CN103718023B - 荧光粒子的检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种荧光粒子的检测方法，其包括：调制包含荧光粒子和促进前述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质的试样溶液；以及计数调制的试样溶液中存在的荧光粒子的分子数。计数前述荧光粒子的分子数包括如下工序：使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置；一边在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由前述光检测区域中的前述荧光粒子发出的光信号，逐个检测前述荧光粒子；和将前述逐个检测到的荧光粒子的个数进行计数而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述荧光粒子的个数的工序。

Description

荧光粒子的检测方法
技术领域
本发明涉及使用共聚焦显微镜、或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学体统而检测荧光粒子的方法。
本申请基于2011年8月12日在日本提交的日本特愿2011-176699号主张优先权，本文援引其内容。
背景技术
随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测技术，进行生物分子等分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的各种装置或方法。例如，荧光相关分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如，参见专利文献1、2、非专利文献1～3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，对于进出试样溶液中的微小区域内的荧光分子或被荧光标记的分子所发出的荧光强度进行测定。由该测定的荧光强度的自相关函数的值确定微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子个数的平均值。基于微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间以及滞留的分子个数的平均值，实现取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度这类信息，或者检测到分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。需要说明的是，前述微小区域是指显微镜的激光束被聚光的焦点区域，被称为共焦体积。另外，荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如，专利文献3)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如，专利文献4)，与FCS同样地，生成检测到的出入共焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图。通过对该直方图的分布拟合统计学模型式，算出荧光分子等固有的明亮度的平均值和共焦体积内滞留的分子个数的平均值。根据上述信息，推测分子结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献5、6中提出了：基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献7中提出了一种信号运算处理技术，其用于：使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上存在的荧光粒子。
特别是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十μL左右),测定时间也大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。因此，特别在对于医学和生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待能够成为低廉或迅速地进行实验或检测的强有力的工具。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-098876号公报
专利文献2：日本特开2008-292371号公报
专利文献3：日本专利第4023523号公报
专利文献4：国际公开第08/080417号公报
专利文献5：日本特开2007-20565号公报
专利文献6：日本特开2008-116440号公报
专利文献7：日本特开平4-337446号公报
非专利文献
非专利文献1：金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431～1438页。
非专利文献2：Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、第204～224页。
非专利文献3：加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6卷、第2号、第271～277页。
发明内容
发明要解决的问题
上述FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理计算所测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在试样溶液中的微小区域内出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述的光分析技术中得到有意义的结果，作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度优选调整成在平衡状态下在秒数量级长度的一次检测时间内有能够统计学处理的个数的荧光分子等出入微小区域内。作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度优选调制成在平衡状态下、在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等。典型地，共焦体积的体积成为1fL左右，所以，荧光分子等的浓度优选为1nM左右或其以上。换言之，试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度大幅低于能够统计学处理的程度时，例如，大幅地低于1nM时，产生检测时间内只有稀少的观测对象物进入微小区域内的状态，荧光强度的检测结果中长期包括着观测对象物在微小区域内完全不存在的状态。并且，显著的荧光强度的观测量变少，通过如上述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术难以获得有意义的或精度良好的分析结果。
专利文献5、6中所述的、使用共聚焦显微镜的光学系统的荧光性物质的检测方法中公开有：不进行如上述的涉及荧光强度波动的统计学处理，根据数秒的测量时间内有无显著强度的荧光信号的产生，判断试样中的观测对象的荧光分子等的有无，而得到显著强度的荧光信号的频率与试样中的荧光分子等的粒子数的相关性。特别是在专利文献6中，提出了产生搅拌试样溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，即便这些方法，也只停留在检测通过扩散或随机的流动概率地进入微小区域内的荧光分子等的存在，不能把握微小区域内的荧光分子等的粒子行为，并没有实现例如：粒子的计数、定量地算出粒子的浓度或数密度。另外，专利文献7中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒的存在的技术。专利文献7中记载的技术不是用于检测试样溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等粒子，即，不是用于对于在试样溶液中随机运动的粒子进行检测的技术。因此，并没有实现定量地算出在试样溶液中溶解或分散的粒子的浓度或数密度。另外,专利文献7的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上的固定化处理的过程，因此可以认为,检测所需要的试样量远大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技术的情况,并且对实施者要求复杂的高难度的操作技术。
从而，本发明的方式不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技术中实行的统计学处理。因此，目的在于提供通过对于观测对象粒子的浓度或数密度低于这些光分析技术中处理水平的试样溶液中的观测对象粒子的状态或特性能够进行检测的新型的光分析技术，更灵敏地检测荧光粒子的方法。
用于解决问题的方案
为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，检测试样溶液中分散并随机地运动的荧光粒子的情况下，通过使用扫描分子计数法进行荧光粒子的检测，即便在试样溶液中的观测对象的粒子的浓度非常低的情况下也能够灵敏度良好地检测荧光粒子；进而，通过在三重激发态猝灭剂的存在下进行利用扫描分子计数法的检测，能够更高灵敏度地检测荧光粒子。
此处，扫描分子计数法是日本特愿2010-044714中提出的新型光分析技术。
即，本发明的一方式提供：
(1)一种在试样溶液中分散并随机运动的荧光粒子的检测方法，其包括：
(a)调制包含荧光粒子和促进前述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质的试样溶液的工序；和
(b)算出前述工序(a)中调制的试样溶液中存在的荧光粒子的分子数的工序，
前述工序(b)中的荧光粒子的分子数的计算包括：
使用共聚焦显微镜或多光子显微镜光学系统，在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的工序；
在前述试样溶液内移动前述光检测区域的位置的同时，通过检测由前述光检测区域中存在的前述荧光粒子发出的光信号，逐个检测前述荧光粒子的工序；和
通过将前述逐个检测到的荧光粒子的个数进行计数而计数前述光检测区域的位置的移动期间检测到的前述荧光粒子的个数的工序。
(2)根据前述(1)所述的荧光粒子的检测方法，前述试样溶液中的前述促进由三重激发态向单重基态跃迁的物质的浓度为0.1mM～20mM。
(3)根据前述(1)所述的荧光粒子的检测方法，前述试样溶液中的前述促进由三重激发态向单重基态跃迁的物质的浓度为0.3mM～10mM。
(4)根据前述(1)所述的荧光粒子的检测方法，前述试样溶液中的前述促进由三重激发态向单重基态跃迁的物质的浓度为0.5mM～5mM。
(5)根据前述(1)～(4)的任一项所述的荧光粒子的检测方法，前述促进由三重激发态向单重基态跃迁的物质为选自碘化钾和半胱胺的一种以上。
(6)根据前述(1)～(5)的任一项所述的荧光粒子的检测方法，前述移动光检测区域的位置的工序包括以规定的速度移动前述光检测区域的位置。
(7)根据前述(1)～(6)的任一项所述的荧光粒子的检测方法，前述移动光检测区域的位置的工序包括以比前述荧光粒子的扩散移动速度更快的速度移动前述光检测区域的位置。
(8)根据前述(1)～(7)的任一项所述的荧光粒子的检测方法，通过检测来自每个前述荧光粒子的光信号来逐个检测前述荧光粒子的工序包括根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状来检测单个前述荧光粒子向前述光检测区域中的进入。
发明的效果
本发明的荧光粒子的检测方法中应用的扫描分子计数法不实行计算荧光强度波动这样的统计学处理。因此，通过本发明的方式的荧光粒子的检测方法，即便试样中仅极微量地存在作为解析对象的荧光粒子时，也能够检测试样中的前述荧光粒子。进而，本发明的方式的荧光粒子的检测方法中，由于利用扫描分子计数法在三重激发态猝灭剂的存在下进行检测，所以能够非常高灵敏度地检测荧光粒子。
附图说明
图1A是用于扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。
图1B是共焦体积(共聚焦显微镜的观察区域)的示意图。
图1C是改变镜7的方向，在试样溶液内部移动光检测区域的位置的机构的示意图。
图2A是说明基于用于扫描分子计数法的光分析技术的光检测原理的示意图。
图2B是利用用于扫描分子计数法的光分析技术的光检测中测量的光强度的时间变化的示意图。
图3A是观测对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的示意图。
图3B是表示观测对象粒子边进行布朗运动边横穿光检测区域时的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
图4A是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的示意图。
图4B是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
图5是以流程图的形式显示根据扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子的计数的处理次序的图。
图6A是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
图7表示通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例(柱状图)、和将数据平滑化后获得的曲线(虚线)、和峰存在区域中拟合的高斯函数(实线)。图中，带有“噪音”的信号作为由噪音或杂质带来的信号被无视。
图8A是表示参考例1中包含Rhodamine Green(注册商标)的各试样溶液中的荧光分子中的三重激发态的比例的图。
图8B是表示参考例1中包含Rhodamine Green(注册商标)的各试样溶液中的荧光分子的每一分子的明亮度的图。
图9A是表示参考例1中包含Alexa Fluor(注册商标)488的各试样溶液中的荧光分子中的三重激发态的比例的图。
图9B是表示参考例1中包含Alexa Fluor(注册商标)488的各试样溶液中的荧光分子中的三重激发态的比例、以及荧光分子的每一分子的明亮度CPP的图。
图10A是表示参考例2中包含Alexa Fluor(注册商标)488的各试样溶液中的荧光分子中的三重激发态的比例的图。
图10B是表示参考例2中包含Alexa Fluor(注册商标)488的各试样溶液中的荧光分子的每一分子的明亮度的图。
图11A是表示参考例2中包含TAMRA(注册商标)的各试样溶液中的荧光分子中的三重激发态的比例的图。
图11B是表示参考例2中包含TAMRA(注册商标)的各试样溶液中的荧光分子的每一分子的明亮度CPP的图。
图12是表示实施例1中对于包含Alexa Fluor(注册商标)488的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。
图13是表示实施例2中对于包含Alexa Fluor(注册商标)488的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。
图14是表示实施例2中对于包含TAMRA(注册商标)的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。
图15是表示实施例3中对于Alexa Fluor(注册商标)488的浓度为1pM的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。
图16是表示实施例3中对于Alexa Fluor(注册商标)488的浓度为100pM的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。
具体实施方式
首先，对扫描分子计数法进行说明。扫描分子计数法为如下技术：一边通过微小区域扫描试样溶液内，一边当在试样溶液中分散并随机运动的发出光的粒子(以下，称为“发光粒子”。)横穿微小区域内时，检测由微小区域中的发光粒子发出的光。由此，扫描分子计数法能够一个一个逐个检测试样溶液中的发光粒子，获得与发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的相关信息。与FIDA等光分析技术同样地，检测所需的试样可以是微量(例如，数十μL左右)，另外测定时间短。并且与FIDA等光分析技术的情况相比，对于更低浓度或数密度的发光粒子，可以定量检测其浓度或数密度等特性。
需要说明的是，发光粒子是指通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的粒子。本实施方式的荧光粒子的检测方法中，以发光粒子中的荧光粒子作为检测对象。
本实施方式中，共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在共焦显微镜或多光子显微镜中检测到光的微小区域，当由物镜照射照明光时，相当于该照明光聚光的区域。需要说明的是，在共聚焦显微镜中，该区域尤其根据物镜与小孔之间的位置关系确定。
边在试样溶液内移动光检测区域的位置、即通过光检测区域扫描试样溶液内边逐次地进行光的检测。于是，当移动的光检测区域包含了与随机运动的粒子结合或缔合的发光探针时，检测到来自发光探针的光。由此，检测到一个粒子的存在。根据实验的方式，也可以存在如下情况：发光探针与希望检测到的粒子暂时结合后，在光的检测时，从粒子解离。接着，在逐次检测到的光中逐个检测来自发光探针的光信号。由此，一个一个地逐个逐次地检测粒子或与发光探针结合的粒子的存在，能够得到关于粒子在溶液内的状态的各种信息。具体而言，例如，在上述构成中，可以计数逐个检测到的粒子，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的粒子的个数(粒子的计数)。根据该构成，通过组合粒子的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中的粒子的数密度或浓度相关的信息。特别是通过任意手法例如以规定速度移动光检测区域的位置等来确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算粒子的数密度或浓度。当然，并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，也可以计算相对于多个试样溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度之比。另外，扫描分子计数法中，通过采用改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成，光检测区域的移动是迅速的，并且在试样溶液中实质上不产生机械振动、流体力学的作用。因此，作为检测对象的粒子能够不受力学的作用的影响而以稳定的状态进行光的测量(在试样溶液中有振动或流动作用时，有粒子的物理性质变化的可能性。)。并且，由于流通试样溶液这样的构成不是必需的，因此能够用与FCS、FIDA等情况下同样微量(1μL～数十μL左右)的试样溶液进行测量和分析。
在上述的逐个地检测粒子的工序中，由逐次检测到的光信号判定与一个粒子结合的发光探针是否进入光检测区域时，可以根据按照时间顺序检测到的光信号的形状而进行。本实施方式中，典型地，当检测到具有比规定阈值大的强度的光信号时，能够检测到与一个粒子结合的发光探针进入了光检测区域。需要说明的是，本实施方式中，与一个粒子结合的发光探针包括：一个发光探针与一个粒子结合的情况；多个发光探针与一个粒子结合的情况；以及根据实验方式的、与一个粒子结合之后从粒子解离的发光探针的情况。
此外，在上述移动光检测区域的位置的工序中，可以根据与粒子结合的发光探针的特性或试样溶液中的数密度或浓度，适当改变试样溶液内部的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解，由与粒子结合的发光探针所检测到的光的形态，可能会根据其特性或试样溶液中的数密度或浓度而改变。特别是，光检测区域的移动速度过快时，由与一个粒子结合的发光探针得到的光量降低，所以为了精度良好或灵敏度良好地测量来自与一个粒子结合的发光探针的光，优选适当地改变光检测区域的移动速度。
进一步，在上述移动光检测区域的位置的工序中，适当的是将试样溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合的发光探针的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)。如上述说明，通过扫描分子计数法，当光检测区域通过存在有与一个粒子结合的发光探针的位置时，检测由该发光探针发出的光而逐个检测发光探针。然而，当与粒子结合的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，多次检测到来自一个发光探针的(表示希望检测的粒子存在)光信号，难以将检测到的光信号与一个希望检测的粒子的存在对应起来。因此，如上述，将光检测区域的移动速度设定为高于与粒子结合的发光探针的扩散移动速度，由此，能够使与一个粒子结合的发光探针对应于一个(表示粒子的存在的)光信号。本实施方式中，具体而言，将光检测区域的移动速度设定为快于作为检测对象的荧光粒子的扩散移动速度。需要说明的是，扩散移动速度随着与粒子结合的发光探针而改变，所以优选如上述那样根据与粒子结合的发光探针的特性(特别是扩散常数)适当改变光检测区域的移动速度。
可以以任意方式，进行用于移动光检测区域的位置的光学系统的光路改变。
例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中采用的检流计镜改变光路，使光检测区域的位置发生变化。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，也可以选自例如圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。
扫描分子计数法中，其光检测机理自身与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成，所以试样溶液的量同样地可以是微量的。然而，扫描分子计数法中，不实施计算荧光强度的波动这样的统计学处理，所以扫描分子计数法的光分析技术可以适用于粒子的数密度或浓度比FIDA等光分析技术所需要的水平大幅地低的试样溶液。
另外，扫描分子计数法中，在溶液中分散或溶解的每个粒子被逐个检测出。因此，使用该信息，可以定量地进行粒子的计数、试样溶液中的粒子的浓度或数密度的计算、或者取得与浓度或数密度相关的信息。即，通过扫描分子计数法，使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应，一个一个地检测出粒子，所以能够进行溶液中分散并随机运动的粒子的计数。因此，通过扫描分子计数法，与以前相比，能够精度良好地确定试样溶液中的粒子的浓度或数密度。实际上，根据逐个检测荧光粒子并计数其数目而确定粒子浓度的本实施方式的荧光粒子的检测方法，即使试样溶液中的荧光粒子的浓度是比基于通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也能够检测目标粒子。
进一步，利用改变光学系统的光路、利用光检测区域扫描试样溶液中的方式，在不对试样溶液产生机械振动或流体力学作用、试样溶液内部均匀的状态或试样溶液机械上稳定的状态下进行观察。因此，例如，与试样中发生流动的情况相比较，定量检测结果的可靠性提高，另外，对于试样溶液中的成为检测对象的粒子，能够在没有力学作用的影响下或没有人为影响的状态下进行测量。需要说明的是，对于试样引起流动时通常难以引起均匀的流速，并且装置结构复杂化。另外，需要的试样量大幅地增大。进而，由流动导致的流体力学的作用，溶液中的粒子、发光探针或结合体或者其他的物质存在变质或变性的可能性。
＜用于扫描分子计数法的光分析装置的构成＞
可以通过在基本的构成中如图1A中示意性的示例那样组合能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器而构成的光分析装置实施扫描分子计数法。参照图1A，光分析装置1是由光学系统2～17、和用于控制光学系统的各部分的行为并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装置1的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统同样，此处，自光源2放射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的NA(Numerical Aperture)规定的角度放射为发散的光，通过准直仪4成为平行光，在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，典型地配置有分注了1μL～数十μL的试样溶液的试样容器或排列有孔10的微孔板9。自物镜8射出的激光在试样容器或孔10内的试样溶液中聚集为焦点，形成光强度强的区域(激发区域)。试样溶液中，分散或溶解有作为观测对象物的粒子、与前述粒子结合的发光探针、带有发光标记（典型地为荧光色素等）的分子。与发光探针结合或缔合的粒子(根据实验的方式，与粒子暂时结合后从粒子解离的发光探针)进入激发区域时，发光探针就在其间被激发而发出光。发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜11处反射，在聚光镜12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14(此处，只选择特定的波长范围的光成分。)被导入至多模光纤15而到达光检测器16，转换成按照时间顺序的电信号之后，输入至计算机18，按照后面说明的方式实施用于光分析的处理。需要说明的是，如本领域技术人员所知，在上述的构成中，小孔13配置于与物镜8的焦点位置共轭的位置上。由此，仅自图1B中示意地所示的激光的焦点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被挡住。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的实际体积的、位于本光分析装置中的光检测区域(典型地，光强度呈现以区域的中心为顶点的高斯型分布或洛伦兹型分布。实际体积是以光强度为1/e2的面为界面的略椭球体的体积。)，被称为共焦体积。另外，扫描分子计数法中，检测到来自一个粒子与发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数个荧光色素分子的微弱光，所以光检测器16优选使用能够用于光子计数的超高灵敏度的光检测器。此外，为了改变欲进行观察的孔10，在显微镜的平台(没有图示)上可以设有用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过所述的构成，即使被检体为多个，也能够实现快速的测量。
进一步，上述的光分析装置的光学系统中，设置有改变光学系统的光路、通过光检测区域扫描试样溶液内部的、即用于在试样溶液内移动焦点区域(即，光检测区域)的位置的机构。该用于移动光检测区域的位置的机构，例如如图1C示意性示例的，也可以采用改变反射镜7的方向的镜转向器17。所述的镜转向器17也可以与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同。另外，为了实现预期的光检测区域的位置移动模式，镜转向器17是在计算机18的控制下，与通过光检测器16的光检测协调而被驱动的。光检测区域的位置的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合(可以从计算机18的程序中的各种移动模式中选择。)。需要说明的是，图中没有显示但也可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置沿上下方向移动。如上所述，若利用的是不移动试样溶液而是改变光学系统的光路从而移动光检测区域的位置的构成，试样溶液内实质上不发生机械振动或流体力学的作用，能够排除对于观测对象物的力学作用的影响，能够实现稳定的测量。
当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光检测区域)中发出光，所以可以去除小孔13。此外，当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学系统2～5。当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。另外，在光分析装置1中，可以如图1A所示那样设置多个激发光源2，可以根据用于将粒子与发光探针的结合体或发光探针激发的光的波长，选择适当的激发光的波长。同样地，可以具备多个光检测器16，当试样中包含波长不同的多种粒子与发光探针的结合体或发光探针时，可以根据波长分别检测来自它们的光。
＜扫描分子计数法的光分析技术的原理＞
FIDA等分光分析技术与以前的生物化学分析技术相比，其优点是必需的试样量非常少，并且可以快速实施检查。然而，在FIDA等分光分析技术中，原理上根据荧光强度波动计算观测对象粒子的浓度或特性。为了获得精度良好的检测结果，要求试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度是如下水平：在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的观测对象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度(光子计数)。如果当观测对象粒子的浓度或数密度低于上述时，例如，当观测对象粒子只是偶尔进入光检测区域CV内的水平时，仅在一部分测量时间内出现显著的光强度(光子计数)，因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在观测对象粒子的浓度大幅地低于测量中通常在光检测区域内存在一个左右的观测对象粒子的水平时，光强度波动的运算易受背景的影响，用于获得对运算而言为充分量的显著的光强度数据的测量时间延长。与此相对，即使当观测对象粒子的浓度低于FIDA等分光分析技术要求的水平时，用扫描分子计数法也能够检测观测对象粒子的数密度或浓度等特性。
扫描分子计数法的光分析技术中，作为实行的处理，直接了当地说，驱动用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)而改变光路，如图2A中示意地描述，一边在试样溶液内移动光检测区域CV的位置即利用光检测区域CV扫描试样溶液内，一边实施光检测。
如此一来，例如，如图2A所示，在光检测区域CV移动期间(图中，时间t0～t2)，当通过存在有1个粒子(图中，发光探针结合有荧光色素)的区域时(t1)，检测到如图2B所述的显著的光强度(Em)。如此，实行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，通过一个一个地检测在此期间出现的如图2B所例示的显著的光强度。由此，逐个检测出与发光探针结合的粒子，通过将其个数进行计数，能够得到与存在于所测量的区域内的粒子的个数或者浓度或数密度相关的信息。所述扫描分子计数法的光分析技术的原理中，粒子一个一个地被检测出且不进行如荧光强度波动的计算这类统计学运算处理。由此，可以认为即便是欲观测粒子浓度低至无法用FIDA等以充分精度分析程度的试样溶液，也能够得到关于粒子的浓度或数密度的信息。
另外，通过扫描分子计数法这类逐个检测、计数试样溶液中的粒子的方法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的粒子的浓度时相比，能够测定至更低的浓度。当通过荧光分光光度计或酶标仪来检测某被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例。然而，该情况下，被荧光标记的粒子的浓度充分地降低时，噪音信号的量相对于由被荧光标记的粒子发出的光的信号量变大(S/N比恶化)，被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解。结果，确定的浓度值的精度变得恶化。另一方面，扫描分子计数法在由被检测的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，从检测结果中排除了噪音信号，只将对应于各个粒子的信号进行计数而计算浓度。由此，与通过假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更低的浓度。
进而还有，当一个观测对象粒子结合有多个发光探针时，与传统的假定荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而确定浓度的方法相比，扫描分子计数法这类对试样溶液中的粒子逐个检测、计数的方法的情况下，粒子浓度高一侧的粒子浓度的测量精度提高。在一个观测对象粒子结合有多个发光探针的情况下，向试样溶液添加某一量的发光探针时，观测对象粒子的浓度升高时，相对而言与粒子结合的发光探针的个数降低。在此情况下，由于每一个观测对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，每个粒子的荧光强度的降低的影响少，由粒子数计算浓度。因此，与通过假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更高的浓度。
＜通过扫描分子计数法的试样溶液的光强度的测定＞
就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动镜转向器17，在试样溶液内移动光检测区域的位置(试样溶液内部的扫描)以外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测工序相同的方式实施光强度检测。在操作处理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入试样溶液而载置于显微镜的平台上之后，使用者对计算机18输入测定开始的指示。接着，计算机18根据存储装置(没有图示)存储的程序(将用于在试样溶液内移动光检测区域的位置的光路进行改变的次序、和在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的次序)，开始试样溶液内光检测区域中的激发光的照射以及光强度的测量。该测量中，在根据计算机18的程序的处理操作的控制下，镜偏向器17驱动镜7(检电镜)，在孔10内进行光检测区域的位置的移动。与此同时，光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18。计算机18以任意方式由送达的光信号生成按照时间顺序的光强度数据并保存。需要说明的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器。由此，光的检测是以如下方式进行的光子计数：在规定时间内，间隔规定的单位时间(BINTIME)如每10μ秒逐次地测量到达光检测器的光子的个数，按照时间顺序的光强度的数据可以为按照时间顺序的光子计数数据。
光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意的，可以为按照适合例如实验或分析目的的方式设定的规定速度。当根据所检测到的观测对象粒子的个数获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或体积是必需的。因此，以移动距离受掌握的方式进行光检测区域的位置移动。需要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系的方式，能够容易地解释测定结果，因此，移动速度基本上优选为恒定速度，但并非仅限于此。
此外，为了由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测观测对象粒子，或以良好的精度定量实施观测对象粒子数的计数，优选将光检测区域的位置的移动速度设定为比观测对象粒子(更严密地，粒子与发光探针的结合体或者与粒子结合后分解而游离的发光探针、本实施方式中为荧光粒子)的随机运动即布朗运动导致的移动速度更快的值。扫描分子计数法的光分析技术的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机运动的粒子，由于布朗运动，位置伴随着时间而移动。因此，光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动导致的移动慢时，如图3A示意地描述，粒子在区域内随机地移动。由此，光强度如图3B所示随机地变化(如已知，光检测区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。)，难以确定对应于各个观测对象粒子的显著的光强度的变化。
此处，将光检测区域的位置的移动速度优选设定为快于粒子的布朗运动导致的平均的移动速度(扩散移动速度)，从而如图4A所示使粒子略直线地横穿光检测区域。因此，按照时间顺序的光强度数据中，如图4B例示，对应于各个粒子的光强度变化的分布图大致一致，能够容易地确定各个观测对象粒子与光强度的对应。粒子略直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的曲线与激发光强度分布几乎相同。
具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的观测对象粒子(更严密的是，粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解、游离的发光探针)通过半径Wo的光检测区域(共焦体积)时所需的时间Δt是由均方位移的关系式如下所示。
(2Wo)2＝6D·Δt…(1)
根据
Δt＝(2Wo)2/6D…(2)
观测对象粒子通过布朗运动移动的速度(扩散移动速度)Vdif大约如下所示。
Vdif＝2Wo/Δt＝3D/Wo…(3)
此处，光检测区域的位置的移动速度可以参考前述Vdif而设定为比之更快的值。例如，假定观测对象粒子的扩散系数为D＝2.0×10-10m2/s左右的情况下，当设定Wo为0.62μm左右时，则Vdif为1.0×10-3m/s。因此，光检测区域的位置的移动速度设定为其大约10倍的15mm/s即可。此外，当观测对象粒子的扩散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化曲线成为预期曲线(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件，可以重复进行预备实验，确定适当的光检测区域的位置的移动速度。
＜通过扫描分子计数法的光强度的分析＞
经上述处理获得试样溶液的按照时间顺序的光强度数据时，可以在计算机18中，根据存储在存储装置中的程序进行处理(由检测到的光逐个检测来自各个发光粒子的光信号的次序)，由此实施如下所述的光强度的分析。
(i)一个观测对象粒子的检测
在按照时间顺序的光强度数据中，当一个观测对象粒子通过光检测区域时的轨迹是如图4A所示几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图6A示意性地描述，具有反映(由光学系统确定的)光检测区域的光强度分布的曲线(通常略呈钟形)。因此，观测对象粒子的检测的手法之一中，对于光强度设定阈值Io，超过该阈值的光强度持续的时间宽度Δτ在规定的范围时，判定为该光强度的分布图与一个粒子通过光检测区域相对应，可以视为检测到一个观测对象粒子。针对光强度的阈值Io以及针对时间宽度Δτ的规定的范围是根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后再分解而游离的发光探针)所发出的光的强度而预想的曲线确定的；所述观测对象粒子相对于光检测区域以规定的速度相对地移动。其具体的值可以根据实验任意地设定，也可以根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后分解而游离的发光探针)的特性而选择确定。
此外，作为观测对象粒子的检测的其他方法，光检测区域的光强度分布假定为高斯分布：
I＝A·exp(-2t2/a2)…(4)时，对显著的光强度曲线(可以明确判断为非背景的曲线)，根据式(4)拟合计算的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度曲线可判断为对应一个观测对象粒子通过了光检测区域，可以视为检测到一个观测对象粒子。当强度A和宽度a落在规定范围之外时，可以在分析中作为噪音或异物而无视。
(ii)观测对象粒子的计数
观测对象粒子的计数可以如下进行：通过任意方法计数通过上述观测对象粒子的检测方法检测到的粒子的个数。然而，当粒子的个数较多时，也可以通过例如图5和图6B所示例的处理来进行。
参照图5和图6B，根据按照时间顺序的光强度(光子计数)数据计数粒子数的方法的一个例子为上述说明的光强度的测定。即，用光检测区域扫描试样溶液内和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据(光子计数数据)后(步骤100)。对该按照时间顺序的光信号数据(图6B最上部分“检测结果(未处理)”)，进行SMOOTHING(平滑化)处理(步骤110，图6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率地发出的，所以在微小的时间内存在数据值的欠缺。因此，通过所述平滑化处理，可以无视如前述的数据值的欠缺。平滑化处理可以例如通过移动平均法而进行。需要说明的是，可以根据获得光信号数据时的光检测区域的位置移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当设定实施平滑化处理时的参数，例如，在移动平均法中一次取平均的数据点数或移动平均的次数等。
然后，为了检测在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中存在显著信号的时间区域(峰存在区域)，对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据对时间进行一阶微分值运算(步骤120)。按照时间顺序的光信号数据的时间微分值，如图6B中下部分的“时间微分”所示，信号值变化时间点处的值的变化变大，因此通过参考所述时间微分值可以有利地确定显著的信号(峰信号)的起点和终点。
之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号(峰信号)，判断检测到的峰信号是否是与观测对象粒子相对应的信号。
具体而言，首先，在按照时间顺序的光信号数据的按照时间顺序的时间微分值数据基础上，逐次地参照时间微分值，搜索、确定一个峰信号的始点和终点，从而确定峰存在区域(步骤130)。一旦确定了一个峰存在区域，就对该峰存在区域中的平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟合(图6B下部分的“钟形函数拟合”)。由此，计算钟形函数的峰强度Imax、峰宽度(半高全宽(full width half maximum))w、拟合中的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数，也可以是洛伦兹型函数。由此，判断计算的钟形函数的参数是否落在一个粒子与发光探针的结合体或发光探针通过光检测区域时检测到的光信号所描述的钟形曲线参数的规定范围内，即，峰强度、峰宽度、相关系数是否分别落在规定范围内等(步骤150)。这样，如图7左侧所示，计算的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或者与发光探针对应的光信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个观测对象粒子对应的信号。由此，判断为检测到一个观测对象粒子，计数为一个粒子(粒子数的计数增加。工序160)。另一方面，如图7右侧所示，将计算的钟形函数的参数没有在预定范围内的峰信号作为噪音而无视。
上述的步骤130～160的处理中的峰信号的搜索和判定可以在按照时间顺序的光信号数据的整个领域内重复地进行，每检测到一个观测对象粒子，则作为粒子而计数。因此，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰信号搜索后(步骤170)，将所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号数据中检测到的观测对象粒子的个数。
(iii)观测对象粒子的数密度或浓度的确定
进行了观测对象粒子的计数后，使用在获得按照时间顺序的光信号数据的过程中光检测区域所通过的区域的总体积，确定观测对象粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的开口数、光学系统的调整状态而改变，所以由设计值计算通常是困难的。因此，计算光检测区域所通过的区域的总体积也不简单。在本文中，典型的是，可以在与所要检查的试样溶液的测定相同的条件下，对已知粒子浓度的溶液(参照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数，根据检测到的粒子的个数和参照溶液的粒子的浓度，确定光检测区域所通过的区域的总体积，即确定观测对象粒子的检测数和浓度之间的关系。
作为参照溶液的粒子，可以优选为与观测对象粒子所形成的粒子和发光探针的结合体(或与观测对象粒子结合后再游离的发光探针)具有相同发光特性的发光标记(荧光色素等)。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶液，其粒子的检测数为N时，光检测区域所通过的区域总体积Vt则根据以下的式子求出。
Vt＝N/C…(5)
另外，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将计算的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt而采用即可。因此，一旦获得Vt值，粒子的计数结果为n的试样溶液的粒子的数密度c就根据以下的式子求出。
c＝n/Vt…(6)，需要说明的是，可以不通过上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积。此外，本实施方式的光分析装置也可以如下构成，对于规定的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子的个数N之间的关系(式(5))的信息预先存储在计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施光分析时可以适当利用存储的关系信息。
＜荧光粒子的检测方法＞
本实施方式的荧光粒子的检测方法为检测试样溶液中分散并随机运动的荧光粒子的方法，在促进荧光粒子由三重激发态向单重基态跃迁的物质的存在下，通过扫描分子计数法对荧光粒子进行计数而检测。扫描分子计数法为能够在分子离散的状况下测定每一粒发光粒子的测定方法，所以对于pM级以下的浓度比较低的发光粒子也能够进行测定。因此，通过本实施方式的荧光粒子的检测方法，即使当试样溶液中的解析对象的目标粒子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数荧光粒子。进而，本实施方式的荧光粒子的检测方法在促进由三重激发态向单重基态跃迁的物质(三重激发态猝灭剂)的存在下进行通过扫描分子计数法的测定，由此能够非常高灵敏度地检测荧光粒子。
对处于基态的分子照射光时，成为单重激发状态，之后再恢复至基态。由单重激发状态恢复至基态的路径有2个。一个为：由单重激发状态直接恢复至基态的路径，此时发出的光为荧光。剩下的一个为：由单重激发状态通过三重激发态恢复至基态的路径，通过前述路径恢复至基态的分子不能发出荧光。已知，荧光的寿命在多个分子中为纳秒数量级。另一方面，由单重激发状态通过三重激发态恢复至基态的(不产生荧光)路径通常需要微秒数量级以上。
即，从荧光发光的观点出发，被激发至单重激发状态的分子中的一部分通过三重激发态恢复至基态，由此产生浪费。
本实施方式中，根据单重激发状态的寿命和三重激发态的寿命的长度不同，相比于与单重激发状态的分子，三重激发态猝灭剂与三重激发态的分子更高频地碰撞而使荧光亮度提高。具体而言，通过在三重激发态猝灭剂的存在下进行利用扫描分子计数法的测定，试样溶液中的处于三重激发态的荧光粒子通过三重激发态猝灭剂恢复至基态。恢复至基态的荧光粒子通过光照射再次被激发成单重激发状态。即，通过迅速地消除不产生荧光的三重激发态而提高荧光亮度，结果能够更高灵敏度地检测荧光粒子。
作为本实施方式中使用的三重激发态猝灭剂，只要是具有使处于三重激发态的分子恢复至基态作用的物质，就没有特别地限定。作为三重激发态猝灭剂，可以考虑荧光粒子的种类、激发光的波长、荧光的波长等从公知的三重激发态猝灭剂中适宜选择而使用。作为三重激发态猝灭剂，可列举出例如：碘化钾(Potassium Iodide、KI)、半胱胺(2-aminoethanethiol)、环辛四烯(Cyclo-octatetraene)等。本实施方式中，优选使用碘化钾或半胱胺。需要说明的是，三重激发态猝灭剂可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。
例如，荧光粒子的检测中，检测荧光波长包含510nm～560nm至少一部分的情况下，优选使用选自碘化钾和半胱胺的一种以上作为三重激发态猝灭剂。在荧光粒子的检测中，检测荧光波长包含510nm～620nm的至少一部分的情况下，优选使用半胱胺作为三重激发态猝灭剂。作为荧光波长包含510nm～560nm的至少一部分的荧光粒子，可列举出例如：Rhodamine Green(注册商标)、Alexa Fluor(注册商标)488、fluorescein、FITC、5-carboxyfluorescein(5-FAM)、Cy2(注册商标)等荧光物质、以及结合有这些荧光物质的粒子等。作为荧光波长包含560nm～620nm的至少一部分的荧光粒子，可以列举例如TAMRA(注册商标)、Rhodamine、Cy3(注册商标)、Alexa Fluor(注册商标)546、Alexa Fluor(注册商标)555等荧光物质、以及结合有这些荧光物质的粒子等。
具体而言，本实施方式的目标粒子的定量方法具有下述工序(a)～(b)。
(a)调制包含荧光粒子和促进前述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质的试样溶液的工序；
(b)算出前述工序(a)中调制的试样溶液中存在的荧光粒子的分子数的工序
以下，对于每个工序进行说明。
本实施方式中，“在试样溶液中分散并随机运动的粒子”是指在试样溶液中分散或溶解的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的或不发光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。
作为本实施方式的荧光粒子的检测方法的检测对象的荧光粒子，只要是通过放射特定波长的光而发出荧光的物质就没有特别地限定，可列举出：荧光色素、量子点等荧光物质等。另外，本实施方式的荧光粒子的检测方法还可以通过使用荧光探针而检测非荧光物质。具体而言，使用如下荧光探针：具有与作为检测对象的目标粒子(非荧光物质)特异地或非特异地结合或吸附的部位，并且在与目标粒子结合的状态下发出荧光。向包含目标粒子的试样溶液中添加荧光探针而使两者结合。与形成的目标粒子结合的荧光探针为荧光粒子，能够通过本实施方式的荧光粒子的检测方法进行检测。
目标粒子为试样溶液中分散并随机运动的粒子，可列举出例如：蛋白质、肽、核酸、核酸类似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物或非生物学的粒子(例如：原子、分子、胶束、金属胶体等)等。核酸可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增的核酸。核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言，可列举出例如：桥式核酸(BNA,Bridged nucleicacid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置换的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA,Hexitol Nucleic Acid)、肽核酸(PNA)等。
另外，作为用于与目标粒子结合的荧光探针，优选为在与目标粒子结合的状态和单独存在的状态下发出的光的发光特性不同的物质。在与目标粒子结合的状态以及单独存在的状态下荧光探针的发光特性不同是指：在与目标粒子结合的状态以及单独存在的状态下，特定的波长的光强度不同。使荧光探针单独存在的状态以及与目标粒子结合的状态下特定波长的光的强度不同(例如，使荧光强度不同)，由此能够在扫描分子计数法中区别地检测出两者。
例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，荧光探针可列举出：使与目标粒子杂交的寡核苷酸结合荧光物质等发光物质而成的物质、结合有荧光物质等核酸结合性蛋白质、与核酸结合的荧光色素分子等。作为前述寡核苷酸,可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质。可以为包含部分或全部核酸类似物质的物质；所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。
另外，目标粒子为蛋白质的情况下，作为荧光探针，可以使用将目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体用荧光物质标记了的物质。需要说明的是，荧光物质与核酸、蛋白质等目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质的结合可以通过常规方法进行。
与目标粒子结合的荧光探针也可以为与目标粒子非特异地结合等的物质，从目标粒子的检测、定量的精度的观点出发，优选特异地结合等的物质。需要说明的是，作为与目标粒子特异地结合的荧光探针，只要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒子结合的物质即可，不需要与除了目标粒子以外的物质完全地不结合的物质。例如，目标粒子为核酸的情况下，被作为荧光探针使用的荧光物质标记的寡核苷酸既可以具有与前述目标粒子的碱基序列完全地互补的碱基序列，也可以具有与前述目标粒子的碱基序列包含错配的碱基序列。
目标粒子为蛋白质的情况下，与蛋白质结合且改变周围环境时荧光强度、荧光波长变化的色素(例如，疏水性探针ANS、MANS、TNS这类的荧光色素)可以作为荧光探针使用。另外，荧光探针自身也可以不发光。例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，使用与前述目标粒子杂交的寡核苷酸作为荧光探针，即便在试样溶液中与前述荧光探针一起添加与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，也能够在发光探针单独存在的状态以及在与目标粒子结合的状态下使发光特性不同。作为与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，可列举出荧光性嵌入剂或结合了荧光物质的沟结合剂等。
其他的，可以使用例如：由至少两个构成要素形成的、通过与目标粒子结合而使前述的至少两个构成要素的相互位置变化而发出荧光的物质作为荧光探针。作为这样的物质的例子，可列举出：与某粒子结合时结构变化而发出强的荧光的荧光性蛋白质、或者与某粒子结合时聚集而形成荧光性金属络合物的分子(络合物的配体)。通过所述的构成，在所有情况下，单独的荧光探针或不与目标粒子结合的荧光探针均几乎不发光，或者即便发光也与目标粒子和荧光探针的结合体的波长不同，所以能够选择地检测由目标粒子和荧光探针的结合体发出的光。
另外，通过利用荧光共振能量转移现象(FRET)，能够使试样溶液中单独存在的荧光探针、和与目标粒子结合的状态的荧光探针的发光特性不同。例如，作为发光探针可以使用如下物质：使在FRET中成为能量供体的荧光物质和成为能量受体的物质(荧光物质、猝灭物质)按照在荧光探针单独存在的状态下产生FRET、在与目标粒子结合的状态下不产生FRET的方式在与目标粒子结合的物质上结合而形成的物质。与目标粒子结合后的荧光探针不再产生FRET，所以由成为能量供体的荧光物质发出荧光。另外，从单独存在的荧光探针中，检测不到由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，或检测到的荧光是减弱的。因此，通过检测由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，能够与单独存在的荧光探针区别地检测到与荧光探针结合的目标粒子。
例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以优选使用分子信标探针作为荧光探针；该分子信标探针如下形成：使FRET中成为能量供体的荧光物质和成为能量受体的物质，按照单链核酸分子的状态下产生FRET、与其他单链核酸分子杂交形成缔合体的状态下不产生FRET的方式，在当为单链核酸分子的状态时形成分子内结构体的寡核苷酸上结合。本实施方式中优选的是：3’末端侧结合有成为能量供体的荧光物质或成为能量受体的物质、5’末端侧结合有剩余的另一者并且3’末端侧区域和5’末端侧具有彼此互补的碱基序列，这些碱基序列形成碱基对由此形成分子内结构(所谓的茎-环结构)的物质。需要说明的是，分子信标探针的形成分子内碱基对的彼此互补的区域，可以夹着与目标粒子杂交的区域而存在；3’末端侧的区域和5’末端侧的区域既可以为分别包含3’末端或5’末端的区域，也可以为不包含3’末端或5’末端的区域。此外，就形成碱基对的区域的碱基数或碱基序列而言，为所形成的碱基对的稳定性低于与目标粒子的缔合体的稳定性、且在检测条件下能够形成碱基对的程度即可。
另外，使用与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，即便前述荧光性双链核酸结合物质与标记了荧光探针的荧光物质之间产生FRET，也能够区别单独存在的荧光探针和与目标粒子结合的荧光探针。即，荧光性双链核酸结合物质和标记了荧光探针的荧光物质中的任一者成为FRET的能量供体，另一者成为前述FRET的能量受体。由单独存在的荧光探针，检测到由标记前述荧光探针的荧光物质发出的荧光。与此相对，与目标粒子结合的荧光探针和荧光性双链核酸结合物质结合，所以由结合体能够检测到由FRET发出的荧光，结果能够与单独存在的荧光探针区别而检测。
此外，当进入荧光探针与目标粒子的缔合体的碱基对之间的荧光性嵌入剂的量过多时，检测自FRET发出的荧光时的背景变得过高，存在影响检测精度的担心。因此，优选将发光探针设计成在荧光探针与目标粒子的缔合体中形成双链的区域为400bp以下。
其他的，本实施方式中，也可以使用两种荧光探针。例如，在目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，将两种荧光探针设计成相对于目标粒子相互邻接而杂交，将一种荧光探针用在FRET中成为能量供体的荧光物质标记，将另一种荧光探针用在前述FRET中成为能量受体的物质标记。该情况下，单独存在的荧光探针不产生FRET，而通过与目标粒子结合，前述两种荧光探针相互接近而产生FRET。因此，通过检测由于前述FRET而发出的荧光，能够检测出与荧光探针结合的目标粒子。
首先，作为工序(a)，调制包含荧光粒子、和与前述荧光粒子的三重激发态猝灭剂进行结合的荧光探针的试样溶液。具体而言，向适当溶剂中添加荧光粒子和三重激发态猝灭剂而调制试样溶液。该溶剂，只要是不阻碍由荧光粒子发出的光的检测、以及不阻碍利用扫描分子计数法检测荧光粒子的溶剂，就没有特别的限定；可以从前述技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液，有例如：PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
三重激发态猝灭剂可以以用于起到使三重激发态恢复至基态的作用(以下，猝灭作用)所需的充分浓度添加至试样溶液中。起到猝灭作用的浓度可以通过实验求出。具体而言，向包含规定量的荧光粒子(可以为包含与作为检测对象的荧光粒子同种的荧光物质的粒子。)的测定溶液中，以各种各样的浓度添加三重激发态猝灭剂，检测各测定溶液中的荧光探针中的处于三重激发态的分子的比例。处于三重激发态的分子的比例相比于没有添加三重激发态猝灭剂的测定溶液显著地降低的浓度为通过前述三重激发态猝灭剂起到猝灭作用的浓度。处于三重激发态的分子的比例通过FCS测定而求出。
具体而言，使用碘化钾或半胱胺作为三重激发态猝灭剂的情况下，通过扫描分子计数法进行检测时的试样溶液的三重激发态猝灭剂的浓度优选为0.1mM～20mM，更优选为0.3mM～10mM，进而优选为0.5mM～5mM。组合使用碘化钾和半胱胺的情况下，优选两者的合计浓度在上述范围内。
将非荧光性的目标粒子与荧光探针的结合体制成为荧光粒子作为检测对象的情况下，可以向包含预先使目标粒子与荧光探针结合的荧光粒子的溶液中添加三重激发态猝灭剂而调制试样溶液。另外，也可以在调制了添加了目标粒子、荧光探针和三重激发态猝灭剂的试样溶液之后，在前述试样溶液中使目标粒子和荧光探针结合而形成荧光粒子。
只是使目标粒子与荧光探针共存于相同的溶液中就能够使两者结合的情况下，调制试样溶液之后，只需根据需要以规定时间孵育前述试样溶液，就能使目标粒子与荧光探针在前述试样溶液中结合。
另一方面，目标粒子、荧光探针为双链结构的核酸或者核酸类似物质的情况下，优选使试样溶液中的核酸等变性之后使两者缔合。需要说明的是，“使核酸或核酸类似物质变性”是指使碱基对解离。例如，使分子信标探针中彼此互补的碱基序列所形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。当荧光探针是包含PNA等核酸类似物质的寡核苷酸时，即使目标粒子是双链核酸分子，有时不进行特别的变性处理也可以形成包含前述荧光探针和目标粒子的缔合体。
作为变性处理，可列举出：利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓度处理的变性等。其中，由于对于荧光物质的影响比较小且操作简便而优选进行热变性。具体而言，热变性通过将前述试样溶液进行高温处理而使前述试样溶液中的核酸等变性。通常地，DNA在90℃下、RNA在70℃下保温数秒至2分钟左右即可以变性；但根据目标粒子的碱基的长度等进行变性的温度千差万别，只要能够变性，就对其温度没有限定。另一方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释，将前述试样溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。
根据需要使之变性之后，使前述试样溶液中的目标粒子与荧光探针缔合。
当进行热变性时，在高温处理后，使前述试样溶液的温度降至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的温度，由此能够使前述试样溶液中的两者适当缔合。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使前述试样溶液的盐浓度升高至目标粒子能够与荧光探针特异地杂交的浓度，能够使前述试样溶液中的两者适当缔合。
需要说明的是，可以根据两者的缔合体的熔解曲线，求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有两者的溶液的温度从高温向低温变化，测定前述溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线，从变性的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度，至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度，都可以作为两者能够特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样地确定熔解曲线，能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。
通常可以用Tm值(熔解温度)，代替两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据荧光探针的碱基序列信息，能够计算与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单链DNA的温度)。
此外，为了抑制非特异杂交，在形成缔合体时，优选使试样溶液的温度较缓慢地下降。例如，使试样溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可以按0.05℃/秒以上的降温速度，降低前述试样溶液的液温。
此外，为了抑制非特异地杂交，优选预先在试样溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加2种以上。通过添加这些化合物，在较低温度环境下也能够使非特异的杂交难以发生。
之后，作为工序(b)，算出调制的试样溶液中存在的荧光粒子的分子数。具体而言，将包含荧光粒子和三重激发态猝灭剂的试样溶液设置于前述用于扫描分子计数法的光分析装置，通过前述的手法检测由荧光粒子发出的光并解析，由此计数荧光粒子的个数。计数的粒子数为测定试样中所含的荧光粒子的个数。
实施例
接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明的方式，但本发明的方式不限于下列实施例。
[参考例1]
通过FCS检测确认碘化钾(KI)具有猝灭作用。
＜Rhodamine Green(注册商标)的情况＞
通过FCS检测确认碘化钾(KI)对于Rhodamine Green(注册商标)具有猝灭作用。
具体而言，调制试样溶液，在1nM Rhodamine Green(注册商标)(AnaSpec公司制)中添加KI以终浓度计成为0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mM。对于各试样溶液，使用能够测定每一分子的荧光强度和三重激发态的比例的单分子荧光测定装置MF20(OlympusCorporation)进行FCS检测。FCS检测条件中，将激发波长设为488nm，激光强度设为1mW，检测时间设为10秒钟。测定对于各试样进行5次，算出其平均和标准偏差。
将测定结果示于图8A和图8B。图8A为表示各试样溶液中的Rhodamine Green分子的三重激发态的比例(Frac.Triplet(%))的图。图8B为表示各试样溶液中的RhodamineGreen分子的每一分子的明亮度CPP(Countrate Per Particle)的图。如图8A所示，KI浓度为3mM的试样溶液中，三重激发态的比例为最低。由该结果可以确认，KI对于RhodamineGreen起到三重激发态猝灭剂的作用。另外，KI浓度为3mM的试样溶液中，与不添加KI的试样溶液相比较CPP变明亮1.3倍左右(参照图8B。)。由此，可以确认通过三重激发态猝灭剂的添加，荧光亮度提高。另一方面，KI浓度为30mM的试样溶液中，三重激发态的比例低于没有添加KI的试样溶液但CPP几乎没有变化。推测由于以高浓度添加KI，KI与荧光色素接近的频率提高，所以甚至单重激发状态的Rhodamine Green也恢复至基态。
＜Alexa Fluor(注册商标)488的情况＞
通过FCS检测确认碘化钾(KI)对于Alexa Fluor(注册商标)488具有猝灭作用。
具体而言，使用Alexa Fluor(注册商标)488(Invitrogen公司制)代替RhodamineGreen(注册商标)(AnaSpec公司制)，除此以外，与Rhodamine Green(注册商标)的情况同样地，对于添加了KI以终浓度计为0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mM的包含Alexa Fluor(注册商标)488的试样溶液，进行FCS检测。
将测定结果示于图9A和图9B。图9A为表示各试样溶液中的Alexa Fluor488分子的三重激发态的比例的图。图9B为表示各试样溶液中的Alexa Fluor488分子的每一分子的明亮度的图。如图9A所示，KI浓度为0.3mM和3mM的试样溶液中，三重激发态的比例与没有添加KI的试样溶液相比较明显降低。由该结果可以确认，KI对于Alexa Fluor488起到三重激发态猝灭剂的作用。另外，三重激发态的比例最低的KI浓度为3mM的试样溶液中，与没有添加KI的试样溶液相比较CPP成为1.8倍左右，产生非常大的效果(参照图9B。)。
由这些结果可以确认，KI对于各种各样的荧光物质具有猝灭作用，具有荧光亮度提高效果。
[参考例2]
通过FCS检测确认半胱胺具有猝灭作用。
＜Alexa Fluor(注册商标)488的情况＞
通过FCS检测确认半胱胺对于Alexa Fluor(注册商标)488具有猝灭作用。
具体而言，调制试样溶液，向1nM Alexa Fluor(注册商标)488(Invitrogen公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以终浓度计为0mM、0.3mM、3mM、30mM。对于各试样溶液，使用单分子荧光测定装置MF20(Olympus Corporation)进行FCS检测。FCS检测条件中，将激发波长设为488nm，激光强度设为1mW，检测时间设为10秒钟。测定对于各试样进行5次，算出其平均。
将测定结果示于图10A和图10B。图10A为表示各试样溶液中的Alexa Fluor488分子的三重激发态的比例的图。图10B为表示各试样溶液中的Alexa Fluor488分子的每一分子的明亮度的图。如图10A所示，半胱胺浓度为3mM的试样溶液中，三重激发态的比例最低。由该结果可知，半胱胺对于Alexa Fluor488起到三重激发态猝灭剂的作用。另外，半胱胺浓度为3mM的试样溶液中，与没有添加半胱胺的试样溶液相比较，CPP变明亮1.5倍左右(参照图10B。)。由此可以确认，通过半胱胺的添加荧光亮度提高。
＜TAMRA(注册商标)的情况＞
通过FCS检测确认半胱胺对于TAMRA(注册商标)具有猝灭作用。
具体而言，调制试样溶液，向1nM TAMRA(注册商标)(AnaSpec公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以终浓度计为0mM、0.3mM、3mM、30mM。对于各试样溶液，使用单分子荧光测定装置MF20(Olympus Corporation)进行FCS检测。FCS检测条件中，将激发波长设为543nm，激光强度设为0.5mW，检测时间设为10秒钟。测定对于各试样进行5次，算出其平均。
将测定结果示于图11A和图11B。图11A为表示各试样溶液中的TAMRA分子的三重激发态的比例的图。图11B为表示各试样溶液中的TAMRA分子的每一分子的明亮度的图。如图11A所示，半胱胺浓度为3mM的试样溶液中，三重激发态的比例最低。由该结果可确认，半胱胺对于TAMRA起到三重激发态猝灭剂的作用。另外，半胱胺浓度为3mM的试样溶液中，与没有添加半胱胺的试样溶液相比较，CPP变明亮1.4倍左右(参照图11B。)。由此可以确认，通过半胱胺的添加，荧光亮度提高。
由这些结果可以确认，半胱胺对于各种荧光物质具有猝灭作用，具有荧光亮度的提高效果。
[实施例1]
使用KI作为三重激发态猝灭剂，通过扫描分子计数法检测荧光粒子。
首先，调制试样溶液，向10pM Alexa Fluor(注册商标)488(Invitrogen公司制)中添加KI以终浓度计为0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mM。对于各试样溶液，使用具备共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测定装置MF20(OlympusCorporation)，通过扫描分子计数法进行检测，获得按照时间顺序的光子计数数据。此时，激发光使用488nm的激光以1mW进行照射，检测光波长使用带通滤波器，设为510nm～560nm。将试样溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为15mm/秒，BIN TIME设为10μ秒，测定时间设为2秒钟。另外，测定对于各试样进行5次，算出其平均和标准偏差。光强度测定后，对于各试样溶液，由获得的按照时间顺序的光子计数数据，计数按照时间顺序的数据中检测到的光信号。在数据的利用移动平均法的平滑化中，将一次平均的数据点设为9个，重复5次移动平均处理。另外，在拟合中，对于按照时间顺序的数据通过最小二乘法拟合出高斯函数，确定(高斯函数中的)峰强度、峰宽(半高全宽)、相关系数。进而，峰的判定处理中，只将满足下述的条件：
20μ秒＜峰宽＜400μ秒、
峰强度＞1(光子/10μ秒)、
相关系数＞0.95、
的峰信号判定为与观测对象分子对应的光信号。另一方面，不满足上述的条件的峰信号作为噪音而无视，将判定为与观测对象分子对应的光信号的信号的个数作为“峰数”而计数。
图12为表示将各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。结果确认，KI浓度为0.1mM～10mM时，相比于没有添加KI的试样溶液峰数增大，荧光粒子的检测能力提高。更详细而言，KI浓度为0.1mM～3mM时，伴随着KI的添加量变多，计数到的峰数也变多。峰数最多的KI浓度为3mM的试样溶液中，与没有添加KI的试样溶液相比较，增加30%以上。可以认为这是因为，由KI导致荧光亮度变高的Alexa Fluor488被重新检测到。
由这些结果可知，通过在KI存在下进行利用扫描分子计数法的荧光粒子的计数，能够提高荧光粒子的检测能力、更高灵敏度地检测荧光粒子。
[实施例2]
使用半胱胺作为三重激发态猝灭剂，通过扫描分子计数法检测荧光粒子。
＜Alexa Fluor(注册商标)488的情况＞
首先，调制试样溶液，向10pM Alexa Fluor(注册商标)488(Invitrogen公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以终浓度计为0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mM。对于各试样溶液，与实施例1同样地，通过扫描分子计数法进行检测，获得按照时间顺序的光子计数数据，计数荧光粒子的个数。
图13为表示将各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。结果，半胱胺浓度为0.3mM～3mM时，伴随着半胱胺的添加量变多，计数到的峰数也变多。峰数最多的半胱胺浓度为3mM的试样溶液中，与没有添加半胱胺的试样溶液相比较增加20%以上。
＜TAMRA(注册商标)的情况＞
首先，调制试样溶液，向10pM TAMRA(注册商标)(AnaSpec公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以终浓度计为0mM、0.1mM、0.3mM、3mM、10mM、30mM。对于各试样溶液，激发光使用543nm的激光以0.5mW进行照射，检测光波长使用带通滤波器设为560nm～620nm，除此以外，与实施例1同样地，通过扫描分子计数法进行检测，获得按照时间顺序的光子计数数据，计数荧光粒子的个数。
图14为表示将各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。结果，半胱胺浓度为0.3mM～3mM时，伴随着半胱胺的添加量变多，计数到的峰数也变多。峰数最多的半胱胺浓度为3mM的试样溶液中，与没有添加半胱胺的试样溶液相比较增加10%以上。
由这些结果可知，通过在半胱胺存在下进行利用扫描分子计数法的荧光粒子的计数，能够提高荧光粒子的检测能力、更高灵敏度地检测荧光粒子。
[实施例3]
调查荧光粒子的浓度与三重激发态猝灭剂具有猝灭作用的浓度的关系。具体而言，在荧光粒子的浓度为1pM的情况下和100pM的情况下，对于三重激发态猝灭剂起到猝灭作用的浓度进行了调查。
首先，调制试样溶液，向1pM或100pM Alexa Fluor(注册商标)488(Invitrogen公司制)中添加KI以终浓度计为0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mM。对各试样溶液，对于Alexa Fluor488的浓度为1pM的试样溶液将测定时间设为20秒钟，对于100pM的试样溶液设为2秒钟，除此以外，与实施例1同样地，通过扫描分子计数法进行检测，获得按照时间顺序的光子计数数据，计数荧光粒子的个数。
图15是表示将Alexa Fluor488的浓度为1pM的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图；图16是表示将Alexa Fluor488的浓度为100pM的各试样溶液的峰数进行计数的结果的图。Alexa Fluor488的浓度为1pM的试样溶液和100pM的试样溶液中，均与实施例1(AlexaFluor488的浓度为10pM的试样溶液的情况)同样地，通过添加KI，利用扫描分子计数法检测时的峰检测能力(荧光粒子的检测能力)提高。另外可知，KI浓度为1mM～3mM时检测到的峰数均最多，所以KI具有猝灭作用的浓度不怎么受荧光粒子的浓度影响，向试样溶液中添加KI以使终浓度成为0.1mM～20mM，能够更高灵敏度地检测荧光粒子。
产业上的可利用性
通过本发明的方式的荧光粒子的检测方法，能够通过扫描分子计数法非常高灵敏度地检测试样溶液中的仅以非常低的浓度存在的目标粒子的浓度。因此，本发明的方式中的荧光粒子的检测方法能够利用于临床被检体等解析对象物质的浓度为微量的试样的解析、检查等领域中。
附图标记说明
1…光分析装置(共聚焦显微镜)
2…光源
3…单模光纤
4…准直仪透镜
5…分色镜
6、7、11…反射镜
8…物镜
9…微孔板
10…孔(试样溶液容器)
12…聚光镜
13…小孔
14…二次滤片
15…多模光纤
16…光检测器
17…镜转向器
17a…平台位置变化装置
18…计算机

Claims (4)

1.一种在试样溶液中分散并随机运动的荧光粒子的检测方法，其包括：
(a)调制包含荧光粒子和促进所述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质的试样溶液的工序；和
(b)计算出所述工序(a)中调制的试样溶液中存在的荧光粒子的分子数的工序，其中，
所述工序(b)中的荧光粒子的分子数的计算包括：
使用共聚焦显微镜或多光子显微镜光学系统，通过采用改变所述光学系统的光路而在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置的工序；
在所述试样溶液内移动所述光检测区域的位置的同时，通过检测由所述光检测区域中存在的所述荧光粒子发出的光信号，逐个检测所述荧光粒子的工序；和
通过将所述逐个检测到的荧光粒子的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动期间检测到的所述荧光粒子的个数的工序；
其中，所述移动光检测区域的位置的工序包括以比所述荧光粒子的扩散移动速度更快的速度移动所述光检测区域的位置；
其中，所述试样溶液中的所述促进所述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质的浓度为0.3mM～10mM；
其中，通过检测来自每个所述荧光粒子的光信号来逐个检测所述荧光粒子的工序包括根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状来检测单个所述荧光粒子向所述光检测区域中的进入。
2.根据权利要求1所述的荧光粒子的检测方法，其中，所述试样溶液中的所述促进所述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质的浓度为0.5mM～5mM。
3.根据权利要求1或2所述的荧光粒子的检测方法，其中，所述促进所述荧光粒子从三重激发态向单重基态跃迁的物质为选自碘化钾和半胱胺的一种以上。
4.根据权利要求1所述的荧光粒子的检测方法，其中，所述移动光检测区域的位置的工序包括以规定的速度移动所述光检测区域的位置。
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