CN110243795B - 一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器 - Google Patents

一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器，其特征在于，包括：激光器；光开关，光开关的两输入端口分别连接一激光器；单多模光纤耦合器，单多模光纤耦合器的单模光纤连接光开关的输出端口，用于传递激发光以及激发与采集荧光；样品池，样品池内放置有阴离子除垢剂和两种荧光染料标记的待测样品；光纤探针，光纤探针上修饰有两种生物分子，光纤探针放置在样品池内，光纤探针连接单多模光纤耦合器的多模光纤；光电探测器，光电探测器连接单多模光纤耦合器的输出端，光电探测器与单多模光纤耦合器之间设置有双带通滤光片；控制系统，控制系统电连接光电探测器，本发明可以广泛应用于环境监测技术领域中。

Description

一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器
技术领域
本发明涉及一种全光纤生物传感器，具体是关于一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器，属于环境监测技术领域。
背景技术
水环境整体质量不高，污染事件频发是水环境危机的核心。近年来，频频曝光的水污染事件已成为制约社会发展的瓶颈，水污染事件屡禁不止，对生态环境和人体健康构成潜在危害，造成严重的社会和经济影响。目前，水环境中有毒污染物的监测技术需要用到例如气相色谱和高效液相色谱等传统的实验室仪器分析方法。这些大型实验室仪器分析方法具有精度高、重现性高和信息丰富等优点，但是同时存在着仪器价格昂贵、样品前处理过程复杂、需要专业技术人员操作和检测费用高等不足之处，且难以满足多指标检测和原位实时检测等要求。因此，开发和生产简单便捷的多指标分析方法或装置，对于预防和控制水体污染，保障生态安全和人体健康具有重要的现实意义。
运用激发光，在传感元件表面产生倏逝波的光学生物传感器是水质安全生物监测方面的研究热点和国际前沿。该类传感器利用倏逝场能量激发传感元件表面捕获的荧光分子，由此建立与待测样品中污染物浓度的定量关系，也称为倏逝波荧光生物传感器。由于倏逝场在光疏介质中呈指数衰减，通常渗透深度只有几百纳米，因此，能够有效隔离及削弱待测样品中的背景干扰，提高检测的灵敏度和选择性。同时，激发光在生物探测区域发生全反射，易于与激发出的荧光信号进行区分，有利于进一步提供检测灵敏度和检测污染物检出限。因此，该类传感器在复杂介质的水环境痕量有机污染物检测中具有优势。
多指标传感方法是生物传感器的一大发展方向，目前为止，多组分同时分析的方式可大致分为空间分隔方式或时间分辨方式，前者的基本原理是将相应的样品捕获物固定在不同的载体表面或载体的不同区域，利用空间位置的不同实现对多组分的同时检测，例如微阵列。后者为标记物识别模式，以不同的标记物标记不同组分，通过区分不同标记物的信号实现不同组分的识别。然而，现有的基于倏逝波的多指标传感方法多依赖于复杂昂贵的检测仪器，且多为“分别激发，分别检测”的模式，在实时检测上存在很大的困难。因此，结合倏逝波传感方法和双色荧光分析方法，开发出新型的倏逝波双色荧光全光纤生物传感器，具有十分重要的实用意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够实现不同荧光样品的激发和检测的倏逝波双色荧光全光纤生物传感器。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器，其特征在于，包括：激光器；光开关，所述光开关的两输入端口分别连接一所述激光器；单多模光纤耦合器，所述单多模光纤耦合器的单模光纤连接所述光开关的输出端口，用于传递激发光以及激发与采集荧光信号；样品池，所述样品池内放置有阴离子除垢剂和两种荧光染料标记的待测样品；光纤探针，所述光纤探针上修饰有两种生物分子，所述光纤探针放置在所述样品池内，所述光纤探针连接所述单多模光纤耦合器的多模光纤；光电探测器，所述光电探测器连接所述单多模光纤耦合器的输出端，所述光电探测器与所述单多模光纤耦合器之间设置有双带通滤光片，所述光电探测器用于将采集的荧光信号转换为电信号；控制系统，所述控制系统电连接所述光电探测器，用于对电信号进行分析处理得到实时的荧光信号。
优选地，所述样品池开设有进样口和出样口，所述进样口处设置有用于将荧光标记的待测样品通入所述样品池内的十位阀，所述出样口处设置有用于将反应后的废液排出所述样品池的蠕动泵；所述十位阀还电连接所述控制系统，所述控制系统通过所述十位阀控制待测样品的定量进样。
优选地，所述激光器采用半导体尾纤激光器。
优选地，两所述半导体尾纤激光器的波长分别为635nm和405nm。
优选地，所述双带通滤光片的中心波长为430nm和700nm，所述双带通滤光片的带宽为30nm。
优选地，所述光纤探针通过光纤连接器与所述样品池固定连接。
优选地，所述光纤探针采用石英光纤探针。
优选地，所述石英光纤探针光纤纤芯的折射率为1.456，光纤的数值孔径为0.22，光纤的芯径为600μm。
优选地，所述光开关内设置有硅基MEMS芯片。
优选地，所述光电探测器采用硅基光电探测器。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的倏逝波双色荧光全光纤生物传感器基于倏逝波和双色荧光分析原理，以两种不同波长的激光器作为激发光源，通过光开关控制两个激发光源的输出与两种荧光信号的收集，采用单多模光纤耦合器传递激发光以及激发与收集荧光，可实现两种波长荧光信号的同时采集与分析，采用全光纤的光学结构，具有结构简单，光传输效率高，抗干扰能力强的特点。2、本发明的倏逝波双色荧光全光纤生物传感器结构简单、体积小、荧光收集效率高、背景噪声干扰小，结合免疫分析原理，能够满足水体中多种污染物质的同时检测要求，为污染控制和管理，污染事故的快速处置提供有力的技术支持，可替代传统的双色荧光检测系统，也可作为高灵敏度双色荧光检测的μ-TAS系统强有力的组成部分。
附图说明
图1是本发明的整体结构示意图；
图2是本发明中光纤探针的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。
如图1所示，本发明提供的倏逝波双色荧光全光纤生物传感器包括激光器1、光开关2、单多模光纤耦合器3、双带通滤光片4、光电探测器5、光纤探针6、样品池7和控制系统8，其中，光纤探针6为两种生物分子修饰的锥形双功能生物探针。
两激光器1分别连接光开关2的一输入端口，光开关2的输出端口通过光纤连接单多模光纤耦合器3的单模光纤，光开关2用于控制两激光器1发射的激发光的输出以及两种荧光信号的收集，单多模光纤耦合器3用于传递激发光以及激发与采集荧光信号，单多模光纤耦合器3的多模光纤连接光纤探针6，光纤探针6设置在样品池7内，样品池7内放置有阴离子除垢剂(例如SDS溶液)和两种荧光染料标记的待测样品，待测样品的信号分子为两种荧光染料标记的特异性单克隆抗体。单多模光纤耦合器3的输出端依次设置有双带通滤光片4和光电探测器5，双带通滤光片4用于防止串扰和抑制散射的激发光，光电探测器5用于将采集的荧光信号转换为电信号。光电探测器5还电连接控制系统8，控制系统8用于对光电探测器5发送的电信号进行分析处理，得到实时的荧光信号。两激光器1发射的激发光分别通过光开关2经单多模光纤耦合器3引入光纤探针6，分别在光纤探针6表面产生倏逝波。样品池7中荧光标记的待测样品在倏逝波有效范围内分别被激发光激发产生荧光，部分荧光耦合回光纤探针6，单多模光纤耦合器3对耦合回的荧光进行收集，经双带通滤光片4滤光后，被光电探测器5接收，光电探测器5将荧光信号转换为可测的电信号发送至控制系统8进行分析处理，得到实时的荧光信号。
在一个优选的实施例中，样品池7开设有进样口和出样口，进样口处设置有十位阀95，用于将荧光标记的待测样品通入样品池7内；出样口处设置有蠕动泵10，用于将反应后的废液排出样品池7，以便检测不同的待测样品或清洗样品池7。十位阀9还电连接控制系统8，控制系统8通过十位阀9控制待测样品的微量定量进样。
在一个优选的实施例中，采用Cy5.5和PB(Pacific Blue，太平洋蓝)作为待测样品的目标荧光染料分子，其最大激发/发射波长分别为675/694nm和416/451nm，斯托克位移约为20～35nm。为避免激发光谱与发射光谱之间的串扰，两激光器1采用635nm和405nm的半导体尾纤激光器作为光源，同时选择中心波长为430nm(带宽为30nm)和700nm(带宽为30nm)的双带通滤光片4(四波段)，双带通滤光片4在635nm和405nm处的截止率大于5OD，在694nm和451nm处的透射率大于90％。
在一个优选的实施例中，光开关2采用2×1光开关，包括两个输入端口和一个输出端口，通过时间分辨效应控制两个波长的激发光交替输入，以实现两种荧光信号的收集；光开关2具有60分贝的串扰，能够将两个波长荧光信号的串扰减少到最小；光开关2内设置有硅基MEMS芯片，硅基MEMS芯片控制两激光器1发射的激发光交替进入单多模光纤耦合器3。
在一个优选的实施例中，单多模光纤耦合器3多模光纤的NA(数值孔径)为0.22，芯径为600μm；单多模光纤耦合器3的单模光纤为4μm，
在一个优选的实施例中，光电探测器5可以采用硅基光电探测器SOP-1000，硅基光电探测器SOP-1000具有体积小、价格低、灵敏度高的优点，能够满足小型化仪器的需要，在4个数量级的光功率范围内，信号值与光功率的线性系数为0.9882。基于3σ标准，硅基光电探测器SOP-1000的灵敏度可以达到50fW，满足微弱荧光信号的检测。硅基光电探测器SOP-1000还具有足够的稳定性，在0～100pW的光强度范围内重复性误差为0.9～3.5％。
在一个优选的实施例中，如图2所示，光纤探针6可以采用石英光纤探针，其中，石英光纤探针光纤纤芯的折射率为1.456，光纤的数值孔径为0.22，光纤的芯径为600μm，当去除石英光纤探针的石英包层后，将石英光纤探针放入样品池7内，样品池7溶液的折射率为1.33，溶液传播光的模数为1758。
在一个优选的实施例中，光纤探针6在样品池7中的固定可以采用光纤连接器例如FC(fiber channel，光纤接口)，其具有方便拆卸的优点。
在一个优选的实施例中，光纤探针6的光纤可以根据不同需求带有不同修饰功能基团例如羟基或氨基。该光纤的处理方法为削去光纤上的涂覆层，漏出纤芯部分，按照不同需求修饰功能基团，使用超纯水进行清洗和烘干。
下面通过具体实施例详细说明本发明的倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法：
1)光纤探针6由石英光纤制成，芯径为600μm，折射率为1.45，将5.5cm长的石英光纤去除2.5cm长的涂覆层，放入30％氢氟酸中腐蚀一端时间，得到锥角度为0.37、锥形部分长约0.5cm、芯径为200μm的组合型光纤探针6，使用刀片去除光纤探针上剩余的涂覆层。
2)在光纤探针6的表面修饰两种生物分子，即在光纤探针6上通过羟基化和硅烷化过程连接双功能基团，基团另一端连接BPA(双酚A)和2,4-D两种包被抗原，构成双功能生物探针。将修饰好的光纤探针6通过光纤连接器固定在样品池7中。
3)同时采用两种不同激发和发射波长的荧光染料对待测样品的高特异性抗体进行标记，5min后直接通入样品池7。由于抗原抗体之间的高度特异性，在预反应过程中部分荧光标记的抗体会分别与其对应抗原结合，剩余的游离抗体还含有活性位点，可以继续与光纤探针上修饰好的包被抗原结合。
4)两激光器1发射的两种波长的激发光通过光开关2进入单多模光纤耦合器3，在光开关2的时间分辨效应下，单多模光纤耦合器3将激发光交替传递至样品池7内的光纤探针6上，在光纤探针6表面产生两种倏逝波，并激发修饰在光纤探针6表面的包被抗原结合的标记抗体的荧光分子，产生两种不同波长的荧光。
5)部分荧光耦合回光纤探针6进入单多模光纤耦合器3，由双带通滤光片4滤除反射的激发光，仅使两种波长的荧光透过，荧光信号通过光电探测器5转换为电信号后，由控制系统8进行处理，从而基于间接免疫竞争反应，通过两种荧光信号的变化实现两种目标污染物的同时高效检测。
6)双功能生物探针可以通过样品池7内的SDS溶液进行再生，最后，通过PBS缓冲溶液冲洗SDS溶液，以便进行下一次检测。完成一次检测过程的时间小于20min。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (6)

1.一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法，其特征在于：
所述倏逝波双色荧光全光纤生物传感器包括：
两个激光器；
光开关，所述光开关的两输入端口分别连接一个所述激光器，所述光开关采用2×1光开关，包括两个输入端口和一个输出端口，通过时间分辨效应控制两个波长的激发光交替输入，所述光开关内设置有硅基MEMS芯片；
单多模光纤耦合器，所述单多模光纤耦合器的单模光纤连接所述光开关的输出端口，用于传递激发光以及采集荧光信号；
样品池，所述样品池内放置有两种不同激发波长和不同发射波长的荧光染料标记的待测样品和SDS溶液；
光纤探针，所述光纤探针上修饰有两种生物分子，所述光纤探针放置在所述样品池内，所述光纤探针连接所述单多模光纤耦合器的多模光纤；
光电探测器，所述光电探测器连接所述单多模光纤耦合器的输出端，所述光电探测器与所述单多模光纤耦合器之间设置有双带通滤光片，所述光电探测器用于将采集的荧光信号转换为电信号；
控制系统，所述控制系统电连接所述光电探测器，用于对电信号进行分析处理得到实时的荧光信号；
所述倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的制备步骤包括：
1)光纤探针由石英光纤制成，芯径为600μm，折射率为1.45，将5.5cm长的石英光纤去除2.5cm长的涂覆层，放入30％氢氟酸中腐蚀一段时间，得到锥角度为0.37、锥形部分长约0.5cm、芯径为200μm的组合型光纤探针，使用刀片去除光纤探针上剩余的涂覆层；
2)在光纤探针的表面修饰两种生物分子，即在光纤探针上通过羟基化和硅烷化过程连接双功能基团，基团另一端连接双酚A（BPA）和2,4-D两种包被抗原，构成双功能生物探针，将修饰好的光纤探针通过光纤连接器固定在样品池中；
3)同时采用两种不同激发波长和不同发射波长的荧光染料对待测样品的高特异性抗体进行标记，5min后直接通入样品池，由于抗原抗体之间的高度特异性，在预反应过程中部分荧光标记的抗体会分别与其对应抗原结合，剩余的游离抗体还含有活性位点，继续与光纤探针上修饰好的包被抗原结合；
所述倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法包括如下步骤：
1)两个激光器发射的两种波长的激发光通过光开关进入单多模光纤耦合器，在光开关的时间分辨效应下，单多模光纤耦合器将激发光交替传递至样品池内的光纤探针上，在光纤探针表面产生两种倏逝波，并激发修饰在光纤探针表面的包被抗原结合的标记抗体的荧光分子，产生两种不同波长的荧光；
2)部分荧光耦合回光纤探针进入单多模光纤耦合器，由双带通滤光片滤除反射的激发光，仅使两种波长的荧光透过，荧光信号通过光电探测器转换为电信号后，由控制系统进行处理，从而基于间接免疫竞争反应，通过两种荧光信号的变化实现两种目标污染物的同时高效检测；
3)双功能生物探针通过样品池内的SDS溶液进行再生，最后，通过PBS 缓冲溶液冲洗SDS溶液，以便进行下一次检测，完成一次检测过程的时间小于20min；
两种不同激发波长和不同发射波长的荧光染料分别为太平洋蓝（PB）染料和Cy5.5染料，太平洋蓝（PB）染料标记双酚A（BPA）抗体，Cy5.5染料标记2,4-D抗体。
2.如权利要求1所述的一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法，其特征在于，所述样品池开设有进样口和出样口，所述进样口处设置有用于将两种不同激发波长和不同发射波长的荧光染料标记的待测样品通入所述样品池内的十位阀，所述出样口处设置有用于将反应后的废液排出所述样品池的蠕动泵；
所述十位阀电连接所述控制系统，所述控制系统通过所述十位阀控制待测样品的定量进样。
3.如权利要求1所述的一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法，其特征在于，所述激光器采用半导体尾纤激光器。
4.如权利要求3所述的一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法，其特征在于，两个所述半导体尾纤激光器的波长分别为635nm和405nm。
5.如权利要求4所述的一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法，其特征在于，所述双带通滤光片的中心波长为430nm和700nm，所述双带通滤光片的带宽为30nm。
6.如权利要求1至5任一项所述的一种倏逝波双色荧光全光纤生物传感器的使用方法，其特征在于，所述光电探测器采用硅基光电探测器。
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