JP6010029B2 - 蛍光粒子の検出方法 - Google Patents
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Description
本願は、2011年8月12日に、日本に出願された特願2011−176699号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ここで、走査分子計数法は、特願2010−044714に於いて提案されている新規な光分析技術である。
(1) 試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、
(a)蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記工程(b)における蛍光粒子の分子数の算出は、
共焦点顕微鏡及び多光子顕微鏡の一方の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の蛍光粒子から放出される光信号を検出して、蛍光粒子を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号の検出及び前記蛍光粒子の検出を、
検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの蛍光粒子に対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの蛍光粒子に対応する信号であると判定することによって、一つの蛍光粒子を検出することにより行う、蛍光粒子の検出方法、
(2) 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、0.1mM〜20mMである前記(1)に記載の蛍光粒子の検出方法、
(3) 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、0.3mM〜10mMである前記(1)に記載の蛍光粒子の検出方法、
(4) 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、0.5mM〜5mMである前記(1)に記載の蛍光粒子の検出方法、
(5) 前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質がヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される1種以上である前記(1)〜(4)のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
(6) 前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを含む前記(1)〜(5)のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
(7) 前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が、前記蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを含む前記(1)〜(6)のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
(8) 前記検出された光から、個々の前記蛍光粒子からの光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程は、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、1つの前記蛍光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される前記(1)〜(7)のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
を提供するものである。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図1Aに模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1Aを参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザ光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNA(Numerical Aperture)にて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1μL〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されている。対物レンズ8から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、前記粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子(実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ)が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図1Bに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1Bに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、1fL〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、1つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るための計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がFIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
そうすると、例えば、図2Aの如く、光検出領域CVが移動する間(図中、時間t0〜t2)において1つの粒子(図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。)の存在する領域を通過する際(t1)には、図2Bに描かれている如く有意な光強度(Em)が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2Bに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出する。これによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。これにより、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行う他は、FCS又はFIDAにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力する。続いてコンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測を開始する。この計測中、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器17は、ミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信する。コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。よって、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BINTIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
そこで、好適には、図4Aに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切るよう、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度(拡散移動速度)よりも速く設定される。これにより、時系列の光強度データにおいて、図4Bに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できる。粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。
(2Wo)2=6D・Δt …(1)
から、以下のように示される。
Δt=(2Wo)2/6D …(2)
従って、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、以下のように示される。
Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo …(3)
そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなる。従って、光検出領域の位置の移動速度は、その略10倍の15mm/sと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理(検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順)により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4Aに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図6Aに模式的に描かれている如く、(光学系により決定される)光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル(通常、略釣鐘状)を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ioが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Io及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体(又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ)から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。その具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体(又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ)の特性によって選択的に決定されてよい。
ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(4)であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(4)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。強度A及び幅aが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図5及び図6Bに例示された処理により為されてよい。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される(ステップ130)。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行わる(図6B下段「釣鐘型関数フィッティング」)。これにより、釣鐘型関数のピーク強度Imax、ピーク幅(半値全幅)w、フィッティングにおける(最小二乗法の)相関係数等のパラメータが算出される(ステップ140)。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される(ステップ150)。かくして、図7左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる(粒子数がカウントアップされる。ステップ160)。一方、図7右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液(参照溶液)について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体(又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ)と同様の発光特性を有する発光標識(蛍光色素等)であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Cの参照溶液について、その粒子の検出数がNであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Vtは、以下の式で与えられる。
Vt=N/C …(5)
また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の粒子の数密度cは、以下の式によって与えられる。
c=n/Vt …(6) なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係(式(5))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、蛍光粒子を、三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の存在下で走査分子計数法によって計数することにより検出する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、pMオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の蛍光粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の蛍光粒子の濃度が非常に低い場合であっても、蛍光粒子を高感度に計数することができる。さらに、本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、走査分子計数法による測定を、三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質(三重項励起状態消光剤)の存在下で行うことにより、蛍光粒子を非常に高感度に検出することができる。
つまり、蛍光発光という点からは、一重項励起状態に励起された分子のうちの一部が三重項励起状態を介して基底状態に戻ることによって無駄が発生している。
(a)蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
また、標的粒子がタンパク質である場合には、蛍光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを蛍光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への蛍光物質の結合は、常法により行うことができる。
熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。
ヨウ化カリウム(KI)が消光作用を有することを、FCS計測により確認した。
<Rhodamine Green(登録商標)の場合>
Rhodamine Green(登録商標)に対してヨウ化カリウム(KI)が消光作用を有することを、FCS計測により確認した。
具体的には、1nM RhodamineGreen(登録商標)(AnaSpec社製)にKIが終濃度で0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、1分子あたりの蛍光強度と三重項励起状態の割合が測定可能な1分子蛍光測定装置MF20(オリンパス株式会社)を使ってFCS計測を行った。FCS計測条件は、励起波長を488nmとし、レーザ強度を1mWとし、計測時間を10秒間とした。測定は各試料について5回行い、その平均と標準偏差を算出した。
Alexa Fluor(登録商標)488に対してヨウ化カリウム(KI)が消光作用を有することを、FCS計測により確認した。
具体的には、RhodamineGreen(登録商標)(AnaSpec社製)に代えてAlexa Fluor(登録商標)488(Invitrogen社製)を用いた以外は、Rhodamine Green(登録商標)の場合と同様にして、KIが終濃度で0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mMとなるように添加したAlexa Fluor(登録商標)488を含む試料溶液に対してFCS計測を行った。
これらの結果から、KIが様々な蛍光物質に対して消光作用を有しており、蛍光輝度の向上効果があることが確認できた。
システアミンが消光作用を有することを、FCS計測により確認した。
<Alexa Fluor(登録商標)488の場合>
Alexa Fluor(登録商標)488に対してシステアミンが消光作用を有することを、FCS計測により確認した。
具体的には、1nM Alexa Fluor(登録商標)488(Invitrogen社製)にシステアミン(Sigma社製)が終濃度で0mM、0.3mM、3mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、1分子蛍光測定装置MF20(オリンパス株式会社)を使ってFCS計測を行った。FCS計測条件は、励起波長を488nmとし、レーザ強度を1mWとし、計測時間を10秒間とした。測定は各試料について5回行い、その平均を算出した。
TAMRA(登録商標)に対してシステアミンが消光作用を有することを、FCS計測により確認した。
具体的には、1nM TAMRA(登録商標)(AnaSpec社製)にシステアミン(Sigma社製)が終濃度で0mM、0.3mM、3mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、1分子蛍光測定装置MF20(オリンパス株式会社)を使ってFCS計測を行った。FCS計測条件は、励起波長を543nmとし、レーザ強度を0.5mWとし、計測時間を10秒間とした。測定は各試料について5回行い、その平均を算出した。
これらの結果から、システアミンが様々な蛍光物質に対して消光作用を有しており、蛍光輝度の向上効果があることが確認できた。
三重項励起状態消光剤としてKIを用いて、走査分子計数法により蛍光粒子を検出した。
まず、10pM Alexa Fluor(登録商標)488(Invitrogen社製)にKIが終濃度で0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF20(オリンパス株式会社)を用いて走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、488nmのレーザ光を用いて1mWで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて510nm〜560nmとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、15mm/秒とし、BIN TIMEを10μ秒とし、測定時間は2秒間とした。また、測定は各試料について5回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は9個とし、移動平均処理を5回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、(ガウス関数に於ける)ピーク強度、ピーク幅(半値全幅)、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
20μ秒<ピーク幅<400μ秒、
ピーク強度>1(フォトン/10μ秒)、
相関係数>0.95、
を満たすピーク信号のみを観測対象分子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
これらの結果から、走査分子計数法による蛍光粒子の計数をKI存在下で行うことによって、蛍光粒子の検出能が向上し、より高感度に蛍光粒子を検出できることが明らかである。
三重項励起状態消光剤としてシステアミンを用いて、走査分子計数法により蛍光粒子を検出した。
<Alexa Fluor(登録商標)488の場合>
まず、10pM Alexa Fluor(登録商標)488(Invitrogen社製)にシステアミン(Sigma社製)が終濃度で0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について実施例1と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
図13は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、システアミン濃度が0.3mM〜3mMでは、システアミンの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったシステアミン濃度が3mMの試料溶液では、システアミン無添加の試料溶液と比較して、20%以上増加していた。
まず、10pM TAMRA(登録商標)(AnaSpec社製)にシステアミン(Sigma社製)が終濃度で0mM、0.1mM、0.3mM、3mM、10mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、励起光は、543nmのレーザ光を用いて0.5mWで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて560nm〜620nmとした以外は実施例1と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
図14は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、システアミン濃度が0.3mM〜3mMでは、システアミンの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったシステアミン濃度が3mMの試料溶液では、システアミン無添加の試料溶液と比較して、10%以上増加していた。
蛍光粒子の濃度と三重項励起状態消光剤が消光作用を有する濃度との関係を調べた。具体的には、蛍光粒子の濃度が1pMの場合と100pMの場合とにおいて、三重項励起状態消光剤が消光作用を奏する濃度を調べた。
まず、1pM又は100pM Alexa Fluor(登録商標)488(Invitrogen社製)にKIが終濃度で0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mMとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、測定時間を、Alexa Fluor488の濃度が1pMの試料溶液については20秒間とし、100pMの試料溶液については2秒間とした以外は実施例1と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
図15は、Alexa Fluor488の濃度が1pMの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図であり、図16は、Alexa Fluor488の濃度が100pMの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。Alexa Fluor488の濃度が1pMの試料溶液と100pMの試料溶液のいずれにおいても、実施例1(Alexa Fluor488の濃度が10pMの試料溶液の場合)と同様にKIを添加することによって、走査分子計数法による計測時のピーク検出能(蛍光粒子の検出能)が向上した。また、いずれもKI濃度が1mM〜3mMにおいて検出されたピーク数が最大となったことから、KIが消光作用を有する濃度は、蛍光粒子の濃度にさほど影響を受けず、終濃度が0.1mM〜20mMとなるように試料溶液中にKIを添加することにより、より高感度に蛍光粒子を検出できることがわかった。
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
Claims (8)
- 試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、
(a)蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記工程(b)における蛍光粒子の分子数の算出は、
共焦点顕微鏡及び多光子顕微鏡の一方の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号の検出及び前記蛍光粒子の検出を、
検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの蛍光粒子に対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの蛍光粒子に対応する信号であると判定することによって、一つの蛍光粒子を検出することにより行う、
蛍光粒子の検出方法。 - 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、0.1mM〜20mMである請求項1に記載の蛍光粒子の検出方法。
- 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、0.3mM〜10mMである請求項1に記載の蛍光粒子の検出方法。
- 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、0.5mM〜5mMである請求項1に記載の蛍光粒子の検出方法。
- 前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質がヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される1種以上である請求項1〜4のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを含む請求項1〜5のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が、前記蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを含む請求項1〜6のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
- 前記検出された光から、個々の前記蛍光粒子からの光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程は、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、1つの前記蛍光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを含む請求項1〜7のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
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