelösung 1-1 wurde bei 95 °C 10 Sekundenlang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und die Probelösung 1-1 wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Bilden von Assoziat zwischen einer Donorsonde und einer Akzeptorsonde und Ziel-DNA
  • Eine Probelösung (Probelösung 1-2) wurde auf die gleiche Weise wie in <1> zubereitet, mit der Ausnahme, dass die Donorsonde b nicht in dieselbe gemischt wurde und eine Akzeptorsonde b (5'-ACCTGGCCGTCAGGCAGCTCGTAGCTCT-3', SEQ ID Nr. 5: die Sonde, in der eine fluoreszierende Substanz ATTO633 am 5'-Terminus modifiziert ist) anstelle der Akzeptorsonde a als Akzeptorsonde verwendet wurde. Die so zubereitete Probelösung 1-2 wurde bei 95 °C 10 Sekundenlang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und die Probelösung 1-2 wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Messung von Assoziat in der Probelösung durch SSMC
  • Assoziate, die Ziel-DNA in den in <1> und <2> oben zubereiteten Probelösungen enthielten, wurden anhand SSMC gemessen. Insbesondere wurden die Assoziate jeder Probelösung anhand eines Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopiesystems MF-20 (Olympus Corporation) gemessen, das mit einem optischen System eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops und einem Photonenzählsystem ausgestattet ist und daher wurden Zeitreihen-Lichtintensitätdaten (Photonenzähldaten) erhalten. Die Probelösung wurde mit einem Laser mit 488 nm und 300 µW erregt, was die Erregungswellenlänge von Thiazolorange ist, und Fluoreszenz bei 600 bis 660 nm, was die Fluoreszenzwellenlänge von ATTO633 ist, wurde mittels eines Bandbreitenfilters nachgewiesen. Ein Lichtdetektionsbereich in der Probelösung konnte sich mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 15 mm/sec bewegen, um 20 Sekunden lang Messungen auszuführen. Außerdem wurden, mit BIN TIME auf 10 µsec eingestellt, durch Differenzierung nach Glätten der Zeitreihen-Lichtintensitätdaten, die durch die Messung erhalten wurden, Spitzen nachgewiesen. Unter den Bereichen, die als Spitzen angesehen wurden, wurden Peakintensitäten der Bereiche extrahiert, die sich einer Gauß-Funktion annähern können und eine Intensität von 0,8 oder mehr aufwiesen.
  • Die Messergebnisse der Fluoreszenz-Leuchtdichte für jede Probelösung sind in 2 gezeigt. Bei diesen Ergebnissen wurde in allen Probelösungen beobachtet, dass die Fluoreszenz-Leuchtdichte der Fluoreszenz-Wellenlänge von ATTO633 zu einem Anstieg auf eine Weise neigte, die von der Ziel-DNA-Konzentration abhängig war. Insbesondere war die fluoreszierende Leuchtdichte gesättigt, wenn die Konzentration der Ziel-DNA 30 nM betrug, und es wurde bemerkt, dass alle Sonden die Assoziate mit der Ziel-DNA bildeten. Beim Vergleich der Fluoreszenz-Leuchtdichte von jeder der Probelösungen war in der Probelösung 1-1, die die beiden Donorsonden am Sättigungspunkt verwendet (Probelösung mit der Ziel-DNA-Konzentration von 30 nm) die Fluoreszenz-Leuchtdichte ungefähr 2 Mal so hoch wie die Fluoreszenz-Leuchtdichte der Probelösung 1-2, die eine Donorsonde verwendete. Daher wurde gezeigt, dass die Fluoreszenz-Leuchtdichte durch Anordnen von zwei Donorsonden für eine Akzeptorsonde anstieg.
  • Außerdem werden in 3 Messergebnisse für die Anzahl der Molekülen von Assoziaten in jeder Probelösung gezeigt, die durch SSMC gemessen wurde. Die Anzahl der nachgewiesenen Moleküle in SSMC in der Probelösung 1-1, die die beiden Donorsonden am Sättigungspunkt verwendet (Probelösung mit der Ziel-DNA-Konzentration von 30 nm) war ungefähr 10 Mal so hoch wie die Anzahl der nachgewiesenen Moleküle in der Probelösung 1-2, die eine Donorsonde verwendet. Es wurde bemerkt, dass der Grund dafür eine Verbesserung des Nachweiswirkungsgrads für ein Molekül durch eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität pro Molekül war.
  • [Bezugsbeispiel 1]
  • Das Ziel-Nukleinsäuremolekül wurde durch Assoziieren mehrerer Donorsonden hintereinander auf der gleichen Seite wie die Akzeptorsonde nachgewiesen.
  • Als Ziel-DNA wurde Ziel-DNA-1 (5'-AACTATACAACGGGCTGAA-3', SEQ ID Nr. 6), Ziel-DNA-2 (5'-AACTATACAACGGGCTGAAGGGCTGAA-3', SEQ ID Nr. 7), Ziel-DNA-3 (5'-AACTATACAACGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAA-3', SEQ ID Nr. 8), Ziel-DNA-4 (5'-AACTATACAACGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAA-3', SEQ ID Nr. 9) und Ziel-DNA-5 (5'-AACTATACAACGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAA-3', SEQ ID Nr. 10) verwendet. Ziel DNA-1 bis Ziel-DNA-5 assoziieren jeweils so, dass 1 bis 5 Donorsonden in der gleichen Richtung bezüglich der Akzeptorsonde lagen.
  • Jede der Folgenden wurde in einem Reaktionspuffer (10 mM Tris-HCI, 400 mM NaCl, 0,05% Triton X-100) gelöst, um jede Ziel-DNA mit einer endgültigen Konzentration von 10 mM zu erhalten; eine Donorsonde b (5'-TTCAGCCC-3', SEQ ID Nr. 11: die Sonde, in der im fünften T eine fluoreszierende Atomgruppe mit zwei Thiazolorange modifiziert ist) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nM; und eine Akzeptorsonde (5'-GTTGTATAGTT-3', SEQ ID Nr. 12: die Sonde, in der eine fluoreszierende Substanz ATTO633 am 5'-Terminus modifiziert ist) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nm. Daher wurde eine Probelösung zubereitet. Probelösungen, die Ziel-DNA-1 bis Ziel-DNA-5 enthalten, wurden jeweils als Probelösungen 2-1 bis 2-5 verwendet. Als Kontrolle wurde eine Probelösung als eine Probelösung 2-0 verwendet, die auf die gleiche Weise zubereitet wurde, mit der Ausnahme, dass die Ziel-DNA nicht hinzugefügt wurde. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Danach wurden Assoziate, die die Ziel-DNA in jeder Probelösung enthielten, durch SSMC auf die gleiche Weise wie in <3> von Beispiel 1 gemessen. 4 zeigt Messergebnisse der Fluoreszenz-Leuchtdichte von jeder Probelösung und 5 zeigt Messergebnisse der Anzahl der Molekülen vom Assoziat in jeder Probelösung, die durch SSMC gemessen wurde. In 4 und 5 zeigt „N“ das Ergebnis der Probelösung 2-0 und „Wiederholung 1“ bis „Wiederholung 5“ zeigt jeweils die Ergebnisse für Probelösung 2-1 bis Probelösung 2-5. Infolgedessen nahm in den Fällen, in denen eine beliebige Ziel-DNA verwendet wurde, die Fluoreszenz-Leuchtdichte im Vergleich zu dem Fall, in dem keine Ziel-DNA hinzugefügt wurde („N“ in der Zeichnung), zu, es bestand jedoch kein Unterschied zwischen der Fluoreszenz-Leuchtdichte in Probelösung 2-1 bis Probelösung 2-5 (4). Daher wurde gezeigt, dass die vom Assoziat freigesetzte Fluoreszenz-Leuchtdichte nicht zunahm, selbst wenn mehrere Donorsonden auf einer Seite der Akzeptorsonde angeordnet wurden. Außerdem wurde, wie in 5 gezeigt, die gleiche Tendenz bezüglich der Anzahl der festgestellten Moleküle gezeigt. Mit anderen Worten wurde es deutlich, dass die Wirkung des Erhöhens der Fluoreszenz-Leuchtdichte nicht erzielt werden kann, wenn die Donorsonden nicht auf beiden Seiten der Akzeptorsonde angeordnet sind, wie in Beispiel 1.
  • [Bezugsbeispiel 2]
  • Es wurde der Einfluss eines Abstands zwischen der fluoreszierenden Akzeptorsubstanz und der fluoreszierende Donorsubstanz auf die Wirksamkeit von FRET im Assoziat untersucht, das aus der Akzeptorsonde, der Donorsonde und dem Ziel-Nukleinsäuremolekül zusammengesetzt ist.
  • Ausbilden von Assoziat in dem der Abstand zwischen fluoreszierender Akzeptorsubstanz und fluoreszierender Donorsubstanz am Ziel-Nukleinsäuremolekül eine Base ist
  • Jede der Folgenden wurde in einem Reaktionspuffer (10 mM Tris-HCI, 400 mM NaCl, 0,05% Triton X-100) gelöst, um eine Ziel-DNA-1 (5'-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3', SEQ ID Nr. 13) mit einer endgültigen Konzentration von 20 mM zu erhalten; eine Donorsonde-1 (5'-CTACTACCTCA-3', SEQ ID Nr. 14: die Sonde, in der im zweiten T eine fluoreszierende Atomgruppe mit zwei Thiazolorange modifiziert ist) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nM; und eine Akzeptorsonde-1 (5'-AACTATACAAC-3', SEQ ID Nr. 15: die Sonde, in der eine fluoreszierende Substanz ATTO633 am 3'-Terminus modifiziert ist) mit einer endgültigen Konzentration von 20 nm. Daher wurde eine Probelösung (Probelösung 3-1) zubereitet. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Ausbilden von Assoziat in dem der Abstand zwischen fluoreszierender Akzeptorsubstanz und fluoreszierender Donorsubstanz am Ziel-Nukleinsäuremolekül vier Basen ist
  • Eine Probelösung (Probelösung 3-2) wurde auf die gleiche Weise zubereitet wie in <1>, mit der Ausnahme, dass eine Donorsonde-2 (5'-CTACTACCTCA-3', SEQ ID Nr. 14: die Sonde, in der im fünften T eine fluoreszierende Atomgruppe mit zwei Thiazolorange modifiziert ist) anstelle der Donorsonde-1 als Donorsonde verwendet wurde. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Ausbilden von Assoziat in dem der Abstand zwischen fluoreszierender Akzeptorsubstanz und fluoreszierender Donorsubstanz am Ziel-Nukleinsäuremolekül acht Basen ist
  • Eine Probelösung (Probelösung 3-3) wurde auf die gleiche Weise zubereitet wie in <1>, mit der Ausnahme, dass eine Donorsonde-3 (5'-CTACTACCTCA-3', SEQ ID Nr. 14: die Sonde, in der im neunten T eine fluoreszierende Atomgruppe mit zwei Thiazolorange modifiziert ist) anstelle der Donorsonde-1 als Donorsonde verwendet wurde. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Ausbilden von Assoziat in dem der Abstand zwischen fluoreszierender Akzeptorsubstanz und fluoreszierender Donorsubstanz am Ziel-Nukleinsäuremolekül dreizehn Basen ist
  • Eine Probelösung (Probelösung 3-4) wurde auf die gleiche Weise zubereitet wie in <3>, mit der Ausnahme, dass die Ziel-DNA-2 (5'-GTTGTATAGTTTGAGGTAGTAG-3', SEQ ID Nr. 16) anstelle der Ziel-DNA-1 als Ziel-Nukleinsäuremolekül verwendet wurde. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Ausbilden von Assoziat in dem der Abstand zwischen fluoreszierender Akzeptorsubstanz und fluoreszierender Donorsubstanz am Ziel-Nukleinsäuremolekül siebzehn Basen ist
  • Eine Probelösung (Probelösung 3-5) wurde auf die gleiche Weise zubereitet wie in <2>, mit der Ausnahme, dass die Ziel-DNA-2 anstelle der Ziel-DNA-1 als Ziel-Nukleinsäuremolekül verwendet wurde. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Ausbilden von Assoziat in dem der Abstand zwischen fluoreszierender Akzeptorsubstanz und fluoreszierender Donorsubstanz am Ziel-Nukleinsäuremolekül zwanzig Basen ist
  • Eine Probelösung (Probelösung 3-6) wurde auf die gleiche Weise zubereitet wie in <1>, mit der Ausnahme, dass die Ziel-DNA-2 anstelle der Ziel-DNA-1 als Ziel-Nukleinsäuremolekül verwendet wurde. Danach wurde jede Probelösung bei 95 °C 10 Sekunden lang anhand eines Thermocyclers inkubiert. Die Temperatur wurde auf 25 °C gesenkt und jede Probelösung wurde 30 Minuten lang inkubiert.
  • Messung von Assoziat in der Probelösung durch SSMC
  • Assoziate, die die Ziel-DNA in jeder Probelösung enthielten, wurden durch SSMC auf die gleiche Weise wie in <3> von Beispiel 1 gemessen.
  • Messergebnisse für die Anzahl der Moleküle von Assoziaten in jeder Probelösung, die durch SSMC gemessen wurde, sind in 6 gezeigt. In der Zeichnung zeigen „1 Base“, „4 Basen“, „8 Basen“, „13 Basen“, „17 Basen“ und „20 Basen“ jeweils die Ergebnisse der Probelösungen 3-1 bis 3-6 an. Wie in 6 gezeigt, ist in Probelösung 3-2 eine maximale Anzahl nachgewiesener Moleküle gezeigt. In der Probelösung 3-3 wurde die Anzahl der nachgewiesenen Moleküle, die 10 % oder mehr der Anzahl nachgewiesener Moleküle von Probelösung 3-2 ist, aufrechterhalten. Die Anzahl der nachgewiesenen Moleküle war in den Probelösungen 3-4 bis 3-6 jedoch deutlich klein. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde festgestellt, dass in der Ziel-DNA ein Abstand (Abstand zwischen Pigmenten) zwischen der Base, mit der die Base assoziiert ist, an die die fluoreszierende Donorsubstanz in der Donorsonde gebunden ist, und der Base mit der die Base assoziiert ist, an die die fluoreszierende Akzeptorsubstanz in der Akzeptorsonde gebunden ist, den Nachweiswirkungsgrad des Ziel-Nukleinsäuremoleküls beeinflusst; dass der Nachweiswirkungsgrad des Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit zunehmendem Abstand zwischen den Pimenten abnimmt; dass FRET nicht als einschränkend angesehen wird, da eine Abnahme der Anzahl nachgewiesener Moleküle für einen kurzen Abstand zwischen Pigmenten klein ist; und dass der Abstand zwischen Pigmenten vorzugsweise 8 Basen or weniger ist.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Gemäß dem Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung kann das in der Probe vorliegende Ziel-Nukleinsäuremolekül mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit nachgewiesen werden, und kann daher in den Bereichen der Biochemie, Molekularbiologie, klinischen Untersuchung und dergleichen angewendet werden, in denen Nachweis oder quantitative Analyse von Nukleinsäuren in einer Probe durchgeführt wird.
  • Bezugszeichenliste
    • T:
    Ziel-Nukleinsäuremolekül
    d:
    erste fluoreszierende Substanz (fluoreszierende Donorsubstanz)
    a:
    zweite fluoreszierende Substanz (fluoreszierende Akzeptorsubstanz)
    1:
    erste Sonde
    2:
    zweite Sonde
    3:
    dritte Sonde
  • SEQUENZPROTOKOLL
    • <110> OLYMPUS CORPORATION, Ltd. <110> RIKEN <120> verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls <130> PC-21488 <160> 16
    • <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ziel-DNA <400> 1
      Figure DE112016007245T5_0006
    • <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Donorsonde a <400> 2
      Figure DE112016007245T5_0007
    • <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Donorsonde b <400> 3
      Figure DE112016007245T5_0008
    • <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Akzeptorsonde a <400> 4
      Figure DE112016007245T5_0009
    • <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Akzeptorsonde b <400> 5
      Figure DE112016007245T5_0010
    • <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ziel-DNA-1 <400> 6
      Figure DE112016007245T5_0011
    • <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ziel-DNA-2 <400> 7
      Figure DE112016007245T5_0012
    • <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: ziel-DNA-3 <400> 8
      Figure DE112016007245T5_0013
    • <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Künstliche sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ziel-DNA-4 <400> 9
      Figure DE112016007245T5_0014
    • <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ziel-DNA-5 <400> 10
      Figure DE112016007245T5_0015
    • <210> 11 <211> 8 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Donorsonde <400> 11
      Figure DE112016007245T5_0016
    • <210> 12 <211> 11 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Akzeptorsonde <400> 12
      Figure DE112016007245T5_0017
    • <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen sequenz: Ziel-DNA-1 <400> 13
      Figure DE112016007245T5_0018
    • <210> 14 <211> 11 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Donorsonde-1 <400> 14
      Figure DE112016007245T5_0019
    • <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Akzeptorsonde-1 <400> 15
      Figure DE112016007245T5_0020
    • <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ziel-DNA-2 <400> 16
      Figure DE112016007245T5_0021
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • JP 4118932 [0004]
    • WO 2014/034818 [0004]
    • WO 2012/102260 [0045]

Claims (11)

  1. Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend: einen Schritt (a), in dem in eine nukleinsäurehaltige Probe eine erste Sonde, die mit einer ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energiedonor in einem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist, eine zweite Sonde, die mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energieakzeptor in dem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist, und eine dritte Sonde gemischt wird, die mit der ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, um eine Probelösung zuzubereiten; einen Schritt (b), in dem ermöglicht wird, dass das Ziel-Nukleinsäuremolekül in der Probelösung, die in Schritt (a) zubereitet wurde, mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde assoziiert, um ein Assoziat aus der ersten Sonde, der zweiten Sonde, der dritten Sonde und dem Ziel-Nukleinsäuremolekül zu bilden; und einen Schritt (c), in dem nach Schritt (b) Licht mit einer Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an die Probelösung abgegeben wird, um das Ziel-Nukleinsäuremolekül anhand der Fluoreszenz nachzuweisen, die von der zweiten fluoreszierenden Substanz in dem Assoziat als ein Indikator freigesetzt wird, wobei ein Bereich, der mit der zweiten Sonde assoziiert, zwischen einem Bereich, der mit der ersten Sonde assoziiert, und einem Bereich liegt, der im Ziel-Nukleinsäuremolekül mit der dritten Sonde assoziiert.
  2. Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1, wobei die erste Sonde, die zweite Sonde oder die dritte Sonde eine Sonde ist, in der sich die Emissionsleuchtdichte gemäß einem Zustand des Assoziierens oder Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ändert.
  3. Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 2, wobei die erste fluoreszierende Substanz oder die zweite fluoreszierende Substanz eine fluoreszierende Atomgruppe ist, die exzitonische Effekte zeigt.
  4. Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der ersten Sonde gebunden ist, und einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist, und ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der dritten Sonde gebunden ist, und der Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der die Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist.
  5. Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Basenlänge der zweiten Sonde 5 bis 17 Basen beträgt.
  6. Verfahren zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei ein erstes Ziel-Nukleinsäuremolekül, das mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde assoziiert, und ein zweites Ziel-Nukleinsäuremolekül, das sich nur an eine aus der ersten Sonde und der dritten Sonde und an die zweite Sonde bindet, in der nukleinsäurehaltigen Probe enthalten sind, in (b) ein erstes Assoziat, das durch Assoziieren des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit der ersten Sonde, der zweiten Sonde und der dritten Sonde erhalten wird, und ein zweites Assoziat gebildet werden, das durch Assoziieren des zweiten Ziel-Nukleinsäuremoleküls mit der zweiten Sonde und einer beliebigen aus der ersten Sonde und der dritten Sonde erhalten wird, und in Schritt (c) das Licht mit der Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an die Probelösung abgegeben wird, und das erste Ziel-Nukleinsäuremolekül und das zweite Ziel-Nukleinsäuremolekül anhand Fluoreszenz-Leuchtdichte, die von der zweiten fluoreszierenden Substanz in dem Assoziat von einem Molekül als Anzeiger freigesetzt wird, unverwechselbar nachgewiesen werden, um ein Häufigkeitsverhältnis des ersten Ziel-Nukleinsäuremoleküls und des zweiten Ziel-Nukleinsäuremoleküls in der Probelösung zu berechnen.
  7. Sondensatz zum Nachweisen eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend: eine erste Sonde, in der ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit einer ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energiedonor in einem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist; eine zweite Sonde, in der ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz markiert ist, die ein Energieakzeptor in einem Fluoreszenzresonanz-Energietransferphänomen ist; und eine dritte Sonde, in der ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül assoziiert, mit der ersten fluoreszierenden Substanz markiert ist, wobei die erste Sonde, die zweite Sonde und die dritte Sonde mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ein Assoziat bilden können, in dem, bezogen auf die zweite Sonde, die dritte Sonde auf einer der ersten Sonde entgegengesetzten Seite angeordnet ist, und in einem Fall, in dem Licht mit einer Erregungswellenlänge der ersten fluoreszierenden Substanz an das Assoziat abgegeben wird, ein Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zwischen der ersten fluoreszierenden Substanz in der ersten Sonde und der zweiten fluoreszierenden Substanz in der zweiten Sonde und zwischen der ersten fluoreszierenden Substanz in der dritten Sonde und der zweiten fluoreszierend Substanz in der zweiten Sonde stattfindet und von der zweiten fluoreszierenden Substanz freigesetzte Fluoreszenz nachgewiesen wird.
  8. Sondensatz nach Anspruch 7, wobei die erste Sonde, die zweite Sonde oder die dritte Sonde eine Sonde ist, in der sich die Emissionsleuchtdichte gemäß einem Zustand des Assoziierens oder Nicht-Assoziierens mit dem Ziel-Nukleinsäuremolekül ändert.
  9. Sondensatz nach Anspruch 8, wobei die erste fluoreszierende Substanz oder die zweite fluoreszierende Substanz eine fluoreszierende Atomgruppe ist, die exzitonische Effekte zeigt.
  10. Sondensatz nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei im Assoziat ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der ersten Sonde gebunden ist, und einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist, und ein Abstand zwischen einer Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der eine Base assoziiert ist, an die die erste fluoreszierende Substanz in der dritten Sonde gebunden ist, und der Base im Ziel-Nukleinsäuremolekül, mit der die Base assoziiert ist, an die die zweite fluoreszierende Substanz in der zweiten Sonde gebunden ist, 8 Basen oder weniger ist.
  11. Sondensatz nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei eine Basenlänge der zweiten Sonde 5 bis 17 Basen beträgt.
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