JPWO2018073872A1 - 標的核酸分子の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] (a)核酸含有試料に、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第1の蛍光物質で標識された第1のプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第2の蛍光物質で標識された第2のプローブ、及び前記第1の蛍光物質で標識された第3のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブと会合させて前記第1のプローブと前記第2のプローブと前記第3のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記試料溶液に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第2の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、
を有し、
前記標的核酸分子中、前記第2のプローブと会合する領域は、前記第1のプローブと会合する領域と前記第3のプローブと会合する領域の間にある、標的核酸分子の検出方法。
[2] 前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、又は前記第3のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、前記[1]の標的核酸分子の検出方法。
[3] 前記第1の蛍光物質又は前記第2の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、前記[2]の標的核酸分子の検出方法。
[4] 前記第1のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下であり、
前記第3のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下である、前記[1]〜[3]のいずれかの標的核酸分子の検出方法。
[5] 前記第2のプローブの塩基長が5〜17塩基である、前記[1]〜[4]のいずれかの標的核酸分子の検出方法。
[6] 前記核酸含有試料に、前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブと会合する第1の標的核酸分子と、前記第1のプローブと前記第3のプローブのどちらか一方のみと前記第2のプローブと結合する第2の標的核酸分子が含まれており、
前記(b)において、前記第1の標的核酸分子と、前記第1のプローブと、前記第2のプローブと、前記第3のプローブとを会合させた第1の会合体と、前記第2の標的核酸分子と、前記第2のプローブと、前記第1のプローブ及び前記第3のプローブのいずれか一方とを会合させた第2の会合体と、を形成し、
前記工程(c)において、前記試料溶液に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射し、一分子の会合体中の前記第2の蛍光物質から放出された蛍光の輝度を指標として、前記第1の標的核酸分子と前記第2の標的核酸分子とを区別して検出し、前記試料溶液中の前記第1の標的核酸分子と前記第2の標的核酸分子の存在比を算出する、前記[1]〜[5]のいずれかの標的核酸分子の検出方法。
[7] 標的核酸分子を検出するためのプローブセットであり、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第1の蛍光物質で標識された第1のプローブと、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第2の蛍光物質で標識された第2のプローブと、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、前記第1の蛍光物質で標識された第3のプローブと、
を備え、
前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブは、前記標的核酸分子と、前記第3のプローブが前記第2のプローブに対して前記第1のプローブとは反対側に配置されている会合体を形成することができ、
前記会合体に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、前記第1のプローブ中の前記第1の蛍光物質と前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質との間、及び前記第3のプローブ中の前記第1の蛍光物質と前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質との間に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、前記第2の蛍光物質から放出された蛍光が検出される、プローブセット。
[8] 前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、又は前記第3のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、前記[7]のプローブセット。
[9] 前記第1の蛍光物質又は前記第2の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、前記[8]のプローブセット。
[10] 前記会合体が、
前記第1のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下であり、
前記第3のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下である、前記[7]〜[9]のいずれかのプローブセット。
[11] 前記第2のプローブの塩基長が5〜17塩基である、前記[7]〜[10]のいずれかのプローブセット。
また、本発明に係るプローブセットを用いることにより、当該検出方法を簡便かつ容易に実施することができる。
(a)核酸含有試料に、前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブと会合させて前記第1のプローブと前記第2のプローブと前記第3のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記試料溶液に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第2の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程。
任意の濃度の標的核酸分子を、2つのドナープローブと1つのアクセプタープローブを用いて検出した。
終濃度0〜100mMの標的DNA(5’−AGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGCGGTTC−3’、配列番号1)、終濃度20nMのドナープローブa(5’−GAACCGCTCATTGCCAATGGTGATG−3’、配列番号2、2番目のTに、チアゾールオレンジが2つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ)、終濃度20nMのドナープローブb(5’−GTCAGGCAGCTCGTAGCTCTTCTCC−3’、配列番号3、2番目のTに、チアゾールオレンジが2つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ)、終濃度20nMのアクセプタープローブa(5’−ACCTGGCC−3’、配列番号4、4番目のTに蛍光物質ATTO633が修飾されたプローブ。4番目のT以外の塩基はENAである。)となるように反応用バッファー(10mM Tris−HCl、400mM NaCl、0.05% Triton X−100)に溶解させ、試料溶液(試料溶液1−1)を調製した。調製された試料溶液1−1を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
ドナープローブbを混合せず、アクセプタープローブとしてアクセプタープローブaに代えてアクセプタープローブb(5’−ACCTGGCCGTCAGGCAGCTCGTAGCTCT−3’、配列番号5、5’末端に蛍光物質ATTO633が修飾されたプローブ。)を用いた以外は、前記<1>と同様にして試料溶液(試料溶液1−2)を調製し、調製された試料溶液1−2を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
前記<1>及び<2>で調製した試料溶液中の標的DNAを含む会合体を、SSMCにより測定した。具体的には、各試料溶液に対してそれぞれ、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた一分子蛍光測定装置MF−20(オリンパス株式会社)を用いて測定を行い、時系列光強度データ(フォトンカウントデータ)を取得した。試料溶液を、チアゾールオレンジの励起波長である488nm、300μWのレーザーで励起し、バンドパスフィルターを用いて、ATTO633の蛍光波長である600〜660nmの蛍光を検出した。試料溶液中に於ける光検出領域は、15mm/秒の移動速度にて移動させ、20秒間の測定を行った。また、BIN TIMEを10μ秒とし、測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が0.8以上となるもののピーク強度を抽出した。
標的核酸分子を、複数のドナープローブをアクセプタープローブに対して同じ側にタンデムに会合させて検出した。
アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、アクセプタープローブとドナープローブと標的核酸分子との会合体におけるFRETの効率に与える影響を調べた。
終濃度20mMの標的DNA−1(5’−TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT−3’、配列番号13)、終濃度20nMのドナープローブ−1(5’−CTACTACCTCA−3’、配列番号14、2番目のTに、チアゾールオレンジが2つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ)、終濃度20nMのアクセプタープローブ−1(5’−AACTATACAAC−3’、配列番号15、3’末端に蛍光物質ATTO633が修飾されたプローブ。)となるように反応用バッファー(10mM Tris−HCl、400mM NaCl、0.05% Triton X−100)に溶解させ、試料溶液(試料溶液3−1)を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
ドナープローブとして、ドナープローブ−1に代えてドナープローブ−2(5’−CTACTACCTCA−3’、配列番号14、5番目のTに、チアゾールオレンジが2つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ)を用いた以外は前記<1>と同様にして、試料溶液(試料溶液3−2)を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
ドナープローブとして、ドナープローブ−1に代えてドナープローブ−3(5’−CTACTACCTCA−3’、配列番号14、9番目のTに、チアゾールオレンジが2つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ)を用いた以外は前記<1>と同様にして、試料溶液(試料溶液3−3)を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
標的核酸分子として、標的DNA−1に代えて標的DNA−2(5’−GTTGTATAGTTTGAGGTAGTAG−3’、配列番号16)を用いた以外は前記<3>と同様にして、試料溶液(試料溶液3−4)を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
標的核酸分子として、標的DNA−1に代えて標的DNA−2を用いた以外は前記<2>と同様にして、試料溶液(試料溶液3−5)を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
標的核酸分子として、標的DNA−1に代えて標的DNA−2を用いた以外は前記<1>と同様にして、試料溶液(試料溶液3−6)を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて95℃で10秒間インキュベートした後、25℃まで温度を落とし30分間インキュベートした。
各試料溶液中の標的DNAを含む会合体を、実施例1の<3>と同様にしてSSMCにより測定した。
Claims (11)
- (a)核酸含有試料に、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第1の蛍光物質で標識された第1のプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第2の蛍光物質で標識された第2のプローブ、及び前記第1の蛍光物質で標識された第3のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブと会合させて前記第1のプローブと前記第2のプローブと前記第3のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記試料溶液に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第2の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、
を有し、
前記標的核酸分子中、前記第2のプローブと会合する領域は、前記第1のプローブと会合する領域と前記第3のプローブと会合する領域の間にある、標的核酸分子の検出方法。 - 前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、又は前記第3のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、請求項1に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記第1の蛍光物質又は前記第2の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、請求項2に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記第1のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下であり、
前記第3のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。 - 前記第2のプローブの塩基長が5〜17塩基である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記核酸含有試料に、前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブと会合する第1の標的核酸分子と、前記第1のプローブと前記第3のプローブのどちらか一方のみと前記第2のプローブと結合する第2の標的核酸分子が含まれており、
前記(b)において、前記第1の標的核酸分子と、前記第1のプローブと、前記第2のプローブと、前記第3のプローブとを会合させた第1の会合体と、前記第2の標的核酸分子と、前記第2のプローブと、前記第1のプローブ及び前記第3のプローブのいずれか一方とを会合させた第2の会合体と、を形成し、
前記工程(c)において、前記試料溶液に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射し、一分子の会合体中の前記第2の蛍光物質から放出された蛍光の輝度を指標として、前記第1の標的核酸分子と前記第2の標的核酸分子とを区別して検出し、前記試料溶液中の前記第1の標的核酸分子と前記第2の標的核酸分子の存在比を算出する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。 - 標的核酸分子を検出するためのプローブセットであり、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第1の蛍光物質で標識された第1のプローブと、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第2の蛍光物質で標識された第2のプローブと、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、前記第1の蛍光物質で標識された第3のプローブと、
を備え、
前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、及び前記第3のプローブは、前記標的核酸分子と、前記第3のプローブが前記第2のプローブに対して前記第1のプローブとは反対側に配置されている会合体を形成することができ、
前記会合体に、前記第1の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、前記第1のプローブ中の前記第1の蛍光物質と前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質との間、及び前記第3のプローブ中の前記第1の蛍光物質と前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質との間に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、前記第2の蛍光物質から放出された蛍光が検出される、プローブセット。 - 前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、又は前記第3のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、請求項7に記載のプローブセット。
- 前記第1の蛍光物質又は前記第2の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、請求項8に記載のプローブセット。
- 前記会合体が、
前記第1のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下であり、
前記第3のプローブ中の前記第1の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第2のプローブ中の前記第2の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、8塩基以下である、請求項7〜9のいずれか一項に記載のプローブセット。 - 前記第2のプローブの塩基長が5〜17塩基である、請求項7〜10のいずれか一項に記載のプローブセット。
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