CN113030035A - 基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器及其检测方法，用于解决光纤生化传感器在实际检测中检测成本高、检测时间长、灵敏度低、特异性低的问题，属于生物医学光子学中的光纤传感领域。该传感器利用核酸适体作为生物探针，将探针修饰在空芯微结构光纤内壁，以空芯光纤作为信号转换系统，构建了新型空芯光纤生化传感器。本发明基于不同的核酸适体结构设计了两款不同的生物探针，第一款生物探针基于分子信标探针原理，第二款生物探针基于阴阳探针原理，并在两种探针的基础上设计了相应的检测方法，两种方法均利用荧光恢复值与待测物质浓度之间良好的线性关系，通过检测荧光强度的变化实现对待测物质的定量检测。

Description

基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器及其检 测方法
技术领域
本发明涉及到应用由核酸适体与新型空芯微结构光纤结合构成的传感器及其检测方法，用于对物质进行高灵敏度的特异性检测，属于生物医学光子学中的光纤传感领域。
背景技术
光纤生化传感器是采用光纤或光纤束作为传感检测平台的一种传感器，它以抗电磁干扰能力强、非侵入性、高灵敏度连续检测等优势在生物与化学传感领域备受瞩目。传统的实芯光纤传感器待测物质的折射率应低于纤芯折射率,从而满足入射光的全反射条件。若想检测折射率更高的物质,就需要选择更高折射率的材料作为纤芯,这样不但限制了检测范围，还会使制作难度和成本增大。为了解决这一问题,空芯光纤(HF)被用于传感检测技术的研究。空芯光纤的导光原理是通过特殊微结构形成的光子禁带或反谐振效应来抑制纤芯中光的横向泄漏，实现低折射率纤芯中的轴向光传输。相比于全内反射(total internalreflection,TIR)型光纤，空芯光纤中绝大部分光能量(95％以上)在空气芯中传输，因此光传输受光纤材料吸收影响少，非线性效应和延迟较小，损伤阈值高，热稳定性好，扩大了待测物质的检测范围。更重要的是，在此过程中，空芯光纤不仅可以作为光通道，也能作为流体通道，可以容纳在纤芯附近甚至芯内以气态或液态形式存在的待测物质。与传统的实芯光纤传感器相比，空芯光纤传感器无需准备样品检测池，nL-μL量级的待测物质即可满足检测条件。待测物质与光在空芯光纤传感器中获得了更大的相互作用体积，这大大提高了传感器的响应速度和灵敏度。
虽然空芯光纤传感器相比于实芯光纤传感器存在光与物质相互作用强、所需待测物质体积少等的优势，但若想在实际中应用，仍然需要进一步降低检测成本，提高传感器的检测灵敏度、特异性。
发明内容
本发明用于解决光纤生化传感器在实际检测中检测成本高、检测时间长、灵敏度低、特异性低的问题，提出了一种基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器及其检测方法，该传感器利用核酸适体作为生物探针，将探针修饰在空芯微结构光纤内壁，以空芯光纤作为信号转换系统，构建了新型空芯光纤生化传感器。基于不同的核酸适体结构设计了两款不同的生物探针，具体说明如下。
1.第一款生物探针基于分子信标探针(MB)原理，分别在核酸适体的两端修饰荧光分子和淬灭分子。根据荧光共振能量转移原理，荧光分子发出的荧光被近距离处的淬灭分子淬灭，使检测体系在初始状态下的背景荧光值较低。当检测体系中加入可以与核酸适体特异性结合的待测物质后，荧光分子与淬灭分子的间距增大，核酸适体的二级结构被打开，荧光强度恢复，且荧光恢复值与待测物质浓度呈良好的线性关系。基于此原理，仅需不同荧光标记的生物识别分子即可实现对其他生物化学物质的高灵敏度快速直接检测。
2.第二款生物探针基于阴阳探针原理，利用核酸链之间的竞争性杂交实现对待测物质的分析检测。这种探针由标记淬灭分子的适体链(识别分子)及标记荧光分子的互补链(报告分子)组成，其中与待测物质结合的适体链比互补链长几个碱基。在没有待测物质存在的情况下，荧光基团与淬灭基团距离很近，符合发生荧光共振能量转移的条件，因此荧光基团的荧光被淬灭，探针不发光。当加入待测物质后，适体与待测物质形成更稳定的杂交体，荧光基团与淬灭基团发生分离，荧光共振能量转移作用消失，荧光得以恢复。不同浓度的待测物质会对荧光恢复值产生影响，通过检测荧光强度的变化，实现对待测物质浓度的定量检测。
以空芯微结构光纤作为传感元件，具有光与物质的相互作用强、光谱传输带宽、低传输损耗、低弯曲损耗、高激光损伤阈值和高模式纯度等优点。因为光纤特殊的结构设计，使光限制在液芯内传播，极大地增强了光与物质的相互作用，荧光效应显著，从而通过光谱仪灵敏测定光纤内的荧光信号。两端标记了荧光分子和淬灭分子的核酸适体作为检测试剂，具有检测试剂少、检测成本低、结合特异性好、检测灵敏度高等优势。
本发明所用的光纤包括各种类型的空芯微结构光纤；所使用的核酸适体能够与待测物质特异性结合；所构建的传感器能够对目标物质如细胞，外泌体，肿瘤标记物，蛋白质，DNA，microRNA等生物分子和氨基酸，药物或无机离子等化学物质进行有效检测。
为实现上述目的，本发明采用基于空芯微结构光纤与特异性核酸适体结合的生化传感器，具体器件如下：
激光器(9)(波长根据荧光分子的激发和发射波段选择)，用于发射激光；光纤传感系统由精密三维调整台(1)上固定的空芯微结构光纤(2)构成；光路准直系统包括反射镜A、B、C，45°倾斜放置的二向色镜(4)，长通滤光片(5)以及两个光纤耦合透镜(3)、(6)；信号采集系统由大芯径的多模光纤(7)和一台光谱仪或单色仪(F)组成，用于采集空芯微结构光纤(2)中的光信号。
对于传感器性能而言，待测物质的体积、检测时间、仪器的灵敏度及仪器的探测极限是几个重要的评估传感器性能的参数。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1.检测成本低。仅需两端标记了荧光分子和淬灭分子的核酸适体作为检测试剂，即可实现对待测物质的特异性检测。
2.被测物质体积小。由于这种微结构光纤纤芯的直径在微米量级，使用这种微结构光纤检测待探测物质的体积仅需nL-μL量级，这在化学和生物医学应用中意义重大，有利于实现生物化学物质的快速实时检测。
3.检测时间短。当激光耦合进微结构光纤后，会立即在纤芯周围产生倏逝波，使光纤内的待测物质立刻发生荧光效应。荧光效应会引起光谱信息的改变，这种变化可以通过检测仪器观测得知，因此利用该技术需要的检测时间很短。
4.检测灵敏度高。用于修饰光纤内壁的核酸适体可以根据待测物质来选择，修饰于光纤内的核酸适体可以在复杂多样的检测环境中精确识别出目标待测物，大大提高了检测灵敏度。
5.检测极限低。传感器的检测极限不仅取决于其灵敏度，还取决于它的传感结构。计算中，常将测得的输出信号的标准差σ与灵敏度S的比值作为检测极限的参考值。因此，纤芯直径越小，灵敏度越高，传感器的检测精度越高。故而本发明采用的具有小芯径的多孔微结构空芯光纤可以获取较低的检测极限。
总的来说，这种类型的光纤为待测物质与光相互作用提供了良好的平台，即使在较长的纵向路径上依然具有极低的光学损耗和更高的激光损伤阈值，使空芯微结构光纤成为生物传感和光化学应用的理想选择。
发明内容附图说明：
图1(a)用作光纤传感的新型微结构空芯光纤截面结构示意图；
图1(b)用作光纤传感的新型微结构空芯光纤纤芯截面结构示意图；
图2新型空芯微结构光纤的传输频带图；
图3(a)基于第一款生物探针的传感器示意图；
(b)基于第一款生物探针的传感器反应机理示意图；
图4(a)基于第二款生物探针的传感器示意图；
(b)基于第二款生物探针的传感器反应机理示意图；
图5实施案例的实验装置结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施案例1
本实验基于第一款生物探针设计的光纤生化传感器检测水环境中的抗生素卡那霉素。首先，用APTES对光纤进行硅烷化处理，使光纤表面修饰有氨基官能团，有利于光纤与生物识别元件的有效结合。实验所用的核酸适体能够与卡那霉素特异性结合，形成稳定的二级结构。核酸适体两端分别由荧光分子HEX和淬灭分子BHQ-1修饰；在淬灭分子的一端连接羧基，可以与光纤表面修饰的氨基共价结合，从而将核酸适体固定在光纤内壁。用精密注射仪将核酸适体注入空芯光纤，观察到光纤末端有明显液珠时停止充液，令溶液在光纤内孵育12小时，使适体充分结合在光纤内壁；此时检测体系处于初始状态，检测出的背景荧光值较低。当检测体系中加入卡那霉素后，核酸适体与卡那霉素特异性结合，荧光分子远离淬灭分子，荧光强度增加，荧光恢复值与卡那霉素浓度具有良好的线性关系。
实验采用无节点反谐振空芯七孔光纤，其外径为200μm，其中七个包层孔直径d为13μm，二氧化硅结构厚度t为200nm的无结核心环绕，内接直径D为31μm(d/D＝0.419)。由于具有更薄的包层石英壁和不存在Fano共振，这种光纤可以同时拥有很多优良的光学特性，包括非常宽且平滑的传输通带，非常低的传输和弯曲损耗，更高的损伤阈值，具有单模导向和非常低的光衰减，测量值为～0.1dB/m。最重要的是，在470-730nm具有宽传输带宽，适用于荧光检测。
实验采用背向检测法，实验装置如图4所示。532nm激光光源依次经过非连续衰减片，反射镜C和二向色镜(4)，最后由第一光纤耦合透镜(3)将光源激光耦合进光纤中，光纤前端的功率在控制在70μW。二向色镜的参数为：直径d＝1英寸，50％T/R，其中：T-Range505～800nm,R-Range 380～475nm。在光纤内，光与物质相互作用，产生的荧光信号经原路返回到二向色镜，再依次通过反射镜A、反射镜B、550nm长波通滤光片(5)、第二光纤耦合透镜(6)进入到接收荧光信号的大芯径的多模光纤(7)中，荧光信号由QE65 Pro Spectrometer海洋光谱仪(F)采集，其探测波长范围是185～1100nm，光学分辨率为0.14～7.7nm。通过观测荧光光谱强度，实现对卡那霉素浓度的定量检测。
实施案例2
本实验基于第二款生物探针设计的光纤生化传感器检测乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。首先，用APTES对光纤进行硅烷化处理，使光纤表面修饰有氨基官能团，有利于光纤与生物识别元件的有效结合。实验所用的核酸适体能够与乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性结合。在适体链一端修饰淬灭分子BHQ-2，在互补链一端修饰荧光分子CY5.5。在淬灭分子的一端连接羧基，可以与光纤表面修饰的氨基共价结合，从而将核酸适体固定在光纤内壁。用精密注射仪将核酸适体注入空芯光纤，观察到光纤末端有明显液珠时停止充液，令溶液在光纤内孵育12小时，使适体充分结合在光纤内壁；此时检测体系处于初始状态，检测出的背景荧光值较低。当光纤中通过MDA-MB-231细胞悬液，核酸适体与细胞结合成更稳定的杂交体，荧光分子修饰的互补链脱离适体，在光纤中游离，使荧光强度增加。荧光恢复值与细胞浓度具有良好的线性关系。

Claims (5)

1.基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器，包括光源系统、光学准直系统、光纤传感系统和信号采集系统，其中，光源系统为一连续激光器(9)，输出功率可调；光学准直系统包括非连续衰减片(8)、反射镜镜A、B、C，45°倾斜放置的二向色镜(4)，长通滤光片(5)、第一光纤耦合透镜(3)、以及第二光纤耦合透镜(6)；光纤传感系统由精密三维调整台(1)及固定其上的空芯微结构光纤(2)构成；信号采集系统由大芯径的多模光纤(7)和一台光谱仪或单色仪(F)组成，用于采集空芯微结构光纤(2)中的光信号，其探测波长范围为185～1100nm，光学分辨率为0.14～7.7nm，其特征在于：利用核酸适体作为生物探针，将探针修饰在空芯微结构光纤(2)内壁，以空芯微结构光纤(2)作为信号转换系统。
2.根据权利要求1所述的基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器，其特征在于：所述的生物探针基于分子信标探针原理，分别在核酸适体的两端修饰荧光分子和淬灭分子。
3.根据权利要求1所述的基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的生化传感器，其特征在于：所述的生物探针基于阴阳探针原理，利用核酸链之间的竞争性杂交实现对待测物质的分析检测，由标记淬灭分子的适体链及标记荧光分子的互补链组成，其中适体链即识别分子，互补链即报告分子，与待测物质结合的适体链比互补链长多个碱基。
4.根据权利要求2所述的基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的检测方法，其特征在于：进行传感检测时，通过精密注射仪将待测物质注入内壁修饰核酸适体的空芯微结构光纤(2)；连续激光器(9)发出的光源通过非连续衰减片(8)和反射镜C将激光照射到二向色镜(4)上，第一光纤耦合透镜(3)将光源耦合进空芯微结构光纤(2)；根据荧光共振能量转移原理，荧光分子发出的荧光被近距离处的淬灭分子淬灭，使初始状态下的背景荧光值较低；当加入可以与核酸适体特异性结合的待测物质后，荧光分子与淬灭分子的间距增大，核酸适体的二级结构被打开，荧光强度恢复，且荧光恢复值与待测物质浓度呈良好的线性关系；空芯微结构光纤(2)中的荧光信号通过二向色镜(4)，反射镜A、B，经过550nm长通滤光片(5)过滤，通过第二光纤耦合透镜(6)耦合进光纤中；光谱仪(F)实时观测检测到的荧光光谱，通过检测荧光强度的变化来定量检测待测物质的浓度。
5.根据权利要求3所述的基于空芯微结构光纤和特异性核酸适体的检测方法，其特征在于：进行传感检测时，用精密注射仪将核酸适体注入空芯光纤，使适体充分结合在光纤内壁，初始状态检测出的背景荧光值较低；当核酸适体与细胞结合成稳定的杂交体，荧光分子修饰的互补链脱离适体，在光纤中游离，荧光强度增加，荧光恢复值与细胞浓度具有线性关系，光谱仪(F)实时观测检测到的荧光光谱，通过检测荧光强度的变化来定量检测待测物质的浓度。
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