JP6009944B2 - 核酸分子の多型識別方法 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、体細胞変異や一塩基多型などの遺伝子多型のような、塩基配列が類似する核酸を識別する方法に関する。
本願は、２０１１年１月２６日に、日本に出願された特願２０１１−０１４０６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。これらの方法は、特に、体細胞変異や一塩基多型などの遺伝子解析における検出感度に優れていることから、蛍光を用いた様々な手法が開発されている。

ＦＲＥＴプローブを用いた核酸の識別方法の１つとして、例えば、５’末端側と３’末端側が互いに相補的な塩基配列を有しており、かつ両末端が蛍光物質と消光物質を用いてそれぞれラベルされている１本鎖核酸（分子ビーコンプローブ）を用いる、いわゆる分子ビーコン法がある（例えば、非特許文献１参照。）。分子ビーコンは、単独で存在している場合には、両末端が会合して分子内ループを形成しているため消光状態であるが、標的核酸分子とハイブリダイズすることにより、分子内ループが解消されて蛍光を発する。遺伝子多型のうちの特定の遺伝子型と特異的にハイブリダイズする分子ビーコンを用いて、遺伝子多型を識別することができる（例えば、非特許文献２参照。）。

その他にも、蛍光性インターカレーターと蛍光プローブによるＦＲＥＴを用いて核酸を検出する方法がある（例えば、非特許文献３参照。）。蛍光物質で標識されたプローブが他の１本鎖核酸とハイブリダイズすると、形成された２本鎖核酸の塩基対間に蛍光性インターカレーターが入りこむ。この蛍光性インターカレーターとプローブを標識する蛍光物質との間に起こるＦＲＥＴを利用して、単独で存在している蛍光プローブと、２本鎖核酸を形成している蛍光プローブとを識別することができる。また、この原理を利用して、例えば、遺伝子多型のうちの特定の遺伝子型と特異的にハイブリダイズするプローブと、別の遺伝子型と特異的にハイブリダイズするプローブとを、それぞれ異なる蛍光物質で標識し、それぞれの蛍光物質と蛍光性インターカレーターとの間に起こるＦＲＥＴを検出することにより、遺伝子多型を識別することができる（例えば、非特許文献４参照。）。

一方で、近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献５〜７参照）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為される。そして、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される、微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。そして、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測して、フロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。

特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される、希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報

タャギ（Tyagi）、他１名、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、１９９６年、第１４巻、第３０３〜３０８ページ。 ジッセンドルフ（Giesendorf）、他５名、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、１９９８年、第４４巻、第３号、４８２〜４８６ページ。 ハウエル（Howell）、他２名、ゲノム・リサーチ（Genome Research）、２００２年、第１２巻、第１４０１〜１４０７ページ。 タカツ（Takatsu）、他３名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid Research）、２００４年、第３２巻、第１９号、ｅ１５６。 金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１〜１４３８ページ。 メイヤー−アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４〜２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１〜２７７ページ。

上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように調製されていることが好ましい。好適には、上記の蛍光分子等の濃度又は数密度は、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生する。この場合、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。

特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定できる。したがって、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数との相関を得ることができる。特に、特許文献６では、攪拌により試料溶液中にランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することは出来ない。例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出することは出来ない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。したがって、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出することは出来ない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。

遺伝子多型を検出する対象となるゲノム試料は、臨床検査における検体等のように、微量である場合が多い。このため、試料中の解析対象の核酸の濃度が非常に低い場合であっても、当該解析対象の核酸の多型を高感度に識別可能な方法の開発が望まれている。

しかしながら、例えば非特許文献２において実施されている遺伝子変異解析では、分子ビーコンを３００ｎＭで用いており、希薄な状態での計測とは言えない。
また、非特許文献４においても、数十〜数百ｎＭ程度の比較的高濃度の核酸について塩基配列の識別が行われている。このように、一般的に、ｐＭオーダーの比較的低濃度の核酸検体に対して多型を識別するには至っていない。

本発明は、これまでに説明した状況でなされたものである。本発明の目的は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行される統計的処理を必要としない遺伝子多型等の多型配列を有する核酸を識別する方法を提供することを目的とする。この本発明により提供される核酸分子の多型識別方法では、観測対象粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い場合であっても、試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術が用いられる。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、多型配列のうちの１の型の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて、当該核酸プローブとの会合体の形成の有無により、試料中の核酸分子の多型を識別する方法において、核酸プローブを含む会合体の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料中の解析対象の核酸分子の濃度が非常に低い場合であっても、感度よく多型を識別することができることを見出した。さらに、核酸プローブと試料中の核酸分子との会合体の形成反応、及び走査分子計数法による会合体の検出を、前記多型配列のうちの前記１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（デコイ核酸）の存在下で行うことにより、精度よく多型を識別することができることを見出し、本発明を完成させた。
ここで、走査分子計数法は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。

本発明は、以下に示す態様を有する。
（１）（ａ）多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する試料溶液調製工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる会合工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、第１の核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する算出工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の結果に基づき、前記解析対象の核酸分子の多型を識別する識別工程と、
（ｅ）前記工程（ｃ）において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する検出領域移動工程と、
（ｆ）前記工程（ｃ）において、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する蛍光検出工程と、
（ｇ）前記工程（ｃ）において、前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する会合体検出工程と、
（ｈ）前記工程（ｃ）において、前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する粒子計数工程と、を有し、
前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域を検出し、前記検出された有意な信号が存在する時間領域における光強度の時間変化に対する釣鐘状関数のフィッティングによって、前記検出された有意な信号が存在する時間領域に於ける光強度の時間変化が前記光検出領域内を相対的に移動する単一の発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有すると判定されたとき、前記検出された有意な信号が存在する時間領域における光強度の時間変化を、一つの会合体からの光信号として個別に検出し、
前記工程（ａ）における試料溶液、又は前記工程（ｂ）の後、前記工程（ｃ）の前の試料溶液が、前記多型配列のうちの前記第１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをさらに含んでいる核酸分子の多型識別方法。
（２）前記第１の核酸プローブが、蛍光物質により標識されている上記（１）に記載の核酸分子の多型識別方法。
（３）前記工程（ａ）において、前記試料溶液中に、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれている上記（１）又は（２）記載の核酸分子の多型識別方法。
（４）前記工程（ａ）において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、
前記工程（ｃ）において、前記第１の核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光であ上記（２）に記載の核酸分子の多型識別方法。
（５）前記第１の核酸プローブは、単独で存在している状態では蛍光エネルギー移動が起こり、かつ他の１本鎖核酸分子と会合体を形成した状態では蛍光エネルギー移動が起こらないように、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とが結合されており、
当該核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光である上記（２）に記載の核酸分子の多型識別方法。
（６）前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される上記（１）から（５）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（７）前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される上記（１）から（６）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（８）前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの会合体が前記光検出領域に入ったことが検出される上記（１）から（７）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（９）前記試料溶液が、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び尿素からなる群より選択される１種以上を含む上記（１）から（８）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（１０）前記工程（ｂ）を、前記工程（ａ）において調製された試料溶液の温度を７０℃以上にすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を会合させることにより行う上記（１）から（９）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（１１）前記第１の核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似物質からなる群より選択される２以上の分子が結合して構成されている上記（１）から（１０）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（１２）前記多型配列が、遺伝子多型の多型部位を含む塩基配列、又は体細胞変異の変異部位を含む塩基配列である上記（１）から（１１）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法。
（１３）前記体細胞変異がＫ−ｒａｓ遺伝子の変異である上記（１２）に記載の核酸分子の多型識別方法。

本発明の一態様である核酸分子の多型識別方法（以下、「本発明の核酸分子の多型識別方法」と称する）において用いられる走査分子計数法では、蛍光強度のゆらぎを算出する統計的処理を実行する必要を持たない。そのため、本発明の核酸分子の多型識別方法により、解析対象である多型配列を有する核酸分子が、試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、多型を識別することができる。
また、本発明の核酸分子の多型識別方法では、核酸プローブと試料中の核酸分子との会合体の走査分子計数法による検出を、前記多型配列のうちの前記１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下で行う。そのため、会合体形成反応から検出までの間に核酸プローブが他の型の核酸分子と非特異的に会合体を形成することが効果的に抑制され、その結果、核酸プローブによる非特異的な会合体の形成を効果的に抑制することができ、非常に精度よく多型を識別することができる。

図１（Ａ）は、走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図５は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図６は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 図７は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 多型と会合体の分子数によるクラスタリングの一例を模式的に示した図である。 実施例１において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例２において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。図１０（Ａ）はデコイ核酸を添加しなかった試料溶液の、図１０（Ｂ）はデコイ核酸を添加した試料溶液の結果である。 実施例３において、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例４において、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例５において、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例６において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例７において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例８において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子の変異率ごとに、変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体及び野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体の計数されたピーク数の値を示した図である。

まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。

発光粒子は、観測対象となる粒子と発光プローブとが結合又は会合した粒子を意味する。「発光プローブ」とは、観測対象となる粒子に結合又は会合する性質を有し、且つ、光を発する物質（通常、分子又はそれらの凝集体）であり、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。本発明の核酸分子の多型識別方法において用いられる第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブは、発光プローブに相当する。

本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。

試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出され、これにより、一つの粒子の存在が検出されることとなる（実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出したい粒子と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。）。そして、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号を個別に検出して、これにより、（発光プローブと結合した）粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。

上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブ（１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである場合を含む。以下同様）が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。

また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。

更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（即ち、本発明の核酸分子の多型識別方法においては、第１の核酸プローブを含む会合体や、第２の核酸プローブを含む会合体）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し（具体的には、第１の核酸プローブを含む会合体や、第２の核酸プローブを含む会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定し）、これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。

光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。

走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出する統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。

また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するので、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、第１の核酸プローブを含む会合体等を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本発明の核酸分子の多型識別方法によれば、試料溶液中のこれらの会合体の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、多型核酸を識別することが可能である。

更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合（流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上する。また、試料溶液中の検出対象となる粒子（本発明においては、第１の核酸プローブを含む会合体等）に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。

＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせた光分析装置により実現可能である。同図を参照して、上記の光分析装置について説明する。光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、かかる粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。

粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。

＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れず、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすくなり、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。

走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、図２に模式的に描かれる光検出が行われる。この光検出においては、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）が駆動され、光路が変更される。そして、試料溶液内において、光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が行われる。
そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２（Ｂ）に描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるので、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。

また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出するので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度においても、精度良く蛍光強度を検出できる。

更にまた、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出するので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度においても、精度良く蛍光強度を検出できる。

＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。

ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。
走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図３（Ｂ）の如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ａ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データにおいて、図４（Ｂ）に例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、下記の平均二乗変位の関係式（１）
（２Ｗｏ）^２ ＝６Ｄ・Δｔ （１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）^２ ／６Ｄ （２）
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ （３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２ ／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

＜走査分子計数法による光強度の分析＞
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。

（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ａ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６（Ａ）に模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められるところ、具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。

また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２ ／ａ^２ ） （４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。）

（ii）観測対象粒子のカウンティング
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６（Ｂ）に例示された処理により為されてよい。

図５及び図６（Ｂ）を参照して、観測対象粒子のフォトカウンティングについて説明する。時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、かかる時系列光信号データ（図６（Ｂ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６（Ｂ）中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６（Ｂ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６（Ｂ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。

上記のステップ１３０〜１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。

（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、下記式（５）
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ （５）
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、下記式（６）
ｃ＝ｎ／Ｖｔ （６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

＜核酸分子の多型識別方法＞
本発明の核酸分子の多型識別方法は、多型配列のうちの特定の型（第１の型）の核酸分子と特異的に結合する核酸プローブを用いて、当該核酸プローブと解析対象の核酸分子とをハイブリダイズさせ、形成された会合体の量に基づいて解析対象の核酸分子の型を識別する方法である。さらに本発明においては、会合体の検出を、上記の走査分子計数法により測定する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、蛍光を有する粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の核酸分子に対しても測定が可能である。このため、本発明の核酸分子の多型識別方法により、試料溶液中の解析対象の核酸分子の濃度が非常に低い場合であっても、形成された会合体を高感度に計数することができる。

本発明及び本願明細書において、多型配列とは、２以上の互いに類似する塩基配列が存在する塩基配列であり、多型配列を有する核酸分子を多型核酸という。ここで、塩基配列が類似するとは、例えば、１０〜２０個中、１〜数個の核酸塩基が置換、欠損、挿入、又は重複することにより相違していることを意味する。また、多型を識別するとは、多型配列中の特定の型の塩基配列を有する核酸分子と、当該多型配列中の当該特定の型以外の型の塩基配列を有する核酸分子とを区別することを意味する。

本発明の核酸分子の多型識別方法において解析対象とされる多型配列は、一遺伝子多型（ＳＮＰ）等のような遺伝子上の塩基配列であってもよく、人工的な塩基配列であってもよい。本発明においては、先天的な多型である遺伝子多型の多型部位や、後天的に生ずる多型である体細胞変異の変異部位を識別することが好ましい。体細胞変異としては、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異等が挙げられる。

本発明において、核酸プローブが、多型配列中の特定の型を有する１本鎖核酸分子と特異的に結合するとは、当該核酸プローブが、当該多型配列を有する１本鎖核酸分子のうち、当該特定の型以外の型の１本鎖核酸分子よりも、当該特定の型の１本鎖核酸分子と優先的にハイブリダイズすることを意味する。このため、核酸プローブは、特定の型の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、多型配列間で塩基が異なる多型部位以外にミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。

本発明においては、多型配列中の特定の型（第１の型）の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブ（以下、第１核酸プローブ）を用いる。解析対象の核酸分子と第１核酸プローブとをハイブリダイズさせ、形成された会合体を検出することにより、当該核酸分子中の多型配列が第１の型と同じかどうかを識別することができる。例えば、野生型と変異型の２型が知られている一遺伝子多型を識別する場合には、変異型を第１の型とすることにより、解析対象の核酸分子が変異型か野生型かを識別することができる。解析対象の核酸分子が変異型である場合には、試料溶液中から第１核酸プローブを含む会合体が検出される。

なお、本発明において用いられる第１核酸プローブ等の核酸プローブは、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとからなるキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。また、解析対象とする核酸も、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。

本発明においては、核酸プローブが単独で存在している状態と、他の１本鎖核酸分子と会合体を形成している状態とで蛍光強度を異ならせることにより、走査分子計数法において、核酸プローブ及び他の１本鎖核酸分子から形成された会合体と、会合体を形成していない核酸プローブとを区別して検出することができる。

例えば、単独で存在している状態において２本鎖構造を有さない核酸プローブを第１核酸プローブとし、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用いることによって、核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブと区別して検出することができる。この場合、単独で存在している核酸プローブは蛍光物質により標識されていないため、蛍光を発さない。これに対して、核酸プローブを含む会合体には蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、当該蛍光性２本鎖核酸結合物質から放出される蛍光が検出される。

また、蛍光性２本鎖核酸結合物質との間で蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる蛍光物質により標識された核酸プローブを用いることによっても、核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブと区別して検出することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と核酸プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が当該ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している第１核酸プローブ等の核酸プローブからは、当該核酸プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、会合体には蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、会合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している核酸プローブとは区別して検出することができる。

２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。なお、会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、第１核酸プローブ等の核酸プローブを設計することが好ましい。

また、分子ビーコンプローブを、核酸プローブとして用いることもできる。分子ビーコンプローブは、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドである。この分子ビーコンプローブでは、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させてある。会合体を形成している核酸プローブからはエネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光が検出されるのに対して、単独で存在している核酸プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブとは区別して検出することができる。

第１核酸プローブとして用いる分子ビーコンプローブとしては、多型配列の特定の型とハイブリダイズし得る塩基配列を有しており、かつ３’末端側の領域及び５’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列を有しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム−ループ構造）を形成するものが好ましい。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的核酸分子と相補的な塩基配列からなる領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的核酸分子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。

なお、蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。また、核酸プローブの蛍光物質による標識は、常法により行うことができる。

その他、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と、第１の核酸プローブと隣接する状態で特異的にハイブリダイズするように設計され、かつ第１核酸プローブを標識している蛍光物質との間でＦＲＥＴが起こる蛍光物質若しくは消光物質により標識された核酸プローブを用いることによっても、第１核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している第１核酸プローブと区別して検出することができる。この場合、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子に、第１核酸プローブと前記核酸プローブは互いに隣接してハイブリダイズするため、これら３者からなる会合体ではＦＲＥＴが起こる。このため、当該ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、第１核酸プローブを含む会合体を検出することができる。

本発明の核酸分子の多型識別方法は、具体的には、下記の工程を有する。
（ａ）多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、第１の核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の結果に基づき、前記解析対象の核酸分子の多型を識別する工程。

まず、工程（ａ）として、第１核酸プローブと解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する。具体的には、第１核酸プローブと解析対象の核酸分子を適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。該溶媒は、第１核酸プローブによる会合体の形成、及び、走査分子計数法による会合体の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

第１核酸プローブを含む会合体の検出に、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質や第１核酸プローブ以外の核酸プローブを用いる場合には、第１核酸プローブ等と同様に、蛍光性２本鎖核酸結合物質やその他の核酸プローブを試料溶液中に添加する。

次いで、工程（ｂ）として、工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる。試料溶液中の核酸分子が二本鎖核酸分子である場合には、会合させる前に、変性させることが好ましい。本発明において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、１本鎖核酸分子中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、核酸プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、核酸分子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該核酸プローブを含む会合体を形成することができる場合がある。

本発明においては、蛍光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該試料溶液を、高温処理をすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的核酸分子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。

必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該試料溶液の温度を、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該試料溶液の塩濃度を、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。

なお、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度は、多型配列を有する核酸分子と核酸プローブとからなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、第１核酸プローブと第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した第１核酸プローブと第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。

第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、第１核酸プローブの塩基配列情報から、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。本発明においては、好ましくは、試料溶液の温度を、第１核酸プローブ中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。

また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。

本発明の核酸分子の多型識別方法においては、工程（ｃ）における会合体の検出を、多型配列のうちの第１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、第１の型以外の型のデコイ核酸）の存在下で行う。このため、工程（ａ）において試料溶液を調製する際に、第１の型以外の型のデコイ核酸を試料溶液に含ませるか、又は、工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の前に、試料溶液に第１の型以外の型のデコイ核酸を添加する。本発明の核酸分子の多型識別方法においては、工程（ｂ）における第１核酸プローブによる非特異的な会合体形成をも抑制することができるため、工程（ａ）において試料溶液を調製する際に、第１の型以外の型のデコイ核酸を試料溶液に添加することが好ましい。

試料溶液に添加する第１の型以外の型のデコイ核酸の量は、特に限定されるものではないが、試料溶液中の第１の型以外の型のデコイ核酸の量が、解析対象の多型核酸の量よりも多くなるように、例えば、約５倍以上となるように添加されることが好ましい。試料溶液中にその他の型を有する核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが過剰量存在していることにより、添加した核酸プローブとその他の型の核酸分子との非特異的なハイブリダイゼーションを効果的に抑制することができる。

その他、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、工程（ｃ）の前に、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。これらの化合物は、工程（ａ）において試料溶液を調製する際に試料溶液に含ませてもよく、工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の前に、試料溶液に添加してもよい。

その後、工程（ｃ）として、試料溶液中の、第１核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する。具体的には、会合体を形成させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、会合体から放出される蛍光を検出し解析することにより、会合体の分子数を算出する。

最後に工程（ｄ）として、工程（ｃ）の結果に基づき、解析対象の核酸分子の多型を識別する。試料溶液中に第１の型の多型核酸分子が含まれていた場合には、工程（ｃ）において第１核酸プローブを含む会合体が検出される。

例えば、体細胞変異や一塩基多型を識別する場合には、変異型を第１の型とし、変異型の核酸分子と特異的にハイブリダイズする変異型プローブ（Ｍｔプローブ）を第１核酸プローブとして用いることにより、解析対象の核酸分子が野生型と変異型のいずれであるか（体細胞変異の有無）を識別することができる。

また、多型配列中の各型に対して、各型を第１の型とし、全ての型に対してそれぞれ本発明の核酸分子の多型識別方法を行うことにより、より精度よく多型核酸を識別することができる。例えば、一塩基多型を識別する場合には、変異型を第１の型として本発明の核酸分子の多型識別方法を行い、さらに、野生型を第１の型として本発明の核酸分子の多型識別方法を行い、両者の結果を検討することによって、より精度よく多型核酸を識別することができる。具体的には、変異型の核酸分子と特異的にハイブリダイズする変異型プローブ（Ｍｔプローブ）と、野生型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（野生型のデコイ核酸）を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を行い、さらに独立して、野生型の核酸分子と特異的にハイブリダイズする野生型プローブ（Ｗｔプローブ）と、変異型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（変異型のデコイ核酸）を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を行う。Ｍｔプローブを含む会合体の分子数の計数結果と、Ｗｔプローブを含む会合体の分子数の計数結果とに基づいて、解析対象の核酸分子が変異型であったのか、野生型であったのかを識別することができる。解析対象の核酸分子が変異型の場合には、Ｍｔプローブと優先的に会合体を形成するため、Ｍｔプローブを含む会合体の分子数のほうが、Ｗｔプローブを含む会合体よりも有意に多くなる。

Ｍｔプローブを用いて行う工程（ａ）〜（ｃ）と、Ｗｔプローブを用いて行う工程（ａ）〜（ｃ）とは、別個独立に行ってもよく、実質的に同時に行ってもよい。例えば、Ｍｔプローブと解析対象の核酸分子と野生型のデコイ核酸とを添加した試料溶液を調製し、当該試料溶液内の核酸分子の会合体形成を行い、形成された会合体を計数した後、Ｗｔプローブと解析対象の核酸分子と変異型のデコイ核酸とを添加した試料溶液し、当該試料溶液内の核酸分子の会合体形成を行い、形成された会合体を計数してもよい。また、Ｍｔプローブと解析対象の核酸分子と野生型のデコイ核酸とを添加した試料溶液と、Ｗｔプローブと解析対象の核酸分子と変異型のデコイ核酸とを添加した試料溶液とをそれぞれ調製した後、両試料溶液の温度を同時に上昇させた後、徐々に低下させることにより、試料溶液内の核酸分子の会合体形成を同時に行った後、各試料溶液を光分析装置に設置し、順次、解析することもできる。その他、一の試料溶液中に、解析対象の核酸分子、Ｗｔプローブ、Ｍｔプローブ、変異型のデコイ核酸、及び野生型のデコイ核酸を添加し、当該試料溶液内の核酸分子の会合体形成を行った後、Ｗｔプローブを含む会合体及びＭｔプローブを含む会合体を区別して計数することもできる。

例えば、一塩基多型を識別する場合には、解析対象の核酸分子に代えて多型配列が既知である対照用１本鎖核酸分子を用いて、Ｗｔプローブを添加した場合に形成されたＷｔプローブを含む会合体の分子数と、Ｍｔプローブを添加した場合に形成されたＭｔプローブを含む会合体の分子数とを算出する。対照用１本鎖核酸分子として、野生型の核酸分子、変異型の核酸分子、又は野生型の核酸分子と変異型の核酸分子を等モル量ずつ混合したものをそれぞれ用い、さらにネガティブコントロールとして核酸プローブのみを添加する。
各測定の結果から、対照用１本鎖核酸分子の多型と会合体の分子数との関係をクラスタリングするために必要な情報を得ることができる。

図８に、多型と会合体の分子数によるクラスタリングの一例を模式的に示す。核酸プローブのみを添加した試料溶液では、Ｗｔプローブを含む会合体とＭｔプローブを含む会合体のいずれも少ない（図８中、クラスター１）。これに対して、野生型の核酸分子を添加した試料溶液では、Ｗｔプローブを含む会合体の分子数が、Ｍｔプローブを含む会合体の分子数よりも明らかに多くなる（図８中、クラスター２）。逆に、変異型の核酸分子を添加した試料溶液では、Ｍｔプローブを含む会合体の分子数が、Ｗｔプローブを含む会合体の分子数よりも明らかに多くなる（図８中、クラスター３）。野生型の核酸分子と変異型の核酸分子を等モル量ずつ混合したものを添加した試料溶液では、Ｗｔプローブを含む会合体の分子数とＭｔプローブを含む会合体の分子数とは両方とも多くなる（図８中、クラスター４）。クラスタリングの結果と、解析対象の核酸分子を添加した場合の結果とを比較し、解析対象の核酸分子がどの多型に当てはまるかを識別することができる。

その他、本発明の核酸分子の多型識別方法では、第１核酸プローブとともに、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と、多型配列領域以外の領域において特異的にハイブリダイズするように設計した他の核酸プローブ（第２核酸プローブ）を併用することもできる。このように設計された第２核酸プローブは、多型配列を有する核酸分子に、多型配列以外の領域で結合するため、多型配列のうちの第１の型以外の遺伝子型を有する核酸分子とも会合体を形成する。このため、第２核酸プローブを、第１核酸プローブ及び解析対象の核酸分子とともに試料溶液に添加し、当該試料溶液内の温度を同時に上昇させた後、徐々に低下させることにより、解析対象の核酸分子が第１の型であった場合には、当該試料溶液中に、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体が形成される。一方で、解析対象の核酸分子が野生型の場合には、当該試料溶液には、第２核酸プローブを含む会合体は形成されるものの、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体は形成されない。したがって、試料溶液中に、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体が形成された場合には、解析対象の核酸分子は第１の型であり、第２核酸プローブは含むが第１核酸プローブは含まない会合体が形成された場合には、解析対象の核酸分子は、多型配列中の第１の型以外の型であると識別することができる。

解析対象の核酸分子が、ゲノムＤＮＡのように２本鎖核酸分子を形成している場合には、第２核酸プローブを、前述のように、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように設計することもできるが、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸分子（すなわち、多型配列を有する１本鎖核酸分子と会合する１本鎖核酸分子）と特異的にハイブリダイズするように第２核酸プローブを設計することもできる。この場合にも、第２核酸プローブは、多型配列を有する１本鎖核酸分子の相補鎖である１本鎖核酸分子と、多型核酸の間で塩基配列が共通する領域において会合する。つまり、第２核酸プローブは、多型配列の型に関わらず、多型配列を有する１本鎖核酸分子と会合して２本鎖核酸分子を構成する１本鎖核酸分子と、会合体を形成する。このため、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子が、当該１本鎖核酸分子と相補的な１本鎖核酸分子との２本鎖核酸分子（会合体）として存在している試料溶液中に、第１核酸プローブと第２核酸プローブの両方を添加し、当該試料溶液内の温度を同時に上昇させた後、徐々に低下させることにより、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子は第１核酸プローブと会合し、当該１本鎖核酸分子と相補的な１本鎖核酸分子は第２核酸プローブと会合する。一方で、解析対象の核酸分子が多型配列中の第１の型以外の型であった場合には、同様の処理によって、第２核酸プローブを含む会合体のみが形成され、第１核酸プローブを含む会合体は形成されない。したがって、試料溶液中に、第１核酸プローブを含む会合体と第２核酸プローブを含む会合体の両方が形成された場合には、解析対象の核酸分子は第１の型であり、第２核酸プローブを含む会合体は形成されたが、第１核酸プローブを含む会合体は形成されなかった場合には、解析対象の核酸分子は、多型配列中の第１の型以外の型であると識別することができる。

第２核酸プローブを、多型配列の型に関わらず、多型配列を有する１本鎖核酸分子又は当該１本鎖核酸分子と相補的な１本鎖核酸分子と会合体を形成するように設計することにより、試料溶液中に存在する多型核酸中に占める、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子の割合を算出することができる。例えば、野生型と変異型の２型を有するＳＮＰを多型配列とし、変異型を第１の型とし、被験者のゲノムＤＮＡを含む試料溶液に対して本発明の核酸分子の多型識別方法を行った場合に、第１核酸プローブを含む会合体の数と、第２核酸プローブを含む会合体の数がほぼ等しかった場合には、当該被験者の遺伝子型は変異型ホモであり、第１核酸プローブを含む会合体の数が、第２核酸プローブを含む会合体の数よりも有意に少ない場合には、当該被験者の遺伝子型はヘテロであり、第１核酸プローブを含む会合体がほとんど検出されなかった場合には、当該被験者の遺伝子型は野生型ホモである、と識別することができる。

また、第２核酸プローブを、多型配列の型に関わらず、多型配列を有する１本鎖核酸分子又は当該１本鎖核酸分子と相補的な１本鎖核酸分子と会合体を形成するように設計することにより、測定系の精度評価にも用いることができる。例えば、第２核酸プローブを含む会合体がほとんど検出されなかった場合には、用いた試料溶液中に、測定のために十分な量の多型核酸が含まれていないか、測定系が上手く機能していない可能性があり、信頼できる結果が得られていないことが示唆される。

なお、第２核酸プローブを含む会合体を検出するための指標とする蛍光と、第１核酸プローブを含む会合体を検出するための指標とする蛍光の光学的特性を互いに異なるようにし、放出される光によって、第１核酸プローブを含む会合体と第２核酸プローブを含む会合体とを区別して検出してもよい。

次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
１種類の分子ビーコンプローブを用いて、走査分子計数法により、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別可能であることを検証した。
変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブとして、５’末端にＴＡＭＲＡが付加され、３’末端にＢＨＱ−２が付加された表１に記載の塩基配列（配列番号１）を有する核酸分子を用いた。また、解析対象の核酸分子として、同じく表１に記載の塩基配列を有する野生型（ＧＧＴ）核酸（配列番号２）のみ（変異率：０％）、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸（配列番号３）を９：１のモル比で混合したもの（変異率：１０％）、及び変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（変異率：１００％）用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、野生型（ＧＧＴ）核酸と相補的な塩基配列を有する非蛍光標識プローブ（野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸）（配列番号４）を用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。表１中、右欄には配列番号を示す。また、表１中、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基である。さらに、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。

上記の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、試料溶液を調製した。
調製された試料溶液を、９５℃で５分間加熱することにより変性させた後、２０℃まで徐々に液温を低下させて会合体を形成させた。具体的には、降温速度を０．１℃／秒とし、９０℃で５分間、８０℃で１０分間、７０℃で１０分間、６０℃で１０分間、５０℃で１０分間、４０℃で１０分間、３０℃で１０分間の降温処理を行った。

降温処理後の試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０〜６２０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。また測定は各試料５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９５
を満たすピーク信号のみを観測対象の核酸分子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象の核酸分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。

図９に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、ＧＴＴ変異率依存的にピーク数が増加していることから、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブがＧＴＴ変異配列特異的にハイブリダイゼーションしていることが確認された。

［実施例２］
試料溶液中に、核酸プローブが特異的に結合する型以外の型の多型配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することによる、当該核酸プローブを含む会合体の検出精度を調べた。
具体的には、実施例１で用いた変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、１μＭとなるように、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。一方、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しない以外は同様にして、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有しない試料溶液を調製した。
これらの試料溶液に対して、実施例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後会合体を形成し、さらに、実施例１と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数を計数した。

図１０に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。図１０（Ａ）は野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しなかった試料溶液の、図１０（Ｂ）は野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加した試料溶液の結果である。この結果、図１０（Ａ）に示すように、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸非存在下では、変異率が０％のときにピーク数がすでに増加していた。これは、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブが野生型（ＧＧＴ）核酸にも非特異的にハイブリダイゼーションしたことを示唆している。一方、図１０（Ｂ）に示すように、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸存在下では、変異率依存的にピーク数が増加していることから、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブが変異型（ＧＴＴ）核酸に特異的にハイブリダイゼーションしたことを示唆している。これらの結果から、デコイ核酸を試料溶液中に添加することにより、分子ビーコンプローブの非特異的なハイブリダイゼーションを抑制できることが明らかである。

［実施例３］
実施例１で用いた変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブと、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブとを用いて、各遺伝子型を識別した。
野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブとして、５’末端にＴＡＭＲＡが付加され、３’末端にＢＨＱ−２が付加された表２に記載の塩基配列（配列番号５）を有する核酸分子を用いた。

また、解析対象の核酸分子として、実施例１で用いた野生型（ＧＧＴ）核酸のみ（変異率：０％）、変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（ＧＴＴ変異率：１００％）に加えて、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸を１：１のモル比で混合したもの（ＧＴＴ変異率：５０％）を用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、実施例１で用いた野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸と、変異型（ＧＴＴ）核酸と相補的な塩基配列を有する非蛍光標識プローブ（変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸）（配列番号６）を用いた。
表２に、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸の配列を示す。表２中、右欄には配列番号を示し、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基であり、下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。なお、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。

具体的には、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブと野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。また、解析対象の核酸分子を添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。
一方、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭとなるように、前記トリス緩衝液に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブと変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。また、解析対象の核酸分子を添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。

これらの試料溶液に対して、それぞれ、実施例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合体を形成し、さらに、実施例１と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数及び野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数をそれぞれ計数した。

図１１に、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＴＴ）」）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＧＴ）」）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、解析対象の核酸分子が存在していなかった対照用試料溶液（図中、「Ｎ．Ｃ．」）では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数と野生型（ＧＧＴ）ピーク数のいずれも非常に少なかった。一方で、ＧＴＴ変異率０％の試料溶液（図中、「０％」）では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は対照用試料溶液とほぼ同程度しかなかったが、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は非常に多かった。逆に、ＧＴＴ変異率１００％の試料溶液（図中、「１００％」）では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は対照用試料溶液とほぼ同程度しかなかったが、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は非常に多かった。これに対して、ＧＴＴ変異率５０％の試料溶液（図中、「５０％」）では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数のいずれも多かった。このように、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数から、ＧＴＴ変異率の異なる３種類の試料溶液は、互いに区別することができた。これらの結果から、本発明の核酸分子の多型識別方法を用いて遺伝子変異を識別することにより、解析対象の核酸分子を、変異率ごとに識別可能であること、特に、一塩基多型等の解析において、解析対象のゲノムＤＮＡの遺伝子型が、野生型ホモなのか、ヘテロなのか、変異型ホモなのかを、容易にタイピング可能であることがわかった。

［実施例４］
本発明の核酸分子の多型識別方法において、一の試料溶液中で、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体と野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の両方を形成させる条件で、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別した。
変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブとして、表１に記載の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブと同じ塩基配列（配列番号１）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎを付加し、３’末端にＢＨＱ−３を付加したものを用いた。野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、及び野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸は、実施例３で用いたものを用いた。なお、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。
具体的には、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸、及び変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭ、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより試料溶液を調製した。また、解析対象の核酸分子を添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。

これらの試料溶液に対して、それぞれ、実施例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後に会合体を形成した。降温処理後の試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、ＴＡＭＲＡ標識された野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを励起するために、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６５〜５９５ｎｍとした。ＡＴＴＯ６４７Ｎ標識された変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを励起するために、励起光は６３３ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６５０〜６９０ｎｍとした。それ以外は、実施例３と同様の条件で走査分子計数法にて計測を行い、解析を行った。

図１２に、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＴＴ）」）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＧＴ）」）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、解析対象の核酸分子が存在していなかった対照用試料溶液では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数と野生型（ＧＧＴ）ピーク数のいずれも非常に少なかった。一方で、ＧＴＴ変異率０％の試料溶液では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は少なかったが、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は多かった。逆に、ＧＴＴ変異率１００％の試料溶液では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は少なかったが、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は多かった。これに対して、ＧＴＴ変異率５０％の試料溶液では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数のいずれも多かった。このように、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数から、ＧＴＴ変異率の異なる３種類の試料溶液は、互いに区別することができた。これらの結果から、解析対象の核酸分子と変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブとの会合体の形成及び検出と、解析対象の核酸分子と野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブとの会合体の形成及び検出とを、別個の試料溶液中で行った実施例７と同様に、両会合体の形成及び検出を一の試料溶液中で行った場合でも、解析対象の核酸分子を、変異率ごとに識別可能であることが明らかである。

［実施例５］
実施例４では、解析対象の核酸分子を変異率ごとに識別可能ではあったが、図１２における各試料溶液のスポット間の距離は、図１１に示される実施例３の場合よりも、互いの距離が近い。これは、実施例３の方法よりも、実施例４の方法のほうが、識別能がやや劣ることを示唆する。
そこで、デコイ核酸の長さを調整し、変異率の識別能を改善させた。
具体的には、実施例４で用いた野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸及び変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸に代えて、表３に記載されている野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸（配列番号７）及び変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸（配列番号８）を用いた以外は、実施例４と同様にして試料溶液を調製した。なお、本実施例において用いたデコイ核酸は、実施例４で用いたものよりもそれぞれ１塩基だけ短い。また、表３中、右欄は配列番号を示し、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基を示す。

これらの試料溶液に対して、実施例４と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後会合体を形成し、さらに、実施例４と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数及び野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数をそれぞれ計数した。

図１３に、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＴＴ）」）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＧＴ）」）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、図１２に示される実施例４の場合よりも、各試料溶液のスポット間の距離が広くなり、試料溶液中のＧＴＴ変異率の識別能がわかった。
実施例４における識別能が、実施例３における識別能よりも低かったのは、２種類の分子ビーコンプローブと２種類のデコイ核酸とが共存していたため、デコイ核酸が分子ビーコンの標的配列への非特異結合だけでなく、特異的な結合も阻害したためだと考えられる。本実施例においては、デコイ核酸の長さが短いことにより、分子ビーコンの標的配列への特異的結合阻害が小さくなったために、ＧＴＴ変異率の識別能が改善されたものと推察される。
これらの結果から、デコイ核酸の設計を工夫することにより、多型配列中の一の型に特異的な核酸プローブと、当該多型配列中の他の型に特異的な核酸プローブとを、一の試料溶液中で共存させた状態で、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体と野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の両方の会合体の形成・検出を行う場合であっても、非常に高い精度で多型を識別することができることが明らかである。

［実施例６］
第１核酸プローブとは異なる塩基配列を有し、かつ、解析対象の多型配列からなる多型部位を認識しない核酸プローブ第２核酸プローブとし、第１核酸プローブと合わせて用いて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別した。
具体的には、第２核酸プローブとして、Ｋ−ｒａｓ遺伝子中の領域であって、コドン１２を含まず、野生型と変異型に共通する領域の塩基配列（共通配列）（配列番号９）と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１０）に対して、５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎを付加し、３’末端にＢＨＱ−３を付加した共通分子ビーコンプローブを用いた。また、前記共通配列からなるオリゴヌクレオチドを、共通核酸として用いた。表４に、共通分子ビーコンプローブ及び共通配列の塩基配列を示す。表４中、右欄には配列番号を示す。また、共通分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。

その他、第１核酸プローブとして、実施例１で用いた変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを用いた。また、解析対象の核酸分子として、実施例１で用いた野生型（ＧＧＴ）核酸のみ（変異率：０％）、変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（ＧＴＴ変異率：１００％）を用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、実施例１で用いた野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を用いた。なお、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。

具体的には、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、共通分子ビーコンプローブ、野生型（ＧＧＴ）核酸又は変異型（ＧＴＴ）核酸、共通核酸、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、試料溶液を調製した。また、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸のいずれも添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。

これらの試料溶液に対して、それぞれ、実施例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後会合体を形成し、さらに、実施例５と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数及び野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数をそれぞれ計数した。

図１４に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。図１４（Ａ）は変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の計数結果であり、図１４（Ｂ）は共通分子ビーコンプローブを含む会合体の計数結果である。５４３ｎｍで励起してＴＡＭＲＡの蛍光を検出した場合、変異率０％（野生型（ＧＧＴ）核酸のみ添加）と変異率１００％（変異型（ＧＴＴ）核酸のみ添加）とで、計数された変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の数に有意に差が出ており、両者を識別できた。また、６３３ｎｍで励起してＡＴＴＯ６４７Ｎの蛍光を検出した場合、変異率０％と変異率１００％は、解析対象の核酸分子を添加しなかった対照試料溶液（図中、「Ｎ．Ｃ．」）の結果と比べて有意に差が出ていた。

本実施例では、野生型（ＧＧＴ）核酸や変異型（ＧＴＴ）核酸とは別個に、共通核酸を試料溶液中へ添加したが、解析対象の核酸分子がゲノムＤＮＡである場合や、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ等によって増幅したＤＮＡである場合には、共通配列及び多型配列は、同一の１本鎖核酸分子又は当該１本鎖核酸分子の相補鎖上に存在している。このため、本実施例のように、第２核酸プローブを、多型核酸間で共通する領域にハイブリダイズするプローブとした場合には、当該第２核酸プローブを含む会合体の有無により、試料溶液中に解析対象の多型配列を含む核酸分子が存在しているか否かを確認することができる。また、第２核酸プローブを含む会合体の検出量により、ＰＣＲの増幅量のばらつきによる核酸分子の量を補正し、多型識別の精度を向上することができる。

［実施例７］
１種類の核酸プローブと蛍光性インターカレーターを用いて、走査分子計数法により、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別可能であることを検証した。
変異型（ＧＴＴ）プローブとして、５’末端にＲＯＸが付加された表５に記載の塩基配列（配列番号１１）を有する核酸分子を用いた。表５中、右欄には配列番号を示し、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基である。さらに、解析対象の核酸分子として、実施例１で用いた野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸を、それぞれ用いた。

具体的には、変異型（ＧＴＴ）プローブ、野生型（ＧＧＴ）核酸又は変異型（ＧＴＴ）核酸、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。一方、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しない以外は同様にして、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有しない試料溶液を調製した。
調製された試料溶液を、９４℃で５分間加熱することにより変性させた後、０．１℃／秒で降温させ、６８．８℃で５分間恒温処理させて会合体を形成させた。
これらの濃縮試料溶液に、それぞれ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を前記トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液を添加し、当該濃縮試料溶液の１０倍希釈を調製し、これらの試料溶液とした。
これらの試料溶液を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ希釈液添加後３０分間以上放置した。

その後、試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて、回転速度６，０００ｒｐｍ、１００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０〜６２０ｎｍとした。アバランシェフォトダイオードから得られるシグナルを、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。
測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ−Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出した。野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を加えた試料溶液と加えない試料とで得られるピーク数を比較した。

図１５に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、変異型（ＧＴＴ）核酸を添加した試料溶液（図中、「ＧＴＴ核酸」）では、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸の添加の有無によるピーク数にあまり相違はなかったが、野生型（ＧＧＴ）核酸を添加した試料溶液（図中、「ＧＧＴ核酸」）では、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加した試料溶液よりも、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しなかった試料溶液のほうが、ピーク数が明らかに多かった。この結果は、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸が野生型（ＧＧＴ）核酸と特異的に結合したことにより、変異型（ＧＴＴ）プローブとが野生型（ＧＧＴ）核酸との非特異的な結合を阻害し、配列特異的な結合が促されたためと考えられる。すなわち、これらの結果から、多型配列のうちの、核酸プローブが特異的に結合する型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を試料溶液に添加することにより、核酸プローブの識別精度を向上させられることが明らかである。

［実施例８］
実施例７で用いた変異型（ＧＴＴ）プローブと、野生型（ＧＧＴ）プローブと、蛍光性インターカレーターを用いて、走査分子計数法により、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別した。
野生型（ＧＧＴ）プローブとして、５’末端にＲＯＸが付加された表６に記載の塩基配列（配列番号１２）を有する核酸分子を用いた。表６中、右欄には配列番号を示し、太字の塩基が変異（多型）部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基である。また、解析対象の核酸分子として、表１に記載の塩基配列を有する野生型（ＧＧＴ）核酸（配列番号２）のみ（変異率：０％）、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸（配列番号３）を９：１のモル比で混合したもの（変異率：１０％）、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸（配列番号３）を１：１のモル比で混合したもの（変異率：５０％）、及び変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（変異率：１００％）用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、実施例３で用いた変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を用いた。

具体的には、変異型（ＧＴＴ）プローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、変異型（ＧＴＴ）プローブと野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。一方、野生型（ＧＧＴ）プローブ、解析対象の核酸分子、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるように、前記トリス緩衝液に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）プローブと変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。
調製された試料溶液を、９４℃で５分間加熱することにより変性させた後、０．１℃／秒で降温させ、６８．８℃で５分間恒温処理させて会合体を形成させた。
これらの濃縮試料溶液に、それぞれ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を前記トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液を添加し、当該濃縮試料溶液の１０倍希釈を調製し、これらの試料溶液とした。
これらの試料溶液を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ希釈液添加後３０分間以上放置した。

これらの試料溶液に対して、実施例７と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体又は野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体の分子数を計数した。図１６に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子の変異率ごとに、変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体の計数されたピーク数（図中、「ＧＴＴプローブ」）及び野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体の計数されたピーク数（図中、「ＧＧＴプローブ」）の値を示した。この結果、変異型（ＧＴＴ）プローブと野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液では、変異率が高いほど（すなわち、試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）核酸濃度が高いほど）、得られるピーク数が多くなり、変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体量が多くなることがわかった。同様に、野生型（ＧＧＴ）プローブと変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液では、変異率が低いほど（すなわち、試料溶液中の野生型（ＧＧＴ）核酸濃度が高いほど）、得られるピーク数が多くなり、野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体量が多くなることがわかった。これらの結果から、本発明の核酸分子の多型識別方法により、一塩基のみ異なる極めて類似した核酸分子であるにも関わらず、多型の識別できることが明らかである。

［実施例９］
核酸プローブと蛍光性インターカレーターを用いて、当該核酸プローブを含む会合体を走査分子計数法により計数する場合における、会合体中の２本鎖構造の塩基対長が与える影響を調べた。
まず、プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を鋳型とし、５’末端をＲｏｘで修飾したオリゴヌクレオチド、非標識のオリゴヌクレオチド、及びＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、１００ｂｐ、２００ｂｐ、４００ｂｐ、８００ｂｐ、及び１．５ｋｂｐの鎖長の異なるＰＣＲ産物を調製した。これらのＰＣＲ産物からＷｉｚａｒｄ Ｖ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｐｒｏｍｅｇａ社製)を用いてプライマー除去し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いた電気泳動により、ＰＣＲ産物の有無及び濃度を測定した。これらのＰＣＲ産物（蛍光標識）は、５’末端がＲｏｘで標識された１本鎖核酸分子と、非標識の１本鎖核酸分子との会合体である。
上記で用いた５’末端をＲｏｘで修飾したオリゴヌクレオチドに代えて、５’末端が修飾されていないオリゴヌクレオチドを用いた以外は、上記と同様にして、非標識の１本鎖核酸分子同士の会合体であるＰＣＲ産物（非標識）を得た。
その後、トリス緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、各ＰＣＲ産物が１００ｐＭとなるように調製した。この調製されたＰＣＲ産物の溶液を、前記トリス緩衝液で１００００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)溶液に任意の濃度で加え、試料溶液とした。
これらの試料溶液を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ希釈液添加後３０分間以上放置した。

その後、試料溶液中のＰＣＲ産物の分子数を、実施例７と同じ条件で、走査分子計数法により計数した。この結果、ＰＣＲ産物の鎖長によって、蛍光標識されたＰＣＲ産物から測定されたピーク数と、非標識のＰＣＲ産物から測定されたピーク数との間に差が生じた。ＰＣＲ産物の鎖長が長くなるに連れ、得られるピーク数差が小さくなっていた。この結果は、鎖長が長いほどインターカレーターのパルス強度が強まり、本来のインターカレーターの蛍光波長より長波長領域でも非特異的なシグナルとしてピークが発生することによると考えられる。逆に言えば、鎖長が短い方が、非特異的なシグナルが少ない事となる。
これらの結果より、およそ４００ｂｐ程度の鎖長以下であれば、充分な非特異シグナルの低減が成されていると見ることができる。

本発明の核酸分子の多型識別方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない多型核酸を、特定の型に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて識別し、走査分子計数法により計数することができるため、遺伝子多型や体細胞変異等を識別するような臨床検査等の分野で利用が可能である。

１ 光分析装置（共焦点顕微鏡）
２ 光源
３ シングルモードオプティカルファイバー
４ コリメータレンズ
５ ダイクロイックミラー
６、７、１１ 反射ミラー
８ 対物レンズ
９ マイクロプレート
１０ ウェル（試料溶液容器）
１２ コンデンサーレンズ
１３ ピンホール
１４ バリアフィルター
１５ マルチモードオプティカルファイバー
１６ 光検出器
１７ ミラー偏向器
１７ａ ステージ位置変更装置
１８ コンピュータ

Claims (13)

1. （ａ）多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する試料溶液調製工程と、
   （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる会合工程と、
   （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、第１の核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する算出工程と、
   （ｄ）前記工程（ｃ）の結果に基づき、前記解析対象の核酸分子の多型を識別する識別工程と、
   （ｅ）前記工程（ｃ）において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する検出領域移動工程と、
   （ｆ）前記工程（ｃ）において、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する蛍光検出工程と、
   （ｇ）前記工程（ｃ）において、前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する会合体検出工程と、
   （ｈ）前記工程（ｃ）において、前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する粒子計数工程と、を有し、
   前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域を検出し、前記検出された有意な信号が存在する時間領域における光強度の時間変化に対する釣鐘状関数のフィッティングによって、前記検出された有意な信号が存在する時間領域に於ける光強度の時間変化が前記光検出領域内を相対的に移動する単一の発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有すると判定されたとき、前記検出された有意な信号が存在する時間領域における光強度の時間変化を、一つの会合体からの光信号として個別に検出し、
   前記工程（ａ）における試料溶液、又は前記工程（ｂ）の後、前記工程（ｃ）の前の試料溶液が、前記多型配列のうちの前記第１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをさらに含んでいる核酸分子の多型識別方法。
2. 前記第１の核酸プローブが、蛍光物質により標識されている請求項１に記載の核酸分子の多型識別方法。
3. 前記工程（ａ）において、前記試料溶液中に、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれている請求項１又は２に記載の核酸分子の多型識別方法。
4. 前記工程（ａ）において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
   前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、
   前記工程（ｃ）において、前記第１の核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光である請求項２に記載の核酸分子の多型識別方法。
5. 前記第１の核酸プローブは、単独で存在している状態では蛍光エネルギー移動が起こり、かつ他の１本鎖核酸分子と会合体を形成した状態では蛍光エネルギー移動が起こらないように、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とが結合されており、
   当該核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光である請求項２に記載の核酸分子の多型識別方法。
6. 前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
7. 前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
8. 前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの会合体が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
9. 前記試料溶液が、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び尿素からなる群より選択される１種以上を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
10. 前記工程（ｂ）を、前記工程（ａ）において調製された試料溶液の温度を７０℃以上にすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を会合させることにより行う請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
11. 前記第１の核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似物質からなる群より選択される２以上の分子が結合して構成されている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
12. 前記多型配列が、遺伝子多型の多型部位を含む塩基配列、又は体細胞変異の変異部位を含む塩基配列である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
13. 前記体細胞変異がＫ−ｒａｓ遺伝子の変異である請求項１２に記載の核酸分子の多型識別方法。

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