JPH11500826A

JPH11500826A - 固相結合アッセイのためのコンポジット・ウェーブガイド

Info

Publication number: JPH11500826A
Application number: JP8525862A
Authority: JP
Inventors: ライカート、ダブリュ．モンティー; エヌ．ヘロン、ジェイムス; ウォン、ス−クン; エー．クリステンセン、ダグラス
Original assignee: ユニバーシティーオブユタリサーチファンデーション
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1996-02-23
Publication date: 1999-01-19
Also published as: US20020034457A1; US5814565A; EP0812416A4; WO1996026432A1; AU693666B2; EP0812416A1; CA2213694A1; CA2213694C; AU4997696A; US5961924A; US6350413B1; US7537734B2

Abstract

(57)【要約】蛍光結合アッセイにおけるエバネッセント・センシングのためのステップ・グラディエント・コンポジット・ウェーブガイド（１００）は厚い基体層（１０２）と、同基体層（１０２）上に堆積された１つ以上の薄膜ウェーブガイド・チャネル（１０４）とを有する。

Description

【発明の詳細な説明】固相結合アッセイのためのコンポジット・ウェーブガイド発明の背景発明の分野本発明は生化学的固相結合アッセイ（Solid-state biochemical binding assa ys）のための装置、より詳細には同装置及びアッセイに使用するエバネッセント検出原理を利用した光学構造体に関する。従来技術全内反射（以下、ＴＩＲと称する）として知られる光学技術の特性を利用したイムノアッセイは１０^-10〜１０^-13モル以下の濃度の分析物を洗浄工程を実施することなく検出するための効果的なツールであることか証明されている。ウェーブガイド内を伝搬される光線ビームがウェーブガイドと、同ウェーブガイドより低い屈折率を備えた隣接する媒体との間のインターフェースにおいて全内反射する際、ＴＩＲ光線の電磁界の一部は隣接する媒体内に浅く侵入する。この現象は “エバネッセント透過（Evanescent penetration）”または“エバネッセント光線”と称される。エバネッセント光線の強度はウェーブガイド表面から遠ざかるとともに指数関数的に低減する。一般的に、結合アッセイは所望の分析物に対して特異的に結合する選択された “捕獲”分子（”Capture"molecule）の強力な親和力に基づいて実施される。当該技術分野において知られるように、捕獲分子／分析物ペアーは抗体／抗原ペアー若しくはその逆、または受容体／リガンド・ペアー若しくはその逆等であり得る。蛍光結合アッセイ（Fluorescent binding assay）では、抗体に対する分析物の結合は入力光線ビームによる励起に反応して蛍光を放射するトレーサー分子を用いて監視される。蛍光測定を実施すべくエバネッセント・ライト・フィールドの特性を利用する幾つかの技術のうちの１つを以下に詳述する。ＴＩＲを通じて光線ビームを伝搬する光学構造体上に抗体を不動化する場合、ＴＩＲによって生じるエバネッセント光線は不動化された抗体に結合（直接的または間接的）するトレーサー分子を選択的に励起すべく使用できる。この際、エバネッセント透過深度より深い溶液中を浮遊するトレーサー分子は励起されない。このため、同トレーサー分子は蛍光を発しない。シリカをベースとする光学材料またはポリスチレン等の光学プラスチックでは、隣接する媒体として水溶液を使用した際のエバネッセント透過深度は一般的に約１０００〜２０００オングストロームである。従って、蛍光の量は不動化された捕獲分子に結合したトレーサーの量を示す尺度となる。結合するトレーサーの量は存在する分析物の量に依存しており、これはイムノアッセイ・プトシージャの詳細に基づいて決定される。カーターに付与された米国再発行特許第３３，０６４号と、フラナガン他に付与された米国特許第５，０８１，０１２号と、ケックに付与された米国特許第４，８８０，７５２号と、アトリッジに付与された米国特許第５，１６６，５１５号と、スロバッキ及びラブに付与された米国特許第５，１５６，９７６号と、スロバッキ他が出願した欧州特許出願公開第０５１７５１６号及び欧州特許出願公開第０５１９６２３号とはエバネッセント検出原理を利用したイムノアッセイのための装置を開示している。イムノセンサ（Immunosensor）は１０^-13〜１０^-15Ｍ（モル）の濃度、さらに好ましくはこれ以下の濃度の分析物分子を反復して正確に検出し得ることが望ましい。現時点において、この感度は市販の実用的、かつ安価なイムノセンサでは得られない。更に、イムノセンサは複数のチャネルを１つのウェーブガイド基体上に有することが望ましい。即ち、イムノセンサは複数の分析物の測定と、一種類の分析物に関する複数の測定とを１つのウェーブガイド上で実施する能力を有することが望ましい。この種のイムノセンサは既知スタンダードを用いた自己較正と、特定の特異的診断プロシージャ（Differential diagnostic procedure）を実施すべく選択された複数の異なる分析物のパネルに関するスクリーニングとを可能にする。蛍光イムノセンサの感度を改善（検出限界を下げる）する１つのアプローチとしては、アイブス他(１９８７年に発行されたＮＡＴＯＡＳＩシリーズＥ(NATO ASI Series E)第１３２刊の３９１〜３９７頁に記載されているアイブス，ジェイ．ティ．；ライヘルト，ダブリュ．エム．；リン，ジェイ．エヌ．；ラディ，ブイ．；ラインエッケ．ディ；スシ，ピー．エイ．；ヴァンヴァンゲネン，アール．エイ；ニューヒィ，ケイ．；ヘロン，ジェイ．；ドライデン，ピー．及びアンドレド，ジェイ．ディ．によるエイ．エヌ．チェスタ、エス．マテルッチ及びエイ．エム．ヴェルガシェッジ版の光ファイバ・センサに記載されている“全内反射蛍光表面センサ”）が開示する非常に薄い（約１μｍの厚さ）ウェーブガイドの使用が挙げられる。この種の薄膜ウェーブガイドは更に高いエバネッセント強度及び５００〜１０００反射／ｃｍ以上の反射濃度を実現できる。しかし、薄膜ウェーブガイドを使用した検出限界の低減は同ウェーブガイドを構成する材料が非蛍光性及び低い伝搬損を有する場合にのみ実現可能である。最新のエバネッセント・イムノセンシング技術（“厚膜”ウェーブガイド）は本質的に非蛍光性を有するシリカ・ガラス（SiO₂）を使用している。高価なＵＶグレード石英に代表される最も純粋なグレードのシリカのみが蛍光を発する添加物及び不純物を含まない（ディエルカ他１９８７年）。更に、ＳｉＯ₂を石英基体上に堆積させることにより、シリカ・オン・シリカ・ウェーブガイド（Silica-on-silica waveguides）を簡単に形成できない。これは屈折率の差がＳｉＯ₂及び石英基体間に存在しないことに起因する。これに代わり、（１）シリカ基体より高い屈折率を有するガラス・ウェーブガイドを同シリカ基体上に形成するか、または（２）シリカ・ウェーブ・ガイドより低い屈折率を有する透明基体上に同シリカ・ウェーブガイドを堆積させる必要がある。従って、他の材料を使用する必要がある。薄膜ウェーブガイドはスローパー他（１９９０年に発行されたセンサ及びアクチュエータＢ１（sensors and Actuators B1）の５８９〜５９１頁に記載されている“平坦な燐酸インジウム・モノモード・ウェーブガイド・エバネッセント・フィールド・イムノセンサ”参照）と、ゾウ他（１９９１年に発行されたバイオセンサ及びバイオエレクトロニクス６（Biosensors and Bioelectronics 6 ）の５９５〜６０７頁に記載されている“イオン交換埋没型ウェーブガイドを使用するエバネッセント蛍光バイオセンサ及びピーク蛍光発光の強化”参照）とによって開示されている。しかし、両者の装置は１０^-10モルより更に低い分析物濃度の検出を達成できない。スローパーが開示するウェーブガイド構造はドープ剤をシリカ・ベース内へ拡散することによって形成されたグラディエントインデックス・タイプ（Gradient-index type）である。この場合、ドープ剤の濃度はインターフェースから遠ざかるとともに低減する。ゾウ他が開示するウェーブガイドは１つのチャネル（測定領域）を有するのみである。従って、伝搬されるＴＩＲ光線の量を増大させ、さらにはエバネッセント・フィールド強度（Evanescent field intensity）を増大させるとともに、複数の測定領域を有するエバネッセント・センシング・イムノアッセイ（Evanescent sen sing immunoassay）に効果的な光学的構造体が必要である。同光学構造体は１０^-13 Ｍ、より好ましくは１０^-15未満の分析物濃度を検出できることが望ましい。更に、商業用装置として十分に安価で、かつ実用的に製造でき、さらには非熟練者が反復性のある正確な結果を実現し得る前記の光学構造体を備えたイムノセンサが必要とされる。更に、ホルモンまたは他の生物学的分子とは異なるイオンを検出できるバイオセンサも必要とされる。発明の概要本発明はエバネッセント・センシング・アッセイの実施に効果的なステップ・グラディエント・ウェーブガイド（コンポジット・ウェーブガイドとも称される）を含む。同ウェーブガイドは屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料から形成され、かつ第１の表面を有する厚い基体と、屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成された薄膜とを有し、同薄膜は基体に隣接し、かつ同基体に対して動作可能に当接している。前記の光学基体は使用する材料に基づいて約０．３μｍ〜１０ｍｍまたはそれ以上の厚さを有する。薄膜は約０．３〜５μ ｍの厚さを一般的に有する。ウェーブガイドの厚さは１〜４つのモードのみの内部伝搬を提供すべく選択することが望ましい。更に、本発明はコンポジット・ウェーブガイド及び少なくとも１つの特異的結合分子を有するキットを提供し、同少なくとも１つの特異的結合分子は前記の薄膜に対して不動化され、かつ分析物に対して特異的に結合すべく形成されている。更に、キットはコンペティション・アッセイ（Competition assay）またはサンドイッチ・タイプ・アッセイ（Sandwich type assay）に使用すべく形成可能である。トレーサー分子は薄膜から隣接する水相内に侵入するエバネッセント光線によって励起され、さらには同エバネッセント光線による励起に応じて光電検出町能なトレーサー信号を放射すべく形成されている。好ましい実施の形態において、コンボジット・ウェーブガイドは基体と、同基体上に堆積された平行アレイの形態をなす複数の薄膜ストリップとを有し、キットは緩衝液内に含まれる既知濃度の分析物を含む第２の溶液をさらに有する。コンポジット・ウェーブガイドの好ましい実施の形態において、カップリング手段は入射光線を薄膜内にカップリングすべく同薄膜に対して完全に適合し、かつ動作可能に当接している。１つの実施の形態に基づくカップリング手段は薄膜に隣接する基体表面にエッチングされたグレーティングである。この種の物理的グレーティングに代わるグレーティング・タイプ・カプラはグレーティングのリッジのように一定間隔で基体上に配置された異なる屈折率ｎ₅を備えた複数のセグメントのアレイを有し得る。別の実施の形態では、比較的厚いウェーブガイド・カプラをコンポジット・ウェーブガイドの一端付近において基体の反対側に位置する薄膜ウェーブガイドの平面上に配置している。ウェーブガイド・カプラは厚い入力ウェーブガイド内をＴＩＲで伝搬された光線を薄いスペース層を通って薄膜ウェーブガイド内にエバネッセント透過によりカップリングすべく適切な光学材料から形成されている。好ましい実施の形態において、コンポジット・ウェーブガイドは薄膜を基体上に蒸着し、次いで薄膜ストリップをレジスト化合物でマスキングし、さらにはマスクされていない領域内の基体を露出すべく薄膜をエッチングすることによって形成されている。次いで、レジスト化合物は薄膜ストリップに対する結合分子の不動化を可能にすべく除去される。更に、本発明は特異的結合アッセイを実施するための装置を提供する。同装置はコンポジット・ウェーブガイドを光学ユニットとともに有し、同光学ユニットはウェーブガイド内における全内反射による伝搬を実現すべく、光線を同ウェーブガイド内に案内するために位置決めされた光源と、前記の光学構造体に隣接する領域からの光線を検出すべく配向された検出手段とを有する。本発明のＩＯＷはフェムトモル（１０^-18Ｍ）範囲の分析物濃度を検出し得る。前記の感度は他の薄膜エバネッセント・センサが実現し得る感度を遥かに上回るとともに、薄膜ウェーブガイド内における反射濃度強度の増大のみによって実現し得る感度を越えている。図面の簡単な説明図１Ａは本発明のコンポジット・ウェーブガイドの縦断面図である。図１Ｂは図１Ａに示す縦断面構造を有するコンポジット・ウェーブガイド・モジュールの平面図である。図２Ａはエッチングされた一体グレーティング・カプラを有するコンポジット・ウェーブガイドの側面図である。図２Ｂは薄膜ウェーブガイドの誘導モード（Guided mode）内への垂直入射光線ビームの回折を示す図２Ａのコンポジット・ウェーブガイドの拡大図である。図３Ａは一体ウェーブガイド・カプラを有する別の実施の形態に基づくコンポジット・ウェーブガイドの縦断面図である。図３Ｂは図３Ａのコンポジット・ウェーブガイドの斜視図である。図３Ｃは入力ウェーブガイド及び薄膜ウェーブガイドの各エバネッセント電磁界のオーバーラップを示す概略図である。図４Ａはマルチチャネル・コンポジット・ウェーブガイドを有するフロー・セルの一部を破断して示す平面図である。図４Ｂは図４ＡのＢ−Ｂ線における縦断面図である。図５は結合アッセイを実施すべく図４Ａ及び図４Ｂのフロー・セルを有する光学装置の概略図である。図６Ａ及び図６Ｂは図４の装置を用いて行った蛍光測定の結果を示すグラフである。図７はエッチングされたサンプル・ウェルを備えた別の実施の形態に基づくコンポジット・ウェーブガイドの平面図である。実施の形態の詳細な説明図１Ａに示すように、符号１００で示すコンポジット・ウェーブガイドは屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料から形成された基体１０２と、屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成された薄膜ウェーブガイド層１０３とを有する。ウェーブガイド層１０３は複数の結合分子１０６を有する。各結合分子１０６は頂面１０３Ａ上に不動化されるとともに、分析物に特異的に結合すべく形成されている。基体１０２は約０．３μｍ〜１０ｍｍまたはそれ以上の厚さＤ１を有する。その一方、薄膜ウェーブガイド１０３は約０．３〜５μｍの厚さＤ２を有する。図１Ａに示すように、基体１０２が比較的厚い（０．５ｍｍ以上）場合、同基体１０２は薄膜ウェーブガイド１０３内における光線の効果的な導波をサポートするために必要な光学特性を有する以外に、機械的支持体としても機能する。しかし、幾つかの実施の形態において、基体１０２は製造を容易にすべく比較的薄いことが好ましい。このようなケースでは、別の支持層（図示略）を光学構造体１０２（図示略）の真下に配置し得る。好ましい実施の形態において、基体１０２は二酸化珪素から形成されている。二酸化珪素は蒸着若しくは当該技術分野において知られている他の技術によって形成されたＳｉＯ₂薄膜と、石英（天然石英及び溶融石英または他の人工石英を含む）とのいずれか一方の形態をなす。そして、ウェーブガイド層はシリコン・オキシナイトライド（Ｓｉ_zＯ_xＮ_yまたは一般的に“ＳｉＯＮ”と表記される）から形成されている。“堆積ＳｉＯ₂（Deposited SiO₂）”という用語は堆積ＳｉＯ₂を石英／溶融石英等と区別すべく以下に使用する。二酸化珪素はｎ＝１．４７の屈折率を有するうえ、十分な純度の二酸化珪素は非常に低い蛍光性を示す。シリコン・オキシナイトライドは機械的耐性に優れるとともに、可視光線波長範囲内で透明であり、さらには実質的に非蛍光性を有する。更に、シリコン・オキシナイトライドは酸素の窒素に対する化学量論比に基づいて一般的に約１．５〜２．０の屈折率を備えている。別の好ましい実施の形態において、ＳｉＯＮはＳｉ₂Ｏ₃Ｎである。別の実施の形態において、基体１０２は屈折率ｎ₁を有するＳｉＯＮから形成され、ウェーブガイド膜１０３はｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を有するＳｉＯＮから形成されている。ＳｉＯＮ組成物の屈折率は窒素の割合によって制御される。即ち、基体のＳｉＯＮはウェーブガイド膜のＳｉＯＮより低い窒素の割合を有する。更に別の実施の形態において、基体１０２は屈折率ｎ＝１．３８を備えたＭｇＦ₂（フッ化マグネシウム）から形成され、ウェーブガイド層１０３は純粋な二酸化珪素薄膜である。ＭｇＦ基体は長い時間及び比較的高いコストを要する蒸着技術等によって形成される。このため、本実施の形態において、基体１０２は少なくとも１つの誘導モードの十分な伝搬を保証する十分な厚さを有すればよい。ＳｉＯＮウェーブガイド層１０３はＭｇＦ₂ウェーブガイドより効果的な基体に対する付着性を水溶液中において提供するため、同ＳｉＯＮウェーブガイド層１０３の使用は現時点において好ましい。しかし、ＭｇＦ₂ウェーブガイド／ＳｉＯ₂コンポジット・ウェーブガイドは非水性溶媒との併用に適し得る。好ましい実施の形態に基づく薄膜ＳｉＯＮを有する構造体において、基体１０２はシリコン・ウェハ支持体上に堆積されたＳｉＯ₂の層である。シリコン・ウェハ支持体上に堆積されたＳｉＯ₂層からなる基体１０２の表面は更に均一、かつ滑らかであり、同表面は堆積ＳｉＯＮ膜に更に滑らかな平面を形成する。このため、基体１０２をシリコン・ウェハ支持体上に堆積されたＳｉＯ₂の層から形成することは好ましい。このウェーブガイド表面の高い平滑度は石英または溶融シリカからなる基体上に堆積された薄膜ウェーブガイドと比べて伝搬損を少なくとも２倍低減する。図１Ｂにおいて、ウェーブガイド層は基体１０２の全長より短い複数のストリップ１０４として示されている。これは異なる複数のサンプル溶液のためのマルチプル・ウェーブガイド“チャネル”及び／または異なる複数の不動化された捕獲分子を有するためのマルチプル・ウェーブガイド“チャネル”を提供すべく設計されたウェーブガイド層の任意の構成である。さらに任意にて、コンポジット・ウェーブガイド１２０は３つのストリップ１０４をそれぞれ有する複数の矩形ウェル１０８Ａ，１０８Ｂ，１０８Ｃとして形成可能である。複数のストリップ１０４は少なくとも約５ｍｍの距離Ｄ３によって互いに分離されている。複数のウエル１０８Ａ，１０８Ｂ，１０８Ｃは基体１０２から上に向かって延びる壁１１０によって互いに分離されている。図１Ｂの装置はＳｉＯＮを基体１０２の全面に蒸着し、次いで薄膜ストリップ１０４に対応する領域をレジスト化合物でマスキングし、さらには基体１０２から露出されたＳｉＯＮを除去すべく同露出されたＳｉＯＮをエッチングし、そしてレジスト化合物を除去することによって形成し得る。図１Ｂにおいて、斜線領域１１２はエッチャントに露出されなかったウェーブガイドの領域を示す。次いで、結合分子１０６を薄膜ストリップ１０４に対して不動化する。これは結合アッセイの技術分野において知られている手段により実現し得る。これに代えて、複数のウェル１０８Ａ，１０８Ｂ，１０８Ｃはバックグラウンド溶液、較正溶液（既知分析物濃度）及びテスト・サンプル溶液（末知）のための互いに独立した流動コンパートメント（Flow-through compa rtments）としてフロー・セル・タイプ・オペレーションのために形成できる。前記の材料から形成した高品質コンポジット・ウェーブガイドは薄膜を基体の全面に堆積させるべくプラズマ増速化学蒸着(PECVD)を使用し、次いで薄膜を所望のストリップ以外の部分からリソグラフィーを介してエッチングすることによって形成できる。ＳｉＯＮの場合、ＰＥＣＶＤは窒素、亜酸化窒素、アンモニア及びシラン・ガスの混合物を用いて実施され、Ｓｉ_zＯ_xＮ_yの化学量論は前記の各成分の分圧を変えることにより変更できる。リソグラフィーを用いた工程では、市販のフォトレジスト化合物を使用するリアクティブイオン・エッチング（Reactive-ion etch;略してＲＩＥ）プロセスを用いることが好ましい。ストリップまたはチャネルとなるフィルムの領域はレジストによって被覆され、同領域の周辺に位置する領域は基体までエッチングされる。本実施の形態では、シップレイ・カンパニー（Shipley Co.）から販売されているＤＵＶネガティブトーン・フォトレジストＸＰ８９１３１（DUV negative -tone photoresist XP89131）が好ましく、エッチャントはＯ₂ガス及びＣＨＣｌ₃ ガスのプラズマである。更に、シップレイ・カンパニーから販売されているＸＰ２１９８と、ＩＢＭから販売されているＡＰＥＸ−Ｅと、ＯＣＧから販売されているＣＡＭＰ６とに代表されるポジティブトーン・レジスト（Positive tone resists）も適切である（これらの組成物の名称は全て登録商標名である）。これら全てのレジスト化合物は実質的にフェノール・ポリマーからなる化学的増幅タイプ（Chemical amplification type）である。ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）等の古いタイプのフォトレジストを使用し得る一方、化学的に増幅されたＤＵＶレジストは本発明の目的を実現する更に優れた結果を提供し得る。チャネルをウェーブガイド膜内にエッチングすべくプラズマ・エッチング、イオン・ミリング（Ion milling）またはウェット・エッチングを含む任意の他のエッチング技術を使用し得る。しかし、カップリング効率を増大すべく基体にエッチングしたグレーティングの使用を望む場合（図２Ａ及び関連する説明を参照）、ＲＩＥプロセスが好ましい。これは同エッチング・プロセスが高い異方性を備えたグレーティングの形成に重要であることに起因する。ＲＩＥエッチングは効果的なグレーティングの形成に最適である。その一方、ウェット・エッチングは不適切である。エッチングされたグレーティング・カプラを有するウェーブガイドの場合、チャネルをウェルとしてエッチングすべくＲＩＥプロセスを使用することは適切である。更に、薄膜ウェーブガイド・チャネルをウェット・リフトオフ・プロセス（We tlift-off process）によって形成することもできる。このプロセスでは、ウェーブガイドの基体をチャネル領域を露出するようにマスクし、次いでＳｉＯＮ薄膜をマスキング剤を含む表面全体に堆積させる。薄膜を堆積させた後、全表面はマスクを同マスク上に堆積したウェーブガイド膜とともに“リフトオフ”、即ち除去し、かつ前記の露出された石英上に堆積した膜を残すべく選択された溶剤中に浸漬される。ウェーブガイドを製造する全工程は非常に清浄な環境内、好ましくは少なくともクラス１０のスタンダードに適合したタリーンルーム内で実施すべきである。例１．ＳｉＯＮコンポジット・ウェーブガイドの製造ＳｉＯ₂上に１μｍの厚さのＳｉ₂Ｏ₃Ｎ膜を備えたウェーブガイドは以下の要領で製造される。１０．１６センチメートル（４インチ）の石英ウェハを含む加熱されたサンプル・ホルダをプラズマ増速化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）リアクタ内に配置する。そして、プロセス・ガスをＰＥＣＶＤ容器の外辺部からサンプル上に流動させ、さらには中央ポートを通じてＰＥＣＶＤ容器からポンプで排出する。堆積中、ＰＥＣＶＤリアクタを３００℃及び１．２５トル（Torr）に維持し、さらに５０Ｗの電力を１３．５６ＭＨｚジェネレータに供給する。ガス混合物は２７立方センチメートル毎分（ｓｃｃ）のシラン（ＳｉＨ₄）と、５００ｓｃｃｍの窒素と、２００ｓｃｃｍのアンモニアと、１３００ｓｃｃｍの亜酸化窒素とを実質的に含む。これらの物質の入口分圧（Inlet partial pressure）はそれぞれ１７ミリトル（mTorr）、３０８ミリトル、１２３ミリトル及び８０２ミリトルである。これらの条件下において、堆積速度は約５９０オングストローム／分であり、１μｍの膜は約１５分で形成された。これらのシリコン・オキシナイトライド膜はほぼＳｉ：Ｏ：Ｎ＝２：３：１の元素比と、ｎ＝約１．５３〜１．５４の屈折率とを有する。次いで、Ｓｉ₂Ｏ₃Ｎ膜をフォトレジストで被覆し、マスクし、さらには５ｍｍ間隔で形成された１ｘ６５ｍｍの大きさの互いに平行な９つのＳｉＯＮ膜ストリップを除く全ての部分を露出すべく現像する。マスクされなかったＳｉＯＮは石英ウェハまでエッチングする。フォトレジストを剥離し、次いでエッチングされたウェハを２３ｘ６９ｍｍの大きさの３つの矩形片を形成すべく切断する。各片は１μｍの厚さを備えた互いに平行な３つのチャネル・ウェーブガイドを有する。このうちの２つの外側チャネルのみを本明細書に開示するアッセイに使用する。コンポジット・ウェーブガイドは生化学的エバネッセント・センシング結合アッセイに適するの幾つかの特性を有する。これらの特性はアッセイに使用する溶剤（一般的に水を使用）に対する耐性能力と、ウェーブガイド内を伝搬される光線の単位距離当たりの損失量（ｄＢ／ｃｍで表される“伝搬損”）と、使用する励起波長の光線で照射した際のウェーブガイドの蛍光の固有レベル（トレーサー蛍光エミッションの帯域幅内で測定）と、ウェーブガイド−スーパーストレイト・インターフェース（Waveguide-superstrate interface）における反射数／ｃｍ（Ｎ_r）と、エバネッセント透過の適切な深度（ｄ_p）とを含む。例２．ＳｉＯＮウェーブガイドの特徴付けエッチングされたチャネル・ウェーブガイドの形状及び厚さを確認すべく走査電子顕微鏡を使用する。標準チャネルは光学的に滑らかな矩形エッジ及び均一な厚さを有する必要がある。チャネル・ウェーブガイドの光学的特徴付けを行うべぐ、ＨｅＮｅレーザーから６３２．８ｎｍラインのビームをプリズム・カプラを介してウェーブガイドに入射させる。一般的な実験において、ウェーブガイドの厚さ（ｔ_wg）、屈折率（ｎ_wg）、内反射角度（ｑ_wg）、ウェーブガイド−スーパーストレイト・インターフェースにおける反射数／ｃｍ（Ｎ_r）、透過深度（ｄ_p ）及び伝搬損（ｄＢ／ｃｍ）の数値をそれぞれ測定する。表１のデータは例１に概略を示す方法に基づいて形成された一般的なＳｉＯＮウェーブガイドについて測定した特徴を示す。更に、これらのウェーブガイドは高い物理的鮮明度(Highd egree of physical definition)と、低い伝搬損及びウェーブガイド固有の最小限の蛍光発光という所望の特性とを有する。例３．ＭｇＦ ₂ ／ＳｉＯ ₂ コンポジット・ウェーブガイドの製造ＳｉＯ₂／ＭｇＦ₂ラミネートをバルザーズＢＡＫ７６０高真空コーター（Balz ers BAK760 high-vacuum coater）内においてマルチポケット電子ビーム・ガン（Multipocket electron beam gum）を使用する電子ビーム蒸着によって適切に堆積させる。最初に、堆積チャンバを２マイクロトル（μTorr）まで減圧する。次いで、ラミネートを堆積させる機械的支持体としてのシリカ・チップを２００ ℃まで加熱する。チャンバ内の圧力は堆積前におけるシリカ・チップの加熱によって３.８マイクロトルまで上昇した。回動可能なソース・カルーセル(Source carousel）内に位置するモリブデン及びグラファイトで内面をそれぞれ被覆した複数の炉の中に、原材料、即ち９９．９％の純度のＭｇＦ₂及び９９．９９９％の純度のＳｉＯ₂をそれぞれ加える。両原材料をシャッタを閉鎖した状態で堆積温度まで加熱する。低速で移動する１０ｋＶ（キロボルト）電子ビーム（約１２ｍｍ²の楕円スポット・サイズを有する）を使用することにより、ＭｇＦ₂を最初に蒸発させる。次いで、ＳｉＯ₂を同様に蒸発させる。ＭｇＦ₂及びＳｉＯ₂の堆積速度はオシレーティング・クリスタル・モニタ（Oscillating crystal monito r）を使用することにより、２０オングストローム／秒及び１０オングストローム／秒にそれぞれ制御する。０．３６μｍの厚さのＭｇＦ₂膜は３分で堆積された。更に、１．０μｍのＳｉＯ₂膜は１６分で堆積された。ウェーブガイドの物理的部分を形成した後、複数の特異的結合分子、即ち選択された分析物に対して特異的に結合する特性を有する分子を薄膜ウェーブガイド・チャネルの表面上に不動化する。この種の特異的結合分子は対応する分析物に対して特異的に結合する抗体及び受容体分子等またはこれらのフラグメントである。分析物である特定の抗体を検出するための抗原等の逆のペアーも適する。他の種類の結合分子／分析物ペアーと、結合分子を不動化する手段とは当業者にとって明白である。結合分子を不動化する好ましい方法を以下に詳述する。図４Ａ及び図４Ｂは製造方法及び特徴付けを例１及び例２においてそれぞれ詳述する２チャネル・ウェーブガイドを備えたフロー・セルを示す。コンポジット・ウェーブガイド１００は一対のブラック・シリコーン・ゴム・オーリング・ガスケット４０６によって互いに離間された底板４０２及び頂板４０４の間に保持されている（図４Ｂ参照）。各ガスケット４０６は頂板内にフライス削りされた対応する溝４０６Ａ内に配置され、さらには長手方向に延びるフロー・チャネル４０８を画定している。フロー・チャネルは対応する入口ポート４１０Ａ，４１２Ａ及び出口ポート４１０Ｂ，４１２Ｂを有する。矢印４０９はチャネル４０８内を流動する液体の流動方向を示す。更に、各フロー・チャネルはカップリング・プリスム４１６を配置するための孔４１４を有する。ウェーブガイドを支持し、かつシリカ・チップ支持層を通じたウェーブガイド底部のクリアな視界を提供すべく窓４１８が底板の内側に形成されており、同窓４１８は底板にフライス削りされている。フロー・セルを構成するアルミニウム部品は迷光を吸収すべく黒く、かつ平坦であることが望ましい。カップリング・プリズム（カール・ラムブレット・カンパニーから入手した４ｍｍの幅及び１０ｍｍの高さを備えた面取りされた４５−４５−９０ＬａＳＦプリズム，ｎ_p＝１．８３）をＧＴＥ１１８ＲＴＶシリコーン・ゴム・セメントを使用して窓４１４の内側の所定位置に固定してある。一連のフインガ・ネジ（Finger screws）（図示略）は頂板４０４及び底板４０２を基体１０２上に保持し、さらにはプリズム４１６に加えるカップリング・プレッシャを維持すべく使用される。ポリエチレンねじ込み式チュービング・コネタタ（Polyethylene screw-in tubing connectors）、テフロン・マイクロチュービング（TEFLON microtubing）及び使い捨てシリンジ（Disposable syr inges）をサンプル供給システム（図示略）として使用する。各チャネル４０８のサンプル体積は３００マイクロリットルである。ウェーブガイドを水相スーパーストレイト（Aqueous superstrate）に対してカップリングするプリズムはウェーブガイドをフロー・セルの底板上に配置し、基体の反対側に位置するウェーブガイド表面を測定に使用する緩衝液で濡らし、さらには頂板を同頂板に取付けられたプリズムとともに濡れたウェーブガイド上に配置することを含む。隆起チャネル・ウェーブガイド構造体（Raised-channel waveguide structure）の効果としては、軽い圧力をカップリング・プリズムに加えることにより、効果的なプリズム・カップリングを容易に実現できる点が挙げられる。２つのモデル・システム内におけるエバネッセント結合アッセイは１９９３年に発行されたＳＰＩＥ第１８８５刊（蛍光センシング技術における進歩）の２８〜３９頁に記載されているヘロン他による“平面ウェーブガイドを使用する蛍光イムノセンサー”と、米国特許出願第０８／０６４，６０８号及び米国特許出願第０８／２６３，５２２号とに開示されているフォーマットに類似するデュアル・チャネル・アッセイ・フォーマットを使用して図４Ａ及び図４Ｂに示すフロー・セルを用いて実施した。例４．薄膜ウェーブガイド・フロー・セルを使用するモデル・アッセイ第１のモデル・システム、即ち直接結合モデル・システムでは、ウェーブガイド表面上に不動化されたアビジンに対する蛍光トレーサーでラベル付けしたヒオチン化抗体（Biotinylated antibody）の結合を測定する。使用する抗体はスタンダード・ハイブリドーマ技術を用いて形成した９−４０と称される抗フルオレセイン抗体（Anti-fluorescein antibody）である。９−４０抗体を製造業者のプロシージャ（バイオロジカル・ディテクション・システムズ（Biological Det ection Systems））に基づいて染料Ｃｙ−５（λ_abs,max＝６５０ｎｍ、λ_em,ma _x ＝６６７ｎｍ、ｅ_max＝２ｘ１０⁵Ｍ^-1ｃｍ^-1）でラベル付けした。ラベル付け効率としては、１つの蛋白質分子に対して染料は約４つであった。アビジンをウェーブガイド表面に吸着させるべく、未処理の親水性ＳｉＯＮからなるＩＯＷ表面を燐酸緩衝生理食塩水（略してＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解した０．２ｍｇ／ミリリットルのアビジン溶液（シグマ（Sigma）から入手）で８時間処理する。Ｃｙ−５でラベル付けした９−４０の一部をＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（N-hydroxy-succinimidobiotin）（シグマから入手）を用いてビオチン化する。より詳細には、２０倍モル過剰量（20-fold molar excess）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９（ＣＢＢ）に含まれる９−４０の１ｍｇ／ミリリットル溶液に対して加える。この混合物を室温で２時間反応させ、さらには反応生成物（ビオチン化され、かつＣＹ−５を結合した９−４０）をＰＢＳ内で平衡を保ったＰＤ−１０カラム（ファーマシア：Pharmacia）を使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって精製する。アッセイの第２のタイプは間接的サンドイッチ・タイプ・アッセイである。間接的サンドイッチ・タイプ・アッセイでは、不動化された抗フルオレセイン抗体（抗体９−４０）に対するフルオレセインを結合した浮遊するＢＳＡ（Free flu orescein-conjugated BSA）の結合はトレーサーとしてＣｙ−５を結合した抗ＢＳＡ抗体（Anti-BSA antibody）を用いて測定する。不動化された９−４０抗体を有するＩＯＷ表面を以下の要領で準備する。リン他（Lin et al.）（１９８０年）が開示する方法に基づき、不動化前の９−４０をクェン酸緩衝液（ｐＨ３）内において１時間にわたって予備酸処理し、次いで同９−４０を２．３ｘ１０^-7 Ｍ（０．０３ｍｇ／ミリリットル）の濃度のＰＢＳ内において再構成する。ＳｉＯＮからなるＩＯＷを１％ジクロロジメチルシラン（略してＤＤＳ、シグマより入手）で処理し、さらには脱イオン水中で３回リンスし、次いで予備酸処理した抗体９−４０の溶液内に室温で３時間浸漬する。マウス・モノクローナル抗ウシ血清アルブミン抗体（Murine monoclonalanti- bovine serum albumin antibody）（抗ＢＳＡ、シグマより入手可能）を抗体９ −４０に関連して詳述した方法を用いてＣｙ−５でラベル付けする。ウシ血清アルブミン（シグマより入手）をフルオレセイン・イソシオシアネート（Fluoresc ein isothiocyanate;略してＦＩＴＣ、シグマより入手）でラベル付けする。２０倍モル過剰量のＦＩＴＣをＣＢＢに含まれるＢＳＡの１ｍｇ／ミリリットル溶液に加える。この混合物を室温で１時間反応させ、次いで複合物をＰＢＳ内で平衡を保ったＰＤ−１０カラムを使用して精製する。ラベル付け効率としては、１つのＢＳＡ分子に対してＦＩＴＣグループは約２つであった。アッセイはＦＩＴＣ（λ_abs,max＝４９２ｎｍ）の吸収帯を遥かに上回る波長、即ち６３２．８ｎｍにおける励起を用いて実施したため、ＦＩＴＣは９−４０に対するハプテンとしてのみ機能する（蛍光タグとしては機能しない）。アッセイを実施すべく、前記の方法でコーティングしたＩＯＷを図４に示すフロー・セル内に取付け、さらにはＣＣＤカメラ５０４に付随するスペクトログラフ５０２のコレクション通路内に位置する回転ゴニオメータ（図示略）上に配置する（図５参照）。ゴニオメータの使用は任意であるが、同ゴニオメータはレーサー・ビームをウェーブ・ガイド内にカップリングさせる最適なカップリング角度を求めるための実験セットアップに効果的である。最適なカップリング角度を決定し、さらには装置を標準化した後、ゴニオメータはアッセイの実施に不必要である。入射光線はＨｅＮｅレーザー（メレス・グリオ（Melles Griot）が製造）のレッド・ライン（６３２．８ｎｍで６ｍＷ）であり、同レッド・ラインはデュアル・ビーム５０６に分割され、さらにはコンポジット・ウェーブガイドの２つのチャネル１０４内にプリズムを介して同時に入射される。これにより、基準チャネル及びサンプル・チャネルを励起する。検出を実施すべく、各チャネル内の１ｍｍ幅の誘導モード（1mm wide guided modes）をスペクトログラフの入口スリットに対して直交するように配向した。２つの平行ストリーク（Streaks）の１ｍｍの長さのセクションから放射された光線はスペクトログラフ５０２のスリット上に取付けられた５０ｍｍのｆ／５．６カメラ・レンズを用いることにより、フロー・セルの底板４０２内の窓４１８を通じて結像させる。集められた光エミッションは７００ｎｍにおいてセンターリングされたシングル・グレーティング・モノクロメータ５０２（スペックス１６８１ｃミニメート２（SPEX 1681c Minimate-2）、ｆ／３．９、溝数３００／ｍｍ）を使用することにより波長分散され、さらには熱電冷却されたＣＣＤ検出器５０４（フォトメトリクス・シリーズ２００）上に案内され、さらには基準領域５１０及びサンプル領域５１２を含むイメージ５０８を形成する。基準イメージ領域５１０及びサンプル・イメージ領域５１２はそれぞれ独立して結像され、かつ垂直方向に統合され、さらにはマッキントッシュIIｘコンピュータ上においてそれぞれ強度ｖｓ.波長を示す基準スペクトル５２０及びサンプル・スペクトル５２２に変換される。前記の両アッセイは同一の一般的方法に基づいて実施された。即ち、１）捕獲蛋白質（Capture protein）をサンプル・チャネル及び基準チャネルの各表面上に不動化し、２）ハプテン−キャリア蛋白質複合体（蛍光トレーサーを含む）のアリコートをサンプル・チャネルに加え、さらには３）これと同時に同一濃度の蛍光トレーサー（ハプテンを含まない）を基準チャネルに対して加える。各測定はＰＢＳ緩衝液のベースライン・スペクトルをサンプル・チャネル及び基準チャネルの両方において集めることから始まる。最も薄い分析物溶液から分析を行うこととし、表１に示す１ミリリットルのサンプル溶液及び基準溶液をそれぞれフローセル内に注入する。各溶液をアッセイ１の場合には２分間、そしてアッセイ２の場合には５分間にわたってウェーブガイド表面でインキュベートし、次いで両チャネルの１０秒スペクトログラフ・イメージ（10 sec spectrograp h images）を集める。このプロセスは最も濃い溶液のアッセイが終了するまで数回繰り返される。全てのＣＣＤイメージはサンプル・チャネル及び基準チャネルの体積を満たす蛍光分析物による洗浄工程を実施することなく集められる。各測定において得られたＣＣＤイメージから形成された基準スペクトル及びサンプル・スペクトルは６５３〜６９３ｎｍに統合される。これらのデータに基づいて結合曲線を形成する。結合曲線は基準の面積強度に対するサンプルの面積強度の比（Ratio of the integrated intensity of the sample to that of the referen ce）をそれぞれ求め、さらには同比を分析物のバルク濃度の関数としてプロットすることによって形成される。この種の放射測定は２つの影響、即ちトレーサーの非特異的結合と、バルク蛍光の寄生励起（Parasitic excitation of bulk flu orescence）とを補償する。図６Ａ及び図６Ｂは２つのアッセイから得られた結果を示す。同結果は２チャネルＳｉ₂Ｏ₃Ｎ薄膜ウェーブガイド・フロー・セルを使用することにより、３ｘ１０^-15Ｍという低い濃度の分析物を検出し得ることを示す。これらの測定値は前記のスローパー他またはゾウ他が開示する薄膜ウェーブガイド・イムノセンサの少なくとも３．３ｘ１０⁴倍の感度を有し、さらには前記のヘロン他が開示する厚膜センサの少なくとも３３倍の感度を有する。例４に開示するプリズム・カップリングは効果的であって、かつ簡単なうえ、研究室内実験における使用に適する。しかし、この種の装置は比較的高価であり、医療現場で使用する光学ユニット（Point-of-care optical unit）とともに使用する使い捨てＩＯＷモジュールとしては理想的でない。更に、プリズム・カップリングはプリズムに加える正確な圧力と、入射レーザー・ビームの正確なアライメントとを必要とする。前記の問題点を解消した別の実施の形態に基づくカップリングは基体の反対側に位置するウェーブガイド表面にエッチングするか、またはウェーブガイドに隣接する基体にエッチングしたグレーティングを提供することによって実現される。現時点における好ましい実施の形態としては、基体にエッチングしたグレーティングが挙げられる。図２Ａに示すように、基体１０２は薄膜１０３に当接する表面１０２Ａにエッチングされたグレーティング２００を有する。結合分子１０６は光線ビームの進行方向に沿ってグレーテイング２００の下流側において不動化されている。任意にて、第２のグレーティング（図示略）を光線ビームの進行方向に沿って不動化された結合分子の下流側において基体１０２内にエッチングし得る。第２のグレーティングはウェーブガイドの光学的特徴付けを目的とするものであり、蛍光結合アッセイには必要ない。基体にエッチングしたグレーティングを使用することにより、光線を装置の後ろ側から効果的に入射させ得るうえ、ウェーブガイド表面に結合した巨大分子による影響を受けることがないため、同グレーティングは効果的である。更に、堆積及びチャネル・ウェーブガイドのエッチングを実施する前に、グレーティングを基体内にエッチングすることは製造上に観点から効果的、かつ経済的である。エッチングされたグレーティングによる入射光線のカップリング効率は間隔、プロフィールまたはブレーズ（Blaze）と、溝のアスペクト比とに基づいて変化する。これらのパラメータは入射（励起）光線の波長と、スーパーストレイトの屈折率と、ウェーブガイドの厚さとに基づいて従来の技術で最適化する必要がある。このケースでは、ｍ＝０モードの薄膜ＳｉＯＮウェーブガイドに対する６３２．８ｎｍの垂直入射レーザー・ビームのカップリング（θ＝８３度；図２Ｂ参照）に対して、約０．４２μｍのグレーティング・ピリオドＤ４が算出された。別のカップリングは光線をウェーブガイド・カプラから精密に形成されたスペース層を横切ってコンポジット・ウェーブガイド内へエバネッセントによりカップリングすべくエバネッセント透過原理を使用する（図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃ参照）。ウェーブガイド・カプラは薄膜の露出面に隣接するコンポジット・ウェーブガイドの頂面に取付けられている。プリズム・カプラ同様に、ウェーブガイド・カプラは特異的結合分子を不動化した領域内まで延びていない。図３Ａに示すように、ウェーブガイド・カプラ３００は屈折率ｎ₃を備えた材料から形成された比較的厚い層（１ｍｍ以上の厚さ）からなる入力ウェーブガイド３０２と、屈折率ｎ₃及びｎ₂より小さい屈折率ｎ₄を備えた薄いスペース層３０４とを有する。入力ウェーブガイドは入力レーザー光線を入射させるための入射エッジと、同入射エッジ内への入力ビームの容易なエンド・カップリングを可能にする十分な厚さＤ５とを有する。スペース層は厚さＤ６を有し、同厚さＤ６は導波された最大限の光線を入力ウェーブガイドからコンポジット・ウェーブガイドの薄膜内にエバネッセント・カップリングすべく選択されている。カップル・モード理論（Coupled mode theory）に基づき、互いに隣接する２つのウェーブガイドのエバネッセント領域か両ウェーブガイドを分離する低い屈折率を備えた領域内において互いに重複している場合、一方のウェーブガイド内を伝搬された光線を隣接する他方のウェーブガイド内に同期してカップリングできる（図３Ｃ参照）。カップリング効率は２つのウェーブガイドの間隔と、各モード伝搬定数（Modal propagation constant）と、相互作用距離（Distance of the interaction）とに依存している。カップリング効率は相互作用距離の余弦に基づいて変化するため、同カップリング効率は特定の距離において理論的には１００％に達する。従って、同期型エバネッセント・カップリング装置は十分に効果的である。最大のカップリング効率を達成すべく、スペース層の厚さは以下の数式に基づいて調整する必要がある。Ｋ₁＝（ｊ＋１）π／２，（ｊ＝０，１，２．．．）上記の数式において、Ｋはカップリング定数であり、かつ屈折率ｎ₁，ｎ₂，ｎ₃ ，ｎ₄と、入力光線の波長λと、薄膜ウェーブガイド、入力ウェーブガイド及びスペース層の各厚さＤ２，Ｄ５，Ｄ６とに依存している。薄膜ウェーブガイドでは、１つまたは僅かな数の最低のモード（好ましくは、ｊ＝０〜約１０であり、ｊ＝２０を越えない）をウェーブガイド内において伝搬する。好ましいウェーブガイド・カプラは前記の低いモードで伝搬されたレーザー光線の伝搬量を増大すべく形成されている。シリコン・オキシナイトライド・コンポジット・ウェーブガイドでは、スペース層はＳｉＯ₂から形成できる。スペース層３０４はエピタキシャル成長により堆積させることが望ましく、これにより同スペース層３０４の厚さを堆積時に非常に正確に制御できる。コンポジット・ウェーブガイドの製造における全てのエピタキシャル処理工程及びエッチング工程を終了した後、入力ウェーブガイド３０２をスペース層の頂部に取付ける。入力ウェーブガイドはルチル、ジルコニアまたはハイインデックス・ガラス（High-index glass）等の高い屈折率を有する材料から形成され、さらにはほぼｎ₃の屈折率を備えたインデックスマッチング・セメント（Index-matching cement）を用いてスペース層３０２に接合できる。このアッセンブリは比較的安価であり、かつ１度だけ使用する使い捨てモジュールに適する。図３Ａに示すように、レーザー光線は入力ウェーブガイドの入射エッジ内に角度θ’でフォーカスすることが好ましく、角度θ’は入力ウェーブガイド及びスペース層の間のインターフェースにおける全内反射のための臨界角より１度または２度小さい。前記の角度を有するビームの入射はエバネッセント・テール（Ev anescent tail）内における内部伝搬された光線の割合を増大させ、これによりエバネッセント強度を増大する。別の実施の形態では、一体成形されたサンプル・ウェル７０２，７０４，７０６（図７参照）を備えたＩＯＷを提供する。各サンプル・ウェル７０２，７０４，７０６はマルチプル薄膜ウェーブガイド・チャネル１０４を有し得る。好ましい実施の形態では、ウェルを囲む壁７００は基体光学材料からなるサブミクロン・クラッディング・フィルム(Submicron cladding film of the substrate optica lmaterial)をコンポジット・ウェーブガイド上に層状に重ね、さらには適切にマスキングし、次いでクラッディングをＳｉＯＮウェーブガイド層までエッチングすることによって形成されている。これらの工程は特異的結合分子を不動化する前に実施される。これによって形成されたサンプル・ウェルは物理的に境界が画定された複数の領域を提供する。異なる複数の抗体を同複数の領域内にそれぞれ不動化するか、または異なる複数の溶液（例：バックグラウンドまたはコントロール・サンプルｖｓ.テスト・サンプル）を同複数の領域内にそれぞれ加え得る。図示するボックス型リザーバに代えて、開放端を有する長手方向に延びるフロー・チャネルを形成すべく同一の技術を使用できる。更に、リザーバ壁材料をコンポジット・ウェーブガイド上に層状に重ねる代わりに、リザーバ壁またはフロー・チャネル壁を独立した頂板上に形成すべく同一の技術を使用できる。現時点において、ウェーブガイド表面に対する特異的結合分子の不動化の化学的作用に関連する２つの別の要因が感度に影響し得ると考えられる。これらの要因としては、１）薄膜表面（任意のサンプル・ウェルの壁を含む）に対する非特異的蛋白質結合の相対量と、２）不動化された結合分子の分析物／トレーサー結合能力とが挙げられる。好ましい実施の形態に基づくマルチチャネルＩＯＷでは、ＩＯＷ表面は複数のチャネル間におけるトレーサー信号の重大な重複を招来し得る非特異的結合を最小限に抑制すべく処理されている。重複の問題は１つのＩＯＷに含まれるチャネル数の増大にともなって急速に悪化する。この問題を６チャネル・ウェーブガイドを例として以下に詳述する。６チャネル・ウェーブガイドは対応する３つの分離したウェル内に配置された互いに隣接する３つのチャネル・ペアに分割されている。そして、抗ＣＫ−ＭＢ（anti-CK-MB）が各ペアの一方のチャネルに対して不動化されており、さらには抗ＣＫ−ＭＭ（anti-CK-MM）が各ペアの他方のチャネルに対して不動化されている。このように形成されたＩＯＷは２つの異なる分析物、即ちＣＫ−ＭＢ及びＣＫ−ＭＭの結合の同時較正測定（Simultaneous calibrated measurement）を可能にする。しかし、非特異的結合の量が特異的結合の量の約５％であると仮定した場合、抗ＣＫ―ＭＢを共有結合により不動化させたチャネルは非特異的に吸着された抗ＣＫ−ＭＭによって約５％汚染される。逆に、抗ＣＫ−ＭＭを不動化させたチャネルは非特異的に吸着された抗ＣＫ−ＭＢによって約５％汚染される。従って、この種の２分析物用ＩＯＷ（2-analyte IOW）を使用した場合、２つのチャネル間に約１０％のクロストークが存在し、同クロストークはバックグラウンド・レベルを望ましくないレベルまで既に増大させている。４分析物用ＩＯＷ（4-analyte IOW）（１２個のチャネルを有する）では、この種のクロストークの影響を受けたバックグラウンドは約３０％増大し得る。これは検出感度を大きく低減させる。分析物の種類の増大にともなって問題も明らかに深刻になる。このため、特異的結合分子をチャネルに対して共有結合で不動化する前に、非特異的結合の量を特異的結合の量の１％以下に低減するコーティングで同チャネルを被覆することが望ましい。分析物結合部位の総数を増加させる方法としては、分析物結合分子を部位特異的に不動化することが挙げられる。Ｆ（ａｂ'）₂等の抗原結合フラグメントの場合、これはペンダント・マレイミド・グループ（Pendant maleimido group）を有するベース・コーティングを提供することによって実現される。Ｆ（ａｂ'）₂ フラグメントはＣ−ターミナル・エンドにフリー・チオール・グループを含むＦａｂ'フラグメントを形成すべく還元される。そして、同チオール・グループはＦ（ａｂ'）₂フラグメントをマレイミド・グループに対して共有結合すべく容易に反応する。ペンダント・マレイミド・グループを有するコーティングが前記の非特異的結合を阻害することが望ましい。例えば、米国特許出願第０８／０６４，６０８号及び米国特許出願第０８／２６３，５２２号に開示されているように、これはシリカ親和性成分を介してウェーブガイド表面に付着した親水性重合体残留物チェーンを含むベース・コーティングによって達成し得る。これら２つの方法を実現するプロトコルは米国特許出願第０８／０６４，６０８号及び米国特許出願第０８／２６３，５２２号と、１９９３年に発行されたＳＰＩＥ１８８５の２８〜３９頁に記載されているヘロン他による“平面ウェーブガイドを使用する蛍光イムノセンサー”とに開示されている。不動化された分析物結合分子の少なくとも７０％が結合可能であることが好ましい。概論核酸プローブは医学的診断に徐々に採用されてきており、将来的にはイムノアッセイの重要性に等しいか、またはそれ以上の重要性を有し得る。エバネッセント・ウェーブ・センサは適切な感度を有する。このため、エバネッセント・ウェーブ・センサは分析物の予備増幅を要することなくＤＮＡハイブリダイゼーションを検出し得る。本発明では、イムノサンドイッチ・アッセイの核酸類自体を使用する。より詳細には、対象物（分析物）のシーケンスに対して相補的なシーケンスを有するオリゴヌクレオチド・プライマー（捕獲オリゴタレオチド）をアミン反応性、チオール反応性または（ストレプト）アビジン−ビオチン結合ケミストリ（amine-reactive，thiol-reactive or the(strep)avidin-biotin coupling chemistry）を使用することにより、ウェーブガイドに対して不動化する（１９９３年に発行されたＳＰＩＥ第１８８５刊（蛍光センシング技術における進歩）の２８〜３９頁に記載されているヘロン，ジェイ．エヌ．、コールドウェル，ケイ．ディ．、クリステンセン，ディ．エイ．、ダイヤー，エス．、レディ，ヴィ．、ホワン，ピー．、ヤナトバ，ヴィ．、ウォン，エッチ．ケイ．及びウェイ，エイ．ピー．による“平面ウェーブガイドを使用する蛍光イムノセンサー”を参照）。次いで、Ｃｙ−５等の蛍光ラベルを分析物上のシーケンスに対して相補的なシーケンスを有する第２のオリゴヌクレオチド・プライマー（トレーサー）の一端に対して結合させる。アッセイを実施すべく、分析物が二重鎖である場合には同分析物を最初に加熱し（２つの鎖を分離するため）、次いで分析物をトレーサー・オリゴヌクレオチドと混合する。この混合物をセンサ上に配置する。センサ上において、分析物は捕獲分子とともにハイブリッドを形成する。そして、トレーサー・オリゴヌクレオチドをエバネッセント・フィールドに移動させる。エバネッセント・フィールドにおいて、トレーサーは蛍光発光する。核酸を検出するうえでの主な技術的障害は増幅工程（例：ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）の削除にある。増幅工程は今日のアッセイにおいて核酸の量を測定可能レベルまで増大すべく必要とされる。理論的には、エバネッセント・ウェーブ・センサは増幅されていないＤＮＡを測定するために必要な固有の感度を有する。しかし、これを実現するためには多くの技術的障害が存在し、同障害は（１）非常に低いレベルの非特異的結合（今日の技術より１０〜１００倍低いレベル）を実現する不動化技術と、（２）フェムトグラムの量の核酸を損失を伴うことなく適切な時間（５〜１０分）内にセンサ表面に移動させる効果的な反応物分配技術と、（３）ハイブリダイゼーション・アッセイに必要とされる二重鎖分析物を単鎖形態にする効果的な変性技術とを開発することを含む。材料及び方法ウェーブガイド蛍光核酸ハイブリダイゼーション・アッセイを実施すべく平面ウェーブガイドを使用する。核酸プローブは以下に詳述するように溶融シリカ・ウェーブガイド（１．０ｘ１．０ｘ０．１ｃｍ、ＣＯグレード、ＥＳＣＯ）または射出成形されたポリスチレン・ウェーブガイド（１．０ｘ１．０ｘ０．０５ｃｍ、ＨＣＰダイアグノースティクス（HPC Diagnostics）、ソルトレイク・シティ）に対して不動化する。核酸プローブＴ３ＲＮＡポリメラーゼの転写プロモーター・サイトを本実験におけるモデル・オリグヌクレオチド・シーケンスとして使用する。Ｔ３プロモーターは以下のシーケンス、即ち５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ３’からなる２０−ｍｅｒの大きさを有する。このオリゴヌクレオチドはユニバーシティ・オブ・ユタの分子生物学サービス施設（Molecular biology service facility）によって合成され、かつ精製された。ＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイに使用した際、このオリゴヌクレオチドはウェーブガイド上に不動化（以下に詳述する方法を用いて）されるとともに、“捕獲”オリゴヌクレオチドとして使用される。更に、同オリゴヌクレオチドはコンペティション・アッセイにおける可溶性インヒビター（Soluble inhibitor）としても使用される。Ｔ３プロモータのシーケンスに対して相補的なシーケンスを有する第２のオリゴヌクレオチド・シーケンスは前記の分子生物学サービス施設において合成され、かつ蛍光標識を付され、さらにはＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイにおいて可溶性“トレーサー”オリゴヌクレオチドとして使用される。このために、オリゴヌクレオチドは３’末端に位置するターミナル・アミノ・グループとともに合成され、さらにはレッド放射蛍光染料（red-emitting fluorescent dye）であるＣｙ−５（モレキュラー・ディテクション・システムズ（Molecular Detection Systems）、ピッツバーグ）でラベル付けされている。シリカ・ウェーブガイドに対するオリゴヌクレオチド・プローブの不動化オリゴヌクレオチド・プローブはアビジン／ビオチン結合ケミストリ（Avidin /biotin coupling chemistry）を使用することによりシリカ・ウェーブガイドに対して結合されている。一般的には、アビジンを静電相互作用（中性のｐＨにおいて、シリカは負に帯電しており、アビジンは正に帯電している）を介してウェーブガイドに対して不動化し、次いでビオチン化ヌクレオチドを不動化されたアビジンに対して結合させる。ビオチン化オリゴヌクレオチドはビオチンアミドカプロエートＮ―ヒドロキシサクシンイミドエステル（Biotinamidocaproate N-hy droxysuccinimide ester、以下、ＢＣＨＳと称し、シグマより入手）を５’アミノ・グループを有する修飾オリゴヌクレオチドに対して結合することによって準備した。ＢＣＨＳ誘導体は６つの炭素を有するスペーサをオリグヌクレオチドの５’末端及びビオチン成分の間に配置すべく使用される。スペーサは他のヌクレオチドとのハイブリダイセーションにおいて更に適した柔軟性を提供する。より詳細には、２０倍モル過剰量のＢＣＨＳを０．１Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ９（略して、ＣＢＢ）に含まれるオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ミリリットル溶液に対して加える。この混合物を室温で２時間反応させ、さらには反応生成物（ビオチン化オリゴヌクレオチド）をアセチルニトリル／Ｈ₂Ｏグラジエント（Acetylnitrile/H₂O gradient）を使用する逆相ＦＰＬＣクロマトグラフィ（ファーマシア（Pharmacia））で精製する。アビジンは物理的吸着作用によりシリカ表面に不動化される。このために、消浄なシリカ・サンプルを室温においてアビジン溶液（燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４内に３ｘ１０^-6Ｍ）中に３時間にわたって浸漬し、次いで吸着されなかったアビジンを除去すべく同一の緩衝液で数回洗浄する。次いで、アビジンで被覆した表面をＰＢＳ中に含まれるビオチン化オリゴヌクレオチドの１．５ｘ１０^-7Ｍ溶液中に室温で１時間浸漬する。末結合のヌクレオチドをＰＢＳ内で洗浄することによって除去する。幾つかのケースでは、ビオチン化オリゴヌクレオチドの不動化後に、ビオチン化ポリ（エチレングリコール）（以下、ビオチン−ＰＥＧと称する）を表面に結合させる。ビオチン−ＰＥＧはＮ−ヒドロキシサクシンイミドビオチン（N-hydroxysuccinimidobiotin、以下、ＮＨＳＢと称する）をＣＢＢ内においてＮＨ₂−ＰＥＧ−ＯＣＨ₃（５０００ＭＷ、シグマ）と２時間反応させ、次いでスペクトラ／ポー透析膜（Spectra/Por dialysis membr anes）（１０００ＭＷカットオフ）を使用した透析で精製することにより準備される。シリカ表面（アビジン及びオリゴヌクレオチドで被覆されている）をビオチン−ＰＥＧの溶液（５ｘ１０^-8Ｍまたは１ｘ１０^-7Ｍ）中に室温で１時間浸漬する。未結合のビオチン−ＰＥＧはＰＢＳ内で洗浄することにより除去する。射出成形されたポリスチレン・ウェーブガイドに対するオリゴヌクレオチド・プローブの不動化オリゴヌクレオチドをポリスチレン・ウェーブガイドに対して不動化すべく、アビジンに代えてストレプトアビジンを使用した点を除いて同様のプロシージャを使用する。アピジンは静電相互作用によりシリカ基体と強力に相互作用する。しかし、同アビジンはポリスチレン表面（本質的に帯電していないうえ、疎水性である）に対してシリカに対する吸着ほどに強力に吸着しない。これとは対照的に、ストレプトアビジンはポリスチレン表面に対する吸着のために選択された蛋白質である。ストレプトアビジンはアビジンと機能的に等しい（即ち、ストレプトアビジンは４つのビオチン結合部位を有する）。その一方、ストレプトアビジンは中性のｐＨにおいて僅かなチャージを有し、さらにはビオチン結合能力を吸着後に維持する。全内反射蛍光測定全内反射蛍光（以下、ＴＩＲＦと称する）分光学はウェーブガイド等の固体面に結合した蛍光分子の濃度の測定に特に適する光学的技術である。水はシリカまたはポリスチレンより低い屈折率を有する。このため、ウェーブガイド内を伝搬され、かつ同ウェーブガイドのエッジに達したビーム光線は同エッジへの入射角度に基づいて水相内に屈折するか、またはウェーブガイド内に全内反射される。後者のケースでは、エッジにおける入射ビーム及び反射ビームはウェーブガイド内に定在波を形成すべく互いに干渉する。この波はウェーブガイドのエッジにおいて有限電界振幅（Finite electric field amplitude）を有する一方で、水相内に移動した際、１０００〜２０００オングストロームの距離において指数関数的に減衰する。この減衰する電界はエバネッセント・フィールドと称される。エバネッセント・フィールドはウェーブガイド表面に比較的近い領域内に存在するのみである。このため、エバネッセント・フィールドはウェーブガイド表曲において発生する核酸ハイブリダイゼーション反応を検出すべく使用可能である。ウェーブガイドは前記のようにオリゴヌクレオチドによって被覆され、さらには米国特許出願第０８／０６４，６０８号に開示されるフロー・セル内に取付けられる。Ｃｙ−５でラベル付けしたトレーサー・オリゴヌクレオチドの蛍光はＨｅ −Ｎｅレーザー（メレス・グリオ（Melles Griot））の６３２．８ｎｍの光線または半導体レーザー（パワー・テクノロジー・インコーポレイテッド（Power Te chnology，Inc.））の６３３ｎｍの光線によって励起される。レッド・ラインはシート・ビーム（約０．２ｘ３ｃｍの横断面を有する）に成形され、さらには円筒カップリング・レンズを使用することによりウェーブガイドの２つのチャネル（サンプル及び基準）内にそれぞれ同時にカップリングされる。Ｃｙ−５の蛍光エミッションは電荷結合素子（ＣＣＤ）（フォトメトリクス・リミテッド・シリーズ２００またはサンタ・バーバラ・インスツルメント・グループＳＴ６（Phot ometrics Ltd Series 200 or Santa Barbara Instrument Group ST6））に取付けられた５０ｍｍのｆ／５．６カメラ・レンズ（ニコン製）を使用して集められた。蛍光エミッションはシングル・グレーティング・モノクロメータ（スペッタス１６８１ｃミニメート２、ｆ／３．９、溝数３００／ｍｍ）または６７０ｎｍバンドパス・インターフェアレンス・フィルタ（オメガ（Omega））を使用することによりレイリー散乱（Rayleigh Iight scattering）から弁別される。アッセイＤＮＡハイブリダイゼーションの検出における平面ウェーブガイド及びＴＩＲＦの使用を２つの異なるアッセイで評価する。このうちの第１のアッセイ（アッセイ１）は直接結合アッセイである。直接結合アッセイでは、ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖(“不動鎖”と称する)をウェーブガイドに対して不動化し、他方の鎖(“ 可溶性鎖”と称する)を蛍光染料でラベル付けする。ウェーブガイド上における二重鎖ＤＮＡ分子の形成を蛍光ラベルを有する可溶性鎖の濃度の関数として監視する。第２のアッセイ（アッセイ２）はアッセイ１で詳述した反応物と同一の反応物を使用するコンペティション・アッセイである。しかし、このケースでは、可溶性鎖のラベルを有する種及びラベルを有さない種の両方が存在する。より詳細には、異なる複数の濃度のラベル無し可溶性鎖を固定された濃度のラベル付き可溶性鎖とそれぞれ混合し、各混合物をウェーブガイド上の不動鎖と反応させる。二重鎖ＤＮＡ分子の形成をＴＩＲＦを使用して監視する。表１は２つのアッセイで使用する複数の反応物を示す。アッセイは米国特許出願第０８／０６４，６０８号に開示されている２チャネル・フロー・セルを使用して実施した。前記の反応物を含む“サンプル”溶液を一方のチャネルに注入し、“基準”溶液を他方のチャネルに注入する（各アッセイに使用するサンプル溶液及び基準溶液の詳細は表１を参照のこと）。基準溶液は蛍光ラベルを付したオリゴヌクレオチド及びウェーブガイドの間の非特異的結合の度合いを測定し、さらには実験中に発生するレーザー強度の変動を補正すべく使用される。各測定はサンプル・チャネル及び基準チャネル内のＰＢＳ緩衝液のベースライン蛍光をそれぞれ集めることから始められる。最も薄い分析物溶液から分析を始めることとして、表１に示す１ミリリットルのサンプル溶液及び基準溶液をそれぞれフローセル内に注入する。２つの溶液をウェーブガイド表面で５分間インキュベートし、さらには両チャネルの１０秒蛍光イメージ（10 sec f luorescence images）を集める。このプロセスは最も濃い溶液のアッセイが終了するまで数回繰り返される。全てのＣＣＤイメージはサンプル・チャネル及び基準チャネルの体積を満たす蛍光分析物による洗浄工程を実施することなく集められる。これらのデータから基準の強度に対するサンプルの強度の比をそれぞれ算出し、さらには同比を分析物バルク濃度の関数としてプロットすることにより、結合曲線を形成する。この種の放射測定は３つの影響、即ちトレーサーの非特異的結合と、ウェーブガイド表面から散乱した光線によるバルク蛍光の励起と、レーザー強度の変動とを補償する。コンポジット・ウェーブガイドの詳細を本発明の概念及び範囲から逸脱することなく変更し得る。請求の範囲は本明細書中に開示する本発明の範囲を定義する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年４月２８日【補正内容】請求の範囲１．特異的結合アッセイを実施するためのキットであって、平面基体を備えたステップ・グラディエント・ウェーブガイドと、前記平面基体は屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料から形成され、かつ表面を有し、前記表面は屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成されたウェーブガイド膜に隣接して配置され、かつ同ウェーブガイド膜に当接していることと、前記ウェーブガイド膜に対して不動化され、かつ分析物に対して特異的に結合すべく形成された少なくとも１つの特異的結合分子とを含むバイオセンサを有するキット。２．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、堆積二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は堆積二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項１に記載のキット。３．前記ウェーブガイド膜は前記平面基体の表面に沿って互いに平行、かつ離間して延びる第２の光学材料からなる複数のストリップとして形成されるとともに、複数のウェーブガイド・チャネルを含み、さらにはウェーブガイド膜に対して不動化された特異的結合分子の複数の異なる種を有し、前記複数のウェーブガイド・チャネルは同ウェーブガイド・チャネルに対して不動化された互いに異なる種をそれぞれ有する請求項２に記載のキット。４．前記平面基体表面は同表面上に形成されたグレーティングを有し、前記グレーティングは入射励起ビームからの光線をウェーブガイド膜内にカップリングすることを促進すべく形成されている請求項２に記載のキット。５．前記ウェーブガイド膜は前記分析物の特異的結合の総量の約１０％より低い非特異的蛋白質結合のレベルを提供するコーティングによって被覆され、前記コーティングはポリメタクリロイル・ポリマー、ポリエチレングリコール及びアビジンからなるグループから選択され、前記捕獲分子は前記コーティングに対する結合によってウェーブガイド膜に対して不動化されている請求項１に記載のキット。６．前記ステップ・グラディエント・ウェーブガイドは、表面を有する第１の光学材料からなる片を提供する工程と、前記ウェーブガイド膜層を形成すべく第２の光学材料を前記表面上に約０．１〜１０μｍの厚さまで蒸着する工程と、前記ウェーブガイド膜層の少なくとも１つの領域をレジスト化合物で被覆する工程と、前記レジスト化合物は被覆領域及び非被覆領域を形成すべくエッチャントに抵抗することと、ウェーブガイド膜を形成すべく前記第２の光学材料を非被覆領域から除去するためにエッチャントで前記ウェーブガイド膜層をエッチングする工程とを含む製造方法によって形成されている請求項１に記載のキット。７．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は堆積二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項６に記載のキット。８．前記少なくとも１つの領域をレジスト化合物で被覆する工程は、前記表面に沿って互いに平行に延びる複数のストリップを前記レジスト化合物で被覆し、これにより複数のウェーブガイド・チャネルを形成する工程を含み、前記特異的結合分子の異なる複数の種がウェーブガイド膜に対して不動化されており、前記複数のウェーブガイド・チャネルは同ウェーブガイド・チャネルに対して不動化された互いに異なる種をそれぞれ有する請求項６に記載のキット。９．前記製造方法はウェーブガイド膜層を堆積させる工程を実施する前に、互いに離間した複数の溝を前記第１の光学材料の表面にエッチングする工程をさらに含み、前記互いに離間した複数の溝は前記複数のウェーブガイド・チャネルに対してほぼ直交する方向に延び、前記互いに離間した複数の溝の間隔はグレーティングとして機能し、前記グレーティングは入射励起ビームからの光線をウェーブガイド膜内へ効果的にカップリングすることを促進する請求項８に記載のキット１０．前記第２の光学材料はほぼＳｉ₂Ｏ₃Ｎの元素比を有するシリコン・オキシナイトライドである請求項１に記載のキット。１１．前記ステップ・グラディエント・ウェーブガイドはウェーブガイド膜に当接して配置されたウェーブガイド・カプラを有し、前記ウェーブガイド・カプラは、屈折率ｎ₃を備えた光学材料から形成され、かつ約０．５〜５ｍｍの厚さを有する入力ウェーブガイドと、前記屈折率ｎ₃より小さく、かつ屈折率ｎ₂より小さい屈折率ｎ₄を備えた光学材料から形成されたスペース層と、前記スペース層は入力ウェーブガイドからの光線をウェーブガイド膜内にエバネッセント・カップリングすることを最適化すべく選択された厚さを有することを含む請求項１に記載のキット。１２．エバネッセント・イムノ蛍光アッセイを実施する装置であって、コンポジット・ウェーブガイドと、前記コンポジット・ウェーブガイドは、屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料から形成された基体と、前記基体は所定の厚さによって互いに分離された２つの平行な平面及び周囲を囲むエッジを有し、前記所定の厚さは約１μｍ〜１０ｍｍであることと、前記２つの平面の少なくとも一部の上に直接堆積されたウェーブガイド膜と、前記ウェーブガイド膜は前記屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成され、かつ約０．１〜１０μｍの厚さを有し、前記ウェーブガイドは同ウェーブガイド膜に対して不動化された複数の特異的結合分子を有することを含むことと、前記コンポジット・ウェーブガイド内における全内反射による伝搬を実現すべくビームを同コンポジット・ウェーブガイド内に案内するために動作可能に配置された光源と、前記コンポジット・ウェーブガイド内への光線ビームのカップリングを促進すべく同コンポジット・ウェーブガイドに動作可能に付随する光線カップリング手段と、前記平行な２つの平面から離間した平面上に入射する光線を集めるべく位置決めされた集光手段と、前記集められた光線を検出すべく前記集光手段に対して動作可能に位置決めされた検出器とを有する装置。１３．前記第１の光学材料及び第２の光学材料は堆積二酸化珪素／シリコン・オキシナイトライドと、石英または溶融シリカ／シリコン・オキシナイトライドと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライド／屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウム／堆積二酸化珪素とからなる対をなす組合わせのグループからそれぞれ選択された請求項１２に記載の装置。１４．前記光線カップリング手段はウェーブガイド膜に当接して配置されたウェーブガイド・カプラであり、さらには、屈折率ｎ₃を備えた光学材料から形成された約０．５〜５ｍｍの厚さを有する入力ウェーブガイドと、前記屈折率ｎ₂より小さく、かつ屈折率ｎ₃より小さい屈折率ｎ₄を備えた光学材料から形成されたスペース層と、前記スペース層は入力ウェーブガイドからの光線をウェーブガイド膜内へエバネッセント・カップリングすることを最適化すべく選択された厚さを有することを含む請求項１２に記載の装置。１５．前記ウェーブガイド膜は空気中において約１ｄＢ／センチメートルより低い伝搬損を有するように形成されている請求項１３に記載の装置。１６．光学ユニットとともに特異的結合アッセイを実施するための光学構造体であって、前記光学ユニットがウェーブガイド内における全内反射による伝搬を実現すべく、光線をウェーブガイド内に案内するために位置決めされた光源と、光学構造体に隣接する領域からの光線を検出すべく配向された検出器とを含む光学構造体において、屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料を含む基体と、前記基体は所定の厚さによって互いに分離された２つの平行な平面及び周囲を囲むエッジを有し、前記所定の厚さは約０．３μｍ〜１０ｍｍであることと、前記基体の平行な２つの平面のうちの一方の少なくとも一部に対して当接する屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成されたウェーブガイド膜と、前記ウェーブガイド膜は約０．３〜５μｍの厚さを有し、さらに前記ウェーブガイド膜は同ウェーブガイド膜に対して不動化された複数の特異的結合分子を有することと、光線をウェーブガイド膜内にカップリングすべく同ウェーブガイド膜に完全にに当接するカップリング手段とを備えた光学構造体。１７．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は純粋な二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項１６に記載の光学構造体。１８．前記カップリング手段は前記第１の材料から形成された光学グレーティングと、前記第２の材料から形成された光学グレーティングと、ウェーブガイド膜上に完全に取付けられたウェーブガイド・カプラとからるグループから選択され、前記ウェーブガイド・カプラは、入力ウェーブガイドと、前記入力ウェーブガイドはエッジを通じて光線を入射され、さらには入射した光線を全内反射によって伝搬すべく形成されていることと、前記入力ウェーブガイド及びウェーブガイド膜の間に配置されたスペース層と、前記スペース層は入力ウェーブガイドからの光線をウェーブガイド膜内にエバネッセント・カップリングすることを最適化すべく選択された厚さを有することを含む請求項１７に記載の光学構造体。１９．前記第１の光学材料は石英、溶融シリカまたは堆積ＳｉＯ₂であり、前記カップリング手段はウェーブガイド・カプラであり、前記入力ウェーブガイドはルチル、ジルコニア及びハイインデックス・ガラスからなるグループから選択された光学材料から形成され、前記スペース層は二酸化珪素から形成され、かつ約０．１〜５μｍの厚さを有する請求項１８に記載の光学構造体。２０．前記ウェーブガイド膜は第２の光学材料からなる複数のストリップとして形成され、前記複数のストリップは互いに離間した平行なアレイの形態で前記平行な２つの平面のうちの一方に対して付着されている請求項１６に記載の光学構造体。２１．表面に形成された複数のサンプル・ウェルを有し、前記複数のサンプル・ウェルは、屈折率ｎ₁を備えた外層をエピタキシャル成長によって前記ウェーブガイド膜上に堆積させる工程と、前記サンプル・ウェルを画定する複数のアウトラインに対してレジスト化合物を加え、この際、被覆されていないアウトラインを有する領域と、被覆されていないアウトラインを有さない領域とを残す工程と、前記非被覆領域内のウェーブガイド膜を露出すべくエッチングにより外層を除去する工程とによって形成された請求項１６に記載の光学構造体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヘロン、ジェイムスエヌ. アメリカ合衆国 84109 ユタ州ソルトレイクシティーエス．プラトウドライブ 2965 (72)発明者ウォン、ス−クンアメリカ合衆国 84102 ユタ州ソルトレイクシティーエリザベスストリートナンバー２ 73 (72)発明者クリステンセン、ダグラスエー. アメリカ合衆国 84121 ユタ州ソルトレイクシティートップオブザワールドサークル 8520

Claims

【特許請求の範囲】１．光線を光学基体内に案内すべく位置決めされた光源と、ウェーブガイドに隣接する領域からの光線を検出すべく配向された検出手段とを含む光学ユニットとともに特異的結合アッセイを実施するためのキットであって、基体を備えたステップ・グラディエント・ウェーブガイドと、前記基体は屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料から形成され、かつ表面を有し、前記表面は屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成されたウェーブガイド膜に隣接して配置され、かつ同ウェーブガイド膜に当接していることと、前記ウェーブガイド膜に対して不動化され、かつ分析物に対して特異的に結合すべく形成された少なくとも１つの特異的結合分子とを含むバイオセンサを有するキット２．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、堆積二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は堆積二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項１に記載のキット。３．前記ウェーブガイド膜は前記表面に沿って長手方向に互いに平行、かつ離間して延びる第２の光学材料からなる複数のストリップとして形成されるとともに、複数のウェーブガイド・チャネルを含み、さらにはウェーブガイド膜に対して不動化された特異的結合分子の複数の異なる種を有し、前記複数のウェーブガイド・チャネルは同ウェーブガイド・チャネルに対して不動化された互いに異なる種をそれぞれ有する請求項２に記載のキット。４．前記基体表面は同表面上に形成されたグレーティングを有し、前記グレーティングは入射励起ビームからの光線をウェーブガイド膜内にカップリングすることを促進すべく形成されている請求項２に記載のキット。５．前記ウェーブガイド膜は前記分析物の特異的結合の総量の約１０％より低い非特異的蛋白質結合のレベルを提供するコーティングによって被覆され、前記コーティングはポリメタクリロイル・ポリマー、ポリエチレングリコール及びアビジンからなるグループから選択され、前記捕獲分子は前記コーティングに対する結合によってウェーブガイド膜に対して不動化されている請求項１に記載のキット。６．前記ウェーブガイドは、表面を有する第１の光学材料からなる片を提供する工程と、前記ウェーブガイド膜を形成すべく第２の光学材料を前記表面上に約０．１〜１０μｍの厚さまで蒸着する工程と、前記ウェーブガイド層の少なくとも１つの領域をレジスト化合物で被覆する工程と、前記レジスト化合物は被覆領域及び非被覆領域を形成すべくエッチャントに抵抗することと、前記第２の光学材料を非被覆領域から除去すべくエッチャントで前記ウェーブガイド層をエッチングする工程とによって形成された請求項１に記載のキット。７．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は堆積二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項６に記載のキット。８．前記少なくとも１つの領域をレジストで被覆する工程は、前記表面に沿って長手方向に互いに平行に延びる複数のストリップを前記レジストで被覆し、これにより複数のウェーブガイド・チャネルを形成する工程を含み、前記特異的結合分子の異なる複数の種かウェーブガイド膜に対して不動化されており、前記複数のウェーブガイド・チャネルは同ウェーブガイド・チャネルに対して不動化された互いに異なる種をそれぞれ有する請求項６に記載のキット。９．前記ウェーブガイド層を堆積させる工程を実施する前に、互いに離間した複数の溝を基体の表面にエッチングする工程をさらに含み、前記複数の溝はウェーブガイド・チャネルに対してほぼ直交する方向に延び、前記複数の溝の間隔はグレーティングとして機能すべく選択され、前記グレーティングは入射励起ビームからの光線をセンサ・ストリップ内へ効果的にカップリングすることを促進する請求項８に記載のキット。１０．前記第２の光学材料はほぼＳｉ₂Ｏ₃Ｎの元素比を有するシリコン・オキシナイトライドである請求項１に記載のキット。１１．前記ステップ・グラディエント・ウェーブガイドはウェーブガイド膜に当接して配置されたウェーブガイド・カプラを有し、前記ウェーブガイド・カプラは、屈折率ｎ₃を備えた光学材料から形成され、かつ約０．５〜５ｍｍの厚さを有する入力ウェーブガイドと、前記屈折率ｎ₃より小さく、かつ屈折率ｎ₂より小さい屈折率ｎ₄を備えた光学材料から形成されたスペース層と、前記スペース層は入力ウェーブガイドからの光線をウェーブガイド膜内にエバネッセント・カップリングすることを最適化すべく選択された厚さを有することを含む請求項１に記載のキット。１２．エバネッセント・イムノ蛍光アッセイを実施する装置であって、コンポジット・ウェーブガイドと、前記コンポジット・ウェーブガイドは、屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料から形成された基体と、前記基体は所定の厚さによって互いに分離された２つの平行な平面及び周囲を囲むエッジを有し、前記所定の厚さは約１μｍ〜１０ｍｍであることと、前記屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成され、かつ約０．１〜１０μｍの厚さを有するウェーブガイド膜とを有することと、前記コンポジット・ウェーブガイド内における全内反射による伝搬を実現すべくビームを同コンポジット・ウェーブガイド内に案内するために動作可能に配置された光源と、前記コンポジット・ウェーブガイド内への光線ビームのカップリングを促進すべく同コンポジット・ウェーブガイドに動作可能に付随する光線カップリング手段と、前記平面から離間した平面上に入射する光線を集めるべく位置決めされた集光手段と、前記集められた光線を検出すべく前記集光手段に対して動作可能に位置決めされた検出手段とを有する装置。１３．前記第１の光学材料及び第２の光学材料は堆積二酸化珪素／シリコン・オキシナイトライドと、石英または溶融シリカ／シリコン・オキシナイトライドと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライド／屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウム／堆積二酸化珪素とからなる対をなす組合わせのグループからそれぞれ選択された請求項１２に記載の装置。１４．前記光線カップリング手段はウェーブガイド膜に当接して配置されたウェーブガイド・カプラであり、さらには、屈折率ｎ₃を備えた光学材料から形成された約０．５〜５ｍｍの厚さを有する入力ウェーブガイドと、前記屈折率ｎ₂より小さく、かつ屈折率ｎ₃より小さい屈折率ｎ₄を備えた光学材料から形成されたスペース層と、前記スペース層は入力ウェーブガイドからの光線をウェーブガイド膜内へエバネッセント・カップリングすることを最適化すべく選択された厚さを有することを含む請求項１２に記載の装置。１５．前記ウェーブガイド膜は空気中において約１ｄＢ／センチメートルより低い伝搬損を有するように形成されている請求項１３に記載の装置。１６．光学ユニットとともに特異的結合アッセイを実施するための光学構造体であって、前記光学ユニットがウェーブガイド内における全内反射による伝搬を実現すべく、光線をウェーブガイド内に案内するために位置決めされた光源と、光学構造体に隣接する領域からの光線を検出すべく配向された検出手段とを含む光学構造体において、屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料を含む基体と、前記基体は所定の厚さによって互いに分離された２つの平行な平面及び周囲を囲むエッジを有し、前記所定の厚さは約０．３μｍ〜１０ｍｍであることと、前記複数の平面のうちの１つの少なくとも一部に対して動作可能に当接する屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成されたウェーブガイド膜と、前記ウェーブガイド膜は約０．３〜５μｍの厚さを有することと、光線をウェーブガイド膜内にカップリングすべく同ウェーブガイド膜に完全にに当接するカップリング手段とを備えた光学構造体。１７．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は純粋な二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項１６に記載の光学構造体。１８．前記カップリング手段は前記第１の材料から形成された光学グレーティングと、前記第２の材料から形成された光学グレーティングと、ウェーブガイド膜上に完全に取付けられたウェーブガイド・カプラとからるグループから選択され、前記ウェーブガイド・カプラは、入力ウェーブガイドと、前記入力ウェーブガイドはエッジを通じて光線を入射され、さらには入射した光線を全内反射によって伝搬すべく形成されていることと、前記入力ウェーブガイド及びウェーブガイド膜の間に配置されたスペース層と、前記スペース層は入力ウェーブガイドからの光線をウェーブガイド膜内にエバネッセント・カップリングすることを最適化すべく選択された厚さを有することを含む請求項１７に記載の光学構造体。１９．前記第１の光学材料は石英、溶融シリカまたは堆積ＳｉＯ₂であり、前記カップリング手段はウェーブガイド・カプラであり、前記入力ウェーブガイドはルチル、ジルコニア及びハイインデックス・ガラスからなるグループから選択された光学材料から形成され、前記スペース層は二酸化珪素から形成され、かつ約０．１〜５μｍの厚さを有する請求項１６に記載の光学構造体。２０．前記ウェーブガイド膜は第２の光学材料からなる複数のストリップとして形成され、前記複数のストリップは互いに離間した平行なアレイの形態で前記複数の平面のうちの１つに対して付着されている請求項１６に記載の光学構造体。２１．表面に形成された複数のサンプル・ウェルを有し、前記複数のサンプル・ウェルは、屈折率ｎ₁を備えた外層をエピタキシャル成長によって前記ウェーブガイド膜上に堆積させる工程と、前記サンプル・ウェルを画定する複数のアウトラインに対してレジスト化合物を加え、この際、被覆されていないアウトラインを有する領域と、被覆されていないアウトラインを有さない領域とを残す工程と、前記非被覆領域内のウェーブガイド膜を露出すべくエッチングにより外層を除去する工程とによって形成された請求項１６に記載の光学構造体。２２．光学ユニットとともに特異的結合アッセイを実施するためのウェーブガイド・バイオセンサを形成する方法であって、前記光学ユニットが前記光学構造体内における全内反射による伝搬を実現すべく、光線を前記光学構造体内に案内するために位置決めされた光源と、前記光学構造体に隣接する領域からの光線を検出すべく配向された検出手段とを含む方法において、屈折率ｎ₁を備えた第１の光学材料を含む基体を提供する工程と、前記基体は所定の厚さによって互いに分離された２つの平行な平面及び周囲を囲むエッジを有することと、前記屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を備えた第２の光学材料から形成されたウェーブガイド層を前記複数の平面のうちの１つの上に堆積させる工程と、前記ウェーブガイド層は約０．１〜１０μｍの厚さを有することと、前記ウェーブガイド層の少なくとも１つの領域をレジスト化合物で被覆する工程と、前記レジスト化合物は被覆領域及び非被覆領域を形成すべくエッチャントに抵抗することと、前記第２の材料を非被覆領域から除去すべくエッチャントで前記ウェーブガイド層をエッチングする工程と、前記被覆領域を露出すべく、レジスト化合物をエッチングされたウェーブガイドから除去する工程と、複数の捕獲分子を前記露出した被覆領域に対して不動化する工程と、前記捕獲分子は選択された分析物分子に対して特異的に結合すべく形成されていることを含む方法。２３．前記露出した被覆領域を前記分析物の特異的結合の総量の約１０％より低い非特異的蛋白質結合のレベルを提供するコーティングによって被覆する工程を有し、前記コーティングはポリメタクリロイル・ポリマー、ポリエチレングリコール及びアビジンからなるグループから選択され、前記捕獲分子を不動化する工程において、前記捕獲分子は前記コーティングに対して結合される請求項２２に記載の方法。２４．前記第２の光学材料は屈折率ｎ₂を備えたシリコン・オキシナイトライドと、堆積二酸化珪素とからなるグループから選択され、前記第１の光学材料は堆積二酸化珪素と、石英または溶融シリカと、屈折率ｎ₁を備えたシリコン・オキシナイトライドと、フッ化マグネシウムとからなるグループから選択された請求項２３に記載の方法。