JP5946168B2 - 標的核酸分子の検出方法 - Google Patents
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Description
(1) (a)標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有しており、かつ第1マーカー及び第2マーカーが結合された分子ビーコンプローブを、核酸含有試料に添加した試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、前記試料溶液中の前記分子ビーコンプローブのうち、会合していないものに対して、3’末端側の領域及び5’末端側の領域をハイブリダイズさせてステムーループ構造を形成させる工程と、
(e)前記工程(d)の後、ステムーループ構造が形成されている分子ビーコンプローブにおいて、ステム領域を形成している3’末端側の領域と5’末端側の領域との間に少なくとも1の共有結合を形成させる工程と、
(f)前記工程(e)の後、前記試料溶液中の第1マーカー又は第2マーカーの光学的特性に基づき、前記標的核酸分子を検出する工程と
を有し、
前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が、前記分子ビーコンプローブが、3’末端側の領域と5’末端側の領域とがハイブリダイズしてステムーループ構造を形成している場合としていない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であることを特徴とする、標的核酸分子の検出方法、
(2) 前記工程(c)の後、工程(d)の前に、
(g)前記工程(c)の後、前記試料溶液の温度及び塩濃度が前記工程(c)における会合体形成時と同じ条件下で、形成された会合体中の2本の核酸鎖間に共有結合を形成する工程と、
(h)前記工程(g)の後、会合体を形成する2本の核酸鎖のうちの一方が前記分子ビーコンプローブである会合体のうち、2本の核酸鎖間に共有結合が形成されていない会合体を解離させる工程と、
を有することを特徴とする前記(1)に記載の標的核酸分子の検出方法、
(3) 前記工程(h)において、前記試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液を急冷することにより、2本の核酸鎖間に共有結合が形成されていない会合体を解離させることを特徴とする前記(2)に記載の標的核酸分子の検出方法、
(4) 共有結合の形成反応が、光化学的反応であることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(5) 前記分子ビーコンプローブのうち、ステム領域を形成する3’末端側の領域及び5’末端側の領域中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記共有結合が、前記光反応性塩基誘導体を介して形成されることを特徴とする前記(4)記載の標的核酸分子の検出方法、
(6) 前記分子ビーコンプローブのうち、前記標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記共有結合が、前記光反応性塩基誘導体を介して形成されることを特徴とする前記(4)又は(5)記載の標的核酸分子の検出方法、
(7) 前記光反応性塩基誘導体が、3−Cyanovinylcarbazole Nucleosideであり、
前記共有結合が、前記試料溶液に340〜380nmの光を照射することにより形成されることを特徴とする前記(4)〜(6)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(8) 前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が蛍光色素であり、
前記標的核酸分子の検出を、
下記(p)〜(r):
(p)前記試料溶液の蛍光強度を測定する工程、
(q)蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は蛍光偏光強度分布解析法により、前記試料溶液中に存在している前記標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの分子数を算出する工程、
(r)共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの蛍光を検出することにより、前記試料溶液中に存在している前記標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの分子数を算出する工程、
のいずれかの工程により行うことを特徴とする前記(1)〜(7)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(9) 前記工程(r)において、前記光学系の光検出領域の位置が、前記標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする前記(8)に記載の標的核酸分子の検出方法、
(10) 前記工程(d)における共有結合形成時の前記試料溶液の温度が、Tm値±3℃の範囲内の温度であることを特徴とする前記(1)〜(9)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(11) 前記第1マーカーと前記第2マーカーのうち、いずれか一方が蛍光物質であり、他方が前記蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする前記(1)〜(10)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(12) 前記第1マーカー及び前記第2マーカーが蛍光色素であることを特徴とする前記(1)〜(11)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(13) 前記標的核酸分子がRNAであることを特徴とする前記(1)〜(12)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法、
(14) 核酸含有試料中の標的核酸分子を検出するために用いられる分子ビーコンプローブであって、
標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有し、かつ、第1マーカー及び第2マーカーが結合されており、
前記互いに相補的な5’末端側の領域及び3’末端側の領域中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が、前記分子ビーコンプローブが、3’末端側の領域と5’末端側の領域とがハイブリダイズしてステムーループ構造を形成している場合としていない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であり、
前記分子ビーコンプローブがステムーループ構造を形成している場合に、前記光反応性塩基誘導体は、5'末端側の領域と3'末端側の領域との間に共有結合を形成させることを特徴とする分子ビーコンプローブ、
(15) 前記標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されていることを特徴とする前記(14)に記載の分子ビーコンプローブ、
(16) 前記(1)〜(13)のいずれか一つに記載の標的核酸分子の検出方法に用いられるキットであって、
標的核酸分子を検出するために用いられる分子ビーコンプローブを含み、
前記分子ビーコンプローブが、標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有し、かつ、第1マーカー及び第2マーカーが結合されており、
前記互いに相補的な5’末端側の領域及び3’末端側の領域中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が、前記分子ビーコンプローブが、3’末端側の領域と5’末端側の領域とがハイブリダイズしてステムーループ構造を形成している場合としていない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であり、
前記分子ビーコンプローブがステムーループ構造を形成している場合に、前記光反応性塩基誘導体は、5'末端側の領域と3'末端側の領域との間に共有結合を形成させることを特徴とする、標的核酸分子検出用キット、
(17) 前記分子ビーコンプローブ中の標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されていることを特徴とする前記(16)に記載の標的核酸分子検出用キット、
を提供するものである。
このため、本発明の標的核酸分子の検出方法を用いることにより、標的核酸分子の検出精度を犠牲にすることなく、FRETの蛍光強度解析を、温度コントロールを行わない状態で行うことができる。
(a)標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有しており、かつ第1マーカー及び第2マーカーが結合された分子ビーコンプローブを、核酸含有試料に添加した試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、前記試料溶液中の前記分子ビーコンプローブのうち、会合していないものに対して、3’末端側の領域及び5’末端側の領域をハイブリダイズさせてステムーループ構造を形成させる工程と、
(e)前記工程(d)の後、ステムーループ構造中のステム領域において、当該分子ビーコンプローブの3’末端側の領域と5’末端側の領域との間に少なくとも1の共有結合を形成させる工程と、
(f)前記工程(e)の後、前記試料溶液中の第1マーカー又は第2マーカーの光学的特性に基づき、前記標的核酸分子を検出する工程。
(g)前記工程(c)の後、前記試料溶液の温度及び塩濃度が前記工程(c)における会合体形成時と同じ条件下で、形成された会合体中の2本の核酸鎖間に共有結合を形成する工程と、
(h)前記工程(g)の後、会合体を形成する2本の核酸鎖のうちの一方が前記分子ビーコンプローブである会合体のうち、2本の核酸鎖間に共有結合が形成されていない会合体を解離させる工程。
例えば、標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基を、光反応性塩基誘導体に置換されている分子ビーコンプローブを用いることにより、光化学反応によって、標的核酸分子と分子ビーコンプローブとの会合体に、当該光反応性塩基誘導体を介した共有結合を形成することができる。光反応性塩基誘導体に置換されている分子ビーコンプローブと標的核酸分子との会合体を形成させた後、当該会合体が含まれている試料溶液に、当該光反応性塩基誘導体中の光反応性部位を活性化し得る波長の光を照射すると、当該光反応性部位が活性化され、この光反応性部位に近接する標的核酸分子中の原子との間に共有結合が形成される。
また、FIDA−POにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の偏光を検出した後、統計解析を行うことによって、標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの分子数を算出することにより、標的核酸分子を検出し定量することができる。
さらに、FCSにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの分子数を算出することにより、標的核酸分子を検出し定量することができる。
走査分子計数法は、基本的な構成において、図2(A)に模式的に例示されている如き、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。同図を参照して、光分析装置101は、光学系102〜117と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ118とから構成される。光分析装置101の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこにおいて、光源102から放射されシングルモードファイバー103内を伝播したレーザ光(Ex)が、ファイバーの出射端において固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター104によって平行光となり、ダイクロイックミラー105、反射ミラー106、107にて反射され、対物レンズ108へ入射される。対物レンズ108の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル110が配列されたマイクロプレート109が配置されており、対物レンズ108から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル110内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、かかる粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光プローブと結合又は会合した粒子(実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後粒子から解離した発光プローブ)が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ108、ダイクロイックミラー105を通過し、ミラー111にて反射してコンデンサーレンズ112にて集光され、ピンホール113を通過し、バリアフィルター114を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー115に導入されて、光検出器116に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ118へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者において知られている如く、上記の構成において、ピンホール113は、対物レンズ108の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図2(B)に模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図2(B)に例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、1つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器116としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル110を変更するべく、マイクロプレート109の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置117aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置117aの作動は、コンピュータ118により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がFIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器117を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行う他は、FCS又はFIDAにおける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート109のウェル110に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ118に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ118は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ118のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器117は、ミラー107(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル110内において光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器116は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ118へ送信し、コンピュータ118では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器116は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2Wo)2=6D・Δt …(1)
から、
Δt=(2Wo)2/6D …(2)
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo …(3)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略10倍の15mm/sと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ118において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5(A)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図7(A)に模式的に描かれている如く、(光学系により決定される)光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル(通常、略釣鐘状)を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ioが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が
為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Io及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体(又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ)から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められるところ、具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体(又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ)の特性によって選択的に決定されてよい。
ガウス分布:
I=A・exp(−2t2 /a2 ) …(4)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(4)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。)
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図6及び図7(B)に例示された処理により為されてよ
い。
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液(参照溶液)について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体(又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ)と同様の波長特性を有する発光標識(蛍光色素等)であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Cの参照溶液について、その粒子の検出数がNであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Vtは、
Vt=N/C …(5)
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の粒子の数密度cは、
c=n/Vt …(6)
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係(式(5))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
本発明の標的核酸分子の検出方法に用いられる、分子ビーコンプローブをはじめとする各種試薬や機器等をキット化することも好ましい。当該キットにより、本発明の標的核酸分子の検出方法をより簡便に行うことができる。当該キットには、前記の分子ビーコンプローブの他に、試料溶液を調製するために用いられる各種バッファーや、恒温装置付インキュベーター等を含ませることができる。その他、蛍光強度解析の際の測定用コントロールとして用いられるオリゴヌクレオチド、例えば、標的核酸分子と同じ塩基配列を有する非標識のオリゴヌクレオチド(又は核酸)や、標的核酸分子とは異なる塩基配列を有する非標識のオリゴヌクレオチド(又は核酸)等を含んでいてもよい。
ヒトのマイクロRNAであるmiR−21(hsa−miR−21, 5’− UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA −3’,The miRBase Sequence Database−Release 12.0, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)と相同な配列をもつ1本鎖DNAを標的核酸分子として、本発明の標的核酸分子の検出方法により、未標識の標的核酸分子を検出した。miR−21と相同な配列を有し、5’末端の6塩基と3’末端の6塩基が互いに相補的な塩基配列であり、5’末端に第1マーカーとしてTAMRAが、3’末端に第2マーカーとしてBHQ-2が結合しており、さらに、5’末端の6塩基のうちの1つの塩基をクロスリンクする塩基誘導体としてCNVKに置換された1本鎖DNAを分子ビーコンプローブとして用いた。分子ビーコンプローブ1のCNVKに置換する前の塩基配列を配列番号1に示す。なお、分子ビーコンプローブは、株式会社ファスマックにより合成された。
各試料溶液を、90℃で2分間変性させた後、50℃まで1℃/15秒間で温度を下げることによりハイブリダイゼーション(会合)を行った。その後、当該試料溶液を2分割し、そのうちの一方を当該試料溶液の温度をただちに氷中に置くことにより急冷し、365nmの光照射を行った。残る一方は、1℃/15秒間で5℃まで冷却した後に40℃で5分間保持した後、蛍光測定まで室温にて保持した。また、90℃で変性後、光照射を行わず、5℃まで1℃/15秒間で冷却した後に40℃で5分間保持した後、測定まで室温にて保持したものを対照として用いた。
光照射によるクロスリンクを行わなかった場合には、PMの蛍光強度相対値が1に対して、MMの蛍光強度相対値は0.98とほぼ等しかった。これに対して、氷中での光照射を行った場合には、蛍光強度相対値は、PMが1の場合に、MMは0.58まで減少しており、分子ビーコンプローブの特異性が増していることがわかった。これは、標的核酸分子とクロスリンクを介して会合していない分子ビーコンプローブは、急冷工程により、速やかに自己構造であるステムーループ構造を形成し、氷中で光照射を行ったことにより、ステムーループ構造が安定化し、40℃及び室温での保持中における分子ビーコンプローブの非標的核酸分子への会合が阻害されたためと推察される。
ヒトのマイクロRNAであるmiR−21と相同な配列をもつ1本鎖DNAを標的核酸分子として、本発明の標的核酸分子の検出方法により、未標識の標的核酸分子を、1塩基のみが相違する核酸分子と区別して検出した。
分子ビーコンプローブとしては、実施例1で使用した分子ビーコンプローブを用いた。また、標的核酸分子及び非標的核酸分子も、実施例1で使用したものを用いた。
各試料溶液を、90℃で2分間変性させた後、50℃まで1℃/15秒間で温度を下げることによりハイブリダイゼーション(会合)を行った。その後、当該試料溶液を2分割し、そのうちの一方は、当該試料溶液を90℃で2分間変性させた後、ただちに氷中に置くことにより急冷し、365nmの光照射を行った。残る一方は、1℃/15秒間で5℃まで冷却した後に40℃で5分間保持した後、蛍光測定まで室温にて保持した。また、90℃で変性後、光照射を行わず、5℃まで1℃/15秒間で冷却した後に40℃で5分間保持した後、測定まで室温にて保持したものを対照として用いた。
光照射によるクロスリンクを行わなかった場合には、PMの蛍光強度相対値が1に対して、MMの蛍光強度相対値は0.99とほぼ等しかった。これに対して、氷中での光照射を行った場合には、蛍光強度相対値は、PMが1の場合に、MMは0.26まで減少しており、分子ビーコンプローブの特異性が増していることがわかった。これは、標的核酸分子とクロスリンクを介して会合していない分子ビーコンプローブは、変性、急冷工程により、速やかに自己構造であるステムーループ構造を形成し、さらに氷中で光照射を行ったことにより、ステムーループ構造が安定化し、40℃及び室温での保持中における分子ビーコンプローブの非標的核酸分子への会合が阻害されたためと推察される。また、50℃におけるハイブリダイゼーションの後にクロスリンクにより会合体を安定化させた後、変性し、さらに急冷・クロスリンク形成を行うことにより、会合体を安定化させていない場合(実施例1)よりも、分子ビーコンプローブの特異性が改善されていた。
Claims (17)
- (a)標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有しており、かつ第1マーカー及び第2マーカーが結合された分子ビーコンプローブを、核酸含有試料に添加した試料溶液を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、前記試料溶液中の前記分子ビーコンプローブのうち、会合していないものに対して、3’末端側の領域及び5’末端側の領域をハイブリダイズさせてステムーループ構造を形成させる工程と、
(e)前記工程(d)の後、ステムーループ構造が形成されている分子ビーコンプローブにおいて、ステム領域を形成している3’末端側の領域と5’末端側の領域との間に少なくとも1の共有結合を形成させる工程と、
(f)前記工程(e)の後、前記試料溶液中の第1マーカー又は第2マーカーの光学的特性に基づき、前記標的核酸分子を検出する工程と
を有し、
前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が、前記分子ビーコンプローブが、3’末端側の領域と5’末端側の領域とがハイブリダイズしてステムーループ構造を形成している場合としていない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であることを特徴とする、標的核酸分子の検出方法。 - 前記工程(c)の後、工程(d)の前に、
(g)前記工程(c)の後、前記試料溶液の温度及び塩濃度が前記工程(c)における会合体形成時と同じ条件下で、形成された会合体中の2本の核酸鎖間に共有結合を形成する工程と、
(h)前記工程(g)の後、会合体を形成する2本の核酸鎖のうちの一方が前記分子ビーコンプローブである会合体のうち、2本の核酸鎖間に共有結合が形成されていない会合体を解離させる工程と、
を有することを特徴とする請求項1に記載の標的核酸分子の検出方法。 - 前記工程(h)において、前記試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液を急冷することにより、2本の核酸鎖間に共有結合が形成されていない会合体を解離させることを特徴とする請求項2に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 共有結合の形成反応が、光化学的反応であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記分子ビーコンプローブのうち、ステム領域を形成する3’末端側の領域及び5’末端側の領域中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記共有結合が、前記光反応性塩基誘導体を介して形成されることを特徴とする請求項4記載の標的核酸分子の検出方法。 - 前記分子ビーコンプローブのうち、前記標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記共有結合が、前記光反応性塩基誘導体を介して形成されることを特徴とする請求項4又は5記載の標的核酸分子の検出方法。 - 前記光反応性塩基誘導体が、3−Cyanovinylcarbazole Nucleosideであり、
前記共有結合が、前記試料溶液に340〜380nmの光を照射することにより形成されることを特徴とする請求項4〜6のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。 - 前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が蛍光色素であり、
前記標的核酸分子の検出を、
下記(p)〜(r):
(p)前記試料溶液の蛍光強度を測定する工程、
(q)蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は蛍光偏光強度分布解析法により、前記試料溶液中に存在している前記標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの分子数を算出する工程、
(r)共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの蛍光を検出することにより、前記試料溶液中に存在している前記標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの分子数を算出する工程、
のいずれかの工程により行うことを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。 - 前記工程(r)において、前記光学系の光検出領域の位置が、前記標的核酸分子と会合している分子ビーコンプローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする請求項8に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記工程(d)における共有結合形成時の前記試料溶液の温度が、Tm値±3℃の範囲内の温度であることを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記第1マーカーと前記第2マーカーのうち、いずれか一方が蛍光物質であり、他方が前記蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記第1マーカー及び前記第2マーカーが蛍光色素であることを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 前記標的核酸分子がRNAであることを特徴とする請求項1〜12のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
- 核酸含有試料中の標的核酸分子を検出するために用いられる分子ビーコンプローブであって、
標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有し、かつ、第1マーカー及び第2マーカーが結合されており、
前記互いに相補的な5’末端側の領域及び3’末端側の領域中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が、前記分子ビーコンプローブが、3’末端側の領域と5’末端側の領域とがハイブリダイズしてステムーループ構造を形成している場合としていない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であり、
前記分子ビーコンプローブがステムーループ構造を形成している場合に、前記光反応性塩基誘導体は、5'末端側の領域と3'末端側の領域との間に共有結合を形成させることを特徴とする分子ビーコンプローブ。 - 前記標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されていることを特徴とする請求項14に記載の分子ビーコンプローブ。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法に用いられるキットであって、
標的核酸分子を検出するために用いられる分子ビーコンプローブを含み、
前記分子ビーコンプローブが、標的核酸分子と相補的な塩基配列と、3’末端側の領域及び5’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列とを有し、かつ、第1マーカー及び第2マーカーが結合されており、
前記互いに相補的な5’末端側の領域及び3’末端側の領域中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されており、
前記第1マーカーと前記第2マーカーの少なくともいずれか一方が、前記分子ビーコンプローブが、3’末端側の領域と5’末端側の領域とがハイブリダイズしてステムーループ構造を形成している場合としていない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であり、
前記分子ビーコンプローブがステムーループ構造を形成している場合に、前記光反応性塩基誘導体は、5'末端側の領域と3'末端側の領域との間に共有結合を形成させることを特徴とする、標的核酸分子検出用キット。 - 前記分子ビーコンプローブ中の標的核酸分子と相補的な塩基配列中の少なくとも1の塩基が光反応性塩基誘導体に置換されていることを特徴とする請求項16に記載の標的核酸分子検出用キット。
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