CN115656132B - 一种复用光纤活性氧传感器及其检测活性氧浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型复用光纤活性氧传感器及其检测活性氧浓度的方法，该光纤活性氧传感器是一种适用于溶液中活性氧检测的传感器。采用光纤构建传感器，在锥形光纤表面修饰活性氧传感分子，利用该分子捕获溶液中的活性氧分子并产生化学反应，导致荧光变化，最后检测荧光信号，获得活性氧分子的数量信息。传感器使用后，通过近红外光照射又可以恢复其检测活性。该方法延长了传感器检测寿命，避免了检测活性氧时置换传感端子的繁琐操作，降低了检测成本，提高了检测稳定性，同时保证了荧光检测的高灵敏度特征。本发明可以实现对溶液中活性氧的快速、直接测量，应用范围广泛。

Description

一种复用光纤活性氧传感器及其检测活性氧浓度的方法

技术领域

本发明涉及生物活性分子检测技术领域，特别涉及一种复用光纤活性氧传感器及其检测活性氧浓度的方法。

背景技术

活性氧（ROS）的常见类型有羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O₂ ^·-）、单线态氧（¹O₂）以及过氧化氢（H₂O₂）等，并且紫外线、化学药品以及大气污染等都可以诱导生物内活性氧的产生。它们在体内的不断产生和累积会引起衰老、氧化损伤等多种问题。活性氧涉及多种生理和病理过程,是阿尔茨海默病、帕金森病、癌症等多种疾病的信号分子,活性氧浓度的检测可以评估这些疾病。活性氧也可以用来杀灭病菌病毒实现光动力治疗。 但活性氧半衰期短,活细胞释放量少,因此,快速准确地检测活性氧浓度对疾病的诊断和治疗至关重要。

当前检测活性氧的技术主要有分光光度法、电极测定法、电子自旋共振法等。上述技术虽然可以实现活性氧的检测，但仍存在诸多问题，例如：工作量巨大，操作繁琐、耗时，消耗试剂量大，灵敏度低，或者结果稳定性、重复性较差，选择性差等诸多问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种复用光纤活性氧传感器，利用锥型光纤修饰活性氧传感分子，制备出可复用的光纤活性氧传感探针，并分析了其应用传感性能，为活性氧的检测提供了新的思路。

技术方案：本发明提供了一种复用光纤活性氧传感器，其制备方法包括以下步骤：

步骤一、将石英光纤一端的保护层去除后进行拉锥处理，得锥形石英光纤锥；

步骤二、将锥形石英光纤锥形端用Piranha溶液浸泡，待锥形石英光纤芯羟基化后清洗、吹干，得羟基化光纤；

步骤三、将羟基化光纤放入碳酸钾的DMF溶液中搅拌；

步骤四、在步骤三所得混合物中加入溴代化合物，40-50℃反应8-9h即得复用光纤活性氧传感器。

优选地，步骤一中，所述石英光纤的芯径为400μm。

优选地，步骤一中，所述拉锥处理为将去除保护层的石英光纤的一端拉制成倾角>10°的锥形。

进一步地，步骤二中，所述Piranha溶液为浓硫酸和双氧水按照体积比3：1的比例混合制得；

进一步地，和/或，所述用Piranha溶液浸泡的时间为20-30min。

进一步地，步骤三中，所述碳酸钾的DMF溶液浓度为1mol/L。

进一步地，步骤四中，所述溴代化合物为9-(4-溴苯基)-10-苯基蒽。

本发明还提供了一种活性氧浓度的检测方法，包括以下步骤：

S1：将上述中任意一项所述的复用光纤活性氧传感器置入待测溶液中反应1-2min；

S2：将激发光源导入S1中所述反应后的复用光纤活性氧传感器进行照射，产生荧光；

S3：对S2中所述荧光的强度进行检测，根据测得的荧光强度与标准强度曲线对比，获得所述待测溶液的活性氧浓度。

进一步地，在所述S3之后，还包括：

S4：检测结束后，取出所述复用光纤活性氧传感器，对其红外加热即可恢复其活性氧浓度的检测功能。

进一步地，S4中，所述红外加热时间为4min。

进一步地，S2中，所述激发光源为1mW，400nmLED灯。

本发明的检测过程（图1）说明如下：

本发明检验过程为，首先将光纤拉锥并修饰9-(4-溴-苯基)-10-苯基-蒽获得光纤活性氧传感器，然后将所制得的光纤活性氧传感器插入样品中，传感探针被活性氧氧化后荧光发生变化，检测荧光变化获得活性氧产量。探针使用后经近红外光加热恢复传感器的检测特性。

本发明利用活性氧传感器检测活性氧分子的理论基础可由如下过程表示：

本发明中，锥型光纤是已被理论和实验证实了的光学传输器件。锥形光纤因为附加了光传输的高阶模式，能产生更强的倏逝波，利用倏逝波激发荧光分子，荧光传感灵敏度更高、抗干扰能力更强。被广泛研究和应用。

当被测分子与光纤传感表面的识别分子接触后发生反应，导致荧光逐渐减弱，只需检测荧光信号变化就能检测出溶液活性氧的浓度。修饰到光纤传感表面的溴代化合物苯基蒽能够和活性氧反应，在苯环内产生氧桥，进而导致分子荧光减弱。荧光减弱程度和活性氧的量相关联。因而溴代化合物苯基蒽可以用来检测活性氧的存在。

当检测完毕用红外照射传感器时，光纤传感表面的识别分子就能与检测分子分离，再次恢复其对活性氧的检测能力。溴代化合物苯基蒽和活性氧反应形成的内过氧桥缺乏热稳定性，在80℃以上的高温下又会发生断裂从而还原到原来的分子状态，同时释放出活性氧，利用这一特性，本发明制备的新型复用光纤活性氧传感器可以实现复用。

有益效果：与现有技术相比，本发明有以下显著优点：

1、和已有的活性氧检测技术不同，本发明借助于光纤倏逝波激发原理，激发荧光，并利用荧光分子和活性氧的反应导致的荧光变化，实现活性氧的荧光检测。因而激发效率更高，背景噪声更低，检测更灵敏。

2、本发明利用9-(4-溴苯基)-10-苯基蒽与活性氧结合后产生荧光信号变化的特点，并利用光纤传播光线和承载探针分子，与单纯的激发荧光分子探针方法相比，反应灵敏，可以光控复用，通用性强，延长了传感器检测寿命，避免了检测活性氧时置换传感端子的繁琐操作，降低了检测成本，在检测灵敏度和方便性上都有提升。

3、由该方法构建的新型检测系统结构简单、操作方便、灵敏度高，而且具有普适性和灵活性，能够实现较多环境下氧分子的检测，且可以反复利用，一旦成功应用将具有很高的社会经济价值。

4、本发明借助于光纤技术，并应用了荧光检测手段，而且兼具了复用性，实现了多种现有技术的有机结合，构建了全新的活性氧分子高灵敏检测体系，并研究了其应用传感性能，提高了灵敏度，并大大降低损耗，简化操作过程，为活性氧的检测提供了新的思路。

附图说明

图1是本发明的检测过程及原理图；

图2是本发明实施例1制备的光纤活性氧传感器外观示意图；

图3 是本发明实施例2的9-(4-溴-苯基)-10-苯基-蒽分子的吸收和荧光图；

图4是本发明实施例3的不同活性氧浓度下的荧光曲线图和峰值点图；

图5是本发明实施例4的光纤活性氧传感器的复用检验图和峰值点图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1：

光纤活性氧传感器的制备

1、Piranha溶液的配制：将浓硫酸和双氧水按照3：1的比例混合溶液，取100ml双氧水，300ml浓硫酸充分搅拌得到Piranha溶液。Piranha溶液高度亲水，可以彻底清除基底上的残余有机物。而用它处理过的样品表面会带有羟基。

2、含碳酸钾DMF溶液的配制：由于材料均能在DMF溶液中以任意比例互溶，取0.32g的二甲基甲酰胺，0.32g碳酸钾与适量蒸馏水一起混合获得含有碳酸钾的DMF溶液。DMF溶液是一种无色的透明液体，它对多种有机化合物和无机化合物都有着良好的溶解能力。用于与碳酸钾混合。

3、取若干根长度为10cm的芯径为400μm石英光纤，将石英光纤一端2-3cm的保护层除去，露出光纤芯。然后用拉锥机熔融拉锥。制备好的沸腾的Piranha溶液浸泡15mins使光纤芯羟基化，再用纯水清洗，用氮气吹干，得到羟基化光纤。

4、将这些带羟基的光纤加入到碳酸钾的DMF溶液中，充分搅拌均匀后再加入溴代苯基蒽化合物，置于电磁加热搅拌机中，40-50℃反应，反应时间为8h，之后取出干燥即可获得新型复用光纤活性氧传感器。新型复用光纤活性氧传感器外观如图2。

实施例2：

对本发明中9-(4-溴-苯基)-10-苯基-蒽分子和活性氧反应前后的吸收和荧光特性变化检测：

将苯基蒽溶于纯水中制成20μM的溶液，置于石英皿中，用卤素灯照射，同时利用光谱仪进行吸收性能检测。测荧光时，准备两份苯基蒽溶液，一份作为参照，另一份用25%的过氧化氢溶液氧化10mins，然后用1mW，400nmLED灯作为激发光源，激发石英皿中氧化前后的苯基蒽溶液，用光谱仪检测荧光特性。氧化前后的苯基蒽吸收图如图3a，荧光图如图3b。图3a和3b表明：还原态的苯基蒽分子在300-450nm光范围内有很强吸收，且400nm激发下有很强的荧光。当接触到H₂O₂后，迅速被氧化，在300-450nm范围内的光吸收大幅度的减小。而且，400nm的光对其激发产生的荧光很快减小，该特性为利用苯基蒽荧光检测活性氧奠定了技术基础。

实施例3：

用不同浓度的过氧化氢对实施例1中制备得到的新型复用光纤活性氧传感器的检测性能进行测试：

活性氧选用过氧化氢（H₂O₂）为范例，常温下为淡蓝色液体，用水将其稀释成不同浓度的过氧化氢来对新型复用光纤活性氧传感器的检测性能进行测试，浓度按照0%，5%，10%，15%，20%，25%配置，取600μl依次加至测试皿中，用新型复用光纤活性氧传感器插入不同浓度的瓶中，使新型复用光纤活性氧传感器与液体充分接触，1min后使用400nm的光进行通光照射，利用光谱仪检测不同浓度处理的新型复用光纤活性氧传感器的荧光，最后定量并分析出不同活性氧氧浓度与荧光强度的关系。结果如图4所示，图4a图显示了传感探针荧光光谱发生了变化，说明光纤探针表面的识别分子与H₂O₂反应生成了氧化产物，并且随着活性氧浓度的升高，修饰在光纤表面的识别分子溴基苯反应加剧，生成的更多的氧化产物，因此探针检测出的荧光信号也越弱。图4b图显示了探针荧光峰值信号活性氧浓度变化的趋势及其拟合曲线，结果显示探针的荧光和活性氧浓度成线性反比，活性氧浓度越高，荧光越低。

实施例4：

对使用后的新型复用光纤活性氧传感器进行恢复过程检测：

在活性氧检测完毕后，进行新型复用光纤活性氧传感器的复用性能检测，取25%活性氧处理过的新型复用光纤活性氧传感器进行红外激光照射，激光波长为808nm，功率为2w，照射时间分别为0.5mins，1.0mins，1.5mins，2.0mins，2.5mins，3.0mins，3.5mins，4.0mins，400nmLED光激发新型复用光纤活性氧传感器，光谱仪检测荧光信号强度，并绘制曲线。最后根据峰值的加热时间和强度获得峰值点图。结果如图5所示。其中图5a图为近红外光加热条件下荧光光谱的变化；b图为荧光峰值变化趋势统计。传感探针经980nm的红外激光照射后，检测出的光纤探针荧光信号随时间呈下降趋势，说明在加热条件下，修饰在光纤表面的活性氧敏感分子可以由氧化态恢复到还原态，变成荧光特性增强的分子。图5b图表明，利用该功率下的近红外光加热，约3分钟探针的荧光峰值达到最大，传感器基本恢复到初始状态。

上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种复用光纤活性氧传感器，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

步骤一、将石英光纤一端的保护层去除后进行拉锥处理，得锥形石英光纤锥；

步骤二、将锥形石英光纤锥形端用Piranha溶液浸泡，待锥形石英光纤芯羟基化后清洗、吹干，得羟基化光纤；

步骤三、将羟基化光纤放入碳酸钾的DMF溶液中搅拌；

步骤四、在步骤三所得混合物中加入溴代化合物，40-50℃反应8-9h即得复用光纤活性氧传感器；所述溴代化合物为9-(4-溴苯基)-10-苯基蒽。

2.根据权利要求1所述的复用光纤活性氧传感器，其特征在于，步骤一中，所述石英光纤的芯径为400μm。

3.根据权利要求1所述的复用光纤活性氧传感器，其特征在于，步骤一中，所述拉锥处理为将去除保护层的石英光纤的一端拉制成倾角>10°的锥形。

4.根据权利要求1所述的复用光纤活性氧传感器，其特征在于，步骤二中，所述Piranha溶液为浓硫酸和双氧水按照体积比3：1的比例混合制得；

和/或，所述用Piranha溶液浸泡的时间为20-30min。

5.根据权利要求1所述的复用光纤活性氧传感器，其特征在于，步骤三中，所述碳酸钾的DMF溶液浓度为1mol/L。

6.一种活性氧浓度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将权利要求1至5中任意一项所述的复用光纤活性氧传感器置入待测溶液中反应1-2 min；

S2：将激发光源导入S1中所述反应后的复用光纤活性氧传感器进行照射，产生荧光；

S3：对S2中所述荧光的强度进行检测，根据测得的荧光强度与标准强度曲线对比，获得所述待测溶液的活性氧浓度。

7.根据权利要求6所述的活性氧浓度的检测方法，其特征在于，在所述S3之后，还包括：

S4：检测结束后，取出所述复用光纤活性氧传感器，对其红外加热即可恢复其活性氧浓度的检测功能。

8.根据权利要求7所述的活性氧浓度的检测方法，其特征在于，S4中，所述红外加热时间为4min。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的活性氧浓度的检测方法，其特征在于，S2中，所述激发光源为1mW，400nmLED灯。